第一篇：考馬斯亮藍(lán)R250染色法觀察細(xì)胞骨架

考馬斯亮藍(lán)R250染色法觀察細(xì)胞骨架

高熹 1120152430（李安一）

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院16121501班）

摘要：狹義的細(xì)胞骨架概念是指真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系微管、微絲及中間纖維組成的體系?？捡R斯亮藍(lán)R250是通過范德瓦爾鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合的一種物質(zhì)，用于微量蛋白質(zhì)染色。該實(shí)驗(yàn)通過植物和動物細(xì)胞的細(xì)胞骨架染色，觀察細(xì)胞骨架，使我們掌握了動植物細(xì)胞內(nèi)微絲的染色方法。關(guān)鍵詞：細(xì)胞骨架；考馬斯亮藍(lán)；微絲；染色；實(shí)驗(yàn) 引言

由微管、微絲和中間絲所組成的蛋白纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)體系稱為“細(xì)胞骨架系統(tǒng)”，與細(xì)胞內(nèi)的遺傳系統(tǒng)、生物膜系統(tǒng)、并稱“細(xì)胞內(nèi)的三大系統(tǒng)”。是真核細(xì)胞借以維持其基本形態(tài)的重要結(jié)構(gòu)，被形象地稱為細(xì)胞骨架，它通常也被認(rèn)為是廣義上細(xì)胞器的一種。廣義的細(xì)胞骨架概念是細(xì)胞核骨架、細(xì)胞質(zhì)骨架、細(xì)胞膜骨架和胞外基質(zhì)所形成的網(wǎng)絡(luò)體系。核骨架、核纖層與中間纖維在結(jié)構(gòu)上相互連接，貫穿于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的網(wǎng)架體系。細(xì)胞骨架是指真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)較晚，主要是因?yàn)橐话汶婄R制樣采用低溫（0-4℃）固定，而細(xì)胞骨架會在低溫下解聚。直到20世紀(jì)60年代后，采用戊二醛常溫固定，才逐漸認(rèn)識到細(xì)胞骨架的客觀存在。真核細(xì)胞借以維持其基本形態(tài)的重要結(jié)構(gòu)，被形象地稱為細(xì)胞骨架，它通常也被認(rèn)為是廣義上細(xì)胞器的一種。細(xì)胞骨架不僅在維持細(xì)胞形態(tài)，承受外力、保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性方面起重要作用，而且還參與許多重要的生命活動，如：在細(xì)胞分裂中細(xì)胞骨架牽引染色體分離，在細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸中，各類小泡和細(xì)胞器可沿著細(xì)胞骨架定向轉(zhuǎn)運(yùn)；在肌肉細(xì)胞中，細(xì)胞骨架和它的結(jié)合蛋白組成動力系統(tǒng)；在白細(xì)胞(白血球)的遷移、精子的游動、神經(jīng)細(xì)胞軸突和樹突的伸展等方面都與細(xì)胞骨架有關(guān)。另外，在植物細(xì)胞中細(xì)胞骨架指導(dǎo)細(xì)胞壁的合成。

微絲普遍存在于所有真核細(xì)胞中，是一個(gè)實(shí)心狀的纖維，直徑為4nm-7nm一般細(xì)胞中含量約占細(xì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)的1%-2%，但在活動較強(qiáng)的細(xì)胞中可占20%-30%。在一般細(xì)胞主要分布于細(xì)胞的表面，直接影響細(xì)胞的形狀。微絲具有多種功能，在不同細(xì)胞的表現(xiàn)不同，在肌細(xì)胞組成粗肌絲、細(xì)肌絲，可以收縮（收縮蛋白），在非肌細(xì)胞中主要起支撐作用、非肌性運(yùn)動和信息傳導(dǎo)作用。微絲主要由肌動蛋白構(gòu)成，和肌球蛋白一起作用，使細(xì)胞運(yùn)動。它們參與細(xì)胞的變形蟲運(yùn)動、植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)流動與肌肉細(xì)胞的收縮。微絲是雙股肌動蛋白絲以螺旋的形式組成的纖維，直徑為7納米，螺距為36納米，兩股肌動蛋白絲是同方向的。肌動蛋白纖維也是一種極性分子，具有兩個(gè)不同的末端，一個(gè)是正端，另一個(gè)是負(fù)端。微絲與它的結(jié)合蛋白以及肌球蛋白三者構(gòu)成化學(xué)機(jī)械系統(tǒng)，利用化學(xué)能產(chǎn)生機(jī)械運(yùn)動。由微絲形成的微絲束稱為應(yīng)力纖維，常橫貫于細(xì)胞長軸。脊椎動物肌動蛋白分為α、β和γ三種類型，α型分布于心肌和橫紋肌細(xì)胞中，α及γ型分布于平滑肌細(xì)胞中，β及γ型分布于非肌細(xì)胞中。聚合的及非聚合態(tài)的肌動蛋白能與其多種結(jié)合蛋白相互作用，這些結(jié)合蛋白對肌動蛋白的聚合及對微絲的穩(wěn)定、長度及分布具有調(diào)節(jié)作用?？捡R斯亮藍(lán)R-250是通過范德瓦爾鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，尤其適用于微量蛋白質(zhì)染色。它與不同蛋白質(zhì)結(jié)合呈現(xiàn)出基本相同的顏色，并且在比較寬的范圍內(nèi)（15—20g），掃描峰的面積與蛋白量呈線性關(guān)系。一般當(dāng)細(xì)胞充分鋪展時(shí)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色，可看到沿細(xì)胞長軸伸展的粗大纖維束，即應(yīng)力纖維。應(yīng)力纖維上還周期性地分布著微絲結(jié)合蛋白，包括-輔肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、類肌鈣蛋白等。應(yīng)力纖維的端部連接著質(zhì)膜上的粘著斑，與加強(qiáng)細(xì)胞對基質(zhì)的附著、鋪展及維持細(xì)胞特定形狀有關(guān)?？捡R斯亮藍(lán)R250可以染各種蛋白，并非特異染色微絲，實(shí)驗(yàn)中用1％Triton X－100抽提掉胞質(zhì)中除骨架蛋白外的其他蛋白，能清晰地顯示微絲束。實(shí)驗(yàn)器材及試劑

