第一篇：DH5α感受肽細胞制備

感受態(tài)細胞的制備

一、實驗試劑及材料 1.AMP－ LB液體培養(yǎng)基

2.0.1M CaCL2溶液； 3.AMP+固體培養(yǎng)板

4.DH5α大腸桿菌；

5.10ml玻璃試管、牙簽、5ml刻度吸管、1.5ml離心管、150ml三角燒瓶均需高壓滅菌； 6.20μl槍頭、200μl槍頭、1000μl槍頭及加樣器（法國Gilson公司）。

二、實驗設(shè)備 1.YJ-875醫(yī)用凈化工作臺

2.CF16RX低溫高速離心機

3.HH.B11-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.BCD-216KF冰箱

5.CHB-100恒溫金屬浴

三、實驗方法

(一)DH5α大腸桿菌活化（注意無菌操作）1.實驗前30分鐘紫外消毒凈化工作臺。2.取兩只高壓過的10ml玻璃試管，向其中各加入3ml AMP-LB液體培養(yǎng)基。3.用無菌牙簽挑取少量凍存DH5α大腸桿菌菌液，加入到試管中。4.將試管固定于37℃預(yù)熱的空氣浴振蕩器中，200-250轉(zhuǎn)∕分，過夜振蕩培養(yǎng)。(二)DH5α大腸桿菌增殖（注意無菌操作）5.實驗前30分鐘紫外消毒凈化工作臺。6.取20ml AMP-LB液體培養(yǎng)基（根據(jù)所要制備的感受態(tài)的量確定AMP-LB液體培養(yǎng)基的體積）加入到150ml三角燒瓶中。7.取200μlDH5α大腸桿菌（與AMP-LB液體培養(yǎng)基的體積比為1:1000）菌液加入到三角燒瓶中。

8.將三角燒瓶固定于37℃預(yù)熱的空氣浴振蕩器中，200轉(zhuǎn)∕分，振蕩培養(yǎng)至菌液呈現(xiàn)均勻細沙狀。（約1-1.5小時）

(三)（大量或小量）制備感受態(tài)細胞

100X100μl感受態(tài)

15.實驗前30分鐘紫外消毒凈化工作臺。制冰

1kg。

16.取1.5ml

（二）中的DH5α大腸桿菌菌液加

入到1.5ml離心管，根據(jù)實驗具體要求確定管數(shù)。

17.4℃ 4000g 離心10分鐘。

18.棄上清，向各1.5ml離心管中加入冰預(yù)冷的0.1M CaCL2溶液500μl，混勻后置于冰上10分鐘。

19.4℃ 4000g 離心10分鐘。

20.棄上清，向各1.5ml離心管中加入冰預(yù)冷的0.1M CaCL2溶液100μl，混勻后置于4℃冰箱內(nèi)備用。

第二篇：代謝物及細胞感受代謝物異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展

“代謝物及細胞感受代謝物異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展”重大項目指南

細胞代謝的改變是腫瘤的重要特征之一。大量研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞發(fā)生了代謝重編程，并且對腫瘤代謝的認(rèn)識已經(jīng)不再局限于糖酵解和三羧酸循環(huán)的改變，諸多代謝通路包括脂肪酸代謝、膽固醇代謝、谷氨酰胺代謝、絲氨酸代謝、一碳單位代謝、膽堿代謝等，在腫瘤細胞中均發(fā)生了重編程變化。隨著腫瘤生物學(xué)研究的不斷深入，細胞代謝異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究已成為活躍的國際學(xué)術(shù)前沿，細胞代謝異常先于腫瘤發(fā)生的理論也逐步在研究中得到了證實。近年來，研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖缺乏可促進KRAS野生型的細胞獲得KRAS及其信號通路分子的突變，首次證明細胞代謝異常可以導(dǎo)致原癌基因突變。2-HG競爭性抑制多種α-KG依賴的雙加氧酶活性（如：介導(dǎo)DNA氧化去甲基化的Tet雙加氧酶），以及其他表觀遺傳調(diào)控相關(guān)的酶（如：組蛋白去甲基化酶）等，從而影響表觀遺傳調(diào)控，啟動腫瘤的發(fā)生、影響腫瘤的進展。這些研究發(fā)現(xiàn)提供了代謝改變可以促進腫瘤發(fā)生的直接證據(jù)，而且其調(diào)控的關(guān)鍵節(jié)點也正在成為腫瘤診斷和治療中潛在的靶點。基于腫瘤代謝改變的研究成果，將為腫瘤的分子診斷、精確分型、預(yù)后分析、靶向治療和藥物反應(yīng)性等提供重要的理論指導(dǎo)。

