第一篇：中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則及其在《中國藥典》(20重點(diǎn)

《 中 藥 制 劑 分 析 》 課 程 論 文

中藥材 DNA 條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則及 其在《中國藥典》(2015年版 中的應(yīng)用

藥學(xué)(藥物分析方向 2012級(jí) 指導(dǎo)教師:高曉霞 2015 年 11月

摘要:中藥材存在多基原物種及同名異物、同物異名等問題,鑒于傳統(tǒng)基原鑒定、性 狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定方法存在局限性,為保證中藥材臨床應(yīng)用安全、準(zhǔn)確、有效, 有必要增加中藥材 DNA 條形碼分子鑒定法。如今分子生物學(xué)技術(shù)在中藥材鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用已 逐步深入?！吨袊幍洹?2010年版收載了烏梢蛇飲片、蘄蛇飲片、川貝母藥材的 DNA 分子鑒 定方法,而《中國藥典》 2015年版收載了“中藥材 DNA 條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則” , DNA 條形碼分子鑒定法是利用公認(rèn)的相對(duì)較短的 DNA 序列來進(jìn)行物種假定的一種分子生物學(xué)技 術(shù), 是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的有效補(bǔ)充。這標(biāo)志著中藥材的分子鑒定由實(shí)驗(yàn)室科研層面進(jìn)入國 家標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用層面。

關(guān)鍵詞:中藥材;DNA;鑒定;指導(dǎo)原則

一、中藥材 DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則 [1] 1.1定義及原理

該鑒定方法主要適用于中藥材(包括藥材、藥材粉末及部分藥材飲片 及基原物種的鑒 定。DNA 條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的 DNA 序列來進(jìn)行物種鑒 定的一種分子生物學(xué)技術(shù), 是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的有效補(bǔ)充。由于 DNA 序列是由腺嘌呤(A、鳥嘌呤(G、胞嘧啶(C、胸腺嘧啶(T 4種堿基以不同順序排列組成,因此一定長度 DNA 序列能夠區(qū)分不同物種。

中藥材 DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則通過對(duì)大樣本量中藥材進(jìn)行 DNA 條形碼分子鑒定研 究, 建立以 ITS2為核心, psbA-trnH 為輔的植物類藥材 DNA 條形碼鑒定體系和以 COI 為主、ITS2為輔的動(dòng)物類藥材 DNA 條形碼鑒定體系。

1.2方法與步驟

中藥材 DNA 條形碼分子鑒定法主要包括供試品處理、DNA 提取、PCR 擴(kuò)增、測序、序列 拼接及結(jié)果判定,以下內(nèi)容詳細(xì)說明各流程中的主要原理及注意事項(xiàng)。

1.2.1 供試品處理 除特殊標(biāo)明外, 藥材使用 75%乙醇擦洗表面后晾干, 稱取 10~100 Mg 2+備用。

1.2.2 DNA提取 DNA的提取包括破碎細(xì)胞壁、釋放 DNA , DNA 的分離和純化, DNA 的濃 縮、沉淀與洗滌等基本步驟, 目前常用試劑盒法, 包括植物基因組 DNA 提取試劑盒和動(dòng)物組 織 /細(xì)胞基因組 DNA 提取試劑盒。

由于植物類中藥材種類繁多, 可根據(jù)所研究中藥材的具體情況對(duì)提取方法加以改進(jìn)。植 物細(xì)胞內(nèi)含有大量次生代謝產(chǎn)物,如多糖、多酚等,這些物質(zhì)在提取 DNA 的過程中與 DNA 共沉淀, 形成黏稠的膠狀物難以溶解或產(chǎn)生褐變, 嚴(yán)重影響 DNA 提取的產(chǎn)量與質(zhì)量, 以及后

續(xù)的 PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。EDTA(乙二胺四乙酸螯合 Mg 2+2+或 Mn 2+,抑制 DNase(DNA 酶活性;CTAB(十六烷基三甲基溴化銨 是一種陽離子表面活性劑,可溶解細(xì)胞膜, 與 DNA 形成復(fù)合 物溶于高鹽溶液, 降低溶液鹽濃度至一定程度, 則從溶液中沉淀, 經(jīng)離心即可將 CTAB 與 DNA 復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開。三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl(pH 8.0提供一個(gè) 緩沖環(huán)境,防止 DNA 被破壞。β-巰基乙醇是抗氧化劑,在提取 DNA 過程中加入 β-巰基乙 醇,可以抑制氧化反應(yīng),避免褐化。PVP(聚乙烯吡咯烷酮是酚的絡(luò)合物,能與多酚形成 一種不溶的絡(luò)合物質(zhì), 有效去除多酚, 減少 DNA 提取過程中多酚的污染;同時(shí)它也能和多糖 結(jié)合,有效去除多糖。因此將 PVP 和 β-巰基乙醇配合使用,能夠有效地防止 DNA 提取過程 中多酚及多糖的污染。

