第一篇：生物技術(shù)實驗心得體會

生物技術(shù)實驗心得體會

基因克隆技術(shù)是分子生物學(xué)的核心技術(shù)，其目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝，用于深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，并可達到人為改造細(xì)胞以及物種遺傳性狀的目的。本論文主要從以下幾個方面來介紹基因克隆技術(shù)：目的基因的獲得、目的基因和載體的連接、重組分子的擴增和鑒定。

可概括為∶分、切、連、轉(zhuǎn)、選?！胺帧笔侵阜蛛x制備合格的待操作的DNA，包括作為運載體的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特異的限制性內(nèi)切酶切開載體DNA，或者切出目的基因；“連”是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來，形成重組的DNA分子；“轉(zhuǎn)”是指通過特殊的方法將重組的DNA分子送入宿主細(xì)胞中進行復(fù)制和擴增；“選”則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個體?；蚩寺〖夹g(shù)包括把來自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。

一.目的基因的獲得

目的基因是指所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達的基因。獲得目的基因是分子克隆過程中最重要的一步?；蚬こ塘鞒痰牡谝徊骄褪谦@得目的DNA片段,。所需目的基因的來源, 不外乎是分離自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化學(xué)合成法、cDNA法及建立基因文庫的方法來篩選

PCR方法

PCR 是一種在體外快速擴增特定基因或DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方。

化學(xué)合成法制備基因片段

采用DNA合成儀，對目的基因進行分段合成，然后進行連接，可以得到所需的目的基因。

二、重組質(zhì)粒的構(gòu)建

DNA體外重組是將目的基因在DNA連接酶作用下，連接到合適的載體DNA上，以便下一步轉(zhuǎn)化之用。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。連接反應(yīng)的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12～16℃，連接12～16h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

三、重組分子的擴增和鑒定

重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞

目的基因和載體在體外連接形成重組DNA分子后，需要被導(dǎo)入受體細(xì)胞中才能進行增殖和（或）表達。受體細(xì)胞是重組基因增殖的場所，所以對受體細(xì)胞也應(yīng)具有幾點要求：①容易接納重組DNA分子；②對載體的復(fù)制擴增無嚴(yán)格限制；③不存在特異的能降解外源DNA的內(nèi)切酶體；④不對外源DNA進行修飾。一般將重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)化，而導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)染。將重組DNA分子和感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞相混合，使重組DNA分子進入大腸桿菌中，就可以實現(xiàn)重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。

重組DNA分子的鑒定

重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后是否得到擴增，擴增后的重組DNA分子是否正確，導(dǎo)入的重組DNA分子是否含有正確的插入片段，重組DNA分子能否表達插入的目的基因，一般可以采用X-gal篩選的方法對重組DNA分子進行鑒定。

四、實驗中的注意事項

1、大腸桿菌液體培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基制備：

1)接種過程中，試管或三角瓶口等，也可通過火焰灼燒滅菌。2)培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品等不能使用干熱滅菌。

3)在加熱過程中應(yīng)不斷攪拌，以防瓊脂粉沉淀糊底燒焦，并應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基起泡而溢出容器。

4)注意培養(yǎng)基分裝時避免其沾污三角瓶口、試管口。

5)嚴(yán)格按照高壓蒸汽滅菌的滅菌指標(biāo)（溫度、壓力、時間）對培養(yǎng)基、器皿滅菌，確保滅菌徹底。

2、大腸桿菌工程菌平板培養(yǎng)：

1)劃線分離時，挑菌量要小，嚴(yán)格無菌操作，避免環(huán)境中的雜菌污染。2)畫線時接中環(huán)圈內(nèi)不能有菌膜產(chǎn)生，會造成接種數(shù)過多，結(jié)果不明顯。

3、PCR擴增目的基因片段：

1)PCR體系所加成分的實際用量，應(yīng)根據(jù)實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的貯備液濃度進行核算。2)加樣時要認(rèn)真,吸頭垂直進入試劑管，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。

3)Taq聚合酶（置于冰盒上）應(yīng)最后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深，酶量不能過多。

4、回收目的基因與載體連接：

1)注意調(diào)轉(zhuǎn)速 2)敞開管蓋放置

3)向吸附膜中間位置懸空滴加30ul洗脫緩沖液TE（洗脫緩沖液TE需使用前60℃水浴預(yù)熱）

4)蓋好管蓋，靜置10min

5、大腸桿菌液體培養(yǎng):

1)接種環(huán)節(jié)應(yīng)嚴(yán)格進行無菌操作。

2)實驗中要注意細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生長期的細(xì)胞。密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。菌體密度與震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速密切相關(guān)，根據(jù)測定的菌液OD值調(diào)整培養(yǎng)時間。

3)接種的試管、三角瓶等應(yīng)做好標(biāo)記，注明菌種、日期、組別、姓名等。

6、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化: 1)所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進行。

2)所使用的器皿必須經(jīng)過滅菌。并且要防止跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)、雜菌、DNA酶或雜DNA所污染，否則會大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率。

3)注意轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量和濃度。當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進行轉(zhuǎn)化。

4)實驗所用的溶液最好用3次蒸餾水配制。

7、篩選重組轉(zhuǎn)化菌落:

