第一篇：PCR技術(shù)詳細步驟-從RNA抽提到電泳鑒定

PCR技術(shù)詳細步驟－從RNA抽提到電泳鑒定

(2010-04-21 21:16:04)轉(zhuǎn)載 標簽： 雜談 分類：須一技之長，專業(yè)

RNA抽提 一，準備工作

1，實驗器具與材料：

（1）移液槍：1ml、200ul、10ul（2）吸頭：1ml、200ul、20ul（3）吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置200ul和20ul的吸頭一個（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）鹽水瓶：100ml（8）15ml塑料管一個（配75％乙醇用）2，實驗器具的處理與準備

（1）塑料制品：（包括吸頭、EP管等）

將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中（必要時小槍頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時左右烘干），試驗前將槍頭放入吸頭臺。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）

先泡酸過夜，沖洗干凈后，在1‰DEPC水中泡8小時左右，37℃烘干，用蒙錫紙包裹送至干烤3次。

（3）金屬制品：（鑷子等）

先洗干凈，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3，試劑配制和準備：

（1）DEPC水：泡實驗器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時后備用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶內(nèi)裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過夜，送至高壓。

（2）75％乙醇（要在抽提時現(xiàn)配）：用無水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:無水乙醇＝1:3），然后放于-20℃?zhèn)溆?。?）異丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶

（5）Trizol：100ml/瓶 存放于4℃ 二，抽提時注意事項：

全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤換，避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。三，抽提步驟 1． 勻漿化作用

取約100mg鼠腦組織放于玻璃研磨器內(nèi)，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨組織后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器內(nèi)加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。顛倒混勻10下，室溫靜置5分鐘。2． 分離階段

每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒，使其充分混勻，室溫靜置5分鐘。后12000rmp離心15分鐘。3． RNA的沉淀

將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5mlEP管中（約400-500ul），加入0.5ml異丙醇，混勻后放于-20℃中1小時，后12000rmp離心10分鐘。3 4． RNA的洗脫

小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml現(xiàn)配的75%的乙醇（預(yù)冷）振蕩洗滌RNA沉淀一次，后7500rmp離心5分鐘。5． RNA的再溶解

小心倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺開風(fēng)機吹干（約30分鐘，此時RNA沉淀變透明）。注意不能讓RNA沉淀完全干燥（會極大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分鐘助溶。6，RNA的保存

提取的RNA保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。TRIzol法抽提總RNA 細胞1×107 組織100mg ↓

加1mlTRIzol 細胞用1ml加樣器吹至液體澄清且無細胞團塊 ↓

勻漿（要徹底，后轉(zhuǎn)至EP管）

（組織勻漿量>100mg時分裝1ml/每EP管）↓

顛倒混勻10下，室溫5分鐘 ↓

加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）↓

顛倒混勻15S，室溫5分鐘 ↓

4℃，離心12000rmp，15分鐘 ↓

轉(zhuǎn)上層水相（約400-500μl）于另一新1.5mlEP管中 ↓

加等體積異丙醇（約400-500μl），混勻后-20℃中1小時 ↓

4℃，離心12000rmp，10分鐘 ↓ 棄上清 ↓

加冰預(yù)冷的75%乙醇（用高壓后的DEPC水配）1ml ↓

4℃離心7500rmp，5分鐘 ↓

棄上清，超凈工作臺開風(fēng)機干燥約30分鐘（不能完全干燥）↓

溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）（可在55-60℃水中，<10分鐘助溶）↓

立即保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄 4 逆轉(zhuǎn)錄（RT）一，準備工作

1，實驗器具與材料：（1）移液槍：200ul、10ul（2）吸頭：200ul、20ul（3）EP管1.5ml、100ul（4）水浴箱

2，實驗器具的處理與準備 塑料制品：（包括吸頭、EP管等）

將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中（必要時小槍頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時左右烘干），試驗前將槍頭放入吸頭臺。3，試劑配制和準備：

（1）DEPC水：泡實驗器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時后備用。逆轉(zhuǎn)錄中所用的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶內(nèi)裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過夜，送至高壓，后分裝到幾個1.5mlEP管中，-20℃中保存?zhèn)溆?。?）RT中所需要的各種試劑

（3）引物濃度計算方法：（新合成的引物的稀釋）假如終濃度為X uM(pmol/ul)加DEPC水體積（ul）＝（OD×33×1000000）/（分子量×X）二，RT時注意事項：

為避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。三，RT步驟

用SSⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶進行RT（20ul體積）1，準備0.65ml的EP管

2，冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暫離心。3，65℃水浴5分鐘后，立刻0℃冰水浴至少1分鐘。

