第一篇：水塔老陳醋大曲中酵母菌的分離鑒定 - 20150909

水塔老陳醋大曲中酵母菌的分離鑒定

摘要 目的：大曲是山西著名品牌水塔老陳醋發(fā)酵的主要原料，其富含多種微生物，研究大曲中酵母菌的組成對老陳醋的發(fā)酵生產(chǎn)有重要的指導意義。方法：采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，即通過富集培養(yǎng)再稀釋涂布、分離純化出21株酵母菌，對其進行形態(tài)學觀察、鏡檢，并且擴增和測定了它們的5.8S-ITS、18S、26S D1/D2區(qū)序列，從分子水平上對這些菌株進行了分類學鑒定。結(jié)果：測序結(jié)果與GenBank 中已知序列進行比對，鑒定到2株弗比恩酵母，8株扣囊復膜酵母，6株異常威克漢姆酵母，3株葡萄牙棒孢酵母，2株東方伊薩酵母。結(jié)論：大曲中含有多種酵母菌，分離培養(yǎng)和分子生物學鑒定了酵母菌的種類，為純種制曲打下了基礎。

關鍵詞：大曲，酵母菌，分離，鑒定

大曲是我國傳統(tǒng)釀造酒和釀造食醋生產(chǎn)中主要的原料。大曲是酒和食醋釀造過程中重要的微生物、酶類、香氣物質(zhì)和香氣物質(zhì)前提的主要來源[1-2]。大曲中含有多種微生物，可起到糖化、發(fā)酵、增香的作用，直接或間接地影響酒和醋的風味及口感。然而，大曲采用開放式富集培養(yǎng)，受場地、工具和制曲室環(huán)境以及水、空氣等多種因素影響，大曲質(zhì)量難以得到穩(wěn)定，同時富集式培養(yǎng)使大曲富含多種微生物，包括功能性微生物和無效、有害微生物，難以保證大曲的質(zhì)量穩(wěn)定[3]。酵母菌是大曲中主要的功能性微生物之一，影響酒和老陳醋的發(fā)酵生產(chǎn)及口感。分離鑒定大曲中酵母菌的組成，成了近幾年酒和食醋的研究熱點[4-9]。分離鑒定水塔老陳醋大曲中酵母菌的組成，對提高著名品牌水塔老陳醋的產(chǎn)量和質(zhì)量有很重要的意義。

采用富集培養(yǎng)再稀釋涂布、分離水塔老陳醋大曲中的酵母菌，之后對其進行形態(tài)學觀察、鏡檢，擴增和測定它們的18S、5.8S-ITS、26S D1/D2區(qū)序列，從分子水平上對這些菌株進行了分類學鑒定。分子生物學的鑒定方法不僅能夠快速的將各種酵母鑒定到屬或種, 而且鑒定的結(jié)果精確度更高。隨著數(shù)據(jù)庫中分子信息量的增加,近年來應用分子生物學技術鑒定酵母菌種的研究越來越廣泛[10-17]。

對酵母菌鑒定最常用的分子系統(tǒng)發(fā)育分析方法有18S、5.8S-ITS、26S D1/D2區(qū)等。酵母菌核糖體小亞基18S rRNA 存在不同保守程度序列的鑲嵌現(xiàn)象(從高度保守到半保守區(qū)到高可變區(qū))，使得該分子可以用來衡量較遠的親緣關系，也適宜于較近的親緣關系。這個區(qū)域大約有1800bp，含有不同變異率的區(qū)段，可以用于種、屬或更高等級分類群之間的系統(tǒng)關系研究[10-12]。酵母菌ITS區(qū)為核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，位于18S rDNA 和26S rDNA 之間，包括ITS1 和ITS2 兩個片斷，中間包含一個5.8S rDNA 片段。ITS 區(qū)域與rDNA 轉(zhuǎn)錄區(qū)相比具有較高的變異率，對于親緣關系較近的菌株間的區(qū)分是比較有效的。研究表明ITS 區(qū)域的差異大于1% 時就可能代表不同的種，然而對于不同的屬而言，情況會有所不同[11-18]。26S rDNA 的 Dl/D2 區(qū)域位于大亞基的5'端，序列長度在600bp 左右，該段區(qū)域具有較高的變異率，可以用于親緣關系較近的菌株之間的分類研究，目前已經(jīng)成為酵母鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的重要“標尺”。雖然酵母種內(nèi)26S D1/D2 區(qū)堿基差異小于1%的標準已被普遍接受，然而此數(shù)值仍是一個試驗的經(jīng)驗值[11-13,19-20]。