1)在含有X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。不是一開始就4℃，是等菌長出來之后。一般菌長出來就會有藍(lán)色的了，4℃之后會進一步顯色。2)當(dāng)出現(xiàn)藍(lán)斑較大，白斑很小附在周圍，還有藍(lán)白鑲嵌的斑即衛(wèi)星菌落的時候，可以小心挑取中間的那個菌落，有可能是陽性克隆。

3)要注意培養(yǎng)時間不宜過長，出現(xiàn)陽性菌落就及時處理，以12-16小時為宜。4)培養(yǎng)基中加抗生素的時候，溫度不能高了，不燙手為宜，防止抗生素失效。

8、菌液PCR分析: 注意移液槍正確的使用方法，各種量程的調(diào)試，一般以接近最大量程的為準(zhǔn)。

9、取大腸桿菌重組質(zhì)粒DNA和酶切分析

1)《質(zhì)粒小量提取試劑盒》進行質(zhì)粒的提取的第三步和第四步之間的時間，操作要流暢快速，決定了實驗成敗

2)禁止吸出沉淀

五、總結(jié)

在分子生物學(xué)中，基因克隆是一種常用的技術(shù)。其中關(guān)鍵技術(shù)是DNA重組技術(shù)，它利用酶學(xué)方法將不同來源的DNA分子進行體外特異性切割，重新拼接組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎(chǔ)上將雜合DNA分子轉(zhuǎn)入一定宿主細(xì)胞中進行擴增，形成大量的子代分子，此過程稱基因克隆。有目的地通過基因克隆技術(shù)，人為操作改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過程總稱為基因工程。

基因工程是把雙刃劍。如果不加節(jié)制的使用基因工程，讓它去為你包治百病，那樣你的整體免疫系統(tǒng)也將發(fā)生錯亂，讓你完全可以抵擋的疾病訪問造成你的死亡。如果人們想造什么動物就造什么動物，讓這些動物急速的泛濫，動物的天敵關(guān)系，人類的生態(tài)平衡都將被破壞，動物也將超過人類，霸占我們賴以生存的地球。而且，若是誰都想起死回生，我想終有一天我們將因為人口泛濫而滅亡。

基因工程知識一種讓科技發(fā)展的手段，而不是我們的目的，我們要遵循自然規(guī)律，正確的對待基因工程，正確的對待生活。

第二篇：生物技術(shù)實驗心得

姓名：吳伙福

學(xué)號：11120222

班級：11（生）2

實驗心得體會

我覺得生物技術(shù)實驗它的目的在于鍛煉我們的實際動手能力，讓我們熟悉各種儀器的使用及實驗的各種規(guī)范操作。我認(rèn)為要想學(xué)好這門實驗課，首先，在做實驗前，一定要事先對將要做的實驗進行預(yù)習(xí)，記下有疑問或不懂得地方，因為這是做實驗的基礎(chǔ)，否則，在老師講解時就會聽不懂，這將使你在做實驗時的難度加大,浪費做實驗的寶貴時間。比如做蛋白質(zhì)的水解和氨基酸的紙層析法分離的實驗，你要清楚水解蛋白質(zhì)的方法和紙層析的基本技術(shù)，如果你不清楚，在做實驗時才去摸索，這將使你極大地浪費時間,使你事倍功半。做實驗時，一定要親力親為，務(wù)必要將每個步驟，每個細(xì)節(jié)弄清楚，弄明白實驗后，還要復(fù)習(xí)思考，這樣你的印象才深刻，記得才牢固，否則，過后不久你就會忘得一干二凈，這還不如不做。做實驗時，老師還會根據(jù)自己的親身體會，將一些課本上沒有的知識教給我們，拓寬我們的眼界，使我們認(rèn)識到這門課程在生活中的應(yīng)用是那么的廣泛。

通過那些實驗，使我學(xué)到了不少實用的知識，更重要的是，做實驗的過程，思考問題的方法，這與做其他的實驗是通用的，真正使我們受益匪淺。在實驗的過程中我培養(yǎng)自己的獨立分析問題，和解決問題的能力。不在像以前做實驗?zāi)菢雍茈S便，總是抱著等老師教你怎么做，拿同學(xué)的報告去抄。盡管你成績也許會很高，但對將來是不利的。我覺得實驗課還是有必要認(rèn)真去學(xué)的，很多東西也許你現(xiàn)在覺得沒用，但是它可能潛移默化的影響著你。

最后我覺得老師的指導(dǎo)也是很有必要的，學(xué)生們必然會有問題，老師偶爾的啟發(fā)就可能讓同學(xué)豁然開朗。但是更多的還是得靠我們自己，我們也要注意與老師互動，這樣才會使我們不僅能學(xué)好實驗課也能增進與老師的感情。

第三篇：《園藝植物生物技術(shù)》實驗教案

實驗一 現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室與實驗儀器

一、實驗?zāi)康?/p>

實驗室和實驗儀器是開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)平臺，對實驗室布局和儀器配置的掌握程度是學(xué)生知識結(jié)構(gòu)完整性的重要體現(xiàn)。通過現(xiàn)場參觀和老師講解加深同學(xué)們對現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗室的規(guī)劃與布局及常用儀器設(shè)備的主要功能的認(rèn)識，掌握高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等關(guān)鍵儀器的使用方法。

