第一篇：組織或全血抽提基因組DNA裂解液配方

組織或全血抽提基因組DNA裂解液配方

裂解液配方： 10mM Tris-Cl(pH 8.0)、15mM NaCl、10mM EDTA(pH8.0)、0.4%SDS。200 μg/ml蛋白酶K（使用之前加入）。

（1）1M Tris-Cl(pH8.0)

800ml水中溶解121.1g Tris堿，待溶液冷卻至室溫后加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0(約需42ml濃鹽酸)，定容至1L，高溫高壓滅菌備用。（2）5M氯化鈉

800ml水中溶解292.2g氯化鈉，加水定容至1L，高溫高壓滅菌備用。（3）500 mM EDTA(pH8.0)

800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na。2H2O），磁力攪拌助溶，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0（約需20g NaOH顆粒），定容至1L，高溫高壓滅菌備用。（EDTA二鈉鹽需要調(diào)節(jié)pH至8.0時才能完全溶解）。（4）10% SDS

900ml水中溶解100g SDS加熱助溶，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，加水定容至1L，無需滅菌。

（5）蛋白酶K；

滅菌水配置成20mg/ml，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第二篇：小鼠基因組DNA抽提原理、儀器試劑和操作步驟

小鼠基因組DNA抽提原理、儀器試劑和操作步驟

一、原理與意義

先用細胞裂解液對已制備好的組織勻漿充分裂解，然后用蛋白酶去除其中的蛋白，再用氯仿一次抽提（無需用酚抽提）、預備液沉淀、RNase去除 RNA、乙醇再沉淀即可得到完整DNA。該方法適用于從人或動物的各種組織、血液、培養(yǎng)細胞、G+/G-細菌中快速抽提基因組DNA。抽提出來的DNA能用于幾乎所有的分子生物學實驗，如DNA梯度分析、PCR、限制性內(nèi)切酶反應、克隆、Southern Blot分析等。

二、試劑及其配制

抽提試劑盒購于上海生工公司，內(nèi)含以下試劑：

1、TE緩沖液：PH8.0，由10 mM Tris HCl和1 mM EDTA配成。

2、RNase A（3 mg）：使用前加入300 ul無菌雙蒸水，煮沸10 min后使其自然冷卻后使用，-20 ℃凍存。

3、Proteinase K（12 mg）：使用前加入600 ul無菌水，分裝成小份，-20 ℃凍存。

4、Cell Lysis Solution與Precipitation Solution：溶液出現(xiàn)絮狀沉淀50 ℃加熱溶解后使用。5、1.2 mol/L NaCl。冰冷乙醇和氯仿自備。

三、實驗器材

水浴鍋、普通冰箱、1.5/2 ml離心管、移液器及槍頭、紫外分光計、離心管架、剪刀、鑷子、濾紙等。

四、操作步驟

1、組織勻漿制備：取30 mg左右新鮮組織，加600 ul TE緩沖液，手工勻漿數(shù)次。

2、細胞裂解：吸取300 ul勻漿加600 ul Cell Lysis Solution，混勻。

3、消化蛋白：再加入9 ul Proteinase K（可適當增加）混勻，置于55 ℃水浴30 min以上（可達2.5 h），其間上下混勻幾次。

4、氯仿抽提：加入600 ul氯仿（用戶自備），輕柔上下混勻，不能太劇烈，以保證DNA的完整性。

5、沉淀：在臺式離心機上，10000轉(zhuǎn)/分，室溫離心2 min。此時應分成三層，基因組DNA在上層中，如未能分層，表明樣品與氯仿未混勻（可通過延長離心時間或增加離心速度獲得上清）。取500 ul上清液，置于無菌1.5 ml離心管中，加入500 ul Precipitation Solution，混勻多次至出現(xiàn)絮狀物，室溫靜置2 min。10000轉(zhuǎn)/分，離心2 min。

6、去除RNA：棄除上清，注意不要倒掉沉淀，立即加入100 ul 1.2 mol/L NaCl，輕輕振蕩直至DNA樣品完全溶解，加入3 ul RNase A，置于37 ℃ 10 min，以去除RNA。

7、沉淀DNA：加入300 ul冰冷乙醇（終濃度為75%，沉淀效果最佳），-20 ℃放置10 min。10，000轉(zhuǎn)/分，離心2 min。倒掉乙醇，倒置室溫干燥10~15 min。若DNA量多，可再重復沉淀一次。DNA用TE緩沖液或100 ul三蒸水溶解。