2.1 器材

光學(xué)顯微鏡、溫箱、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備、平皿、直徑30mm小染缸、載波片、蓋玻片條（剪掉一角以區(qū)別細(xì)胞正反面）。2.2 材料

體外培養(yǎng)的貼壁生長的HeLa細(xì)胞、洋蔥鱗莖。2.3 試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM、RPMI－1640等）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH7.4）、0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.3）、M－緩沖液、1％Triton X-100（用M－緩沖液配制）、0.2%考馬斯亮藍(lán)R250、3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制）。實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 HeLa細(xì)胞染色

（1）細(xì)胞培養(yǎng)在平皿中的蓋玻片上，尚未致密時(shí)即可使用。取出蓋玻片，用PBS洗3次。

（2）用1％Triton X-100處理25～30min，室溫或37度均可。（3）立即用M-緩沖液輕輕洗細(xì)胞3次。

（4）略晾干后，用3.0%戊二醛固定細(xì)胞5～15min。（5）PBS洗數(shù)次，濾紙吸干。

（6）用0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色1小時(shí)，然后用水小心沖洗，蒸餾水沖洗，空氣中略干燥。

（7）普通光學(xué)顯微鏡下用40×物鏡或油鏡觀察。3.2 植物細(xì)胞染色

（1）取洋蔥鱗莖表皮，大小約1cm2，放入盛有0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（6.8）的小燒杯中。

（2）吸去緩沖液，用1％Triton X-100處理洋蔥表皮20～30min。（3）除去Triton X-100，用M-緩沖液充分洗3次，每次約10min。（4）加3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制，pH6.8）固定0.5~1h。（5）用PBS洗3次，濾紙吸去殘液。（6）0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色30min。（7）蒸餾水洗數(shù)遍。將樣品置于載玻片上，加蓋玻片，光學(xué)顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 Hela細(xì)胞骨架染色圖

圖2 洋蔥鱗莖細(xì)胞骨架染色圖

結(jié)果分析

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，圖2洋蔥鱗莖細(xì)胞的細(xì)胞骨架染色較為成功，可以清楚地在圖中看到染成藍(lán)紫色的微絲細(xì)胞骨架。而Hela細(xì)胞骨架染色出現(xiàn)了一些問題，顯著觀察到的是細(xì)胞出現(xiàn)了破裂，造成細(xì)胞被染色的部分游離分散在了玻片上，由于分工不同，Hela是李安一同學(xué)做的，在與他交流后，分析可能是最后蒸餾水沖洗的時(shí)候操作不當(dāng)，可能造成了細(xì)胞的吸水脹破，引發(fā)了細(xì)胞骨架的游離的現(xiàn)象。而這種現(xiàn)象在班里很多組里都有出現(xiàn)，因此，這里考慮實(shí)驗(yàn)步驟的錯(cuò)誤，改進(jìn)方法為可以用緩沖液去洗滌脫色。實(shí)驗(yàn)反思

本次實(shí)驗(yàn)步驟無明顯錯(cuò)誤，最后部分結(jié)果不太好，在排除自身操作的同時(shí)，對實(shí)驗(yàn)步驟產(chǎn)生一定的質(zhì)疑，未來的實(shí)驗(yàn)不能按圖索驥，要勤于思考，對每一步加深了解并給出自己的見解。參考文獻(xiàn)

[1]趙孟蓮, 牛敏英, 范保榮,等.用考馬斯藍(lán)R250(Coomassie Blue R250)顯示人成纖維細(xì)胞內(nèi)微絲的觀察[J].解剖學(xué)報(bào), 1983(2).[2]劉宇煒, 文若劍, 向赟.熱療后Hela細(xì)胞微絲和形態(tài)改變關(guān)系的研究[J].江漢大學(xué)學(xué)報(bào)(社會科學(xué)版), 2003, 31(2):13-16.[3]王崇英, 高清祥.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].高等教育出版社, 2011.