腫瘤代謝改變與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系涉及復(fù)雜的生物學(xué)過程和多種分子機制，而代謝物及細胞感受代謝物異常在其中的作用日益受到關(guān)注。例如:代謝產(chǎn)物乳酸可以直接增加某些蛋白的穩(wěn)定性，從而促進細胞增殖和血管新生；腫瘤細胞能感受環(huán)境代謝物變化，增加腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的合成；腫瘤細胞還能調(diào)整自身的能量感受通路，增強對代謝壓力的適應(yīng)，提高在低營養(yǎng)狀態(tài)下的存活率，是腫瘤產(chǎn)生抗藥性的因素之一。此外，腫瘤細胞還通過與免疫細胞競爭營養(yǎng)，而抑制抗腫瘤免疫，如：腫瘤細胞糖酵解增高可以引起腫瘤微環(huán)境中T細胞營養(yǎng)不良，抑制T細胞腫瘤免疫；調(diào)控膽固醇代謝途徑可提高腫瘤特異的細胞毒T細胞的活性，增強抗腫瘤細胞免疫。腫瘤代謝研究的領(lǐng)域已進一步擴展到腫瘤微環(huán)境，以及對腫瘤免疫的影響。因此，發(fā)現(xiàn)代謝物異常、了解細胞如何感受代謝物異常、代謝異常對細胞的惡性轉(zhuǎn)化作用以及對腫瘤免疫微環(huán)境的改造等是重要的前沿科學(xué)問題，闡明其內(nèi)在的分子機制將為腫瘤預(yù)防、早期診斷和治療提供新思路。

本立項擬以發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生相關(guān)的代謝物為切入點，研究重要代謝物異常在細胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及其分子機制；明確細胞感受代謝物失調(diào)的機制及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義；探索代謝異常對腫瘤微環(huán)境的改造及其生物學(xué)效應(yīng)和機制。從而闡釋代謝異常在腫瘤細胞及其微環(huán)境的基因表達與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用和地位，深入理解代謝物（或包括相關(guān)代謝酶）和細胞感受代謝物失調(diào)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能與機制，為臨床轉(zhuǎn)化提供新的診斷靶標(biāo)與治療靶點。本項目的實施對促進代謝生物學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)與腫瘤學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究的學(xué)科交叉，具有重要的意義。

一、科學(xué)目標(biāo)

以我國常見高發(fā)的1-2種腫瘤為模型，發(fā)現(xiàn)一批在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有明確調(diào)控作用的重要代謝物，研究這些代謝物異常在細胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及其機制,確定代謝物和細胞相互作用失調(diào)在腫瘤發(fā)生中的作用與機制，解析代謝物對腫瘤細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因表達的調(diào)控功能，闡明代謝異常對腫瘤微環(huán)境的改造及其生物學(xué)效應(yīng)，建立適于轉(zhuǎn)化研究的代謝物體外及體內(nèi)研究的實驗平臺，發(fā)現(xiàn)可能用于腫瘤臨床診斷的代謝物分子標(biāo)記物，鑒定可能具有腫瘤臨床治療前景的代謝物分子靶標(biāo)。

二、研究內(nèi)容

選擇我國常見高發(fā)的1-2種腫瘤為模型，開展如下四方面的研究：

（一）腫瘤相關(guān)代謝物的發(fā)現(xiàn)：采用高通量代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)等檢測手段，發(fā)現(xiàn)、篩選和鑒定一批與腫瘤表型特征密切相關(guān)的代謝物；運用細胞模型、荷瘤小鼠及轉(zhuǎn)基因小鼠等動物模型，證實其體內(nèi)外對正常細胞的惡性轉(zhuǎn)化作用。

（二）代謝物誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化的機制：建立適于轉(zhuǎn)化研究的代謝物體外及體內(nèi)研究的實驗平臺，研究前期驗證的腫瘤相關(guān)異常代謝物誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化的機制，包括表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯后修飾以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。

（三）腫瘤細胞感受代謝物的調(diào)控：綜合運用生物化學(xué)、細胞生物學(xué)及分子生物學(xué)等方法，鑒定腫瘤細胞感受特定代謝物的受體，解析腫瘤細胞感受細胞內(nèi)外代謝物的通路變化及其對代謝活動的影響，以及在不同營養(yǎng)狀態(tài)下，腫瘤細胞感受代謝物相關(guān)通路的調(diào)控作用。