二、實驗場所選擇及實驗內(nèi)容

園藝學(xué)院植物分子生物技術(shù)實驗室與開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究直接相關(guān)的實驗室分工與布局和主要相關(guān)儀器：如與組織培養(yǎng)有關(guān)的超凈工作臺、高壓滅菌鍋、接種至、培養(yǎng)室等；與分子生物學(xué)有關(guān)的高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。

三、實驗方法與步驟

1、相關(guān)背景知識回顧：對課堂講述的各種生物技術(shù)如分子標(biāo)記、細(xì)胞和組織培養(yǎng)等操作過程進行回顧，重要指出每個環(huán)節(jié)要用到的必備儀器的作用、性能指標(biāo)、操作注意事項及儀器選購中應(yīng)注意的問題等。

2、每班分為兩小組簡要介紹現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室的布局及功能分區(qū)情況；針對每個分區(qū)的重要儀器進行講述，結(jié)束時對所有參觀內(nèi)容進行簡要總結(jié)，并回答同學(xué)們的提問。

四、實驗注意事項

實驗有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時要求同學(xué)們認(rèn)真記錄，不要隨意動手，以保證儀器和人身安全。

五、思考題

1、根據(jù)參觀內(nèi)容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項。

2、一個現(xiàn)代化生物技術(shù)實驗室應(yīng)具備的基本功能的必備儀器有哪些？實驗二 質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測

一、實驗?zāi)康?/p>

質(zhì)粒是攜帶外源基因進入細(xì)菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取時最常用、最基本的實驗技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例介紹質(zhì)粒的抽提過程，應(yīng)掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。

二、實驗原理 在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒DNA。

三、主要儀器及試材

含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機、移液槍、離心管及質(zhì)粒DNA提取有關(guān)試劑。

液氮、及DNA提取有關(guān)試劑。

四、實驗方法與步驟

（一）試劑配制:

1、LB培養(yǎng)基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高壓滅菌15min，室溫貯存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時配制。

7、溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

9、苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

12、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于-20℃。14、6×loading buffer（上樣緩沖液）:0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%瓊脂糖凝膠:稱取1g瓊脂糖與三角燒瓶中，加100ml 1×TBE，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5ug/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1×TBE），即可上樣。

（二）實驗步驟

1、取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過夜培養(yǎng)。

2、用無菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床-250r/min過夜培養(yǎng)。

3、吸取1.5ml菌液，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。

4、加入200ul預(yù)冷的溶液I，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底混勻沉淀或碎塊）。

5、加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

6、加入300ul預(yù)冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見白色絮狀沉淀，置于冰上3-5min，使雜質(zhì)充分沉淀（溶液III為中和液，此時質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇或2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g ×15min。

8、倒盡上清，加75%乙醇浸洗沉淀除鹽1-2次，4℃離心 10000g×10min，棄上清，將沉淀在室溫或超凈工作臺上風(fēng)干。

9、將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10、取制備的質(zhì)粒DNA 1-2ul，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣，1%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳1h進行檢測。

五、實驗注意事項

1、實驗中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質(zhì)，操作時應(yīng)注意防護，盡量減少臺面污染。

2、DAN電泳時只能由負(fù)極到正極，電泳時要注意電極是否正確。

3、質(zhì)粒電泳檢測一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。

六、思考題

簡述質(zhì)粒DAN提取的步驟。

實驗三 PCR技術(shù)

一、實驗?zāi)康?/p>

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中常用技術(shù)之一。PCR具有反應(yīng)快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。通過本實驗應(yīng)掌握PCR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過程。

二、實驗原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環(huán)境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為變性、退火、延伸三步，經(jīng)過一定的循環(huán)，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量擴增。

三、主要儀器及試材

含有外源cDNA片段的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關(guān)試劑。

四、實驗方法與步驟

1、調(diào)整模板濃度至5ng/ul。

2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、檢測：加2ul溴酚藍(lán)，混勻，短暫離心，取15ul反應(yīng)產(chǎn)物點樣電泳

5、在1%瓊脂糖凝膠上點樣電泳；EB染色，紫外觀察。

五、實驗注意事項

1、引物設(shè)計應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計軟件進行引物設(shè)計；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；

2、PCR反應(yīng)的各種成分不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；

3、根據(jù)引物的Tm值和擴增片段長度以及PCR儀的特性來設(shè)定PCR循環(huán)條件；

4、注意分析電泳檢測PCR產(chǎn)物時出現(xiàn)拖帶或非特異性擴增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

六、思考題

簡述PCR技術(shù)的原理和步驟。

第四篇：《園藝植物生物技術(shù)》實驗教案

《園藝植物生物技術(shù)》實驗教案

實驗一 現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室與實驗儀器

一、實驗?zāi)康?/p>

實驗室和實驗儀器是開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)平臺，對實驗室布局和儀器配置的掌握程度是學(xué)生知識結(jié)構(gòu)完整性的重要體現(xiàn)。通過現(xiàn)場參觀和老師講解加深同學(xué)們對現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗室的規(guī)劃與布局及常用儀器設(shè)備的主要功能的認(rèn)識，掌握高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等關(guān)鍵儀器的使用方法。