在提取根、根莖、莖木類、皮類的 DNA 時(shí),一定要注意多糖、多酚的去除;提取葉、花、全 草的 DNA 時(shí)要適當(dāng)增加水浴時(shí)間, 并可將水浴溫度降低;對(duì)于果實(shí)、種子類以及動(dòng)物藥材類 的 DNA 提取可以參考《中國藥典》。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 植物類中藥材及其基原物種擴(kuò)增 ITS2或 psbA-trnH 序列,動(dòng)物類中藥 材及其基原物種擴(kuò)增 COI 序列,通用引物及擴(kuò)增條件如下,具體如有改變見各藥材項(xiàng)下。ITS2序列擴(kuò)增正向引物 ITS2F :5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′;反向引物 ITS3R : 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。psbA-trnH 序列擴(kuò)增正向引物 psbAF : 5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′;反向引物 trnHR :5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。COI 序列擴(kuò)增正向引物 HCO2198:5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′;反向引物 LCO1490: 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′。

PCR 反應(yīng)體系以 25 μL 為參照, 包括 1× PCR 緩沖液(不含 Mg 2+Cl 2 , 2.0 mmol·L-1Mg 2+Cl 2, 0.2 mmol·L-1 dNTPs,0.1 mmol·L-1引物對(duì),模板 DNA , 1.0 U Taq DNA聚合酶,加滅菌雙 蒸水至 25 μL。設(shè)置未加模板 DNA 的 PCR 反應(yīng)為陰性對(duì)照。

ITS2序列擴(kuò)增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s , 56 ℃ 30 s , 72 ℃ 45 s , 40個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。psbA-trnH 序列擴(kuò)增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min , 55 ℃ 1 min , 72 ℃ 1.5 min , 30個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。COI 序列擴(kuò)增程序:94 ℃ 1 min;94 ℃ 1 min , 45 ℃ 1.5 min, 72 ℃ 1.5 min, 5個(gè)循環(huán);94 ℃ 1 min, 50 ℃ 1.5 min, 72 ℃ 1 min, 35個(gè) 循環(huán);72 ℃ 5 min。

1.2.4 PCR 產(chǎn)物檢測 采取瓊脂糖凝膠電泳方法檢測 PCR 產(chǎn)物。電泳后, PCR 產(chǎn)物應(yīng)在相 應(yīng)的 DNA 條形碼序列長度位置出現(xiàn)一條目的條帶,陰性對(duì)照應(yīng)無條帶。

1.2.5 測序 有 PCR 擴(kuò)增條帶的樣品送測序公司進(jìn)行 DNA 序列測定。使用 DNA 測序儀對(duì)

目的條帶進(jìn)行雙向測序, PCR 擴(kuò)增引物作為測序引物,測序原理同 Sanger 測序法。

1.2.6 中藥材 DNA 條形碼序列獲得 主要包括序列拼接和序列質(zhì)量與方向 2個(gè)方面的內(nèi) 容。對(duì)雙向測序峰圖應(yīng)用專業(yè)軟件進(jìn)行序列拼接, 去除引物區(qū),獲得相應(yīng)的 DNA 序列。為確 保 DNA 條形碼序列的可靠性, 需對(duì)測序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估, 去除測序結(jié)果兩端的低質(zhì)量序列。序 列方向應(yīng)與 PCR 擴(kuò)增正向引物方向一致。

1.2.7 結(jié)果判定 將獲得的序列在中藥材 DNA 條形碼鑒定系統(tǒng)(http : //004km.cn/。2011年,中國植物條形碼工作組(Chinese Plant BOL Group 對(duì)來自 42目 75科 141屬 1 757物種的 6 286樣本的 rbcL , matK , psbA-trnH , ITS 序列進(jìn)行研究, 其結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了 ITS2的鑒定能力, 建議 ITS/ITS2應(yīng)成為種子植物的核 心條形碼,當(dāng) ITS 難以擴(kuò)增和測序時(shí), ITS2可以有效地彌補(bǔ)該缺陷 [5]。陳士林等 [6]提出建立 以 ITS2為核心、psbA-trnH 為補(bǔ)充序列的植物類藥材 DNA 條形碼鑒定體系。

