第一篇：冬蟲夏草產(chǎn)多糖菌株的篩選鑒定及多糖提取

冬蟲夏草產(chǎn)多糖菌株的篩選鑒定及多糖提取

摘要：為了得到多糖收率較高的冬蟲夏草菌株，從西藏那曲地五高山草甸中采集的新鮮冬蟲夏草子實(shí)體初步分離得到50株菌株，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察和18S rDNA-ITS序列分析鑒定，采用超聲輔助熱水浸提法進(jìn)行冬蟲夏草多糖的提取。結(jié)果表明，CC-3菌株Cladosporium sp.的模式菌株JN084020的18S rDNA-ITS同源相似性為100%，初步確定為冬蟲夏草的無性型，經(jīng)過超聲輔助熱水浸提后多糖收率最高為6.619%。

關(guān)鍵詞：冬蟲夏草；真菌；篩選；rDNA-ITS序列；Cladosporium sp.中圖分類號(hào)： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0240-03

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，系麥角菌科蟲草屬真菌寄生于蝙蝠蛾的幼蟲所形成的的菌蟲復(fù)合體[1]。2001年統(tǒng)計(jì)，全球冬蟲夏草種類已有400種，其中中國(guó)記載有105種左右[2]。

冬蟲夏草在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)里已經(jīng)流傳1 300多年，最早記載冬蟲夏草的文獻(xiàn)始于唐朝前期公元710年的《月王藥診》，記載冬蟲夏草能治療肺部疾病。公元780年《藏本草》記載的冬蟲夏草具有潤(rùn)肺、補(bǔ)腎的作用；1765年，趙學(xué)敏在《本草綱目拾遺》中記載冬蟲夏草的作用是潤(rùn)肺、補(bǔ)腎、益精氣，理諸虛百損；1757年，吳儀洛所著《本草從新》中指出冬蟲夏草保肺益腎，止血化痰。其后，《黔囊》《文房肆考》《四川通志》《本草圖說》等100多部古書都記載了冬蟲夏草名貴藥材[3]。

目前，研究證實(shí)冬蟲夏草有降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗纖維化、抗炎等功效，對(duì)肺臟、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心臟、肝臟等均有較好的臨床保護(hù)作用[4]。由于冬蟲夏草的生長(zhǎng)環(huán)境及人們過于采挖，冬蟲夏草已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足醫(yī)療的需求，人們開始研究冬蟲夏草成分與功能的關(guān)系，冬蟲夏草多糖作為冬蟲夏草的重要活性成分，具有抗疲勞、抗衰老、提高免疫力的作用[5-6]。表明冬蟲夏草多糖在新藥開發(fā)方面有廣闊的前景。

已報(bào)道的冬蟲夏草的無性型菌株涉及13個(gè)屬，22個(gè)種名[7]，包括細(xì)腳擬青霉（Paecilomyces tenuipes）、蟲草蚧霉屬（Lecanicilliuum sp.）、輪枝孢屬（Verticillium sp.）、被毛孢屬（Hirsutella）、頭孢屬（Cephalosporium sp.）等，其中部分冬蟲夏草的無性型還有待進(jìn)一步確定[8]。冬蟲夏草的無性型研究已成為研究熱點(diǎn)。

本研究分離篩選了50株能夠產(chǎn)多糖的菌株，分子生物學(xué)鑒定分別為蟲草蚧霉屬、枝孢菌屬、黑粉菌屬。超聲輔助熱水浸提法提取冬蟲夏草多糖，CC-3菌株的多糖得率最高為6.619%。研究結(jié)果為應(yīng)用發(fā)酵方法生產(chǎn)冬蟲夏草多糖替代冬蟲夏草應(yīng)用于醫(yī)療，以及進(jìn)一步確定冬蟲夏草多糖的功能奠定基礎(chǔ)。材料與方法

1.1 材料

新鮮冬蟲夏草采自西藏那曲地五高山草甸。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

PDA加富培養(yǎng)基：土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母膏 1 g/L、蛋白胨1 g/L、KH2PO4 1g /L、瓊脂240 g/L、MgSO4 0.5 g/L、蠶蛹粉1 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽滅菌30 min。