本研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和分子生物學相結(jié)合，分離鑒定著名品牌山西水塔老陳醋大曲中酵母菌的種類，研究與老陳醋發(fā)酵產(chǎn)香等相關菌種，同時也為食醋傳統(tǒng)工藝的研究、改造、純種制曲等提供指導。

1材料與方法

1.1材料與儀器設備

1.1.1 樣品和主要試劑

大曲由山西水塔醋液股份有限公司提供。YPD培養(yǎng)基購自北京博奧星。Dream Taq Green PCR Master Mix購自Fermentas;Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR購自寶生物工程有限公司；其它試劑購自北京化工廠。

1.1.2 儀器設備

滅菌鍋，無菌工作臺，生化培養(yǎng)箱，搖床，分光光度計，熒光顯微鏡（重慶奧特光學），GeneAmp PCR System 2720(ABI)，ChampGel凝膠成像分析系統(tǒng)（北京賽智）。1.2 方法

1.2.1

培養(yǎng)基和樣品制備

1.2.1.1 富集培養(yǎng)基

酵母粉1%，葡萄糖2%，蛋白陳2%，調(diào)pH至4.5培養(yǎng)基滅菌后再加入鏈霉素（終濃度30 ug/ml）、青霉素（終濃度為50 ug/ml），孟加拉紅0.033 mg/mL，以抑制細菌和霉菌生長。

1.2.1.2分離培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂粉2%。葡萄糖單獨115℃滅菌15 min，然后加入培養(yǎng)基中，倒平板。1.2.1.3樣品的處理

將曲塊經(jīng)過碾壓研磨后混勻過40目篩，保藏在4℃冰箱中備用。

1.2.2

酵母菌的分離

將10 g曲粉加入100 mL無菌水中，在28℃ 200 r/min下?lián)u20 min。取菌懸液3 mL接種于富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后吸取5 mL稀釋涂布法分離，28℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)，配合鏡檢菌種細胞形態(tài)，2～3 次純化后保存于4℃冰箱中。

1.2.3 菌種菌落形態(tài)和細胞形態(tài)鑒定

將酵母菌接種于YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3d后，觀察菌落形態(tài)特征和細胞形態(tài)。1.2.4酵母菌菌株基因組DNA的制備

取菌種，按方法Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR說明書制備基因組DNA。提取后的基因組DNA作為擴增5.8S-ITS、18S、26S D1/D2區(qū)序列的模板。

1.2.55.8S-ITS、18S、26S的D1/D2 區(qū)序列擴增

利用通用引物ITS1（引物序列：5'-ACGGGGGGTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（引物序列：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）以菌株總DNA為模版進行5.8S-ITS序列擴增。利用通用引物EF3（引物序列：5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'）和EF4（引物序列：5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3'）以菌株總DNA為模版進行18S序列擴增。利用通用引物NL-1（引物序列：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL-4（引物序列： 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）以菌株總DNA為模版進行26S的D1/D2 區(qū)擴增。在50 μl PCR反應體系中加入16 μl水、正向引物和反向引物各2 μl、5 μl 模版、25 μl Taq DNA聚合酶Mix。擴增程序：95℃變性5 min后，95℃變性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸2 min、共35個循環(huán)，72℃延伸10 min。電泳檢測目的條帶，擴增產(chǎn)物送北京理化分析測試中心進行測序。1.2.6 數(shù)據(jù)處理 將rDNA測序結(jié)果輸入數(shù)據(jù)庫http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/，使用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析。根據(jù)比對結(jié)果，找出與數(shù)據(jù)庫同源性最高的已知菌種，推測待定菌株可能的屬或種。

