第一篇：小鼠基因組DNA抽提原理、儀器試劑和操作步驟

小鼠基因組DNA抽提原理、儀器試劑和操作步驟

一、原理與意義

先用細(xì)胞裂解液對(duì)已制備好的組織勻漿充分裂解，然后用蛋白酶去除其中的蛋白，再用氯仿一次抽提（無(wú)需用酚抽提）、預(yù)備液沉淀、RNase去除 RNA、乙醇再沉淀即可得到完整DNA。該方法適用于從人或動(dòng)物的各種組織、血液、培養(yǎng)細(xì)胞、G+/G-細(xì)菌中快速抽提基因組DNA。抽提出來(lái)的DNA能用于幾乎所有的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如DNA梯度分析、PCR、限制性內(nèi)切酶反應(yīng)、克隆、Southern Blot分析等。

二、試劑及其配制

抽提試劑盒購(gòu)于上海生工公司，內(nèi)含以下試劑：

1、TE緩沖液：PH8.0，由10 mM Tris HCl和1 mM EDTA配成。

2、RNase A（3 mg）：使用前加入300 ul無(wú)菌雙蒸水，煮沸10 min后使其自然冷卻后使用，-20 ℃凍存。

3、Proteinase K（12 mg）：使用前加入600 ul無(wú)菌水，分裝成小份，-20 ℃凍存。

4、Cell Lysis Solution與Precipitation Solution：溶液出現(xiàn)絮狀沉淀50 ℃加熱溶解后使用。5、1.2 mol/L NaCl。冰冷乙醇和氯仿自備。

三、實(shí)驗(yàn)器材

水浴鍋、普通冰箱、1.5/2 ml離心管、移液器及槍頭、紫外分光計(jì)、離心管架、剪刀、鑷子、濾紙等。

四、操作步驟

1、組織勻漿制備：取30 mg左右新鮮組織，加600 ul TE緩沖液，手工勻漿數(shù)次。

2、細(xì)胞裂解：吸取300 ul勻漿加600 ul Cell Lysis Solution，混勻。

3、消化蛋白：再加入9 ul Proteinase K（可適當(dāng)增加）混勻，置于55 ℃水浴30 min以上（可達(dá)2.5 h），其間上下混勻幾次。

4、氯仿抽提：加入600 ul氯仿（用戶自備），輕柔上下混勻，不能太劇烈，以保證DNA的完整性。

5、沉淀：在臺(tái)式離心機(jī)上，10000轉(zhuǎn)/分，室溫離心2 min。此時(shí)應(yīng)分成三層，基因組DNA在上層中，如未能分層，表明樣品與氯仿未混勻（可通過(guò)延長(zhǎng)離心時(shí)間或增加離心速度獲得上清）。取500 ul上清液，置于無(wú)菌1.5 ml離心管中，加入500 ul Precipitation Solution，混勻多次至出現(xiàn)絮狀物，室溫靜置2 min。10000轉(zhuǎn)/分，離心2 min。

6、去除RNA：棄除上清，注意不要倒掉沉淀，立即加入100 ul 1.2 mol/L NaCl，輕輕振蕩直至DNA樣品完全溶解，加入3 ul RNase A，置于37 ℃ 10 min，以去除RNA。

7、沉淀DNA：加入300 ul冰冷乙醇（終濃度為75%，沉淀效果最佳），-20 ℃放置10 min。10，000轉(zhuǎn)/分，離心2 min。倒掉乙醇，倒置室溫干燥10~15 min。若DNA量多，可再重復(fù)沉淀一次。DNA用TE緩沖液或100 ul三蒸水溶解。

五、注意事項(xiàng)

1、應(yīng)避免多次凍融樣品，因?yàn)槊看蝺鋈诙即蟠蠼档屯暾鸇NA的產(chǎn)率。

2、加氯仿充分混勻，若離心后上清不到500 ul，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或增加離心速度。

3、吸取DNA上清時(shí)，可用剪刀稍剪槍頭尖部，以防止虹吸現(xiàn)象。

4、操作步驟中許多數(shù)值可進(jìn)行成比例改變，如上清與預(yù)備液按1：1，氯化鈉與無(wú)水乙醇按1：3等。

5、轉(zhuǎn)錄活性很高的組織或細(xì)菌中通常含有大量的RNA，他們可能與DNA一起被分離出來(lái)。RNA的存在并不影響PCR反應(yīng)。如果需要制備RNA-free的基因組DNA。可在第6步加入200 ul的RNase A，37 ℃保溫10 min即可。

6、用分光光度計(jì)測(cè)量DNA含量按1 OD260=50 mg基因組DNA；進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳判定DNA的完整性，也可以判定樣品中是否有RNA。本試劑盒可抽提長(zhǎng)抵達(dá)50kb以上的DNA。一般在 DNA樣品，OD260/OD280比值大于1.8，可能存在RNA；OD260/OD280比值小于1.6，可能存在蛋白質(zhì)或酚。但RNA樣品中 OD260/OD280比值小于2可能存在蛋白質(zhì)或酚，均需要進(jìn)一步純化。

7、通常50ul體系PCR反應(yīng)中用1~5 ul DNA。

第二篇：苯酚-氯仿法從小鼠尾巴中抽提基因組DNA

從小鼠尾巴中抽提基因組DNA

一、試劑與材料

⑴ 裂解液：50mM Tris(pH8.0)100mM EDTA 0.5% SDS ⑵ 蛋白酶K(Proteinase K)10mg/ml(溶解在pH8.0,50mM Tris和1mM CaCl2中，-20℃保存)。使用時(shí)，終濃度達(dá)到100ug/ml

⑶ RNaseA RNaseA溶液配制

將RNaseA溶解在0.001mol／l醋酸鈉（pH5.2）中，使終濃度為10mg／ml，加熱到 100℃，15min。室溫下緩慢冷卻，用0.1體積的1M的Tris-Cl調(diào)整pH至7.4后，小管分裝保存在-20℃。使用時(shí)，終濃度為100ug/ml.⑷ Tris平衡苯酚；