二、實驗場所選擇及實驗內(nèi)容

園藝學(xué)院植物分子生物技術(shù)實驗室與開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究直接相關(guān)的實驗室分工與布局和主要相關(guān)儀器：如與組織培養(yǎng)有關(guān)的超凈工作臺、高壓滅菌鍋、接種至、培養(yǎng)室等；與分子生物學(xué)有關(guān)的高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。

三、實驗方法與步驟

1、相關(guān)背景知識回顧：對課堂講述的各種生物技術(shù)如分子標(biāo)記、細(xì)胞和組織培養(yǎng)等操作過程進行回顧，重要指出每個環(huán)節(jié)要用到的必備儀器的作用、性能指標(biāo)、操作注意事項及儀器選購中應(yīng)注意的問題等。

2、每班分為兩小組簡要介紹現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室的布局及功能分區(qū)情況；針對每個分區(qū)的重要儀器進行講述，結(jié)束時對所有參觀內(nèi)容進行簡要總結(jié)，并回答同學(xué)們的提問。

四、實驗注意事項

實驗有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時要求同學(xué)們認(rèn)真記錄，不要隨意動手，以保證儀器和人身安全。

五、思考題

1、根據(jù)參觀內(nèi)容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項。

2、一個現(xiàn)代化生物技術(shù)實驗室應(yīng)具備的基本功能的必備儀器有哪些？

實驗二 植物組織培養(yǎng)

一、實驗?zāi)康?/p>

植物組織培養(yǎng)是現(xiàn)代生物技術(shù)研究的重要技術(shù)手段，在原生質(zhì)體融合、病毒脫除、離體快繁及遺傳轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。胡蘿卜以其培養(yǎng)體系成熟、再生容易而被視為組織培養(yǎng)的理想外植體材料，本實驗通過胡蘿卜的組織培養(yǎng)使同學(xué)們掌握基本培養(yǎng)基的配制、滅菌及培養(yǎng)的基本技能。

二、實驗原理

基于1902年德國科學(xué)家哈勃蘭特（Haberlandt）提出植物細(xì)胞的全能性理論，即指已分化的細(xì)胞仍然具有分化發(fā)育成新個體的潛能。在適宜的培養(yǎng)條件下，植物的細(xì)胞、組織或器官都具備再生成完整植物的能力。

三、主要儀器及試材

儀器：pH計、微波爐、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、培養(yǎng)室、三角瓶、封口膜、無菌濾紙、手術(shù)刀片、鑷子、酒精燈、記號筆等

試材：新鮮胡蘿卜，培養(yǎng)基配制所需相關(guān)試劑

四、實驗方法與步驟

（一）培養(yǎng)基母液的配制（小規(guī)模實驗應(yīng)按比例減少，避免造成很大的浪費）：

1、大量元素(10倍液)：稱取下列藥品分別溶解定容到1升后，加到5升存儲瓶中。

KNO

395 g NH4NO3

82.5 g KH2PO

48.5 g MgSO4?7H2O

18.5 g CaCl2?2H2O

22.0 g 注意事項：

（1）配置母液前要仔細(xì)清洗存儲容器

（2）應(yīng)按照順序分別徹底溶解后混合，每加完一種藥品，搖動存儲瓶使其混合均勻；（3）溶解時最好加熱，以便充分溶解，避免沉淀的產(chǎn)生；

（4）夏季要用新制的蒸餾水，并加熱，這樣可以避免因為水中帶菌量過大而產(chǎn)生沉淀，同時可以減緩綠藻的生成；

（5）沉淀的產(chǎn)生一是由于溶解不充分就混合造成的渾濁型沉淀，所以配置時一定不要急；二是由于長菌而產(chǎn)生絮狀沉淀，所以要用新制的蒸餾水并加熱。

2、微量元素母液的配制(100倍液)：取少量(200-300ml)溫水依次加入下列藥品，每加一種藥品后攪拌溶解，最后定容到1L：

KI

0.083 g H3BO0.62 g ZnSO4*7H2O

0.86 g NaMoO4*2H2O

0.025 g CuSO4*5H2O

0.0025 g CoCl2*6H2O

0.0025 g

MnSO4*4H2O

2.23 g(MnSO4*H2O 1.69 g)注意：配好后在室溫下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易產(chǎn)生結(jié)晶沉淀。配制過程中產(chǎn)生沉淀的原因有：1.前一個沒徹底溶解就加入了后一個藥品；2.蒸餾水pH 值過高，可加幾滴鹽酸校正。

3、甘氨酸和肌醇的配制(100倍液)：

甘氨酸：0.2 g溶解定容到1L；肌醇：10 g溶解定容到1L

4、鐵鹽的配制（100倍液）：

稱取EDTA 3.73 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.78 g，分別溶解后混合定容到1L，放入棕色細(xì)口瓶中，室溫放置10 h以上（防止結(jié)晶沉淀），然后放入4℃冰箱。

5、維生素B的配制（100倍液）：

VB組分 VB1(鹽酸硫氨素)VB6(鹽酸吡哆素)VB5(煙

酸)