結(jié)果與分析

2.1酵母菌株分離結(jié)果和菌種菌落形態(tài)、細胞形態(tài)鑒定

從水塔老陳醋大曲中分離到優(yōu)勢酵母菌共21株。根據(jù)菌落形態(tài)特征和菌株細胞形態(tài)，將菌株進行初步分類，選取具有代表性的10株菌株，分別編號為M10、Q28、M12、Q13、M17、Q10、M25、Q34、Q7、Q12。其菌落形態(tài)與細胞形態(tài)見圖1。

圖1酵母菌細胞形態(tài)顯微照片（1000×）和菌落形態(tài)

Fig.1 morphology under light microscope(1000×)and Colony morphology of yeast

2.2 分子鑒定結(jié)果

表1 5.8S-ITS測序比對分析

Table 1 5.8S-ITS sequence analysis of 21 yeast species 菌株

5.8S-ITS 測序比對分析

相似菌株 相似度

M10、Q28 M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33 M12、Q3 M15、Q13、Q19、Q27 M25、Q2、Q34 Q7、Q12

Cyberlindnera fabianii strain BZR42 Saccharomycopsis fibuligera strain 3-1Y

100% 100%

Wickerhamomyces anomalus strain SX1 Pichia anomala strain CTSP F5 Clavispora lusitaniae isolate GK11 Issatchenkia orientalis strain zhuan 1.2 Pichia kudriavzevii clone STA197lsu

99% 100% 99% 99% 99%

表2 18s測序比對分析

Table 2.18s sequence analysis of 21 yeast species

菌株

18s 測序比對分析 相似菌株

相似度

M10、Q28 M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33 M12、M15、Q3、Q13、Q19、Q27 M25、Q2、Q34 Q7、Q12

Cyberlindnera fabianii strain NRRL Y-1871 Saccharomycopsis fibuligera strain NRRL Y-2388

Wickerhamomyces anomalus strain TIBx229 Clavispora lusitaniae strain NRRL Y-11827 Candida ontarioensis strain BC 2A Pichia kudriavzevii isolate EM12 Issatchenkia orientalis

100% 99%

99% 99% 99% 99% 99%

表3 26S D1/D2測序比對分析

Table 3.26S D1/D2 sequence analysis of 21 yeast species

菌株

26S D1/D2 測序比對分析 相似菌株

相似度

M10、Q28 M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33 M12、M15、Q3、Q13、Q27、Q19 M25、Q2、Q34 Q7、Q12

Cyberlindnera fabianii strain BZR42 Saccharomycopsis fibuligera strain s-5b-2 Wickerhamomyces anomalus strain XJHFS-1 Clavispora lusitaniae strain IMAU5Y028(G-1)Pichia kudriavzevii strain DMic 113897

Kluyveromyces marxianus strain IMAU4Y089(QH27-4)

Issatchenkia orientalis strain IMAU3Y005

99% 100% 100% 99% 99% 99% 99%

根據(jù)測序結(jié)果，鑒定到2株弗比恩酵母（Cyberlindnera fabianii strain BZR42，M10、Q28），8株扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera strain s-5b-2，Q6、Q33、Q25、M11、M26、Q10、Q14、M17），6株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus strain XJHFS-1，Q3、Q13、Q27、Q19、M15、M12），3株葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae strain IMAU5Y028，M25、Q2、Q34），2株東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis strain IMAU3Y005，Q7、Q12）。結(jié)論和討論

本研究按照酵母菌的富集分離培養(yǎng)方法分離山西老陳醋大曲中的酵母菌，利用形態(tài)學菌落形態(tài)和細胞形態(tài)初步鑒定為酵母菌。

利用通用引物ITS1和ITS4以菌株總DNA為模版進行5.8S-ITS序列擴增，擴增到了酵母菌5.8S-ITS長度為350-650 bp。利用通用引物EF3和EF4以菌株總DNA為模版進行18S序列擴增，擴增到酵母菌的18S長度為1500 bp左右。利用通用引物NL-1和NL-4以菌株總DNA為模版進行26S的D1/D2 區(qū)擴增，擴增到酵母菌的26S D1/D2 區(qū)長度為500-600 bp。成功擴增了21株的酵母菌的5.8S-ITS、18S、26S的D1/D2 區(qū)序列，并進行了測序，測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/進行了比對，鑒定到2株弗比恩酵母，8株扣囊復膜酵母，6株異常威克漢姆酵母，3株葡萄牙棒孢酵母，2株東方伊薩酵母。