種子瓶液體培養(yǎng)基：KH2PO4 3 g/L、MgSO4 1.5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖9 g/L、麥芽糖19 g/L、蛋白胨 10 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4 1 g/L、MnSO4 0.5 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽滅菌30 min。

CTAB提取液：NaCl 1.4 mol/L、EDTA 20 mmol/L、CTAB 20 g/L、Tris-Cl 100 mmol/L、巰基乙醇2 g/L、pH值8.0。

苯酚 ∶氯仿 ∶異戊醇溶液=25 ∶24 ∶1。

RNA酶：1 mg/mL。

真菌通用引物：ITS1和ITS4。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冬蟲夏草菌株的分離純化

無菌條件下將新鮮的冬蟲夏草用1%HgCl2溶液消毒，用無菌水沖洗干凈，并用無菌的濾紙吸干表面的水分，分離冬蟲夏草的蛹體和子座部分，分別研磨成粉，用無菌濕棉簽蘸取粉末涂于加入氯霉素1 g/L 的PDA加富平板上，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。挑選菌絲色澤潔白、生長(zhǎng)健壯、無雜菌污染的菌株，轉(zhuǎn)接加入氯霉素1 g/L 的PDA加富試管斜面中，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，直至整個(gè)斜面都長(zhǎng)滿菌絲，選取生長(zhǎng)健壯，無雜菌的菌株即為分離得到的菌株。

1.3.2 菌種的鑒定

1.3.2.1 菌體形態(tài)觀察

將分離得到的菌株梯度劃線接種于PDA平板中，用無菌鑷子取無菌蓋玻片，斜插入培養(yǎng)基中，每天觀察并記錄菌落生長(zhǎng)情況，7 d后，拔出插片，顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)及產(chǎn)孢形式。

1.3.2.2 菌株的ITS序列測(cè)定

（1）基因組DNA的提取。采用CTAB法[9]提取基因組DNA。

（2）ITS序列分析。

ITS序列引物為真菌通用引物，ITS1和ITS4[10]。ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：DNA 2 μL、TaqDNA聚合酶0.3 μL、10×TaqBuffer（含Mg2+）2.5 μL、ITS1 2 μL、ITS4 2 μL、dNTP 2 μL、ddH2O 14.2 μL。

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s、55 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

（3）瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序。

PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，條帶清晰，用蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定后無蛋白和核酸殘留，送北京寶銳通生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

（4）ITS測(cè)序數(shù)據(jù)分析。

在NCBI中對(duì)菌株的ITS序列進(jìn)行BLAST分析，然后用MEGA5進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.3.3 提取冬蟲夏草多糖

1.3.3.1 冬蟲夏草菌絲體的制備

在無菌條件下挖取1 cm2的分離菌株的培養(yǎng)菌苔接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃搖床培養(yǎng)7 d。

按10%的接種量，接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃搖床培養(yǎng)7 d。

發(fā)酵液 8 000 r/min 離心10 min。收菌絲體、80 ℃烘干、粉碎、過80目篩，備用。

將烘干的冬蟲夏草菌絲體粉碎，過40目篩，備用。

1.3.3.2 超聲輔助熱水浸提法提取冬蟲夏草多糖

取干燥恒重的冬蟲夏草菌絲粉10 g，提取溶液為去離子水（首次加量料液比為1 g ∶20 mL，浸泡30 min之后，加水量料液比按前加量的75%遞減）。提取條件：溫度90 ℃、提取4次、每次浸提時(shí)間90 min，超聲功率150 W。

1.3.4 冬蟲夏草多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸比色法[11-12]測(cè)定。

1.3.4.1 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

取烘干至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成最終濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，取9支試管分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，各補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置10 min。于40 ℃水浴中加熱 30 min，以蒸餾水替代葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液為空白對(duì)照，于D490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。