（四）代謝異常對腫瘤微環(huán)境的改造及其生物學(xué)效應(yīng)：研究代謝異常（代謝物或相關(guān)代謝酶變化）對腫瘤微環(huán)境的影響，特別是對微環(huán)境炎癥細胞、腫瘤相關(guān)免疫細胞的募集、激活和功能的調(diào)控，闡明代謝異常對腫瘤微環(huán)境的改造作用、其產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)和對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響。

三、申請注意事項

（一）本重大項目要求針對上述四部分研究內(nèi)容，分別設(shè)置4個課題。

（二）申請書的附注說明選擇“代謝物及細胞感受代謝物異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展”（以上選擇不準(zhǔn)確或未選擇的項目申請將不予受理）。

（三）申請人申請的直接費用預(yù)算不得超過1530萬元/項（含1530萬元/項）。

（四）本項目由醫(yī)學(xué)科學(xué)部、生命科學(xué)部和化學(xué)科學(xué)部聯(lián)合提出，由醫(yī)學(xué)科學(xué)部負責(zé)受理。

第三篇：在細胞苗生產(chǎn)中使用培養(yǎng)基的幾點感受

在細胞苗生產(chǎn)中使用培養(yǎng)基的幾點感受

山西

宋寶敏

生物制品的生產(chǎn)離不開細胞培養(yǎng), 細胞培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)的重要因素。目前，國內(nèi)尚沒有關(guān)于細胞培養(yǎng)基生產(chǎn)的國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)執(zhí)行各自的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，細胞培養(yǎng)基生產(chǎn)的質(zhì)量管理存在較大差別。有一個系統(tǒng)全面的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，可以相對統(tǒng)一培養(yǎng)基質(zhì)量。

多數(shù)細胞的培養(yǎng)采用合成培養(yǎng)基，而且還需要在合成培養(yǎng)基中添加一定量的血清來支持細胞的生長增殖。培養(yǎng)基和血清這兩個原輔材料的質(zhì)量直接關(guān)系到產(chǎn)品的質(zhì)量。

我們企業(yè)生產(chǎn)所使用的細胞培養(yǎng)基大多為MEM或DMEM合成培養(yǎng)基，添加一定比例的血清來進行。在生產(chǎn)過程中，毒種和細胞的種類不變，生產(chǎn)的過程是按 GMP的要求進行檢查評定的，這兩個環(huán)節(jié)相對于產(chǎn)品的影響相對小，但細胞培養(yǎng)基更換批號或更換廠家，血清批次間的差異經(jīng)常出現(xiàn)影響細胞生長的情況。這兩樣原輔料使用將要結(jié)束時車間就要求采供部購買同廠家、同批次的培養(yǎng)基及血清（在有效期內(nèi)），否則必須先提供小樣來先試驗。這樣不僅給采供帶來購買難度，而且采購周期會很長，同時一個“換批次會影響質(zhì)量”的信息潛在操作人員的意識里，即使同廠家的培養(yǎng)基經(jīng)驗證對細胞生長幾乎沒影響，由于潛意識往往造成細胞培養(yǎng)過程中總感覺不如原來使用的批次，要經(jīng)過一段時間的使用才能轉(zhuǎn)過來。

在實際生產(chǎn)時，因培養(yǎng)基相對容易購買，所以基本在開產(chǎn)前根據(jù)生產(chǎn)計劃把一個周期的量基本備足。而血清則不同，每批可能適合某些細胞系，一旦準(zhǔn)備更換批號，更不用說更換廠家了，必須做連續(xù)三到五批的生長試驗，通過細胞的生長情況和細胞數(shù)選定血清批次。此處有一更換批號后細胞數(shù)對比數(shù)據(jù)(恕不寫明廠家）。兩個批號A和B

4三次試驗的細胞數(shù)，A批號血清對應(yīng)細胞數(shù)為（1）207×10（2)189×104（3）203×104

B批號血清對應(yīng)細胞數(shù)為（1）197×104（2)181×104（3）192×104。

血清因為價格貴等原因總得在一個周期內(nèi)至少換兩個批號。另一個因素是在加血清的培養(yǎng)基采用微孔濾膜過濾除菌時經(jīng)常出現(xiàn)濾器被雜質(zhì)堵塞的情況，這時就需要有備用濾器，同時容易污染。不僅如此好多資料表明血清的添加有好多缺點：

1、血清都是批量生產(chǎn)，各批之間差異很大；

2、血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶、補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡；