改良MT 1g 1g 0.5g

MS 10 mg 50 mg 50 mg 分別稱取順序溶解在溫?zé)岬恼麴s水中，定容到1L。

注: 需要溶解完一個再加另一個；VB5不易溶解，需要攪拌，必要時可以加熱。

6、Vc的配制（100倍液）：

稱取Vc 0.5g 溶解在蒸餾水中，定容到1L即可。

7、其它溶液配制：

BA，NAA，IBA，GA3等激素類試劑可先用少量1N NaOH徹底溶解，再加水定容。配好后室溫放置一段時間，再放入冰箱中冷藏保存。有些試劑在乙醇或鹽酸中也可溶解，但比較而言，用堿溶解比較穩(wěn)定，不易產(chǎn)生沉淀。

注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量較大，短時間內(nèi)用不完，最好分裝一部分到小的細(xì)口瓶中，在制作培養(yǎng)基時使用。這樣不容易產(chǎn)生沉淀。

（二）培養(yǎng)基配制

母液配好后，按以下體種（或質(zhì)量）量取，最后用蒸餾水定溶到1L,調(diào)節(jié)pH至5.8，用塑料燒杯放入微波爐中充分溶解后分裝滅菌。

大量元素(10倍液)

ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)

ml 鐵鹽（100倍）

ml 維生素B（100倍）ml Vc（100倍）

ml 蔗糖

g 瓊脂

7.5 g

（三）接種與培養(yǎng)

在超凈臺上接種后，用記號筆做好標(biāo)簽，放置到光照培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。

五、實驗注意事項

1、實驗中涉及到酒精及砷汞等危險品，注意人身安全的環(huán)境安全，廢液不要隨意亂倒。

2、外植體消毒及接種操作要規(guī)范，注意超凈臺的衛(wèi)生，養(yǎng)成良好的實驗習(xí)慣。

六、實驗結(jié)果處理

一星期后，統(tǒng)計污染率，并對未污染材料的生長狀況進行觀察，并分析產(chǎn)生污染的可能原因。

七、思考題

影響植物組織培養(yǎng)的因素有哪些？

主要參考文獻

1.張婭，曾君祉，周志勇，陳毓荃，黃華樑。胡蘿卜組織培養(yǎng)和高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。植物學(xué)通報,2005，22:37-42。

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。實驗三 植物DNA的提取、純化及檢測

一、實驗?zāi)康?/p>

DNA 提取是開展分子生物學(xué)的重要前提之一，高質(zhì)量的DNA直接關(guān)系到分子標(biāo)記、基因克隆、圖譜構(gòu)建及功能基因組研究等工作的成敗。通過本實驗應(yīng)了解常用DNA提取方法的原理和技術(shù)，掌握改良CTAB法提取植物DNA以及DNA檢測技術(shù)，為將來從事園藝植物生物技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

二、實驗原理

植物的遺傳物質(zhì)是DNA，植物細(xì)胞內(nèi)含有豐富的遺傳物質(zhì)。在機械研磨、高溫和去污劑的共同作用下，植物細(xì)胞破裂，DNA從細(xì)胞核釋放到提取緩沖液中。經(jīng)蛋白質(zhì)強變性劑處理結(jié)合離心，除去蛋白質(zhì)和色素等雜質(zhì)，再用乙醇沉淀便可獲得高純度的DNA。

DNA電泳是依據(jù)DNA帶負(fù)電荷，而不同濃度的瓊脂糖凝膠孔徑大小不同，在外加電場的作用下DNA由負(fù)極向正極移動，分子量小的移動快而分子量大的移動慢，最終達到不同分子量大小的DNA分離的目的。

三、主要儀器及試材

水浴鍋、離心機、移液槍、研缽、離心管、核酸電泳系統(tǒng)等；新鮮健康植物葉片，液氮、及DNA提取有關(guān)試劑。

四、實驗方法與步驟 1.藥品的配制: CTAB提取液：

(1)100 mM Tris-HCl(PH 8.0)，1.5 M NaCl，50 mM EDTA(PH 8.0)(2)1% PVP，2% CTAB(3)取少許(1)加到(2)中，攪拌成糊狀,后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解備用。使用前要在65℃溫浴一會兒，然后加入1-4%巰基乙醇，混均勻。苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）：

重蒸酚65℃水浴溶解，在燒杯中加入80ml溫?zé)岬恼麴s水，加入少許8-羥基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：異戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力攪拌器上攪拌1.5 h左右至停止攪拌后很快分層，然后裝入棕色瓶中，4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?.DNA的粗提

在裝有葉片的離心管中加入石英砂少許（約0.07克），用尖頭玻棒將材料研細(xì)后加入600 ul CTAB提取液，再繼續(xù)研磨一會兒使其懸浮均勻，然后在65℃水浴鍋中溫浴60分鐘，隔15分鐘取出上下輕輕顛倒幾次，水浴之后，加入500 ul苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下晃動10分鐘以上，其間置于37℃水浴鍋中溫浴一會（冬季），使之充分混勻，然后10000-12000 rpm離心5-10分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20℃冰凍無水乙醇1 ml，輕輕顛倒數(shù)次，混合均勻后冰凍30分鐘沉淀DNA，然后8000-10000 rpm離心5分鐘，棄上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小時或過夜，8000 rpm離心5分鐘,棄酒精之后在工作臺上風(fēng)干DNA，注意不要過干，否則會使以后溶解困難。3.DNA的純化：