1.3.4.2 冬蟲夏草多糖含量的測(cè)定

取冬蟲夏草多糖提取濾液，稀釋一定的倍數(shù)，取1 mL稀釋液，加入5%苯酚溶液 1 mL，搖勻、迅速加入5mL濃硫酸，搖勻、靜置10 min。于 40 ℃ 水浴中加熱30 min，以蒸餾水作空白對(duì)照，在D490 nm處測(cè)定吸光度。按回歸方程計(jì)算稀釋液多糖含量。按下式計(jì)算多糖含量：多糖含量（mg/g）=待測(cè)液中多糖濃度（mg/mL）×溶液體積（mL）×稀釋倍數(shù)/原料質(zhì)量（g）。結(jié)果與分析

2.1 冬蟲夏草菌株的分離純化

對(duì)分離出的50株生長(zhǎng)健壯、無雜菌、菌絲潔白的菌株進(jìn)行多糖的提取，并測(cè)定多糖含量，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程，計(jì)算蟲草多糖得率?；貧w方程為y=10.399x-0019 5，r=0.998 7。根據(jù)計(jì)算得到，CC-3菌株的多糖得率最高，達(dá)6.619%。不同菌株的多糖含量結(jié)果見表1。討論與結(jié)論

冬蟲夏草的生活史分為有性型的子囊孢子階段和無性型的分生孢子階段。而人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵菌絲體的冬蟲夏草均為無性型階段，因此，冬蟲夏草無性型及菌種的鑒定至關(guān)重要。

最早人們判定冬蟲夏草有性型和無性型的關(guān)系，依據(jù)假定無性型與蟲草有性型子實(shí)體有相關(guān)性，用人工誘導(dǎo)蟲草子實(shí)體的形成。人工誘導(dǎo)方法在人工誘發(fā)子實(shí)體長(zhǎng)出子囊孢子非常困難，培養(yǎng)出的蟲草子實(shí)體寥寥無幾，人工誘導(dǎo)方法只能為蟲草有性型和無性型的鑒定提供依據(jù)。

劉作易等從云南收集的新鮮冬蟲夏草（Cordyceps sinensis），利用微循環(huán)對(duì)其子囊孢子的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，并與組織和子囊孢子分離的菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，還與中國(guó)被毛孢（Hirsutella sinensis）的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示微循環(huán)的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)與分離菌株和中國(guó)被毛孢的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)相似，由此確定冬蟲夏草的無性型為中國(guó)被毛孢[13]。該方法雖操作簡(jiǎn)單，但必須要先明確此菌株的種屬關(guān)系，該方法在冬蟲夏草無性型的鑒定上也還是一種輔助手段。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，RAPD-PCR技術(shù)為確定蟲草的無性型提供了可靠的分子生物學(xué)證據(jù)，但該方法不能很好地確定菌株的種和亞種。ITS序列分析的發(fā)展，為菌株無性型與有性型關(guān)系及菌株的近緣關(guān)系方面提供了可靠證據(jù)。Kang等報(bào)道，甘肅蟲草和冬蟲夏草具有相同的 ITS序列，并認(rèn)為甘肅蟲草可能是冬蟲夏草的分類異名[14]。張澤文對(duì)古尼擬青霉菌種的完整的 rDNA的ITS 區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定并進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，分離到菌種為古尼蟲草的無性型，即古尼擬青霉（Paecilomyces gunnii）[15]。

本研究從采摘的新鮮冬蟲夏草子實(shí)體中分離得到CC-3菌株，運(yùn)用插片法對(duì)該菌株的菌絲形態(tài)和孢子結(jié)構(gòu)進(jìn)行顯微觀察，初步判斷菌株的菌屬關(guān)系，通過RAPD-PCR技術(shù)，用通用引物ITS1 和ITS4擴(kuò)增出18S rDNA片段，進(jìn)行序列比對(duì)，最后確定該菌株的種屬關(guān)系。

多糖提取方法很多，如水提醇沉方法提取多糖，在醇沉過程中會(huì)損失大量多糖；酶解法提取多糖，條件溫和、質(zhì)量好，但是經(jīng)濟(jì)價(jià)值高；熱水浸提法提取多糖，方法簡(jiǎn)單易行，但效率較低。超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)和空化效應(yīng)，使細(xì)胞破碎程度增大，加速了多糖的溶出，有利于多糖的提取。本試驗(yàn)采取超聲波輔助熱水浸提法提取蟲草多糖。