第二篇：考馬斯亮藍(lán)染色總結(jié)

12.5％考馬斯亮藍(lán)染色液的配制（含30％甲醇，10％乙酸）考馬斯亮藍(lán)R250 0.125g 甲醇 30ml 冰乙酸 10ml 加ddH2O至 100ml 染膠1h~2h 脫色液配制（含30％甲醇，10％乙酸）甲醇 30ml 冰乙酸 10ml 加dd H2O至 100ml 注：1.染色液可回收利用；室溫保存即可；甲醇可以用乙醇代替。

2.其它脫色液：

（1）用水脫色，但效果非常不好，建議不要用。

（2）脫色液也可以用0.5％mol/l的氯化鈉，沒有氣味，脫色效果也不錯(cuò)。但膠可能會脹的厲害!（3）20%的甲醇和0.1M的tis-磷酸（PH6.5）

先用tis-磷酸（PH6。5）漂洗2min，然后用20%的甲醇漂洗1min（最好不要超過1min），最后用20%的NH4SO4固定30min 3.dd H2O煮法脫色

PAGE膠染色完畢后，如果用一般的甲醇－乙酸脫色液進(jìn)行脫色，一般至少需要2－3h，可利用蒸餾水煮的方法：（1）.先將500ml蒸餾水放在一個(gè)干凈的燒杯中，在電爐上煮沸。（2）.將染色好的膠用DD水沖凈后放入煮沸的蒸餾水中，煮3～5min。

（3）.將DD水倒掉，看膠是否已經(jīng)脫凈，如果還不好，可以用少量水再煮一次。一般整個(gè)脫色過程最多15min即可搞定！還可以避免每次脫色時(shí)的醋酸味！4.重復(fù)利用

（1）染色液和脫色液重復(fù)次數(shù)不一定的,可以根據(jù)他們的著染能力和脫色能力考慮是否換新的.夏季甲醇揮發(fā)快,用3~5次應(yīng)該可以用.當(dāng)然,用時(shí)要加蓋.（2）脫色時(shí)注意防止揮發(fā),脫色液可以用活性碳處理后反復(fù)用多次的.（3）脫色液反復(fù)使用，用兩三次后用活性炭“包被”的濾紙過濾，濾紙可反復(fù)使用。脫色液反復(fù)使用后，膠有點(diǎn)泛紅，但不影響觀察，如果要發(fā)表，建議用新配脫色液。

5.加快染色和脫色速度

（1）染色和脫色都可以在微波爐中加熱甚至煮沸，很省時(shí)間。但注意不要沸騰時(shí)間太長，否則容易把膠上煮出泡狀的破損。

（2）若為了提高考染及脫色速度，可在45℃左右的水浴中進(jìn)行，染色時(shí)間只需幾分鐘（其間輕輕晃動一二次，整個(gè)膠變?yōu)檩^深的亮蘭色即可）。脫色也在水浴中（約需15分鐘），（3）膠放入用乙醇-乙酸配成的脫色液后微波加熱10秒鐘至微熱,上搖床,10分鐘后,倒掉,換新的脫色液重復(fù)一次,不超過半個(gè)小時(shí)也好了.（4）用乙醇和乙酸配脫色液,然后加熱脫色，很快的，可加熱到馬上要沸騰為止。不但脫色可以，染色也可加熱，速度也很快（5）用蒸餾水洗膠，并放在微波爐里加熱，效果很好。

只是要掌握好時(shí)間，時(shí)間太長而蛋白的含量又比較低的話，容易脫過了！

（6）加入甲醇－乙酸脫色液后，將其直接放到微波爐里加熱一分鐘，然后放幾張干凈的tissue進(jìn)去（把它疊成條狀，沾在脫色皿邊上就OK啦!(不要和膠混在一起）)，能吸去很多染料，加快脫色，效果不錯(cuò)。6.注意問題

（1）膠脫色不能脫的太久，雖然越脫越清楚，但脫的太久了，弱帶就看不見了，膠也會變的失真，這樣的膠照出的照片是很難被接受的。如果樣品條帶或點(diǎn)不是很濃，就不可以脫太久。但如果要拍照，最起碼要保證底色脫完全，要不然照片效果也不會好的。

（2）如果需要長時(shí)間脫色，注意要換脫色液,且量要足夠,否則甲醇揮發(fā)很快,膠容易干卷.把本底脫干凈后可以把膠放水中保存.半個(gè)月應(yīng)該沒問題；《分子克隆》：長期保存可以在水中加20%的甘油。也有站友經(jīng)驗(yàn)：考染不能長時(shí)間保存，尤其是在水里，3天顏色就會溶到水里。具體情況要自己摸索了。7.膠一般應(yīng)放20%的甘油中長久保存（見“分子克隆”）