4，短暫離心后，冰上操作：加入4ul 5×First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SSⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶。5，短暫離心

6，50℃水浴60分鐘進行逆轉(zhuǎn)錄。7，70℃水浴15分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶 8，-20℃保存，或立即進行PCR。用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進行RT（10ul體積）1，準備0.65mlEP管

2，加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA 3，稍離心，100℃沸水裕1min 4，加入0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 5，稍離心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT 6，100℃沸水裕3min滅活A(yù)MV 7，立即PCR或-20℃保存。5 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）二，準備工作

8，實驗器具與材料：（1）移液槍：200ul、10ul（2）吸頭：200ul、20ul（3）吸頭臺：放置200ul和20ul的吸頭一個（4）EP管1.5ml、100ul 2，實驗器具的處理與準備

(1)塑料制品：（包括吸頭、EP管等）送至高壓3次，試驗前將槍頭放入吸頭臺。3, 試劑配制和準備：

(1)雙蒸水： 100ml鹽水瓶內(nèi)裝40ml蒸餾水，送至高壓，后分裝到幾個1.5mlEP管中，-20℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)PCR中所需要的各種試劑 三，PCR時注意事項：

佩戴一次性手套，同時避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。四，PCR步驟 1，準備100ul EP管

2，依次在管中加入：（50ul反應(yīng)體系）ddH2O 37.5ul ×？ 10mM dNTP 1ul ×？ 10×PCR buffer 5ul ×？

25mM Mgcl2（加之前要搖勻）3ul ×？ 上游引物 1ul ×？ 下游引物 1ul ×？ 模板cDNA 1ul 3，稍離心

4，100℃沸水浴1分鐘

5，趁熱加入Tag酶0.5ul（冰上操作）6，再加入50ul液體石蠟封閉 7，10000rmp離心1分鐘 8，PCR條件 94℃ 1min 58℃ 50sec 72℃ 1min30sec

進行40個循環(huán)，然后72℃ 10min 完后4℃保溫。9，10000rmp離心5min 10，將下層水相轉(zhuǎn)入新的0.65mlEP管中，-20℃保存。6 電泳鑒定 一，準備工作 1，實驗器具與材料：（1）移液槍：10ul（2）吸頭：20ul（3）吸頭臺：放置200ul和20ul的吸頭一個（4）三角燒瓶：50ml一個（5）瓊脂糖

2，實驗器具的處理與準備(1)塑料制品：（包括吸頭等）

送至高壓3次，試驗前將槍頭放入吸頭臺。（2）電泳板及電泳槽： 用自來水沖洗干凈備用 3, 試劑配制和準備：(1)電泳緩沖液（TAE）：

先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液：將37.2g EDTA-Na加入160ml蒸餾水中，在攪拌器上劇烈攪拌。在用NaOH調(diào)節(jié)溶液PH值至8.0（約需4gNaOH）。用蒸餾水定容至200ml。后送至高壓滅菌。室溫保存。

再配制50×TAE溶液：在400ml蒸餾水中溶解121g Tris堿，加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸餾水定容至500ml，室溫保存。（2）瓊脂糖溶液（1.0％）：

50×TAE溶液取10ml，稀釋成500ml，取50ml溶解0.5g瓊脂糖，電爐上煮至沸騰，溶化的瓊脂物冷卻至60℃左右時加入10mg/ml EB 5ul，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的電泳板中，在室溫下放置45min左右后進行電泳。（3）溴化乙錠（EB）（10mg/ml）：

在20ml水中加入0.2g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時。然后用鋁箔包裹容器或?qū)⑷芤恨D(zhuǎn)移至棕色瓶中，室溫保存。

（4）加樣緩沖液（Loading Buffer）一般為6×Loading Buffer 二，電泳鑒定時注意事項：

佩戴一次性手套，避免皮膚接觸EB。無路做膠還是電泳緩沖液盡量用新的，不要超過兩周。五，電泳步驟

1，50×TAE取10ml稀釋成500ml，取50ml溶解0.5g瓊脂糖。電爐上煮沸后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入電泳槽中。

9，用透明膠封閉電泳板，瓊脂糖溶液冷卻至溫?zé)釙r，倒入帶梳子的電泳板中，冷卻后，拔出梳子，放入電泳槽中。

10，加樣：PCR Marker：1ul Marker＋1ul Loading Buffer＋4ul TAE混勻于塑料膜上，加入孔中。PCR樣品：5ul 樣品DNA＋1ul Loading Buffer 混勻后依次加入孔中。11，接上電源，電壓120V，電流50mA進行電泳。12，電泳約1小時后，紫外燈檢測。