多糖測(cè)定方法也很多，通常采用硫酸-蒽酮法、苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量。硫酸-蒽酮法由于糖與蒽酮試劑的顯色深度不同，糖混合時(shí)，常因不同糖類比例造成一定的誤差。而苯酚-硫酸法測(cè)定多糖，方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、不受蛋白質(zhì)存在的影響，產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定。

從西藏新鮮的冬蟲夏草中初步分離得到50株菌株，經(jīng)過多糖含量測(cè)定，CC-3菌株多糖得率最高，為6.619%，多糖含量高達(dá)6.619 mg/g。對(duì)CC-3菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)18S rDNA序列分析，初步鑒定CC-3菌株為Cladosporium sp.菌株。

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第二篇：多糖的提取純化及分析鑒定方法研究

多糖的提取純化及分析鑒定方法研究

王霄

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥230009)

摘要：詳細(xì)介紹了動(dòng)植物多糖的常見提取純化方法的最新研究進(jìn)展，并比較了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。每種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在提取時(shí)應(yīng)根據(jù)所選材料的性質(zhì)選用不同的方法，有些方法在一定的條件下可與別的方法協(xié)同作用，并對(duì)糖的含量測(cè)定及分析鑒定方法的研究進(jìn)展作了概述。

關(guān)鍵詞：多糖；提??；純化；分析鑒定；研究進(jìn)展 中圖分類號(hào)：TU 411.01文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Progress of Polysaccharides Extraction, Purification and Identification Methods

WANG Xiao

(School of Biological and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract: This paper reviews the extraction, purification and identification methods of animal and plantpolysaccharides, and compares the advantages and disadvantages of each mothed.Each mothed has its own advantages and disadvantages, appropriate mothed should be selected according to the nature of the chosen material, and some of these methods can be synergy with other methods under certain conditions.In addition, analysis and identification of polysaccharides are outlined.Key words: polysaccharides;extraction;purification;analysis and identification;research progress

菌來源的糖綴合物具有廣泛的藥理及生物活性

0多糖概述

多糖（polysaccharide）是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，至少要超過10個(gè)以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物。由相同的單糖組成的多糖稱為多糖，如淀粉、纖維素和糖原；以沒的單糖組成的多糖稱為雜多糖，如阿拉伯膠是由戊糖和半乳糖等組成。多糖不是一種純粹的化學(xué)物質(zhì)，而是聚合程度不同的物質(zhì)的混合物。多糖類一般不溶于水，無甜味，不能形成結(jié)晶，無還原性和變旋現(xiàn)象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解過程中，往往產(chǎn)生一系列的中間產(chǎn)物，最終完全水解得到單糖。

近年來，國(guó)際上對(duì)糖及糖復(fù)合物的研究己成熱點(diǎn)，糖類結(jié)構(gòu)測(cè)定和生物活性研究取得了明顯的進(jìn)展。大量實(shí)驗(yàn)事實(shí)揭示糖類是重要信息分子，參與許多生理和病理過程

[1-2]

[3]。

在對(duì)各種中藥材化學(xué)成分研究的過程中，人

們逐步提高了對(duì)植物多糖的關(guān)注。植物多糖研究比較深入的是茶多糖、菜籽多糖、南瓜多糖、苦瓜多糖、銀杏葉多糖、枸杞多糖等等，植物多糖在抗生素替代物及保健品領(lǐng)域已經(jīng)取得很好的應(yīng)用。多糖作為重要的生物活性物質(zhì)具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降低糖脂、延緩衰老等活性，在醫(yī)療保健、食品、動(dòng)物養(yǎng)殖等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景

[4-7]。

1多糖的提取工藝

1.1 水提醇沉法

水提醇沉法是提取多糖最常用的一種方法。多糖是極性大分子化合物，提取時(shí)應(yīng)選擇水、醇等極性強(qiáng)的溶劑。用水作溶劑來提取多糖時(shí)，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提滲濾，然后將提取液濃縮后，在濃縮液中加乙醇，使其最