五、注意事項

1、應避免多次凍融樣品，因為每次凍融都大大降低完整DNA的產(chǎn)率。

2、加氯仿充分混勻，若離心后上清不到500 ul，可適當延長離心時間或增加離心速度。

3、吸取DNA上清時，可用剪刀稍剪槍頭尖部，以防止虹吸現(xiàn)象。

4、操作步驟中許多數(shù)值可進行成比例改變，如上清與預備液按1：1，氯化鈉與無水乙醇按1：3等。

5、轉(zhuǎn)錄活性很高的組織或細菌中通常含有大量的RNA，他們可能與DNA一起被分離出來。RNA的存在并不影響PCR反應。如果需要制備RNA-free的基因組DNA?？稍诘?步加入200 ul的RNase A，37 ℃保溫10 min即可。

6、用分光光度計測量DNA含量按1 OD260=50 mg基因組DNA；進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳判定DNA的完整性，也可以判定樣品中是否有RNA。本試劑盒可抽提長抵達50kb以上的DNA。一般在 DNA樣品，OD260/OD280比值大于1.8，可能存在RNA；OD260/OD280比值小于1.6，可能存在蛋白質(zhì)或酚。但RNA樣品中 OD260/OD280比值小于2可能存在蛋白質(zhì)或酚，均需要進一步純化。

7、通常50ul體系PCR反應中用1~5 ul DNA。

第三篇：苯酚-氯仿法從小鼠尾巴中抽提基因組DNA

從小鼠尾巴中抽提基因組DNA

一、試劑與材料

⑴ 裂解液：50mM Tris(pH8.0)100mM EDTA 0.5% SDS ⑵ 蛋白酶K(Proteinase K)10mg/ml(溶解在pH8.0,50mM Tris和1mM CaCl2中，-20℃保存)。使用時，終濃度達到100ug/ml

⑶ RNaseA RNaseA溶液配制

將RNaseA溶解在0.001mol／l醋酸鈉（pH5.2）中，使終濃度為10mg／ml，加熱到 100℃，15min。室溫下緩慢冷卻，用0.1體積的1M的Tris-Cl調(diào)整pH至7.4后，小管分裝保存在-20℃。使用時，終濃度為100ug/ml.⑷ Tris平衡苯酚；

氯仿（三氯甲烷）；

Tris平衡苯酚:氯仿=1:1(體積比)3M 醋酸鈉（pH5.2）；

無水乙醇； 70%乙醇；

無菌ddH2O.⑸ 手術剪，1.5mlEP管.二、方法

⑴ 剪取0.5cm小鼠尾巴(約20-30mg)，立即放入細胞凍存管并投入液氮中（防止基因組DNA降解）。

⑵ 從液氮中取出鼠尾，剪碎，放入1.5mlEP管中，加入350ul裂解液、20ul蛋白酶K和0.9ul RNaseA，混勻。

⑶ 在熱孵育器中，55℃過夜。（剛開始可每隔30min搖晃一次）

后續(xù)操作可在冰上進行---⑷ 取出EP管，加入等體積Tris平衡苯酚，用力搖晃3min；12000g，離心10分鐘。

⑸ 輕輕吸取上清至一新的1.5mlEP管中（寧可少吸，也不要吸到下層的苯酚或沉淀物）。

⑹ 向上清中加入等體積苯酚/氯仿，用力搖晃2分鐘；12000g，離心2分鐘。⑺ 吸取上清至另一新的1.5mlEP管中，加入1/10體積的醋酸鈉溶液和2.5倍體積的無水乙醇，搖勻。

⑻ 12000g，離心1分鐘，盡可能吸除上層乙醇。

⑼ 加入1ml，70%乙醇漂洗DNA，用力搖勻。（此步為了去除殘留的SDS和苯酚）

⑽ 12000g，離心1分鐘，去除乙醇，再重復⑼、⑽一次（為了盡可能把DNA清洗干凈）。

⑾ 將EP管倒置在吸水紙上，以吸干乙醇。

⑿ 用65℃預熱的無菌ddH2O,35ul溶解DNA，-20℃保存。⒀ 分光光度計檢測純度、濃度。

DNA提取的注意事項

1、裂解液要預熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進DNA溶解。

2、酚一定要堿平衡。苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到皮膚、粘膜和眼睛會造成損傷，因此應注意防護。氯仿易燃、易爆、易揮發(fā)，具有神經(jīng)毒作用，操作時應注意防護。

3、各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解。

4、取各上清時,不應貪多,以防非核酸類成分干擾。

5、異丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要預冷,以減少DNA的降解,促進DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀。