氯仿（三氯甲烷）；

Tris平衡苯酚:氯仿=1:1(體積比)3M 醋酸鈉（pH5.2）；

無(wú)水乙醇； 70%乙醇；

無(wú)菌ddH2O.⑸ 手術(shù)剪，1.5mlEP管.二、方法

⑴ 剪取0.5cm小鼠尾巴(約20-30mg)，立即放入細(xì)胞凍存管并投入液氮中（防止基因組DNA降解）。

⑵ 從液氮中取出鼠尾，剪碎，放入1.5mlEP管中，加入350ul裂解液、20ul蛋白酶K和0.9ul RNaseA，混勻。

⑶ 在熱孵育器中，55℃過(guò)夜。（剛開(kāi)始可每隔30min搖晃一次）

后續(xù)操作可在冰上進(jìn)行---⑷ 取出EP管，加入等體積Tris平衡苯酚，用力搖晃3min；12000g，離心10分鐘。

⑸ 輕輕吸取上清至一新的1.5mlEP管中（寧可少吸，也不要吸到下層的苯酚或沉淀物）。

⑹ 向上清中加入等體積苯酚/氯仿，用力搖晃2分鐘；12000g，離心2分鐘。⑺ 吸取上清至另一新的1.5mlEP管中，加入1/10體積的醋酸鈉溶液和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，搖勻。

⑻ 12000g，離心1分鐘，盡可能吸除上層乙醇。

⑼ 加入1ml，70%乙醇漂洗DNA，用力搖勻。（此步為了去除殘留的SDS和苯酚）

⑽ 12000g，離心1分鐘，去除乙醇，再重復(fù)⑼、⑽一次（為了盡可能把DNA清洗干凈）。

⑾ 將EP管倒置在吸水紙上，以吸干乙醇。

⑿ 用65℃預(yù)熱的無(wú)菌ddH2O,35ul溶解DNA，-20℃保存。⒀ 分光光度計(jì)檢測(cè)純度、濃度。

DNA提取的注意事項(xiàng)

1、裂解液要預(yù)熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進(jìn)DNA溶解。

2、酚一定要堿平衡。苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到皮膚、粘膜和眼睛會(huì)造成損傷，因此應(yīng)注意防護(hù)。氯仿易燃、易爆、易揮發(fā)，具有神經(jīng)毒作用，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。

3、各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解。

4、取各上清時(shí),不應(yīng)貪多,以防非核酸類成分干擾。

5、異丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要預(yù)冷,以減少DNA的降解,促進(jìn)DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀。

6、提取DNA過(guò)程中所用到的試劑和器材要通過(guò)高壓烤干等辦法進(jìn)行無(wú)核酸酶化處理。

7、所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。

8、用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA的可能性。

9、要用新鮮樣品或液氮冷凍-70度保存的樣品。這樣通過(guò)降低內(nèi)切酶的活性DNA的降解。

10、避免劇烈吸打DNA，不能攪動(dòng)基因組DNA。

11、吸取基因組DNA時(shí)，要用專用的粗口吸頭，普通吸頭可能會(huì)切斷DNA或造成DNA缺口。

12、基因組應(yīng)4度保存，如-20度保存可能導(dǎo)致DNA斷裂。

13、在準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，應(yīng)將DNA樣品放在碎冰上。

14、用Tris緩沖液溶解DNA。

15、加緩沖液后，為了加速DNA溶解，可以輕輕晃動(dòng)或輕彈試管。

16、加入緩沖液后，置于4度過(guò)夜，也可以溶解DNA

17、將DNA溶液65度溫育10分鐘，可以滅活DNase。

18、在抽提過(guò)程中如果水相和有機(jī)層的界面不太清楚，說(shuō)明其中蛋白質(zhì)含量較高，可增加酚/氯仿抽提的次數(shù)或適當(dāng)延長(zhǎng)離心的時(shí)間。

19、酚抽提時(shí)如果上清液太粘稠，無(wú)法進(jìn)行水相轉(zhuǎn)移時(shí)，可加入適量TES稀釋后再抽提。

基因組DNA提取方法

制備基因組DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長(zhǎng)度不小于100-200kb。在DNA提取過(guò)程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。主要是CTAB方法，其他的方法還有1物理方式:玻璃珠法,超聲波法,研磨法,凍融法。2化學(xué)方式：異硫氰酸胍法,堿裂解法3生物方式:酶法。根據(jù)核酸分離純化方式的不同有:硅質(zhì)材料、陰離子交換樹脂等

試驗(yàn)步驟：

1、貼壁細(xì)胞用胰酶消化，離心收集。

2、細(xì)胞重懸于冰冷的PBS漂洗一次，離心收集。試驗(yàn)步驟2再重新作一邊。

3、加入5mlDNA提取緩沖液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混勻。

4、加入25ul蛋白酶K,使終濃度達(dá)到100ug/ml,混勻，50℃水浴3h，5、用等體積的酚抽提一次，2500rpm離心收集水相，用等體積的（酚，氯仿，異戊醇）混合物抽提一次，2500r/min離心收集水相

6、用等體積的氯仿，異戊醇抽提一次。加入等體積的5mol/L的LiCL,混勻，冰浴，10min.。7、2500rpm離心10min.轉(zhuǎn)上清于一離心管中。加入等體積的異丙醇。室溫10min。2500rpm,離心10min。棄上清。

8、加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(PH5.2)與2倍體積-20℃預(yù)冷無(wú)水乙醇。-20℃20min。9、12000r/min,室溫離心5min。棄上清。將DNA溶于適量TE中。

外周血DNA提取技術(shù)

分離外周血白細(xì)胞提取方法： 試驗(yàn)步驟：

1、取人肘靜脈血5ml，EDTA抗凝，2500rpm離心10min。

2、小心吸取上層血漿，分裝到3個(gè)0.5ml離心管中。

3、在血細(xì)胞中加入3倍體積的溶血液，搖勻，冰浴15min。4、2500rpm離心10min，棄上清。

5、加入10ml溶血液，搖勻，冰浴15min。6、3000rpm離心10min，棄上清。

7、倒置離心管，去掉殘液。

8、得白細(xì)胞，－80?C凍存。試驗(yàn)要求： 血至分離白細(xì)胞之間隔時(shí)間在室溫下放置不超過(guò)2h，4℃放置不超過(guò)5h，以防白細(xì)胞自溶。

氯仿法抽提外周血白細(xì)胞基因組DNA： 試驗(yàn)試劑： Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加滅菌去離子水至1000ml，高壓滅菌。

ACD抗凝劑：檸檬酸1.68g檸檬酸鈉4.62g葡萄糖5.15g；最后加滅菌去離子水至350ml，高壓滅菌。

提取緩沖液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加滅菌去離子水至100ml，高壓滅菌

試驗(yàn)步驟：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分顛混至清亮。以4000rpm，離心5min。棄上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分勻漿。以6000rpm，離心5min。

3、徹底棄去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解細(xì)胞），混勻置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，顛混，37℃過(guò)夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl飽和酚（取溶液下層）緩慢搖晃10min，以5500rpm，離心15min。

6、取上清，每管加入250μl飽和酚和250μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，適量無(wú)水乙醇（預(yù)冷）至滿，搖勻放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，離心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，離心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl滅菌去離子水，轉(zhuǎn)彈，混勻。NaI提取法提取外周血白細(xì)胞基因組： 實(shí)驗(yàn)步驟：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm離心12min。