。到目前為止。己有

300余種多糖類化合物從天然產(chǎn)物中被分離出來，其中從中草藥、食藥用菌中提取的水溶性多糖最為重要。已發(fā)現(xiàn)有100多種中草藥、食藥用

終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì)，使多糖從提取液中沉淀出來，室溫靜置5 h，多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和得率均較高。影響多糖提取率的因素有：提取溫度、浸提料液比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)等。為此，研究者對(duì)影響多糖提取工藝的這些因素進(jìn)行了大量研究。林娟[8]

等研究表明水提法提取甘薯多糖的優(yōu)化工藝條件為：提取溫度85℃，加水比1：7，提取時(shí)間2.5h，提取率為26．71％。劉永[9]

等研究表明：最佳提取條件為95℃，料液比1：20(g：mL)，提取時(shí)間2h，提取3次，茶葉多糖含量為35.92 mg/g。

水提醇沉法提取多糖不需特殊設(shè)備，生產(chǎn)工藝成本低，安全，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，是一種可取的提取方法。但由于水的極性大，容易把蛋白質(zhì)、苷類等水溶性的成分浸提出來，從而使提取液存放時(shí)腐敗變質(zhì)，為后續(xù)的分離帶來困難，且該法提取比較耗時(shí)，提取率也不高[10]。

1.2酶法提取

酶技術(shù)是近年來廣泛應(yīng)用到有效成份提取中的一項(xiàng)生物技術(shù)，使用酶可降低提取條件，在比較溫和的條件下分解植物組織，加速有效成分的釋放或提取。此外，使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等非目的產(chǎn)物。此法可使后續(xù)的濃縮和脫蛋白工藝更簡(jiǎn)易、省時(shí)，粗多糖的純度更高。但會(huì)提高生產(chǎn)成本，對(duì)提取條件要求較高。楊云

[11]

等人采用的單酶法和復(fù)合酶法提取大棗多糖，單酶法提取多糖含量最高可達(dá)44.69％，而復(fù)合酶法多糖最高含量可達(dá)68.13％。1.3超聲波提取

超聲法是利用超聲波對(duì)細(xì)胞組織的破碎作用來提高多糖浸出率的，具有快速、安全、簡(jiǎn)便、成本低、多糖提取率高，成分又不被破壞等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)提取設(shè)備要求較高。李進(jìn)偉

[12]

等通過響應(yīng)面

分析法考察超聲波功率、提取時(shí)間、提取溫度、料液比對(duì)棗多糖得率與純度的影響，得出棗多糖最佳的提取工藝條件為：超聲波功率86～96W，提取溫度45～53℃，提取時(shí)間20min，料液比1:20（g:ml），棗多糖得率7.63%，純度35.57%。與傳統(tǒng)的水浴浸提法相比，該方法不僅縮短了提取時(shí)間，且提高了棗多糖得率與純度。1.4微波提取

微波萃取是高頻電磁波穿透萃取媒質(zhì)，到達(dá)被萃取物料的內(nèi)部，能迅速轉(zhuǎn)化為熱能使細(xì)胞內(nèi)部溫度快速上升，細(xì)胞內(nèi)部壓力超過細(xì)胞壁承受力，細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)有效成分流出，在較低的溫度下溶解于萃取媒質(zhì)，通過進(jìn)一步過濾和分離，獲得萃取物料。趙怡紅

[13]

等研究表明北冬蟲夏草

多糖微波提取最佳條件：微波功率550W、固液比l：30、提取時(shí)間30s、提取1次，多糖收率3.67％。劉青梅

[14]

等研究結(jié)果表明:對(duì)于紫菜多糖

提取微波提取優(yōu)于熱水提取,微波凍融提取效果最佳,提取率最高達(dá)7.45%,而熱水提取率為2.05%.影響微波浸提的主要因素為浸提時(shí)間,其次是微波功率和液固質(zhì)量比。優(yōu)選方案為微波功率200W、提取時(shí)間8 min、水與紫菜液固質(zhì)量比40:1。

1.5超臨界流體提取

超臨界流體提取法根據(jù)某些氣體在超臨界狀態(tài)下具有特殊的液相性質(zhì)，對(duì)一些組分有較好的溶解性，用來提取目的產(chǎn)物。一般采用CO2超臨界萃取多糖組分。朱俊玲

[15]