6、提取DNA過程中所用到的試劑和器材要通過高壓烤干等辦法進行無核酸酶化處理。

7、所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。

8、用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA的可能性。

9、要用新鮮樣品或液氮冷凍-70度保存的樣品。這樣通過降低內(nèi)切酶的活性DNA的降解。

10、避免劇烈吸打DNA，不能攪動基因組DNA。

11、吸取基因組DNA時，要用專用的粗口吸頭，普通吸頭可能會切斷DNA或造成DNA缺口。

12、基因組應4度保存，如-20度保存可能導致DNA斷裂。

13、在準備實驗的過程中，應將DNA樣品放在碎冰上。

14、用Tris緩沖液溶解DNA。

15、加緩沖液后，為了加速DNA溶解，可以輕輕晃動或輕彈試管。

16、加入緩沖液后，置于4度過夜，也可以溶解DNA

17、將DNA溶液65度溫育10分鐘，可以滅活DNase。

18、在抽提過程中如果水相和有機層的界面不太清楚，說明其中蛋白質(zhì)含量較高，可增加酚/氯仿抽提的次數(shù)或適當延長離心的時間。

19、酚抽提時如果上清液太粘稠，無法進行水相轉(zhuǎn)移時，可加入適量TES稀釋后再抽提。

基因組DNA提取方法

制備基因組DNA是進行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小于100-200kb。在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實驗打下基礎。主要是CTAB方法，其他的方法還有1物理方式:玻璃珠法,超聲波法,研磨法,凍融法。2化學方式：異硫氰酸胍法,堿裂解法3生物方式:酶法。根據(jù)核酸分離純化方式的不同有:硅質(zhì)材料、陰離子交換樹脂等

試驗步驟：

1、貼壁細胞用胰酶消化，離心收集。

2、細胞重懸于冰冷的PBS漂洗一次，離心收集。試驗步驟2再重新作一邊。

3、加入5mlDNA提取緩沖液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混勻。

4、加入25ul蛋白酶K,使終濃度達到100ug/ml,混勻，50℃水浴3h，5、用等體積的酚抽提一次，2500rpm離心收集水相，用等體積的（酚，氯仿，異戊醇）混合物抽提一次，2500r/min離心收集水相

6、用等體積的氯仿，異戊醇抽提一次。加入等體積的5mol/L的LiCL,混勻，冰浴，10min.。7、2500rpm離心10min.轉(zhuǎn)上清于一離心管中。加入等體積的異丙醇。室溫10min。2500rpm,離心10min。棄上清。

8、加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(PH5.2)與2倍體積-20℃預冷無水乙醇。-20℃20min。9、12000r/min,室溫離心5min。棄上清。將DNA溶于適量TE中。

外周血DNA提取技術

分離外周血白細胞提取方法： 試驗步驟：

1、取人肘靜脈血5ml，EDTA抗凝，2500rpm離心10min。

2、小心吸取上層血漿，分裝到3個0.5ml離心管中。

3、在血細胞中加入3倍體積的溶血液，搖勻，冰浴15min。4、2500rpm離心10min，棄上清。

5、加入10ml溶血液，搖勻，冰浴15min。6、3000rpm離心10min，棄上清。

7、倒置離心管，去掉殘液。

8、得白細胞，－80?C凍存。試驗要求： 血至分離白細胞之間隔時間在室溫下放置不超過2h，4℃放置不超過5h，以防白細胞自溶。

氯仿法抽提外周血白細胞基因組DNA： 試驗試劑： Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加滅菌去離子水至1000ml，高壓滅菌。

ACD抗凝劑：檸檬酸1.68g檸檬酸鈉4.62g葡萄糖5.15g；最后加滅菌去離子水至350ml，高壓滅菌。

提取緩沖液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加滅菌去離子水至100ml，高壓滅菌

試驗步驟：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分顛混至清亮。以4000rpm，離心5min。棄上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分勻漿。以6000rpm，離心5min。

3、徹底棄去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解細胞），混勻置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，顛混，37℃過夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl飽和酚（取溶液下層）緩慢搖晃10min，以5500rpm，離心15min。

6、取上清，每管加入250μl飽和酚和250μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，適量無水乙醇（預冷）至滿，搖勻放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，離心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，離心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl滅菌去離子水，轉(zhuǎn)彈，混勻。NaI提取法提取外周血白細胞基因組： 實驗步驟：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm離心12min。

2、棄上清，加雙蒸水200ul溶解，搖勻20s。

3、混勻后加6MNaI溶液200ul，搖勻20s。

4、加入氯仿/異戊醇（24：1）400ul，邊加邊搖，搖勻20s，12000rpm離心12min。

5、取上層液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍體積異丙醇，搖勻20s，室溫放置15min，靜置后的反應體系15000rpm離心12min，使沉淀緊貼eppendorf管壁。