本研究發(fā)現(xiàn)5.8S-ITS序列、18S、26S D1/D2區(qū)在鑒定弗比恩酵母，扣囊復膜酵母，葡萄牙棒孢酵母，鑒定結(jié)果與模式菌種相識度高并且結(jié)果唯一。在鑒定Q3等菌種時，NCBI數(shù)據(jù)庫中庫比對結(jié)果與異常威克漢姆酵母、異常畢赤酵母相識度均為99%，不易鑒定最后是哪種菌。異常威克漢姆酵母，異常畢赤酵母，異常漢遜酵母，這三種酵母是同物異名，但最新的酵母分類學表明部分異常畢赤酵母更名為異常威克漢姆酵母[20]。在鑒定Q7等菌種時，與東方伊薩酵母、德里阿茲威畢赤酵母、馬克思克魯維酵母相識度均為99%，不易鑒定最后是哪種菌。東方伊薩酵母和庫德里阿茲威畢赤酵母也是同物異名，最新的分類學名稱是東方伊薩酵母。本文研究中發(fā)現(xiàn)，鑒定Q7菌種26S D1/D2區(qū)時，BLAST 比對結(jié)果與100個提交的基因序列，相識度在99%-100%，GenBank 數(shù)據(jù)庫中酵母菌生物部分 rDNA 序列多、亂，但完整的基因組序列僅有模式種釀酒酵母和弗比恩酵母。目前公共核酸序列數(shù)據(jù)庫酵母菌其它模式屬和模式種還存在數(shù)據(jù)不完整的問題。因此新增并完善已發(fā)現(xiàn)的酵母菌相關序列數(shù)據(jù)信息，建立一個準確、精簡、完整的酵母菌序列參照數(shù)據(jù)庫顯得十分必要。

本研究對酵母菌鑒定中最常用的分子系統(tǒng)學方法鑒定結(jié)果進行比較得出：它們的鑒定結(jié)果相互印證，可以確認鑒定的結(jié)果。本研究通過最常用的分子系統(tǒng)發(fā)育學方法，即5.8S ITS、18S、26S rDNA D1/D2 區(qū)序列分析及GenBank 查詢和BLAST 比對，對分離自山西老陳醋釀造用大曲分離到的21株酵母菌進行了分類鑒定，同時比較了它們在鑒定結(jié)果上的異同。本研究鑒定到8株扣囊復膜酵母，顏華等研究表明利用扣囊復膜酵母進行生物發(fā)酵，直接將淀粉加工成人們所需要的各種產(chǎn)品而無需液化、糖化，可節(jié)約能源、降低成本，將具有深遠的意義。而且，扣囊復膜酵母較傳統(tǒng)的釀酒酵母來說，具有更豐富的次生代謝[20]。分離到的幾種酵母菌將進一步進行發(fā)酵實驗，測定發(fā)酵后產(chǎn)生的醇類、酯類及老陳醋特征型指紋圖譜物質(zhì)[1, 7, 9, 10, 22, 23, 24]。