2、棄上清，加雙蒸水200ul溶解，搖勻20s。

3、混勻后加6MNaI溶液200ul，搖勻20s。

4、加入氯仿/異戊醇（24：1）400ul，邊加邊搖，搖勻20s，12000rpm離心12min。

5、取上層液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍體積異丙醇，搖勻20s，室溫放置15min，靜置后的反應(yīng)體系15000rpm離心12min，使沉淀緊貼eppendorf管壁。

6、棄異丙醇，加70％乙醇1ml（不振動(dòng)），以15000rpm離心12min。

7、棄乙醇，敞開(kāi)eppendorf管蓋，烘干（37℃恒溫箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

常用的外周血白細(xì)胞基因提取方法： 試驗(yàn)原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，SDS(十二烷基磺酸鈉)將細(xì)胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子，核蛋白變性降解，使DNA從核蛋白中游離出來(lái)。DNA易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團(tuán)，也容易進(jìn)行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能順利地進(jìn)入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機(jī)溶液存在時(shí)，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機(jī)溶劑在試管底層(有機(jī)相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質(zhì)。氯仿的作用是有助于水相與有機(jī)相分離和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍體積的無(wú)水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的鹽，真空干燥，用TE緩沖液溶解DNA備用。

試驗(yàn)步驟：

1、將1mlEDTA抗凝貯凍血液于室溫解凍后移入5ml離心管中，加入1ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS），混勻，3500rpm離心15min,傾去含裂解紅細(xì)胞的上清。重復(fù)一次。用0.7mlDNA提取液混懸白細(xì)胞沉淀，37℃水浴溫育1h。

2、將上述DNA提取液混懸白細(xì)胞，37℃水浴溫育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至終濃度為100-200ug/ml,上下轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，液體變粘稠。50℃水浴保溫3h，裂解細(xì)胞，消化蛋白。保溫過(guò)程中，應(yīng)不時(shí)上下轉(zhuǎn)動(dòng)幾次，混勻反應(yīng)液。

3、反應(yīng)液冷卻至室溫后，加入等體積的飽和酚溶液，溫和地上下轉(zhuǎn)動(dòng)離心管5-10min，直至水相與酚相混勻成乳狀液。5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復(fù)酚抽提一次。加等體積的氯仿﹕異戊醇（24﹕1），上下轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復(fù)一次。

4、加入1/5體積的3mol/LNaAc及2倍體積的預(yù)冷的無(wú)水乙醇，室溫下慢慢搖動(dòng)離心管，即有乳白色云絮狀DNA出現(xiàn)。用玻璃棒小心挑取云絮狀的DNA，轉(zhuǎn)入另一1.5ml離心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm離心5min。洗滌DNA，棄上清，去除殘留的鹽。重復(fù)一次。室溫?fù)]發(fā)殘留的乙醇，但不要讓DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于搖床平臺(tái)緩慢搖動(dòng)，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

真核細(xì)胞DNA的制備

一般真核細(xì)胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組織細(xì)胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提而實(shí)現(xiàn)的。這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)材料來(lái)源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提取方法大體類似，但都應(yīng)考慮以下兩個(gè)原則：

1、防止和抑制DNase對(duì)DNA的降解。

2、盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞。試劑準(zhǔn)備：

1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解緩沖液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4、20%SDS 5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris飽和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、無(wú)水乙醇、75%乙醇 試驗(yàn)步驟： 材料處理：

1、新鮮或冰凍組織處理：

1)取組織塊0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。2)將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混勻。4)60°C水浴1-3hr。

2、培養(yǎng)細(xì)胞處理：

1)將培養(yǎng)細(xì)胞懸浮后，用TBS洗滌一次。2)離心4000g×5min，去除上清液。3)加10倍體積的裂解緩沖液。4)50-55°C水浴1-2hr。DNA提?。?/p>

1、加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。

2、離心5000g×10min，取上層水相到另一1.5ml離心管中。

3、加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

4、加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復(fù)此步驟數(shù)次。

5、加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

6、加1/10體積的3M醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕倒置混勻。

7、待絮狀物出現(xiàn)后，離心5000g×5min，棄上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗滌，離心5000g×3min，棄上清液。

9、室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50-100mlTE溶解過(guò)夜。

植物組織中DNA的提取

試驗(yàn)原理：

脫氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物細(xì)胞的重要組成成分，主要存在于細(xì)胞核中，鹽溶法是提取DNA的常規(guī)技術(shù)之一。從細(xì)胞中分離得到的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA，其中還含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開(kāi)是技術(shù)的關(guān)鍵。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA則能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用這一性質(zhì)就可以將二者從破碎細(xì)胞漿液中分開(kāi)。制備過(guò)程中，細(xì)胞破碎的同時(shí)就有Dnase釋放到提取液中，使DNA因被降解而影響得率，在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白質(zhì)變性而與核酸分離，再加入陰離子去垢劑0.15％的SDS，經(jīng)過(guò)2h攪拌，或用氯仿－異醇除去蛋白，通過(guò)離心使蛋白質(zhì)沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的預(yù)冷乙醇即可把DNA從除去蛋白質(zhì)的提取液中沉淀出來(lái)。

植物DNA的SDS提取法： 試驗(yàn)試劑：

1、研磨緩沖液：稱取59.63gNaCl，13.25g檸檬酸三鈉，37.2gEDTA－Na分別溶解后合并為一，用0.2mol/L的NaOH調(diào)至pH7.0，并定容至1000ml。2、10×SSC溶液：稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉，分別溶解，一起定容至1000ml。3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀釋10倍。4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀釋10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前經(jīng)80℃水浴處理5min（以破壞可能存在的Dnase）。

6、氯仿－異戊醇：按24ml氯仿和1ml異戊醇混合。7、5mol/L高氯酸鈉溶液：稱取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸餾水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸鈉）化學(xué)試劑的重結(jié)晶：將SDS放入無(wú)水酒精中達(dá)到飽和為止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁熱過(guò)濾，冷卻之后即將濾液放入冰箱，待結(jié)晶出現(xiàn)再置室溫下涼干待用。9、1mol／LHCl。10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛試劑：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml濃硫酸，裝入棕色瓶，貯存暗處，使用時(shí)加0.1ml乙醛液［濃乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA標(biāo)準(zhǔn)液：取標(biāo)準(zhǔn)DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷卻后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，則得100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、稱取植物幼嫩組織10g剪碎置研缽中，加10ml預(yù)冷研磨緩沖液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊狀。