6、棄異丙醇，加70％乙醇1ml（不振動），以15000rpm離心12min。

7、棄乙醇，敞開eppendorf管蓋，烘干（37℃恒溫箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

常用的外周血白細胞基因提取方法： 試驗原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復抽提，使蛋白質(zhì)變性，SDS(十二烷基磺酸鈉)將細胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子，核蛋白變性降解，使DNA從核蛋白中游離出來。DNA易溶于水，不溶于有機溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團，也容易進行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能順利地進入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當有機溶液存在時，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機溶劑在試管底層(有機相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質(zhì)。氯仿的作用是有助于水相與有機相分離和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍體積的無水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的鹽，真空干燥，用TE緩沖液溶解DNA備用。

試驗步驟：

1、將1mlEDTA抗凝貯凍血液于室溫解凍后移入5ml離心管中，加入1ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS），混勻，3500rpm離心15min,傾去含裂解紅細胞的上清。重復一次。用0.7mlDNA提取液混懸白細胞沉淀，37℃水浴溫育1h。

2、將上述DNA提取液混懸白細胞，37℃水浴溫育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至終濃度為100-200ug/ml,上下轉(zhuǎn)動混勻，液體變粘稠。50℃水浴保溫3h，裂解細胞，消化蛋白。保溫過程中，應不時上下轉(zhuǎn)動幾次，混勻反應液。

3、反應液冷卻至室溫后，加入等體積的飽和酚溶液，溫和地上下轉(zhuǎn)動離心管5-10min，直至水相與酚相混勻成乳狀液。5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復酚抽提一次。加等體積的氯仿﹕異戊醇（24﹕1），上下轉(zhuǎn)動混勻，5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復一次。

4、加入1/5體積的3mol/LNaAc及2倍體積的預冷的無水乙醇，室溫下慢慢搖動離心管，即有乳白色云絮狀DNA出現(xiàn)。用玻璃棒小心挑取云絮狀的DNA，轉(zhuǎn)入另一1.5ml離心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm離心5min。洗滌DNA，棄上清，去除殘留的鹽。重復一次。室溫揮發(fā)殘留的乙醇，但不要讓DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于搖床平臺緩慢搖動，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

真核細胞DNA的制備

一般真核細胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養(yǎng)細胞或低溫保存的組織細胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細胞，隨后用酚抽提而實現(xiàn)的。這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫構(gòu)建等實驗。

根據(jù)材料來源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提取方法大體類似，但都應考慮以下兩個原則：

1、防止和抑制DNase對DNA的降解。

2、盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞。試劑準備：

1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解緩沖液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4、20%SDS 5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris飽和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、無水乙醇、75%乙醇 試驗步驟： 材料處理：

1、新鮮或冰凍組織處理：

1)取組織塊0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。2)將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混勻。4)60°C水浴1-3hr。

2、培養(yǎng)細胞處理：

1)將培養(yǎng)細胞懸浮后，用TBS洗滌一次。2)離心4000g×5min，去除上清液。3)加10倍體積的裂解緩沖液。4)50-55°C水浴1-2hr。DNA提?。?/p>

1、加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。

2、離心5000g×10min，取上層水相到另一1.5ml離心管中。

3、加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

4、加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復此步驟數(shù)次。

5、加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

6、加1/10體積的3M醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積的無水乙醇，輕輕倒置混勻。

7、待絮狀物出現(xiàn)后，離心5000g×5min，棄上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗滌，離心5000g×3min，棄上清液。

9、室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50-100mlTE溶解過夜。

植物組織中DNA的提取

試驗原理：

脫氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在于細胞核中，鹽溶法是提取DNA的常規(guī)技術之一。從細胞中分離得到的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA，其中還含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開是技術的關鍵。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA則能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用這一性質(zhì)就可以將二者從破碎細胞漿液中分開。制備過程中，細胞破碎的同時就有Dnase釋放到提取液中，使DNA因被降解而影響得率，在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白質(zhì)變性而與核酸分離，再加入陰離子去垢劑0.15％的SDS，經(jīng)過2h攪拌，或用氯仿－異醇除去蛋白，通過離心使蛋白質(zhì)沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的預冷乙醇即可把DNA從除去蛋白質(zhì)的提取液中沉淀出來。

植物DNA的SDS提取法： 試驗試劑：

1、研磨緩沖液：稱取59.63gNaCl，13.25g檸檬酸三鈉，37.2gEDTA－Na分別溶解后合并為一，用0.2mol/L的NaOH調(diào)至pH7.0，并定容至1000ml。2、10×SSC溶液：稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉，分別溶解，一起定容至1000ml。3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀釋10倍。4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀釋10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前經(jīng)80℃水浴處理5min（以破壞可能存在的Dnase）。