通過超臨界CO2流體

萃取處理蘆薈多糖，多糖得率為85.1％，是傳統(tǒng)方法的1.5倍。超臨界萃取的最佳工藝條件是乙醇用量為250 ml/100g蘆薈、萃取壓力為25 MPa、萃取溫度為35℃。1.6超濾法

超濾是一種膜分離技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用于多糖的提取，具有不損害活性、分離效率高、能耗低、設(shè)備簡(jiǎn)單、可連續(xù)生產(chǎn)、無污染等優(yōu)點(diǎn)[16]。

1.7酸提法

有些多糖適合用稀酸提取，并且能夠得到更高的提取率。如趙宇等

[17]

對(duì)海蒿子多糖的提取方

法研究發(fā)現(xiàn)，從多糖提取得率來看，酸提法優(yōu)于傳統(tǒng)的水提法。不過此方法只在一些特定的植物多糖提取中占優(yōu)勢(shì)，目前報(bào)道的并不多。不過在操作上還是應(yīng)該嚴(yán)格控制酸度，因?yàn)樵谒嵝詶l件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂。1.8堿提法

與酸提法類似，有些多糖在堿液中有更高的提取率，尤其是含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。不過，也應(yīng)控制堿的濃度，因?yàn)橛行┒嗵窃趬A性較強(qiáng)時(shí)也會(huì)發(fā)生水解。

2多糖純化方法

2.1除蛋白

根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)，用V（氯仿）∶V（戊醇或正丁醇）為5∶1 或4∶1，混合物劇烈振搖20～30 min，蛋白質(zhì)變性生成凝膠，離心分離，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。此種只能除去少量蛋白質(zhì)，效

率不高，須反復(fù)多次，多糖有損失。但此方法比較溫和，在避免多糖降解上效果較好，如配合加入一些蛋白質(zhì)水解酶，用Sevage 法效果更佳。李婉婷

[18]

研究結(jié)果表明木瓜蛋白酶-Sevage法除

去款冬花多糖中的蛋白最為理想，該法的最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶的酶底比為l％，pH值7.0，先在50℃水浴中酶解2h，再經(jīng)Sevage法脫蛋白3次，其蛋白脫除率為88.95％，多糖保留率為92.63％。2.2透析法

透析法是利用一定孔目的膜，使無機(jī)鹽或小分子糖透過，而將大分子的多糖截留下來從而達(dá)到純化多糖的目的。此法的關(guān)鍵是要選擇孔目合適的透析膜。纖維膜孔徑為2～3nm，可使單糖分子通過，分離效果較好，透析時(shí)常需要多次換水，溶液的pH值維持在6.0～6.5范圍內(nèi)。2.3凝膠柱層析法

凝膠柱層析法主要是根據(jù)多糖分子的大小和形狀不同而達(dá)到分離目的。但溶液流經(jīng)多孔性凝膠柱時(shí)，小分子已擴(kuò)散人孔中，各溶質(zhì)依分子量大小順序依次流出。此方法快速、簡(jiǎn)單、條件溫和。常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sephamse)，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑。此法還可進(jìn)行多糖相對(duì)分子量的測(cè)定。王赫

[19]

采用Sephadex G-100凝膠色譜柱

分離純化，從龍膽水溶性多糖中分離純化得到2 種不同的均一多糖組分TP-

1、TP-2。2.4纖維素住層析法

纖維素陰離子交換劑柱層析對(duì)多糖的分離是利用pH 6時(shí)，酸性多糖能吸附于交換劑上，中性多糖不吸附，用pH相同離子強(qiáng)度不同的緩沖液將酸性強(qiáng)弱不同的酸性多糖分別洗脫出來。常用的陰離子交換纖維素有DEAE-纖維素和ECTEOLA纖維素。張?zhí)m杰

[20]

等就采用DEAE-纖維素柱分離

北五味子多糖，分別得到了白色結(jié)晶和黃色粉末兩種多糖產(chǎn)物。

3多糖的分析

3.1含量的測(cè)定

測(cè)定方法：硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法、比色定量法、分光光度法、紙色譜法、離子交換色譜法、yaphe [21]