2、將勻漿無(wú)損轉(zhuǎn)入25ml刻度試管中加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，加上塞子，劇烈振蕩30s，轉(zhuǎn)入離心管，靜置片刻以脫除組織蛋白質(zhì)。以4000rpm離心5min。

3、離心形成三層，小心地吸取上層清液至刻度試管中，棄去中間層的細(xì)胞碎片、變性蛋白質(zhì)及下層的氯仿。

4、將試管置72℃水浴中保溫3min（不超過(guò)4min），以滅活組織的DNA酶，然后迅速取出試管置冰水浴中冷卻到室溫，加5mol/L高氯酸鈉溶液［提取液：高氯酸鈉溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1mol/L。

5、再次加入等體積氯仿－異戊醇混合液至大試管中，振蕩1min，靜置后在室溫下離心（4000rpm）5min，取上清液置小燒杯中。

6、用滴管吸95％的預(yù)冷乙醇，慢慢地加入燒杯中上清液的表面上，直至乙醇的體積為上清液的兩倍，用玻璃棒輕輕攪動(dòng)。此時(shí)核酸迅速以纖維狀沉淀纏繞在玻璃棒上。

7、然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最終濃度為1×SSC。

8、重復(fù)第6步驟和第7步驟即得到DNA的粗制品。

9、加入已處理的Rnase溶液，使其最后的作用濃度為50～70μg/ml，并在37℃水浴中保溫30min，以除去RNA。

10、加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，在三角瓶中振蕩1min，再除去殘留蛋白質(zhì)及所加Rnase蛋白，室溫下以4000rpm離心5min，收集上層水溶液。

11、再按6、7步驟處理即可得到純化的DNA液。植物DNA的CTAB提取法： 試驗(yàn)步驟：

1、稱取新鮮葉片2-3g，剪碎放入研缽中，在液氮中研磨成粉末。

2、將粉末轉(zhuǎn)移到加有7ml經(jīng)預(yù)熱的15×CTAB提取緩沖液15ml離心管中，迅速混勻后置于65℃水浴中，溫育30min。

3、取出離心管,冷卻至室溫，加入氯仿/異戊醇(24:1)，充分混勻，室溫下2300轉(zhuǎn)離心20min。

4、將上清轉(zhuǎn)移至另一新的15ml離心管中，加入1/10體積10%的CTAB和等體積的氯仿/異戊醇。充分混勻，2300rpm離心20min。

5、轉(zhuǎn)移上清至另一新的15ml離心管中，加入等體積1%的CTAB沉淀緩沖液，輕輕搖晃至形成DNA絮狀沉淀。1000rpm離心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中過(guò)夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃預(yù)冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml離心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、離心機(jī)甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超凈工作臺(tái)上吹干。

9、將風(fēng)干的DNA直接在4℃保存?zhèn)溆没蛉苡?00μlTE溶液中于-20℃保存。

細(xì)菌DNA的提取方法

針對(duì)一些不易于提取的細(xì)菌的方法: 試驗(yàn)試劑：

抽提緩沖液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MLiCl 2MLiCl DEPC-water（抑制RNA酶活性）3MNaAc(pH5.2)96%乙醇 70%乙醇 試驗(yàn)步驟：

1、抽提緩沖液65℃預(yù)熱。

2、加菌體到已經(jīng)預(yù)熱的緩沖液（700ul）中混勻，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振蕩，以12,000rpm，離心10min。

4、取上清，加氯仿/異戊醇（24：1）振蕩，以12,000rpm，離心10min。

5、重復(fù)再作一次步驟4。

6、加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，離心10min。

8、棄上清，以70％乙醇條洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。較為常用的細(xì)菌DNA提取方法： 實(shí)驗(yàn)步驟：

1、將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

2、取1.5ml培養(yǎng)物12000rpm離心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h.4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻后再65℃溫育10min。

5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)，沉淀可稍加離心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇． 真菌DNA提取總結(jié)的兩種方法： 第一種方法： 試驗(yàn)步驟：

1、取真菌菌絲0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振蕩混勻。

3、加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1)，渦旋3～5min（此處是粗提沒(méi)有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，離心5min。

5、上清再用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

6、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇或2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀,混勻,靜置約30min。

7、用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無(wú)水乙醇漂洗1次,吹干，重懸于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下處理1h。

9、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

10、取上清，加入1/10倍體積的3MNaAc,2.5倍體積的無(wú)水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干,溶于200ulTE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。第二種方法： 試驗(yàn)步驟：

1、真菌菌絲0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液，快速振蕩混勻65℃水浴30min,期間混勻2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃離心5min）。

5、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇,混勻,靜置約30min。

6、用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無(wú)水乙醇漂洗1次,吹干，重懸于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃處理1h。

8、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V體積的無(wú)水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干,溶于200ulTE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

石蠟包埋DNA提取試驗(yàn)方法

試驗(yàn)原理：

從石蠟包埋組織中提取DNA的基本步驟，是在常規(guī)DNA提取方法的基礎(chǔ)上改良和演變而業(yè)。Goelz等（1985）最先提出的石蠟包埋組織DNA提取技術(shù)，是用機(jī)械的方法破碎組織，切除多余的石蠟，進(jìn)入含SDS和高濃度蛋白酶K（１mg/ml）的提取緩沖液加溫孵育，然后進(jìn)行苯酚和氯仿抽提。所得DNA雖不完整，但可被限制性內(nèi)切酶切割，因而適于點(diǎn)雜交，印跡雜交等多種分了生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改進(jìn)。首先通過(guò)組織切片和二甲苯和脫蠟，保證了組織的完全破碎，使細(xì)胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過(guò)兩步消化的方法，將不適于做分子雜交的降解的DNA小段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，從而提DNA質(zhì)量，適于做Sorthern印跡雜交分析。

試驗(yàn)試劑：

配方：3mol/lNacl，0.3M檸檬酸三鈉·2H2O，用HCL調(diào)PH值至7。0 石蠟消化液：150nmol/lNacL：15mmol/l檸檬酸鈉，1%SDS，PH7.0。試驗(yàn)步驟：

1、取蠟塊切片15-20張（8μm），置于eppendorf管中，加入1ml的二甲苯，37℃作用3h，以10000rpm，離心3min，傾去二甲苯。重復(fù)3-4次，觀察管壁是否光滑。如果仍有蠟質(zhì)殘存，需繼續(xù)脫蠟。

2、剃度酒精水化：加入100%乙醇1ml，室溫下放置30min，以10000rpm離心3min，去上清；再依次分別加入95%；75%；50%的乙醇重復(fù)上面的步驟。

3、消化：以1×SSC500μL加入SSC洗滌沉淀，以12000rpm離心3min。棄去上清夜，干燥沉淀。加入石蠟消化液400μL，PK（20mg/ml）20μl；55℃消化120h，第四天，補(bǔ)加PK10μl。