參考文獻：

[1] 張春林.瀘州老窖大曲的質(zhì)量微生物與香氣成分關系[D].無錫: 江南大學, 2012．

[2] 武晉海.山西老陳醋大曲微生物種類及主要生物活性的研究[D].山西: 山西農(nóng)業(yè)大學, 2004．

[3] 羅惠波, 楊曉東, 楊躍寰等.濃香型大曲中可培養(yǎng)真菌的分離鑒定與系統(tǒng)發(fā)育學分析[J].現(xiàn)代食品科技, 2013, 29(9): 2047-2052.[4] WU Q, XU Y, CHEN L.Diversity of yeast species during fermentative process contributing to Chinese Maotai-flavour liquor making[J].Applied Microbiology, 2012, 55: 301-307.[5] 張磊, 施思, 張文學等.濃香型白酒大曲中酵母菌的分離和鑒定[J].釀酒科技, 2010 , 5: 39-41.[6] 惠豐立, 柯濤, 褚學英等.大曲中酵母菌種群結(jié)構及多樣性分析[J].食品與生物技術學報, 2009, 28(1): 102-106.[7] 江南大學.利用風味定向技術篩選中國白酒釀造中的?-大馬酮產(chǎn)生菌株及其應用: 中國, 201110122420.3[P].2013.02.27.[8] 吳飛, 陳紅英, 胡承等.濃香型白酒酒醅中可培養(yǎng)酵母18S rDNA 全序列的系統(tǒng)學分析[J].釀酒科技, 2006, 4: 23-26.[9] 莊世文.食源酵母分離株風味物質(zhì)及其三種酯代謝酶基因的分析[D].天津大學, 2010.[10] 高健, 許愛清, 唐新科.一株萵苣內(nèi)生產(chǎn)香酵母菌的分離、鑒定及揮發(fā)性香氣成分分析[J].食品科學, 2011, 32(23): 162-166.[11] 王澤舉, 王汝瑱, 孫悅等.幾株酵母菌的分子系統(tǒng)學鑒定[J].食品科學, 2012, 33(15): 195-200.[12] 唐玲, 劉平, 黃瑛等.酵母的分子生物學鑒定[J].生物技術通報, 2008, 5: 84-87.[13] 劉 寧, 劉延琳.核糖體RNA 基因在酵母分類鑒定中的應用[J].中國農(nóng)業(yè)科學, 2010, 43(22): 4701-4708.[14] LEAW S N, CHANG H C, SUN F H, et al.Identification of Medically Important Yeast Species by Sequence Analysis of the Internal Transcribed Spacer Regions[J].Journal of Clinical Microbiology ,2006, 44(3): 693–699.[15] CARVAJAL M V, QUEROL A, BELLOCH C.Identification of species in the genus Pichia by restriction of the internal transcribed spacers(ITS1 and ITS2)and the 5.8S ribosomal DNA gene[J].Antonie van Leeuwenhoek , 2006, 90: 171–181.[16] Conrad L.Schoch, Keith A.Seifert, Sabine Huhndorf.Nuclear ribosomal internal transcribed spacer(ITS)region as a universal DNA barcode marker for Fungi[J].PNAS , 2012 , 109(16): 6241-6246.[17] 陳源源.基于分子標識的工業(yè)微生物資源快捷分類與鑒定[D].無錫: 江南大學, 2012． [18] 王彩虹.基于克隆文庫法研究不同香型大曲微生物菌群結(jié)構[D].自貢: 四川理工學院, 2014.[19] 李金霞, 劉光全, 程池.釀酒酵母26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育研究[J].釀酒, 2007, 34(1): 37-39.[20] 趙麗麗, 陳存社, 郭鳳蓮.26S rDNA 序列分析法鑒定酵母菌[J].中國釀造, 2008 , 15: 49-51.[21] KURTZMAN C P.Phylogeny of the ascomycetous yeasts and the renaming of Pichia anomala to Wickerhamomyces anomalus [J].Antonie van Leeuwenhoek , 2011, 99: 13–23.[22] 顏華.扣囊復膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)代謝工程的研究[D].北京: 中國科學院微生物研究所, 2007.[23]WALKER G M.Pichia anomala: cell physiology and biotechnology relative to other yeasts [J].Antonie van Leeuwenhoek , 2011, 99: 25–34.[24] 毛青鐘, 俞關松.擬內(nèi)孢霉酵母的特性和在黃酒釀造中的作用研究[J].釀酒, 2013, 40(3): 59-61.Isolation and Identification of Yeast Strains in Shuita