6、氯仿－異戊醇：按24ml氯仿和1ml異戊醇混合。7、5mol/L高氯酸鈉溶液：稱取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸餾水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸鈉）化學試劑的重結(jié)晶：將SDS放入無水酒精中達到飽和為止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁熱過濾，冷卻之后即將濾液放入冰箱，待結(jié)晶出現(xiàn)再置室溫下涼干待用。9、1mol／LHCl。10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛試劑：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml濃硫酸，裝入棕色瓶，貯存暗處，使用時加0.1ml乙醛液［濃乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA標準液：取標準DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷卻后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，則得100μg/ml的標準溶液。

實驗步驟：

1、稱取植物幼嫩組織10g剪碎置研缽中，加10ml預冷研磨緩沖液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊狀。

2、將勻漿無損轉(zhuǎn)入25ml刻度試管中加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，加上塞子，劇烈振蕩30s，轉(zhuǎn)入離心管，靜置片刻以脫除組織蛋白質(zhì)。以4000rpm離心5min。

3、離心形成三層，小心地吸取上層清液至刻度試管中，棄去中間層的細胞碎片、變性蛋白質(zhì)及下層的氯仿。

4、將試管置72℃水浴中保溫3min（不超過4min），以滅活組織的DNA酶，然后迅速取出試管置冰水浴中冷卻到室溫，加5mol/L高氯酸鈉溶液［提取液：高氯酸鈉溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1mol/L。

5、再次加入等體積氯仿－異戊醇混合液至大試管中，振蕩1min，靜置后在室溫下離心（4000rpm）5min，取上清液置小燒杯中。

6、用滴管吸95％的預冷乙醇，慢慢地加入燒杯中上清液的表面上，直至乙醇的體積為上清液的兩倍，用玻璃棒輕輕攪動。此時核酸迅速以纖維狀沉淀纏繞在玻璃棒上。

7、然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最終濃度為1×SSC。

8、重復第6步驟和第7步驟即得到DNA的粗制品。

9、加入已處理的Rnase溶液，使其最后的作用濃度為50～70μg/ml，并在37℃水浴中保溫30min，以除去RNA。

10、加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，在三角瓶中振蕩1min，再除去殘留蛋白質(zhì)及所加Rnase蛋白，室溫下以4000rpm離心5min，收集上層水溶液。

11、再按6、7步驟處理即可得到純化的DNA液。植物DNA的CTAB提取法： 試驗步驟：

1、稱取新鮮葉片2-3g，剪碎放入研缽中，在液氮中研磨成粉末。

2、將粉末轉(zhuǎn)移到加有7ml經(jīng)預熱的15×CTAB提取緩沖液15ml離心管中，迅速混勻后置于65℃水浴中，溫育30min。

3、取出離心管,冷卻至室溫，加入氯仿/異戊醇(24:1)，充分混勻，室溫下2300轉(zhuǎn)離心20min。

4、將上清轉(zhuǎn)移至另一新的15ml離心管中，加入1/10體積10%的CTAB和等體積的氯仿/異戊醇。充分混勻，2300rpm離心20min。

5、轉(zhuǎn)移上清至另一新的15ml離心管中，加入等體積1%的CTAB沉淀緩沖液，輕輕搖晃至形成DNA絮狀沉淀。1000rpm離心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中過夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃預冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml離心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、離心機甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超凈工作臺上吹干。

9、將風干的DNA直接在4℃保存?zhèn)溆没蛉苡?00μlTE溶液中于-20℃保存。

細菌DNA的提取方法

針對一些不易于提取的細菌的方法: 試驗試劑：

抽提緩沖液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MLiCl 2MLiCl DEPC-water（抑制RNA酶活性）3MNaAc(pH5.2)96%乙醇 70%乙醇 試驗步驟：

1、抽提緩沖液65℃預熱。

2、加菌體到已經(jīng)預熱的緩沖液（700ul）中混勻，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振蕩，以12,000rpm，離心10min。

4、取上清，加氯仿/異戊醇（24：1）振蕩，以12,000rpm，離心10min。

5、重復再作一次步驟4。

6、加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，離心10min。

8、棄上清，以70％乙醇條洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。較為常用的細菌DNA提取方法： 實驗步驟：

1、將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。

2、取1.5ml培養(yǎng)物12000rpm離心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE緩沖液，反復吹打使之重新懸浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h.4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻后再65℃溫育10min。

5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇． 真菌DNA提取總結(jié)的兩種方法： 第一種方法： 試驗步驟：