1.4.2動(dòng)物類中藥材 COI 和 ITS2條形碼的選擇依據(jù) 在動(dòng)物界, Herbert 等于 2003年首 次提出將一段長度約為 650 bp的 COI 基因序列作為動(dòng)物條形碼鑒定的基礎(chǔ)片段 [7]。同年, Herbert 等 [8]對(duì) 11門 13 320個(gè)物種的線粒體細(xì)胞色素 c 氧化酶亞基 I(cytochrome c oxidase subunit I , COI基因序列進(jìn)行比較分析,結(jié)果表明所研究物種的種間遺傳距離在 0.0%~

53.7%，物種種間遺傳距離平均可達(dá)到 11.3%，79%的物種種間遺傳距離均大于 8%。以上研究 結(jié)果進(jìn)一步支撐了前期的結(jié)論。隨后，COI 基因特定片段的鑒定能力在鳥類、魚類、節(jié)肢動(dòng) 物、哺乳動(dòng)物等具體動(dòng)物類群的鑒定研究中均獲得了印證，因此研究者一致建議將 COI 序列 作為動(dòng)物的通用條形碼。基于大量前期研究結(jié)果，中藥材 DNA 條形碼分子鑒定法選用 ITS2 和 psbA-trnH 作為植 物類藥材的核心條形碼，COI 和 ITS2 作為動(dòng)物類中藥材的核心條形碼。1.5 中藥材 DNA 提取方法的確定 1.5.1 植物基因組 DNA 提取方法的確定依據(jù) 植物基因組 DNA 提取方法較多，常用基于 CTAB 原理的試劑盒法和改良的 CTAB 法。應(yīng)用不同公司植物基因組 DNA 提取試劑盒等提取 中藥材基因組 DNA，結(jié)果表明試劑盒法適用于中藥材基因組 DNA 的提取。由于中藥材所含成 分復(fù)雜，可針對(duì)不同入藥部位改進(jìn) DNA 提取試劑盒方法 [10] [9]。針對(duì)根及根莖、花、果實(shí)、種子和皮類等藥材質(zhì)地，確定各自合適的樣品量。通過對(duì) 2 373 份藥材樣品的 DNA 提取實(shí)驗(yàn)，葉類、花類藥材取樣量約 10～20 Mg，根類、果實(shí)類、種 子類、皮類藥材約 20～40 Mg。某些藥材需要增加樣品量，如沉香藥材 DNA 提取時(shí)取樣量 為 80 Mg。因此，通過對(duì)大量樣品 DNA 提取的研究，確定中藥材 DNA 條形碼鑒定法取樣量 為 10～100 Mg。通過對(duì)不同入藥部位實(shí)驗(yàn)不同水浴時(shí)間梯度（20，30，40，50，60 min，3 h 及水浴過 夜），發(fā)現(xiàn)葉類藥材水浴時(shí)間一般在 20～40 min，根類藥材在 60 min～3 h，一些質(zhì)地堅(jiān)硬 的藥材可 56 ℃水浴過夜。1.5.2 動(dòng)物類藥材 DNA 提取方法的確定依據(jù) 動(dòng)物基因組 DNA 的提取采用血液/細(xì)胞、組 織基因組 DNA 提取試劑盒。采用天根生化科技（北京）有限公司的血液/細(xì)胞、組織基因組 DNA 提取試劑盒（基于 SDS 法原理）提取動(dòng)物藥材的 DNA，結(jié)果表明試劑盒法適用于動(dòng)物基 因組 DNA 的提取，根據(jù)動(dòng)物藥材藥用部位的不同（肌肉、角甲、殼類），選用不用的 DNA 提 取試劑盒。動(dòng)物類藥材 DNA 提取前，應(yīng)針對(duì)不同取樣部位對(duì)樣品進(jìn)行不同的前期處理。肌肉類動(dòng)物 藥材需進(jìn)行紫外殺菌處理并充分搗碎；骨甲類藥材由于 DNA 含量稍少，應(yīng)適量增加取樣量，并充分研磨粉碎； 含有脂類較多的動(dòng)物內(nèi)臟器官可先用不含蛋白酶 K 和 SDS 的緩沖液浸泡藥 材，并試劑盒消化緩沖液中適量增加 SDS，以利于脫去脂類；分泌物類動(dòng)物藥材（如膽汁），在消化前同樣需進(jìn)行必要的處理。如干蛇膽用雙蒸水浸泡 6 h，其間更換水?dāng)?shù)次，使