3、血清的使用使得實驗和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成；

4、血清質(zhì)量問題還會對接種病毒以及毒價產(chǎn)生影響，例產(chǎn)毒少，毒價低；

5、血清內(nèi)含有雜質(zhì)等等說法不一。

鑒于上述使用情況，看來培養(yǎng)基的生產(chǎn)有必要有一個統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和控制方法。尤其是細胞培養(yǎng)基的生產(chǎn)，不僅要有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和控制方法，更要不斷有新的培養(yǎng)基產(chǎn)品的推出，好多廠家日益重視對無血清培養(yǎng)基的研發(fā)，這是一個有重大意義的工作，在原有培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加成分明確或部分明確的血清替成分。疫苗生產(chǎn)企業(yè)期待新型無血清培養(yǎng)基的上市，無血清培養(yǎng)基可以避免血清的批間質(zhì)量變動對細胞生長的影響，可以降低企業(yè)的實驗成本、儲存成本損耗及采供難度；還可以提高產(chǎn)品的表達水品易于細胞純化，在操作過程中易于滅菌。但同時企業(yè)更關(guān)注這種產(chǎn)品的質(zhì)量，這樣就又提到對培養(yǎng)基的生產(chǎn)企業(yè)有一國家的統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和控制方法，并附帶培養(yǎng)基使用的統(tǒng)一的SOP。使用這樣的原輔料的企業(yè)，企業(yè)的產(chǎn)品才更容易均

一、穩(wěn)定、質(zhì)量可控。

第四篇：DF-1雞胚成纖維傳代細胞的染色體制備及核型分析、致瘤性試驗研究方案

DF-1雞胚成纖維傳代細胞的染色體制備及核型分析、致瘤性試驗研究方案

材料與方法 細胞 DF-1細胞、CEF細胞、Hela細胞。裸鼠 2月齡（或體重18～22g）、或乳鼠（3~5日齡）、或小鼠（8~10g）。細胞營養(yǎng)液 細胞生長液為無血清培養(yǎng)基。細胞染色體制備和核型分析

4.1 染色體標(biāo)本制備 按常規(guī)方法分別將DF1細胞進行秋水仙素處理、細胞消化與低滲處理、細胞固定與在固定、滴片與染色。

4.2 染色體特征及數(shù)目、細胞核型分析 取有絲分裂中期的細胞進行姬母薩染色檢查，（總共需要150個視野的圖片）。細胞致瘤性試驗

5.1 細胞樣品的制備 按常規(guī)方法制備好DF-1細胞。

5.2 陽性對照細胞 將Hela細胞經(jīng)胰酶消化分散，離心收集細胞。制成含活細胞數(shù)約106cells/0.2ml的細胞懸液。

5.3 陰性對照細胞 按常規(guī)方法制備的雞胚成纖維細胞（CEF），制成含活細胞數(shù)約107cells/0.2ml的細胞懸液。

5.4 致瘤性試驗

5.4.1和5.4.2任選其一。

5.4.1 將細胞樣品分別皮下注射裸鼠30只，每只107 cells /0.2ml細胞。

5.4.2 取3~5日齡乳鼠或8~10g小鼠，用抗胸腺血清處理后，將細胞樣品分別皮下接種18只，每只107 cells /0.2ml細胞。

5.4.3 陽性對照 每只裸鼠皮下或肌肉注射106 cells /0.2ml，共注射5只裸鼠，為陽性對照。（如以乳鼠或小鼠試驗，注射劑量不變，數(shù)量為3只）。

5.4.4 陰性對照：每只裸鼠皮下注射107 cells /0.2ml，共注5只裸鼠，為陰性對照。（如以乳鼠或小鼠試驗，注射劑量不變，數(shù)量為3只）。

5.5 實驗動物檢查及處理

5.5.1 逐日觀察至14日，檢查有無結(jié)節(jié)或腫瘤形成。如有結(jié)節(jié)或可疑病灶，應(yīng)在觀察至少7～14日后剖檢，進行病理組織學(xué)檢查。

5.5.2 未發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)的動物，對其中的一半動物觀察21日后剖檢，另外一半動物觀察12周后剖檢，觀察各個淋巴結(jié)核器官中是否形成結(jié)節(jié)，如有懷疑，應(yīng)進行病理組織學(xué)檢查。不應(yīng)有移植瘤形成。

5.5.3 陽性對照組觀察21日后，應(yīng)出現(xiàn)明顯的腫瘤。

5.5.4 陰性對照組觀察21日，應(yīng)為陰性。

試驗要求提供以上的圖片