向風(fēng)干后的DNA中加入500 ul 1×TE，37℃水浴15-30分鐘至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小時，然后加入700 μl苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下顛倒離心管約10分鐘，至充分混勻，10000-12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入700 μl氯仿：異戊醇（24：1），顛倒10分鐘（方法同上），10000 –12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入60 μl 5M NaCl，再加入1 ml冷凍的無水乙醇，輕輕顛倒，然后在-20℃冰箱中置30分鐘沉淀DNA，8000-10000 rpm離心2-3分鐘，使DNA分散狀緊貼在管壁上，棄酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小時后換一次，后浸泡過夜，8000 rpm離心3分鐘后棄酒精，風(fēng)干，加50-100 μl TE充分溶解備用。

4、DNA檢測

（1）取DNA原液15 μl稀釋至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度計測定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值。高質(zhì)量的DNA要求：A260/A230>2.0； 1.7

（3）向一定量的DNA中加入限制性內(nèi)切酶EcoR I至4-5 U/μg DNA，37℃消化過夜，用0.5×TBE，0.8%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳3 h進行檢測。

五、實驗注意事項

1、實驗中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危險或有毒物質(zhì)，操作時要戴手套，并在專門區(qū)域操作。

2、DAN電泳時只能由負(fù)極到正極，電泳時要注意電極是否正確。

六、思考題

簡述DAN提取的步驟及主要試劑的作用。

主要參考文獻

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。實驗四 質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測

一、實驗?zāi)康?/p>

質(zhì)粒是攜帶外源基因進入細(xì)菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取時最常用、最基本的實驗技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例介紹質(zhì)粒的抽提過程，應(yīng)掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。

二、實驗原理 在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒DNA。

三、主要儀器及試材

含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機、移液槍、離心管及質(zhì)粒DNA提取有關(guān)試劑。

液氮、及DNA提取有關(guān)試劑。

四、實驗方法與步驟

（一）試劑配制:

1、LB培養(yǎng)基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高壓滅菌15min，室溫貯存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時配制。

7、溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

9、苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

12、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于-20℃。14、6×loading buffer（上樣緩沖液）:0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%瓊脂糖凝膠:稱取1g瓊脂糖與三角燒瓶中，加100ml 1×TBE，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5ug/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1×TBE），即可上樣。

（二）實驗步驟

1、取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過夜培養(yǎng)。

2、用無菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床-250r/min過夜培養(yǎng)。

3、吸取1.5ml菌液，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。

4、加入200ul預(yù)冷的溶液I，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底混勻沉淀或碎塊）。

5、加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

6、加入300ul預(yù)冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見白色絮狀沉淀，置于冰上3-5min，使雜質(zhì)充分沉淀（溶液III為中和液，此時質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇或2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g ×15min。

8、倒盡上清，加75%乙醇浸洗沉淀除鹽1-2次，4℃離心 10000g×10min，棄上清，將沉淀在室溫或超凈工作臺上風(fēng)干。

9、將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10、取制備的質(zhì)粒DNA 1-2ul，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣，1%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳1h進行檢測。

五、實驗注意事項

1、實驗中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質(zhì)，操作時應(yīng)注意防護，盡量減少臺面污染。

2、DAN電泳時只能由負(fù)極到正極，電泳時要注意電極是否正確。

3、質(zhì)粒電泳檢測一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。

六、思考題

簡述質(zhì)粒DAN提取的步驟。

主要參考文獻

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。

實驗五 PCR技術(shù)

一、實驗?zāi)康?/p>

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中常用技術(shù)之一。PCR具有反應(yīng)快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。通過本實驗應(yīng)掌握PCR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過程。

二、實驗原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環(huán)境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為變性、退火、延伸三步，經(jīng)過一定的循環(huán)，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量擴增。

三、主要儀器及試材

含有外源cDNA片段的質(zhì)粒或轉(zhuǎn)基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關(guān)試劑。

四、實驗方法與步驟

1、調(diào)整模板濃度至5ng/ul。

2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、檢測：加2ul溴酚藍(lán)，混勻，短暫離心，取15ul反應(yīng)產(chǎn)物點樣電泳

5、在1%瓊脂糖凝膠上點樣電泳；EB染色，紫外觀察。

五、實驗注意事項

1、引物設(shè)計應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計軟件進行引物設(shè)計；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；

2、PCR反應(yīng)的各種成分不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；

3、根據(jù)引物的Tm值和擴增片段長度以及PCR儀的特性來設(shè)定PCR循環(huán)條件；

4、注意分析電泳檢測PCR產(chǎn)物時出現(xiàn)拖帶或非特異性擴增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