1、取真菌菌絲0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振蕩混勻。

3、加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1)，渦旋3～5min（此處是粗提沒有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，離心5min。

5、上清再用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

6、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷的異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀,混勻,靜置約30min。

7、用毛細玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復漂洗數(shù)次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干，重懸于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下處理1h。

9、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

10、取上清，加入1/10倍體積的3MNaAc,2.5倍體積的無水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，風干,溶于200ulTE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。第二種方法： 試驗步驟：

1、真菌菌絲0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃預熱的DNA提取緩沖液，快速振蕩混勻65℃水浴30min,期間混勻2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃離心5min）。

5、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇,混勻,靜置約30min。

6、用毛細玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復漂洗數(shù)次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干，重懸于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃處理1h。

8、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，風干,溶于200ulTE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

石蠟包埋DNA提取試驗方法

試驗原理：

從石蠟包埋組織中提取DNA的基本步驟，是在常規(guī)DNA提取方法的基礎上改良和演變而業(yè)。Goelz等（1985）最先提出的石蠟包埋組織DNA提取技術，是用機械的方法破碎組織，切除多余的石蠟，進入含SDS和高濃度蛋白酶K（１mg/ml）的提取緩沖液加溫孵育，然后進行苯酚和氯仿抽提。所得DNA雖不完整，但可被限制性內(nèi)切酶切割，因而適于點雜交，印跡雜交等多種分了生物學實驗。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改進。首先通過組織切片和二甲苯和脫蠟，保證了組織的完全破碎，使細胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過兩步消化的方法，將不適于做分子雜交的降解的DNA小段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，從而提DNA質(zhì)量，適于做Sorthern印跡雜交分析。

試驗試劑：

配方：3mol/lNacl，0.3M檸檬酸三鈉·2H2O，用HCL調(diào)PH值至7。0 石蠟消化液：150nmol/lNacL：15mmol/l檸檬酸鈉，1%SDS，PH7.0。試驗步驟：

1、取蠟塊切片15-20張（8μm），置于eppendorf管中，加入1ml的二甲苯，37℃作用3h，以10000rpm，離心3min，傾去二甲苯。重復3-4次，觀察管壁是否光滑。如果仍有蠟質(zhì)殘存，需繼續(xù)脫蠟。

2、剃度酒精水化：加入100%乙醇1ml，室溫下放置30min，以10000rpm離心3min，去上清；再依次分別加入95%；75%；50%的乙醇重復上面的步驟。

3、消化：以1×SSC500μL加入SSC洗滌沉淀，以12000rpm離心3min。棄去上清夜，干燥沉淀。加入石蠟消化液400μL，PK（20mg/ml）20μl；55℃消化120h，第四天，補加PK10μl。

4、消化后的液體很清亮，肉眼可見的組織較少。將其轉(zhuǎn)入98℃的水浴箱中，煮沸10min，以滅活PK，取出后置于冰上，使其迅速冷卻。以10000rpm，離心5min。