4、消化后的液體很清亮，肉眼可見(jiàn)的組織較少。將其轉(zhuǎn)入98℃的水浴箱中，煮沸10min，以滅活PK，取出后置于冰上，使其迅速冷卻。以10000rpm，離心5min。

5、取上清加等量的酚-氯仿，輕顛倒混勻呈乳白色。低溫下以14000rpm，離心10min。小心取上清，再加入等量的酚-氯仿重復(fù)上面的步驟。

6、取上清加入預(yù)冷的兩倍體積的無(wú)水乙醇及1/10的乙酸鈉（PH5.2），顛倒混勻。置于-20℃，30min。低溫下以14000rpm，離心10min，去上清。

7、沉淀用1ml的70%乙醇洗滌2次，（顛倒eppendorf管數(shù)次）以14000rpm，離心5min，自然干燥沉淀。

8、加TE20μl，（含RNA酶），4℃下過(guò)夜。注意事項(xiàng)：

1、取材時(shí)應(yīng)避免出血壞死的組織，盡可能選用新鮮的標(biāo)本。

2、消化時(shí)應(yīng)不時(shí)震搖離心管，使酶與組織充分接觸。

3、福爾馬林固定和石蠟包埋使組織變得堅(jiān)韌，勻漿的效果往往不理想，可將組織切成10um的薄片進(jìn)行消化。

4、消化不完全，可采用高濃度蛋白酶K及延長(zhǎng)消化時(shí)間。附：elz氏DNA提取方法的主要步驟：

提取液的制備：500mmol/LTris20mmol/LEDTA10mmol/LNaCl1％SDS 500μg/ml蛋白酶ＫpH8.0

1、切除多余石錯(cuò)，暴露組織。將組織切碎（最大徑<0.5mm），稱重。

2、溶于TE9提取液(組織<50mg/5ml.50－500mg/10ml),高速混懸2－3min，于48℃放置24h。

3、再次混懸組織，加入蛋白酶Ｋ至終濃度１mg/ml，SDS至２％，孵育40h。

4、用等體積酚－氯仿溶液抽提３次。2.5倍體積乙醇沉淀DNA。-70℃放置２－４h。9000rpm離心１h。

5、沉淀物用70％乙醇洗１次，干燥，TE（pＨ7.2）溶解。

DNA提取其他方法

適用于PCR研究的快速提取法： 試驗(yàn)步驟：

1、田間剪取植株新鮮葉片5－10mg（約2cm長(zhǎng)）左右，新鮮葉片放于15ml離心管中，存于冰盒中，根據(jù)樣品號(hào)貼上相應(yīng)的標(biāo)簽。

2、用剪刀將葉片組織剪細(xì)（約0.5cm長(zhǎng)）放在點(diǎn)穴式研板中。加入400μlDNA提取緩沖液，用玻棒將葉組織研細(xì)，直到液體變成深綠色即可。

3、加400μlDNA提取緩沖液，混合均勻，轉(zhuǎn)入一新的15ml離心管（貼上相應(yīng)的編號(hào)）。

4、加400μl氯仿，混合均勻后，2400轉(zhuǎn)離心30s，將上清液轉(zhuǎn)入一支新的15ml離心管（貼上相應(yīng)的編號(hào)）。

5、加800μl無(wú)水乙醇，混勻，2400轉(zhuǎn)離心3min。棄上清。70%乙醇沖洗，風(fēng)干。用50μlTE緩沖液溶解，存于－20℃。取1μl用于PCR分析。

Chelex-100法提取DNA： 試驗(yàn)原理：

Chelex-100是一種化學(xué)螯合樹脂，由苯乙烯、二乙烯共聚體組成。含有成對(duì)的亞氨基二乙酸鹽離子，對(duì)高價(jià)金屬離子有很高的親合力和螯合作用。在低離子強(qiáng)度、堿性及煮沸條件下，可以使細(xì)胞膜破裂，并使蛋白質(zhì)變性，DNA游離。Chelex-100特別適用于微量生物樣本的處理，方法簡(jiǎn)便快速，提取過(guò)程始終在同一管中進(jìn)行，不用轉(zhuǎn)移，可減少DNA的損失，操作步驟簡(jiǎn)化，減少了污染的機(jī)會(huì)。

以血液為例實(shí)驗(yàn)步驟：

1、取血液1-3?l，置1.5ml離心管中，加滅菌雙蒸水1ml，振蕩混勻，室溫30min，或置冰箱-20℃5min。2、10000r/min離心5min，棄上清，反復(fù)2-3次。

3、于沉淀中加入200?l懸浮好的5%的Chelex-100溶液，56℃水浴2h或37℃水浴過(guò)夜。

4、振蕩5-10秒，置100℃5-10min，取出振蕩溶液5-10s。5、10000r/min5min，上清液即可作為PCR反應(yīng)的DNA模板。注意事項(xiàng)：

1、Chelex-100處理模板僅適用于PCR反應(yīng)，處理液不宜長(zhǎng)期保存，如果保存的時(shí)間稍長(zhǎng)，可將上清液轉(zhuǎn)移至另一管中保存?zhèn)溆谩Ｒ话阍谝恢軆?nèi)使用，如果保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)影響PCR擴(kuò)增結(jié)果。

2、在處理模板的各個(gè)步驟中，振蕩要充分。

3、煮沸的溫度、時(shí)間要充分，否則將影響擴(kuò)增。

4、使用前要混勻離心，取上清液作為模板，如果PCR反應(yīng)體系中含有Chelex-100，Mg2+會(huì)被螯合，降低酶活性，使PCR擴(kuò)增失敗。

硅珠法提取DNA： 試驗(yàn)原理： 在高濃度的硫氰酸胍存在的條件下，DNA能夠被二氧化硅特異性吸附，當(dāng)沒(méi)有硫氰酸胍存在時(shí)，DNA又可從二氧化硅中釋放出來(lái)。硫氰酸胍是一種高性能的蛋白變性劑，可以使蛋白質(zhì)與DNA充分分離，在硅珠吸附前高速離心可以將變性的蛋白質(zhì)及一些不溶的物質(zhì)除去。吸附后的漂洗過(guò)程則可將溶液中的PCR抑制物洗去。

試驗(yàn)試劑：

1、吸附劑：12gGuSCN溶于10ml0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)，0.8ml0.5mol/LEDTA，0.5mlTritonX-100。