六、思考題

簡述PCR技術(shù)的原理和步驟。

主要參考文獻

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料

實驗六 PCR產(chǎn)物的TA克隆

一、實驗?zāi)康?/p>

采用同源序列法克隆特定基因或DNA片段是果樹上常用的分子克隆方法。相對于粘性末端來說，克隆具有平末端的雙鏈PCR產(chǎn)物效率較低。目前，有兩種方法可以采用，一種是在特異引物設(shè)計時引入酶切位點，另一種是TA克隆。通過本實驗應(yīng)掌握PCR產(chǎn)物TA克隆的原理，學(xué)習(xí)PCR產(chǎn)物純化及回收，以及PCR產(chǎn)物與TA克隆載體的連接。

二、實驗原理

TA克隆是利用耐熱聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，而不具有3’一5’外切酶的校準(zhǔn)活性，即在PCR產(chǎn)物的兩個3’末端加上未配對的單一A凸出尾，質(zhì)粒載體提供線性3’末端單一的T凸出尾，使該載體能夠直接與PCR產(chǎn)物高效連接。TA克隆技術(shù)比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。

三、主要儀器及試材

PCR擴增產(chǎn)物、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Promega公司）、pMD18-T載體（TaKaRa公司）以及感受態(tài)大腸桿菌、高速冷凍離心機、移液槍、瓊脂糖凝膠電泳等相關(guān)儀器及試劑。

四、實驗方法與步驟

1、PCR擴增片段純化回收

將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，割膠，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒收集PCR擴增產(chǎn)物，具體操作步驟參考試劑盒說明書進行。

2、連接反應(yīng) 反應(yīng)體系組成

pMD18-T

0.5-1.0 ul PCR fragment

1.0-4.5 ul ddH2O

0-3.0 ul Ligation Solution I

5.0 ul 混合后，置于室溫下放置數(shù)小時或過夜連接。

3、重組子轉(zhuǎn)化（熱激法）

1）在含適當(dāng)濃度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul x-gal（20mg/ml），然后暗置30 min以上；

2）冰上冷凍新滅菌的1.5 ml 離心管； 3）取出感受態(tài)大腸桿菌，冰上放置凍融；

4）取新滅菌的1.5 ml 離心管，加入50 ul感受態(tài)細(xì)胞和10 ul連接反應(yīng)液，用移液槍輕輕吸打均勻，在冰上放置30 min；

5）熱激：將離心管在42 ℃下水浴90秒鐘。請勿搖動離心管； 6）冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，1-2分鐘；

7）復(fù)蘇：每管加400 ul液體LB培養(yǎng)基，在37 ℃搖床溫和搖動45 min-60 min； 8）涂皿：取150 ul均勻涂布于“1）”已制備好的LB平板上；

9）培養(yǎng)：在37 ℃下倒置培養(yǎng)12-16 h，即可觀察到藍(lán)白相間的菌落。白色菌落為含有外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，藍(lán)色是載體自連的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子可以在4 ℃下保持1個月；

10）單菌落培養(yǎng)：用滅菌的牙簽，挑選白色的單菌落到盛有含50 mg/ml Ampicillin的5 ml液體LB培養(yǎng)基的50 ml離心管中，在37 ℃搖床上培養(yǎng)過夜（12-16 h）。

4、質(zhì)粒DNA的分離 參考有關(guān)文獻。

5、檢測

采用相同的引物對進行PCR再擴增，或質(zhì)粒上根據(jù)插入片段兩端的酶切位點而進行限制性酶切，通過電泳可以檢測出片段是否克隆成功。

五、實驗注意事項

1、連接溫度不宜太高，連接溫度過高（>28℃）可使背景增加，使重組克隆菌減少。降低連接溫度可以提高白斑率；

2、熱激過程注意勿搖動離心管。

六、思考題

簡述PCR產(chǎn)物TA克隆的原理和步驟。

主要參考文獻

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料。

第五篇：生物技術(shù)實習(xí)心得體會

本科認(rèn)識實習(xí)總結(jié)

實習(xí)時 間：

實習(xí)地 點： 廣東省汕尾市遮浪鎮(zhèn) 學(xué) 生 姓 名：

院 系： 生物學(xué)院

專 業(yè) 班 級：

指 導(dǎo) 教 師： 2012年6月28日

首先要感謝李杜院長能夠給予我們2010級全體師生這次令人終身難忘的海濱動植物實習(xí)機會；其次感謝各位帶隊老師行程中為我們的操勞以及實習(xí)間傳授給我們的知識。

一、實習(xí)時間：

2012.06.16-2012.06.23

二、實習(xí)地點：

廣東省汕尾市遮浪鎮(zhèn)沙灘、泥石灘和石礫灘；汕尾濕地；廣東省廣州市華南植物園。

三、實習(xí)目標(biāo)：

1、通過實習(xí)，鞏固和提高課堂所學(xué)的知識，進一步培養(yǎng)學(xué)生的獨立工作能力。

2、學(xué)習(xí)用正確的思維方法觀察和研究動物。

3、初步掌握動物的采集。培養(yǎng)、麻醉、鞏固、保存、標(biāo)本制作等一系列的基本操作方法。

4、通過實習(xí)了解動植物學(xué)在生產(chǎn)中的應(yīng)用級在教學(xué)科研領(lǐng)域的重要性，進而鞏固專業(yè)思想。

四、實習(xí)過程：

期末考試前期，唐老師電話跟我說本次夏季學(xué)期實習(xí)由湖南衡山植物認(rèn)知實習(xí)改為廣東汕尾遮浪鎮(zhèn)海濱實習(xí)，大家興奮不已，對于期末考試更加有動力，更加期待此次實習(xí)之旅。