其軟化 并洗去表面污染物；乙醇浸泡蛇膽，用流水浸泡 1 d，以除去乙醇及表面污染物 [11] 2+ 2+ 2+ 2+。目前多

選用試劑盒法提取 DNA，方法相對(duì)簡潔、易控，而且在大多數(shù)動(dòng)物藥材中都獲得了較為理想 的結(jié)果。1.6 確定可靠的 DNA 條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫 DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫的可靠性是中藥材 DNA 條形碼鑒定的關(guān)鍵。目前已有的公共數(shù)據(jù)庫，如 GenBank，EMBL 等，由世界各地的研究者進(jìn)行獨(dú)立提交，缺乏相互之間的驗(yàn)證，數(shù)據(jù)質(zhì)量 參差不齊，中藥材 DNA 序列數(shù)據(jù)的系統(tǒng)性和代表性尚顯不足。為保證中藥材 DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫的可靠性，首先需要在基原上保證物種鑒定的可靠性，然后采用嚴(yán)格的序列校對(duì)機(jī)制確保獲得序列和基原樣品的一致性，最后規(guī)范管理數(shù)據(jù)庫，確 保數(shù)據(jù)庫的安全維護(hù)和有序增減。二．中藥材 DNA 條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則在《中國藥典》（2015 年版）中的應(yīng)用 2.1 蘄蛇飲片的鑒別（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法）2.1.1 模板 DNA 提取 取本品 0.5g，置乳缽中，加液氮適量，充分研磨使成粉末，取 O.lg，置 1.5ml 離心管中，加人消化液 275m1[細(xì)胞核裂解液 200μ l,0.5mol/L 乙二胺四醋酸二鈉 溶液 50ml，蛋白酶 K(20mg/ml20μ l，RNA 酶溶液 5μ l]，在 55°C 水浴保溫 1 小時(shí)，加人 裂解緩沖液 250μ 1，混勻，加到 D N A 純化柱中，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘 10000 轉(zhuǎn)）3 分鐘； 棄去過濾液，加入洗脫液 8OOμ l[5mol/l 醋酸鉀溶液 26μ l, 1mol/LTris-鹽酸溶液（pH7.518ml,0.5mol/L 乙二胺四醋酸二鈉溶液(pH8.030，無水乙醇 480μ 1，滅菌雙蒸水 273μ l]，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘 10000 轉(zhuǎn)）1 分鐘； 棄去過濾液，用上述洗脫液反復(fù)洗脫 3 次，每次離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘 10000 轉(zhuǎn)）1 分鐘;棄去過濾液，再離心 2 分鐘，將 DN A 純化柱轉(zhuǎn) 移人另一離心管中，加入無菌雙蒸水 100μ l，室溫放置 2 分鐘后，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘 10 000 轉(zhuǎn)）2 分鐘，取上清液，作為供試品溶液，置零下 20°C 保存?zhèn)溆?。另取蘄蛇對(duì)照藥材 0.5g，同法制成對(duì)照藥材模板 DNA 溶液.2.1.2 PCR 反應(yīng)鑒別 引物：5' GGCAATTCACTACACAGCCAA-CACAACT 3’,和 5' CCATA GTCAGGTGGTTAGTGATAC 3’。PCR 反應(yīng)體系：在 200μ l 離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為 25m1，反應(yīng)體系包括 10*PCR 緩沖液 2.5μ l，dNTP(2.5mmol/L2μ 1，鑒別引物（10μ mol/L各 0.5μ 1，高保真 TaqDNA 聚合酶(5U/μ 10.2μ 1，模板 0.5 士無菌雙蒸水 18.8μ 1。將離心管 置 PCR 儀，PCR 反應(yīng)參數(shù)： 95°C 預(yù)變性 5 分鐘，循環(huán)反應(yīng) 3 0 次(95°C30 秒，63°C45 秒），延伸（72°C5 分鐘。2.1.3 電泳檢測 照瓊脂糖凝膠電泳法方法 2(通則 0541，膠濃度為 1 %，膠中加入核 酸凝膠染色劑 GelRed;供試品與對(duì)照藥材 PCR 反應(yīng)溶液的上樣量分別為 8μ 1，DNA 分子量標(biāo)