2、漂洗劑：12gGuSCN溶于10ml0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)。

3、硅珠懸浮液：0.06gSilica溶于1ml滅菌超純水。

4、TES：1ml1mol/LTris-HClpH8.0，2ml5mol/LNaCl，2ml0.5mol/LpH8.0EDTA，95ml滅菌超純水。

試驗(yàn)步驟：

1、取1.5ml離心管1支，加入TES200ul，10%SDS40?l再加入血液2-4?l，混勻，煮沸5min。

2、振蕩混勻，加入300-600?l吸附液，混勻。

3、加入20-40?l硅珠懸浮液，振蕩混勻，置室溫15min，振蕩5s，10000r/min離心2min。

4、除去上清，于沉淀中加入200-400?l漂洗液，充分懸浮沉淀物，10000r/min離心1min。

5、去上清液，重復(fù)漂洗一次，去上清后沉淀物用70%乙醇漂洗1－2次。10000r/min5min。

6、去乙醇，置56℃ 10min，于沉淀中加入50-100?lTES，旋渦混合30s，56℃保溫10min。7、10000r/min離心10min，上清液可直接用于PCR反應(yīng)。固相吸附法提取DNA： 試驗(yàn)原理：

硫氰酸胍具有溶解細(xì)胞和滅活核酸酶的性質(zhì)，利用當(dāng)硫氰酸胍存在時(shí)硅藻顆粒能特異性吸附DNA，而當(dāng)去除硫氰酸胍時(shí)，DNA又能從硅藻上釋放出來(lái)的特性，來(lái)提取樣本中的DNA。該方法尤其適用于臨床標(biāo)本的DNA提取。

試驗(yàn)試劑：

1、裂解液：12gGuSCN，10ml0.1mol/LTris-HClpH6.4，2.2ml0.2mmol/LEDTApH8.0，0.3mlTritonX-100。

2、洗滌液：12gGuSCN，10ml0.1mol/LTris-HClpH6.4。試驗(yàn)步驟：

1、取100?l樣品加900ul裂解液，20?l硅藻液，振蕩混合，10000r/min離心1min，去上清。

2、加1ml洗滌液，懸浮沉淀洗滌，10000r/min離心1min，再重復(fù)一次。加1ml70%乙醇洗一次，1ml丙酮洗一次，去上清，56℃ 10min。

3、加60?lTE緩沖液混勻，56℃ 10min，10000r/min離心5min，上清液備用.DNA含量的檢測(cè)和純化

DNA含量的檢測(cè)：

一種方法是通過(guò)凝膠電泳的方法檢測(cè)DNA的含量：取2-5?lDNA溶解液與0.4?l6×載樣緩沖液混合，用0.75%瓊脂糖凝膠(含EB0.5?g/ml)檢測(cè)。溴化乙錠可迅速嵌于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，嵌入DNA中的溴化乙錠受紫外光激發(fā)而發(fā)出熒光，這種熒光強(qiáng)度與DNA總質(zhì)量數(shù)成正比，通過(guò)比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度，對(duì)樣品中的DNA進(jìn)行定量。（詳見(jiàn)凝膠電泳）另一方法是分光光度法，組成DNA的堿基，具有一定的吸收紫外線的特性，其最大吸收值在波長(zhǎng)250-270之間。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后，其吸收紫外線的特性沒(méi)有改變，核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm，利用DNA的這個(gè)物理特性來(lái)測(cè)定DNA的濃度。

分光光度法的具體方法是：

1、取兩只清潔的比色杯，各加入2ml0.1mol/LNaOH校正零點(diǎn)。

2、以其中的一只比色杯作為空白對(duì)照，在另一只比色杯中加入4?lDNA溶液，再加入0.1mol/LNaOH至2ml混勻。

3、測(cè)定波長(zhǎng)為260nm時(shí)的OD值，再將波長(zhǎng)調(diào)至280nm測(cè)其OD值。

4、根據(jù)OD260=1時(shí)，雙鏈的DNA濃度為50?g/ml，單鏈DNA或RNA濃度為40?g/ml，按計(jì)算公式：樣品DNA濃度(?g/ml)=OD260×40?g/ml×稀釋倍數(shù)，計(jì)算樣品的DNA濃度。

DNA純化：

首先利用瓊膠電泳將不同分子量的DNA片段分開(kāi),將某一特定分子量區(qū)域的瓊膠切下,利用DNAextractionkit將DNA從瓊膠中溶出并濃縮。（可參考質(zhì)粒DNA的純化）實(shí)驗(yàn)材料： 1、6Xgel-loadingde:15%Ficoll400,0.25%bromophenolblue,0.25%xlenecanol紫外光箱

2、DFBuffer

3、WashBuffer

4、ElutionBuffer:10mMTris-HCl(pH8.5)

5、DFColumn 6、2mlCollectionTube 實(shí)驗(yàn)步驟：

1、將欲分離之DNA混合物以0.7%瓊膠電泳分離。

2、電泳后,將瓊膠置於紫外光箱上觀察,把含有欲純化之DNA片段的瓊膠部位切下。

3、將步驟B的瓊膠以藍(lán)色微量吸管盡可能戳碎。

4、加入500mlDFbuffer,55oC作用10分鐘,每2-3分鐘搖晃數(shù)次,直至瓊膠完全溶解。

5、將步驟D瓊膠溶液全部吸入DFColumn,并套上CollectionTube(收集過(guò)濾液)。6、8000rpm離心1分鐘,將過(guò)濾液倒掉。加入500mlWashBuffer,8000rpm離心1分鐘,過(guò)濾液倒掉。14000rpm離心2分鐘。

7、將DFColumn轉(zhuǎn)移至上另一乾凈的微量離心管.加入15mlElutionBuffer,室溫靜置2分鐘。8、14000rpm離心2分鐘,微量離心管內(nèi)之液體即為純化的DNA片段。

9、取0.5ml純化的DNA加入4.5mlDDW及1ml6xDNAloadingde,跑0.7%瓊膠電泳,與marker比較,估計(jì)DNA的濃度。

第三篇：組織或全血抽提基因組DNA裂解液配方

組織或全血抽提基因組DNA裂解液配方

裂解液配方： 10mM Tris-Cl(pH 8.0)、15mM NaCl、10mM EDTA(pH8.0)、0.4%SDS。200 μg/ml蛋白酶K（使用之前加入）。

（1）1M Tris-Cl(pH8.0)

800ml水中溶解121.1g Tris堿，待溶液冷卻至室溫后加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0(約需42ml濃鹽酸)，定容至1L，高溫高壓滅菌備用。（2）5M氯化鈉

800ml水中溶解292.2g氯化鈉，加水定容至1L，高溫高壓滅菌備用。（3）500 mM EDTA(pH8.0)