期末考完后期，大家都忙于籌備實習(xí)的物品，泳衣、泳褲、泳鏡、墨鏡、沙灘褲、沙灘鞋等等。大家準(zhǔn)備得都非常完善，期待出發(fā)的那一刻。

出發(fā)之時，每位同學(xué)提著大包小包在天馬停車場集合座大巴出發(fā)前往長沙火車站。

整理行李篇心得：帶好充電器、插排（賓館電源插口一般是不夠用的）、衣架（賓館的衣架也少之甚少）、蚊香液、花露水（野外防蟲室內(nèi)驅(qū)蚊必備之選）、防曬霜、防曬服（不然皮膚一定會變黑脫皮的）、人字拖（洞洞鞋鞋里進沙子出不來）、火車篇等個人證件。

組織站隊篇心得：每一個即將行動的點都要集合一次清點人數(shù)，排隊行走時

女生在前男生在后，負(fù)責(zé)人在整個隊伍的兩極。要有時間觀念，集體集合要提前五到十分鐘站好，每人遲到一分鐘，就等于浪費了大家每人一分鐘。

火車前往篇心得：準(zhǔn)備好一切可以充實時間的東西，mp3、mp4、mp5、三國殺、紙牌等，并注意防盜，貴重物品不要拿出來。

由于是硬座，大家一晚休息得不是很好，一個個蓬頭垢面，無精打采，在廣州火車站下車無過多的停留，直接沿地下通道直徑走到廣州到汕尾遮浪鎮(zhèn)的大巴上，3個小時的路程，車上鴉雀無聲全部在補覺。

大巴車上的心得：其實沿途的風(fēng)景很美，我認(rèn)為旅行的重要是欣賞前行中路邊白變的風(fēng)景而不是終點目的地的拍照留念。一片片農(nóng)民開墾的莊稼地，結(jié)滿荔枝的果園，村莊古樸的建筑，烏云的邊際一邊下雨一邊晴天。等到了得勝賓館，我完全被周圍的風(fēng)景所吸引，窗外就是波濤洶涌的大海，金黃刺眼的沙灘，深吸一口氣，可以感覺到海水的腥味，周圍大片的棕櫚科植物長得十分的健碩。

巖石灘是由巖石組成的海灘。在海灣內(nèi)的巖石灘，滿潮時被水侵沒，低潮時成陸地環(huán)境，在大小礁石上、礁石之間的巖池里、在石礪間、石礪下得沙層中生活著各種動物。

泥沙灘由沙組成的海灘，棲息動物種類、數(shù)量稀少，幾乎是生物學(xué)的荒漠。泥沙灘常生活著感覺靈敏、行動迅速的沙蟹。潮間帶平坦，而且延伸很遠(yuǎn)。

五、實習(xí)成果：

經(jīng)過四天的努力，我們小組一共采了32種動物標(biāo)本、27種植物標(biāo)本。以下是動物類： 海蟑螂，節(jié)肢動物門，節(jié)肢動物門。身體平扁，呈長橢圓形，體長一般為30～45毫米。身體背面為棕褐色或黃褐色，中間色淺，身體表面具顆粒。頭部短小，前緣為半圓形。復(fù)眼很大，無柄，在頭部兩側(cè)。

石鱉（拉丁文名acanthochitonseuischnochilon）屬于多板綱中原始類型的貝類，它們的顏色和巖石一樣，形狀有點像陸地上的潮蟲。通常呈卵圓形，扁平，兩側(cè)對稱。貝殼由8塊殼板覆瓦狀排列而組成。貝殼周圍有一圈外套膜，又稱環(huán)帶。足扁而寬，幾占整個身體腹面，適于吸附在巖石表面或匍匐爬行。是海洋浮游生物重要組成之一。1、2、3、習(xí)見赤蛙螺，蛙螺科。節(jié)蠑螺，蠑螺科。方斑東鳳螺，蛾螺科。4、5、6、脈紅螺，骨螺科。節(jié)織紋螺，織紋螺科。西格織紋螺，織紋螺科。7、8、9、海老鼠，黃口荔枝螺，骨螺科。親近馬蹄螺，馬蹄螺科。10、11、12、黑凹螺，馬蹄螺科。褶條馬蹄螺，馬蹄螺科。鋸齒巴非蛤，簾蛤科。13、14、15、波紋巴非蛤，簾蛤科。理紋哥特蛤，簾蛤科。麗文蛤，簾蛤科。16、17、18、魁蚶，蚶科。聯(lián)珠蚶，蚶科。阿文綬貝，寶貝科。19、20、21、玉螺，玉螺科。梨形乳玉螺，玉螺科。棒錐螺，錐螺科。22、23、24、海膽 青蛤，簾蛤科。皺紋盤鮑，鮑科。25、26、27、雜色鮑，鮑科。龜足，甲殼綱。雞爪擬帽貝，笠貝科。28、29、30、硨磲科。翡翠貽貝，貽貝科。條紋隔貽貝，貽貝科。