5、取上清加等量的酚-氯仿，輕顛倒混勻呈乳白色。低溫下以14000rpm，離心10min。小心取上清，再加入等量的酚-氯仿重復上面的步驟。

6、取上清加入預冷的兩倍體積的無水乙醇及1/10的乙酸鈉（PH5.2），顛倒混勻。置于-20℃，30min。低溫下以14000rpm，離心10min，去上清。

7、沉淀用1ml的70%乙醇洗滌2次，（顛倒eppendorf管數(shù)次）以14000rpm，離心5min，自然干燥沉淀。

8、加TE20μl，（含RNA酶），4℃下過夜。注意事項：

1、取材時應避免出血壞死的組織，盡可能選用新鮮的標本。

2、消化時應不時震搖離心管，使酶與組織充分接觸。

3、福爾馬林固定和石蠟包埋使組織變得堅韌，勻漿的效果往往不理想，可將組織切成10um的薄片進行消化。

4、消化不完全，可采用高濃度蛋白酶K及延長消化時間。附：elz氏DNA提取方法的主要步驟：

提取液的制備：500mmol/LTris20mmol/LEDTA10mmol/LNaCl1％SDS 500μg/ml蛋白酶ＫpH8.0

1、切除多余石錯，暴露組織。將組織切碎（最大徑<0.5mm），稱重。

2、溶于TE9提取液(組織<50mg/5ml.50－500mg/10ml),高速混懸2－3min，于48℃放置24h。

3、再次混懸組織，加入蛋白酶Ｋ至終濃度１mg/ml，SDS至２％，孵育40h。

4、用等體積酚－氯仿溶液抽提３次。2.5倍體積乙醇沉淀DNA。-70℃放置２－４h。9000rpm離心１h。

5、沉淀物用70％乙醇洗１次，干燥，TE（pＨ7.2）溶解。

DNA提取其他方法

適用于PCR研究的快速提取法： 試驗步驟：

1、田間剪取植株新鮮葉片5－10mg（約2cm長）左右，新鮮葉片放于15ml離心管中，存于冰盒中，根據(jù)樣品號貼上相應的標簽。

2、用剪刀將葉片組織剪細（約0.5cm長）放在點穴式研板中。加入400μlDNA提取緩沖液，用玻棒將葉組織研細，直到液體變成深綠色即可。

3、加400μlDNA提取緩沖液，混合均勻，轉(zhuǎn)入一新的15ml離心管（貼上相應的編號）。

4、加400μl氯仿，混合均勻后，2400轉(zhuǎn)離心30s，將上清液轉(zhuǎn)入一支新的15ml離心管（貼上相應的編號）。

5、加800μl無水乙醇，混勻，2400轉(zhuǎn)離心3min。棄上清。70%乙醇沖洗，風干。用50μlTE緩沖液溶解，存于－20℃。取1μl用于PCR分析。

Chelex-100法提取DNA： 試驗原理：

Chelex-100是一種化學螯合樹脂，由苯乙烯、二乙烯共聚體組成。含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，對高價金屬離子有很高的親合力和螯合作用。在低離子強度、堿性及煮沸條件下，可以使細胞膜破裂，并使蛋白質(zhì)變性，DNA游離。Chelex-100特別適用于微量生物樣本的處理，方法簡便快速，提取過程始終在同一管中進行，不用轉(zhuǎn)移，可減少DNA的損失，操作步驟簡化，減少了污染的機會。

以血液為例實驗步驟：

1、取血液1-3?l，置1.5ml離心管中，加滅菌雙蒸水1ml，振蕩混勻，室溫30min，或置冰箱-20℃5min。2、10000r/min離心5min，棄上清，反復2-3次。

3、于沉淀中加入200?l懸浮好的5%的Chelex-100溶液，56℃水浴2h或37℃水浴過夜。

4、振蕩5-10秒，置100℃5-10min，取出振蕩溶液5-10s。5、10000r/min5min，上清液即可作為PCR反應的DNA模板。注意事項：

1、Chelex-100處理模板僅適用于PCR反應，處理液不宜長期保存，如果保存的時間稍長，可將上清液轉(zhuǎn)移至另一管中保存?zhèn)溆?。一般在一周?nèi)使用，如果保存時間過長則會影響PCR擴增結(jié)果。

2、在處理模板的各個步驟中，振蕩要充分。

3、煮沸的溫度、時間要充分，否則將影響擴增。

4、使用前要混勻離心，取上清液作為模板，如果PCR反應體系中含有Chelex-100，Mg2+會被螯合，降低酶活性，使PCR擴增失敗。

硅珠法提取DNA： 試驗原理： 在高濃度的硫氰酸胍存在的條件下，DNA能夠被二氧化硅特異性吸附，當沒有硫氰酸胍存在時，DNA又可從二氧化硅中釋放出來。硫氰酸胍是一種高性能的蛋白變性劑，可以使蛋白質(zhì)與DNA充分分離，在硅珠吸附前高速離心可以將變性的蛋白質(zhì)及一些不溶的物質(zhì)除去。吸附后的漂洗過程則可將溶液中的PCR抑制物洗去。

試驗試劑：

1、吸附劑：12gGuSCN溶于10ml0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)，0.8ml0.5mol/LEDTA，0.5mlTritonX-100。

2、漂洗劑：12gGuSCN溶于10ml0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)。

3、硅珠懸浮液：0.06gSilica溶于1ml滅菌超純水。

4、TES：1ml1mol/LTris-HClpH8.0，2ml5mol/LNaCl，2ml0.5mol/LpH8.0EDTA，95ml滅菌超純水。

試驗步驟：

1、取1.5ml離心管1支，加入TES200ul，10%SDS40?l再加入血液2-4?l，混勻，煮沸5min。

2、振蕩混勻，加入300-600?l吸附液，混勻。

3、加入20-40?l硅珠懸浮液，振蕩混勻，置室溫15min，振蕩5s，10000r/min離心2min。

4、除去上清，于沉淀中加入200-400?l漂洗液，充分懸浮沉淀物，10000r/min離心1min。

5、去上清液，重復漂洗一次，去上清后沉淀物用70%乙醇漂洗1－2次。10000r/min5min。

6、去乙醇，置56℃ 10min，于沉淀中加入50-100?lTES，旋渦混合30s，56℃保溫10min。7、10000r/min離心10min，上清液可直接用于PCR反應。固相吸附法提取DNA： 試驗原理：