800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na。2H2O），磁力攪拌助溶，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0（約需20g NaOH顆粒），定容至1L，高溫高壓滅菌備用。（EDTA二鈉鹽需要調(diào)節(jié)pH至8.0時(shí)才能完全溶解）。（4）10% SDS

900ml水中溶解100g SDS加熱助溶，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，加水定容至1L，無(wú)需滅菌。

（5）蛋白酶K；

滅菌水配置成20mg/ml，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第四篇：TRIpure Reagent總RNA抽提試劑操作方法及步驟說(shuō)明書

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TRIpure Reagent

TRIpure Reagent總RNA提取試劑

目錄號(hào)：RN01 ? 試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性： 試劑盒組成

TRIpure（4℃避光）

(RN0101)50 ml

(RN0102)

ml ? 儲(chǔ)存事項(xiàng)：

TRIpure 在室溫下能穩(wěn)定保存12個(gè)月。盡管如此，為達(dá)到最佳效果，我們建議保存在2~8°C的環(huán)境下。

? 重要提示：

本品中含有苯酚，具有毒性和腐蝕性。如果吸入體內(nèi)、接觸皮膚、吞食等會(huì)導(dǎo)致中毒、灼傷以及其他身體傷害。使用本制品時(shí)應(yīng)穿戴防護(hù)物品，如防護(hù)服裝、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接觸，應(yīng)立即用大量的水沖洗并前往醫(yī)院治療。

? 1.注意事項(xiàng)：

樣品用TRIpure勻漿后，如果不即刻加入氯仿之前，置于-70°C下可放置一個(gè)月以上。保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2-8°C可以保存一周，-20°C條件下可以保存1年。RNA半衰期比較短，容易降解，建議提取后盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Northern Blot等。

2.若下游實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA非常敏感，建議用 RNase free DNase I（貨號(hào)：RN45）對(duì)RNA進(jìn)行處理。

3.自備試劑：氯仿、異丙醇（新開(kāi)封或提取RNA專用）、75%乙醇(用DEPC處理過(guò)的水配制)、RNase free water或者DEPC處理過(guò)的水。

4.本公司生產(chǎn)TRIpure Reagent質(zhì)量?jī)?yōu)異，可以完美替代Invitrogen的Trizol Reagent。提取質(zhì)量和下游實(shí)驗(yàn)完全一樣。已經(jīng)銷售8年數(shù)萬(wàn)瓶。從無(wú)質(zhì)量問(wèn)題?？蛻羧绻?gòu)買本公司TRIpure Reagent證明不能替換Invitrogen的Trizol，無(wú)條件退貨，并3倍銷售價(jià)格賠償。

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? RNA抽提操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）

提示：用TRIpure 抽提RNA時(shí)要戴手套和護(hù)眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學(xué)通風(fēng)櫥完成操作。避免呼吸道吸入。如無(wú)特殊說(shuō)明，所有的操作應(yīng)該在在15~30°C的室溫條件下。1.勻漿

a.植物組織：取新鮮植物組織在液氮中充分研磨或?qū)⒅参锝M織剪碎后直接在TRIpure中迅速研磨，每50-100mg組織加入1ml TRIpure，混勻。注意：樣品體積一般不要超過(guò)TRIpure體積的10%。

b.動(dòng)物組織：取新鮮或-70℃凍存動(dòng)物組織盡量剪碎，每30-100mg組織加入1ml TRIpure，勻漿儀進(jìn)行勻漿處理?；蛟谝旱醒心ズ蠹尤隩RIpure 1ml混勻。注意：樣品體積一般不要超過(guò)TRIpure體積的10%。

c.單層培養(yǎng)細(xì)胞：盡量去除干凈殘留培養(yǎng)液后直接往直徑3.5 cm的培養(yǎng)板中加入1ml 的TRIpure覆蓋并反復(fù)吹打裂解細(xì)胞。依據(jù)培養(yǎng)板的面積而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量來(lái)決定所需的TRIpure 量（每10cm2加1ml）。當(dāng)TRIpure 量不足時(shí)可導(dǎo)致抽提的RNA中污染有DNA。

注意：貼壁培養(yǎng)細(xì)胞往往不能完全從培養(yǎng)瓶（皿）脫落，這并不意味著裂解不完全，此時(shí)細(xì)胞膜實(shí)際已經(jīng)完全破裂開(kāi)，并已釋放出全部RNA，繼續(xù)做即可。d.細(xì)胞懸液： 離心收集細(xì)胞。在TRIpure 試劑中用移液管反復(fù)吹打來(lái)裂解細(xì)胞。每5~10×106的動(dòng)物細(xì)胞，植物或酵母菌細(xì)胞或每1×107細(xì)菌加1ml的TRIpure。在加入TRIpure 前應(yīng)避免洗滌細(xì)胞，因?yàn)槟菢訒?huì)增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和細(xì)菌可能需要使用勻漿器。

e.血液：推薦使用本公司的TRIpure Reagent LS(貨號(hào)：RN02)，這是全血或者液體樣品專用的TRIpure Reagent，LS就是Liquid Sample 液體樣品的首字母簡(jiǎn)寫。相當(dāng)于Invitrogen公司的 TRIzol LS。

2.3.將勻漿樣品劇烈震蕩后在室溫條件下放置5分鐘以使核蛋白體完全解離?？蛇x步驟： 在4°C的條件下以12,000 rpm的離心力離心10分鐘，取上清。如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或肌肉，植物的塊莖結(jié)節(jié)等可離心去除。杭州昊鑫生物科技股份有限公司

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離心后的沉淀中包含有細(xì)胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織的樣品時(shí)，上層是大量油脂應(yīng)除去。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步。4.每1ml TRIpure加0.2ml氯仿。蓋緊管蓋，劇烈震蕩15秒并將其在室溫下放置2~3分鐘。5.在4°C 12,000 rpm的離心力高速冷凍離心10-15分鐘。離心后混合物分成三層：下層紅色有機(jī)苯酚氯仿層，中間層，上層無(wú)色的水樣層。RNA無(wú)一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所加TRIpure 容量的50-60%。（有機(jī)層和中間層是蛋白和DNA，如果需要提取，請(qǐng)聯(lián)系我們索取提取方法）。6.將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的離心管中，加入等體積異丙醇。顛倒混勻后室溫放置10分鐘。

RNA沉淀在離心前通常不可見(jiàn)，離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。

7.8.9.在室溫或者4°C 12,000 rpm 離心10分鐘，棄上清。

加入75%乙醇洗滌沉淀。每使用1?ml?TRIpure用1?ml?75%乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌。在室溫或者4°C 12,000 rpm離心3分鐘，棄上清，注意不要丟失RNA沉淀。注意：剩余的少量液體可短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸棄沉淀。? 10.室溫放置2-3分鐘，晾干。加入30-100μl RNase free water，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。