法、薄層色譜法、酶法、原子吸

收法

[22]、HPLC法、凝膠電泳法、親和電泳法連、續(xù)流動(dòng)分析法檢測(cè)法

[23]、次亞碘酸鹽定量法、蒽

酮-硫酸法（總糖）、DNS法

[24]

（還原法）、磷鉬

比色法、鄰鉀苯胺比色法等。每種方法只對(duì)某些多糖的測(cè)量效果好。比色法分光光度法離子交換色譜法酶法和電泳法等可同時(shí)用于多糖的定性定量分析。3.2純度鑒定

多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通常所說的多糖純品實(shí)質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分。多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、HPLC法等?，F(xiàn)在應(yīng)用較多的是HPLC法，旋光度測(cè)定[25]

也是純度

測(cè)定的一種方法。3.3分子量的測(cè)定

多糖分子量的測(cè)定是研究多糖性質(zhì)的一項(xiàng)重要工作常用方法：滲透壓法、蒸氣壓滲透劑法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法、超過率法、沉淀法、凝膠電泳法、HPLC法、超離心分析法、分子篩色譜法、GPC法

[26]。

4多糖的鑒定

4.1 多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，主要是分析組成多糖的單糖類型、數(shù)目連接方式及苷建構(gòu)型。常用化學(xué)法和儀器分析法。多糖組分與分子比例測(cè)定法：部分酸解法、完全酶解法、色譜法；吡喃、呋喃環(huán)形式結(jié)構(gòu)的分析：紅外光譜；連接次序：選擇性光譜法、糖苷鍵順序水解、核磁共振； α-β-異頭異構(gòu)體：糖苷酶水解核磁共振；羥基被取代情況：甲基化反應(yīng)、氣相色譜、過碘酸氧化、Smith降解法和測(cè)硫酸基法（terho法）、核磁共振、質(zhì)譜法；糖鏈、肽鏈連接方式：?jiǎn)翁桥c氨基酸組成、稀堿水解法、肼解反應(yīng)；多糖結(jié)構(gòu)的分析方法很多，迄今沒有一種方法可以單獨(dú)完成多糖結(jié)構(gòu)的分析。儀器分析與化學(xué)方法相結(jié)合是常用的多糖結(jié)構(gòu)測(cè)定方法。4.2多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

目前研究多糖的二級(jí)結(jié)構(gòu)常用的手段是NMR技術(shù)，如2D-NMR，13C譜，通用的方法是將現(xiàn)代NMR技術(shù)與理論計(jì)算相結(jié)合通過一定的理論計(jì)算篩選構(gòu)象，主要的理論計(jì)算方法有從頭計(jì)算、豐度經(jīng)驗(yàn)計(jì)算及經(jīng)驗(yàn)力場(chǎng)計(jì)算

[27]

。圓二色

譜法（CD）也可用于糖的構(gòu)象分析,張麗萍等

[28]

應(yīng)用譜測(cè)定了金頂側(cè)耳多鍺的水溶液構(gòu)象近年來，以精確三維結(jié)構(gòu)知識(shí)為基礎(chǔ)揭示重要生命活

動(dòng)的規(guī)律已達(dá)到前所未有的深度和廣度[29]，多糖

作為一類重要的生物活性大分子其結(jié)構(gòu)的研究勢(shì)

必推動(dòng)對(duì)多糖的認(rèn)識(shí)向深層次發(fā)展。多糖的應(yīng)用展望

我國(guó)對(duì)多糖的研究起步較晚，但近年來的工作取得了較大的進(jìn)展，愈來愈多的多糖被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)它們具有復(fù)雜廣泛的生物活性和功能。隨著對(duì)多糖生物活性的深入研究，多糖的生物活性機(jī)理，功效因子會(huì)更加明確，它的應(yīng)用領(lǐng)域也將會(huì)更加拓寬。然而，由于多糖本身結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，種類繁多，其結(jié)構(gòu)測(cè)定和分離純化有很大的難度；有些多糖在天然植物中的含量低且不易分離及多糖的藥理作用與諸多因素有關(guān)，給多糖的研究和應(yīng)用帶來許多的挑戰(zhàn)，這需要相關(guān)行業(yè)的人士共同應(yīng)對(duì)。

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