硫氰酸胍具有溶解細胞和滅活核酸酶的性質(zhì)，利用當硫氰酸胍存在時硅藻顆粒能特異性吸附DNA，而當去除硫氰酸胍時，DNA又能從硅藻上釋放出來的特性，來提取樣本中的DNA。該方法尤其適用于臨床標本的DNA提取。

試驗試劑：

1、裂解液：12gGuSCN，10ml0.1mol/LTris-HClpH6.4，2.2ml0.2mmol/LEDTApH8.0，0.3mlTritonX-100。

2、洗滌液：12gGuSCN，10ml0.1mol/LTris-HClpH6.4。試驗步驟：

1、取100?l樣品加900ul裂解液，20?l硅藻液，振蕩混合，10000r/min離心1min，去上清。

2、加1ml洗滌液，懸浮沉淀洗滌，10000r/min離心1min，再重復一次。加1ml70%乙醇洗一次，1ml丙酮洗一次，去上清，56℃ 10min。

3、加60?lTE緩沖液混勻，56℃ 10min，10000r/min離心5min，上清液備用.DNA含量的檢測和純化

DNA含量的檢測：

一種方法是通過凝膠電泳的方法檢測DNA的含量：取2-5?lDNA溶解液與0.4?l6×載樣緩沖液混合，用0.75%瓊脂糖凝膠(含EB0.5?g/ml)檢測。溴化乙錠可迅速嵌于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，嵌入DNA中的溴化乙錠受紫外光激發(fā)而發(fā)出熒光，這種熒光強度與DNA總質(zhì)量數(shù)成正比，通過比較樣品與標準品的熒光強度，對樣品中的DNA進行定量。（詳見凝膠電泳）另一方法是分光光度法，組成DNA的堿基，具有一定的吸收紫外線的特性，其最大吸收值在波長250-270之間。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后，其吸收紫外線的特性沒有改變，核酸的最大吸收波長為260nm，利用DNA的這個物理特性來測定DNA的濃度。

分光光度法的具體方法是：

1、取兩只清潔的比色杯，各加入2ml0.1mol/LNaOH校正零點。

2、以其中的一只比色杯作為空白對照，在另一只比色杯中加入4?lDNA溶液，再加入0.1mol/LNaOH至2ml混勻。

3、測定波長為260nm時的OD值，再將波長調(diào)至280nm測其OD值。

4、根據(jù)OD260=1時，雙鏈的DNA濃度為50?g/ml，單鏈DNA或RNA濃度為40?g/ml，按計算公式：樣品DNA濃度(?g/ml)=OD260×40?g/ml×稀釋倍數(shù)，計算樣品的DNA濃度。

DNA純化：

首先利用瓊膠電泳將不同分子量的DNA片段分開,將某一特定分子量區(qū)域的瓊膠切下,利用DNAextractionkit將DNA從瓊膠中溶出并濃縮。（可參考質(zhì)粒DNA的純化）實驗材料： 1、6Xgel-loadingde:15%Ficoll400,0.25%bromophenolblue,0.25%xlenecanol紫外光箱

2、DFBuffer

3、WashBuffer

4、ElutionBuffer:10mMTris-HCl(pH8.5)

5、DFColumn 6、2mlCollectionTube 實驗步驟：

1、將欲分離之DNA混合物以0.7%瓊膠電泳分離。

2、電泳后,將瓊膠置於紫外光箱上觀察,把含有欲純化之DNA片段的瓊膠部位切下。

3、將步驟B的瓊膠以藍色微量吸管盡可能戳碎。

4、加入500mlDFbuffer,55oC作用10分鐘,每2-3分鐘搖晃數(shù)次,直至瓊膠完全溶解。

5、將步驟D瓊膠溶液全部吸入DFColumn,并套上CollectionTube(收集過濾液)。6、8000rpm離心1分鐘,將過濾液倒掉。加入500mlWashBuffer,8000rpm離心1分鐘,過濾液倒掉。14000rpm離心2分鐘。

7、將DFColumn轉(zhuǎn)移至上另一乾凈的微量離心管.加入15mlElutionBuffer,室溫靜置2分鐘。8、14000rpm離心2分鐘,微量離心管內(nèi)之液體即為純化的DNA片段。

9、取0.5ml純化的DNA加入4.5mlDDW及1ml6xDNAloadingde,跑0.7%瓊膠電泳,與marker比較,估計DNA的濃度。