注意：沉淀不要過(guò)分干燥，以免難于溶解。

第五篇：TRIpure LS 總RNA抽提試劑操作方法及步驟說(shuō)明書

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TRIpure Reagent LS 液體樣本總RNA提取試劑

目錄號(hào)：RN02 ? 試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性： 試劑盒組成

TRIpure LS（4℃避光）(RN0201)50 ml

(RN0202)

ml

? 儲(chǔ)存事項(xiàng)：

TRIpure LS在室溫下能穩(wěn)定保存12個(gè)月。盡管如此，為達(dá)到最佳效果，我們建議保存在2~8°C的環(huán)境下。

? 重要提示：

本品中含有苯酚，具有毒性和腐蝕性。如果吸入體內(nèi)、接觸皮膚、吞食等會(huì)導(dǎo)致中毒、灼傷以及其他身體傷害。使用本制品時(shí)應(yīng)穿戴防護(hù)物品，如防護(hù)服裝、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接觸，應(yīng)立即用大量的水沖洗并前往醫(yī)院治療。

? 1.注意事項(xiàng)：

樣品用TRIpure LS勻漿后，如果不即刻加入氯仿之前，置于-70°C下可放置一個(gè)月以上。保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2-8°C可以保存一周，-20°C條件下可以保存1年。RNA半衰期比較短，容易降解，建議提取后盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Northern Blot等。

2.若下游實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA非常敏感，建議用 RNase free DNase I（貨號(hào)：RN45）對(duì)RNA進(jìn)行處理。

3.自備試劑：氯仿、異丙醇（新開(kāi)封或提取RNA專用）、75%乙醇(用DEPC處理過(guò)的水配制)、RNase free water或者DEPC處理過(guò)的水。

4.本公司生產(chǎn)TRIpure Reagent LS質(zhì)量?jī)?yōu)異，可以完美替代Invitrogen的Trizol Reagent LS。提取質(zhì)量和下游實(shí)驗(yàn)完全一樣。

? RNA抽提操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）杭州昊鑫生物科技股份有限公司

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提示：用TRIpure LS抽提RNA時(shí)要戴手套和護(hù)眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學(xué)通風(fēng)櫥完成操作。避免呼吸道吸入。如無(wú)特殊說(shuō)明，所有的操作應(yīng)該在15~30°C的室溫條件下。1.勻漿

a.生物液體：每0.25ml液體樣品(血清，血漿，腦脊液等等)加入0.75ml TRIpure LS，用加樣槍吹打液體樣品幾次以幫助裂解樣品中細(xì)胞。每5~10×106個(gè)細(xì)胞至少加入0.75ml TRIpure LS。TRIpure LS 和液體樣品的終體積比總是3：1。b.動(dòng)物組織：用glass或強(qiáng)力勻漿器攪勻組織樣品，每50~100mg組織或者0.25ml組織懸液加0.75ml的TRIpure LS。一般50~100mg組織體積都要小于0.25ml，如果組織樣品的體積小于0.25ml，加入滅菌水將組織樣品體積調(diào)整到0.25ml以保證體積比例是3：1。

c.單層生長(zhǎng)細(xì)胞：直接往直徑3.5 cm的培養(yǎng)板中加入0.3ml-0.4ml的TRIpure LS裂解細(xì)胞，用加樣槍吹打幫助充分裂解細(xì)胞。依據(jù)培養(yǎng)板的面積而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量來(lái)決定所需的TRIpure LS量（每10cm2加0.3-0.4ml）。不需要往裂解物里面加水，因?yàn)榕囵B(yǎng)板中附著殘留的培養(yǎng)液已經(jīng)充分稀釋了TRIpure LS。注意：貼壁培養(yǎng)細(xì)胞往往不能完全從培養(yǎng)瓶（皿）脫落，這并不意味著裂解不完全，此時(shí)細(xì)胞膜實(shí)際已經(jīng)完全破裂開(kāi)，并已釋放出RNA，繼續(xù)做即可。d.細(xì)胞懸液：通過(guò)離心來(lái)沉淀細(xì)胞。在TRIpure LS試劑中用移液管反復(fù)吹打來(lái)裂解細(xì)胞。每5~10×106的動(dòng)物細(xì)胞，植物或酵母菌細(xì)胞或每1×107細(xì)菌加0.75ml的TRIpure LS。和步驟b一樣用滅菌水調(diào)節(jié)樣品體積到0.25毫升。在加入TRIpure LS前應(yīng)避免洗滌細(xì)胞，因?yàn)槟菢訒?huì)增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和細(xì)菌可能需要使用勻漿器。

e.植物組織：取新鮮植物組織在液氮中充分研磨或?qū)⒅参锝M織剪碎后直接在TRIpure LS中迅速研磨，每50-100mg組織加入0.75ml TRIpure LS，和步驟b一樣用滅菌水調(diào)節(jié)樣品體積到0.25毫升，混勻。

2.3.將勻漿樣品劇烈震蕩后在室溫條件下放置5分鐘以使核蛋白體完全解離?？蛇x步驟： 在4°C的條件下以12,000 rpm的離心力離心10分鐘，取上清。杭州昊鑫生物科技股份有限公司

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如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或肌肉，植物的塊莖結(jié)節(jié)等可離心去除。離心后的沉淀中包含有細(xì)胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織的樣品時(shí)，上層是大量油脂應(yīng)除去。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步。4.每0.75ml TRIpure LS加0.2ml氯仿。蓋緊管蓋，劇烈震蕩15秒并將其在室溫下放置2~3分鐘。5.在4°C 12,000 rpm的離心力高速冷凍離心10-15分鐘。離心后混合物分成三層：下層有機(jī)苯酚氯仿層，中間層，上層無(wú)色的水樣層。RNA無(wú)一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所加TRIpure LS容量的70%。（有機(jī)層和中間層是蛋白和DNA，如果需要提取，請(qǐng)聯(lián)系我們索取提取方法）。6.將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的離心管中，加入等體積異丙醇。顛倒混勻后室溫放置10分鐘。

RNA沉淀在離心前通常不可見(jiàn)，離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。

7.8.在室溫或者4°C 12,000 rpm 離心10分鐘，棄上清。

加入75%乙醇洗滌沉淀。每使用0.75ml TRIpure LS用1ml 75%乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌。9.在室溫或者4°C 12,000 rpm離心3分鐘，棄上清，注意不要丟失RNA沉淀。注意：剩余的少量液體可短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸棄沉淀。? 10.室溫放置2-3分鐘，晾干。加入30-100μl RNase free水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。

注意：沉淀不要過(guò)分干燥，以免難于溶解。