記上樣量為 2μ l(0.5μ g/μ l。電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢 視。供試品凝膠電泳圖譜中，在與對(duì)照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，在 300?400bp 應(yīng) 有單一 D N A 條帶。2.2 川貝母藥材的鑒別（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法）2.2.1 模板 D N A 提取取本品 0.lg,依次用 75 %乙醉 1ml、滅菌超純水 1ml 淸洗，吸干表 面水分，置乳缽中研磨成極細(xì)粉。取 20mg,置 1.5ml 離心管中，用新型廣譜植物基因組 D N A 快速提取試劑盒提取 DNA [加人緩沖液 API 400μ 1 和 RNA 酶溶液（10mg/ml4μ l,渦漩振蕩，65°C 水浴加熱 10 分鐘，加入緩沖液 AP2 130μ 1，充分混勻，冰浴冷卻 5 分鐘，離心（轉(zhuǎn) 速為每分鐘 14000 轉(zhuǎn)）1 0 分鐘；吸取上淸液轉(zhuǎn)移入另一離心管中，加人 1.5 倍體積的緩沖 液 A P 3 / E，混勻，加到吸附柱上，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘 13000 轉(zhuǎn)）1 分鐘，棄去過濾液，加入漂洗液 700μ 1，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘 12000 轉(zhuǎn)）30 秒，棄去過濾液;再加入溧洗液 500 μ 1，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘 12000 轉(zhuǎn)30 秒，棄去過濾液;再離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘 13000 轉(zhuǎn)）2 分鐘，取出吸附柱，放入另一離心管中，加入 50μ 1 洗脫緩沖液，室溫放置 3?5 分鐘，離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘 12000 轉(zhuǎn)）1 分鐘，將洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置 2 分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘 12000 轉(zhuǎn)）1 分鐘],取洗脫液，作為供試品溶液，置 4°C 冰箱中備用。另 取川貝母對(duì)照藥材 O.lg，同法制成對(duì)照藥材模板 DNA 溶液。2.2.2 PCR-RFLP 反應(yīng) 鑒別引物：5' CGTAACAAGGTTT-CCGTAGGTGAA 3 ’和 5’ GCTA CGTTCTTCATCGAT 3 '。PCR 反應(yīng)體系：在 200μ 1 離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為 30μ 1，反 應(yīng)體系包括 10* P C R 緩沖液 3μ 1，二氧化鎂（25mmol/L2.4μ l, dNTP(10mmol/L0.6μ l,鑒別引物（30μ mol/L各 0.5μ l，髙保真 Taq DAN 聚合酶（5U/μ l0.2μ l,模板 1μ l，無菌超純水 21.8m1。將離心管置 PCR 儀，P C R 反應(yīng)參數(shù)：95°C 預(yù)變性 4 分鐘，循環(huán)反 應(yīng) 3 0 次（95°C 3 0 秒，5 5?58°C3 0 秒，72°C 3 0 秒），72℃延伸 5 分鐘。取 PCR 反 應(yīng)液，置 500μ l 離心管中，進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)總體積為 20μ l，反應(yīng)體系包括 10*酶切緩 沖液 2μ 1,PCR 反應(yīng)液 6μ l，SmaI(10U/μ 10.5μ l，無菌超純水 11.5μ l，酶切反應(yīng)在 30° C 水浴反應(yīng) 2 小時(shí)。另取無菌超純水，同法上述 P C R-R F L P 反應(yīng)操作，作為空白對(duì)照。2.2.3 電泳檢測 照瓊脂糖凝膠電泳法（通則 0541，膠濃度為 1.5 %，膠中加入核酸凝 膠染色劑 GelRed;供試品與對(duì)照藥材酶切反應(yīng)溶液的上樣量分別為 8μ 1 ,DNA 分子量標(biāo)記上 樣量為 lμ l(0.5μ g/μ l。電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。供試品凝膠電泳圖譜中，在與對(duì)照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，在 100?250bp 應(yīng)有兩 條 DNA 條帶，空白對(duì)照無條帶。

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