Super-vinegar Daqu Abstract: Daqu is the main raw material of the fermentation of Shuita Super-vinegar.It is rich in many microorganisms.The research on the composition of yeasts in Daqu has important directive significance for the fermentation of Super-vinegar.The 21 yeast strains are purified by traditional method which includes enrichment,dilution,coating etc.They are researched

by

morphological

observation

and

microscopic

examination.Their 5.8S-ITS,18S,26SD1/D2 domain sequences are amplified and measured to identify these strains in molecular taxonomy.The result of sequencing is intercompared with the known sequences in GenBank.It shows that these strains include 2 Cyberlindnera fabianii strains,8 Saccharomycopsis fibuligera strains,6 Wickerhamomyces anomalus strains,3 Clavispora lusitaniae strains,2 Issatchenkia orientalis strains.There are many yeast strains in Daqu.Their isolation,culture,identification in the molecular biology is the basis for culturing purified strain Daqu.Keyword:Daqu,Yeast,isolation,identification

第二篇：水塔老陳醋廣告語

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第三篇：牛奶中酪蛋白和乳糖的分離、鑒定

牛奶中酪蛋白和乳糖的分離、鑒定(杜青 胡弘毅)

牛奶中酪蛋白和乳糖的分離、鑒定

杜青 胡弘毅

（化學與分子科學學院；湖北 武漢 430072）

摘要：本文介紹了從牛奶中分離酪蛋白和乳糖的方法，和鑒定酪蛋白的方法。關鍵詞：酪蛋白、乳糖、等電點、分離

1.引言

牛奶是營養(yǎng)最完備的食品之一，這一點已為許多人認識并接受。尤其是在嬰兒及青少年時期，每天一定量的牛奶能促進身體健康成長。牛奶的主要成分是水、蛋白質(zhì)、脂肪、糖和礦物質(zhì)，這些都是人體發(fā)育所必不可少的物質(zhì)。

牛奶中的蛋白質(zhì)主要是酪蛋白。酪蛋白是含磷蛋白質(zhì)的復雜混合物，在牛奶中以其鈣鹽形式存在，即酪蛋白鈣。利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最小的特性，把牛奶的ＰＨ值調(diào)到酪蛋白的等電點(ＰＨ =4.8)來沉淀分離酪蛋白?？岬鞍撞蝗苡谝掖己鸵颐?，所以可用乙醇和乙醚將其中的脂肪洗滌除去。

牛奶中的糖主要是乳糖。乳糖是一種二糖。它是唯一由哺乳動物乳糖合成的糖，它是在乳腺中被合成的。乳糖是成長中的嬰兒建立其發(fā)育中的腦子和神經(jīng)組織所需的物質(zhì)。乳糖也是不溶于乙醇的，所以，當

2.材料與方法

2.1 實驗儀器

恒溫水浴鍋、抽氣抽濾瓶、布氏漏斗、蒸發(fā)皿、燒杯600ml、100ml各一個、表面皿、天平、玻璃棒。

2.2 主要試劑

10%醋酸溶液、95%乙醇、乙醚、伊利牌純牛奶、精密PH試紙（PH=3~5）、碳酸鈣、濾紙、1%CuSO4溶液、10%NaOH溶液、茚三酮溶液。

2.3 實驗過程

2.3.1 酪蛋白的分離

取三份20ml新鮮牛奶于100ml燒杯中，在恒溫水浴中加熱至45℃，邊攪拌邊慢慢加入10%醋酸溶液，通過PH試紙測量至牛奶PH分別為4.8、4.6和3.8。放置冷卻、澄清后，抽濾。注意先將上層清液濾出，再將沉淀傾入漏斗中。（濾完后，在濾液中加入少量粉狀碳酸鈣留作乳糖的分離。）再依次用95%乙醇、乙醇乙醚等體積混合液、乙醚洗滌酪蛋白。用乙醚洗滌時，注意用玻璃棒搗碎成團的固體，并反復翻洗，保證脂肪被洗凈。將洗凈的酪蛋白移至表面皿上，自然晾干后稱重。

2.3.2 酪蛋白的鑒定（在酪蛋白分離后立即完成效果最好）

取少量酪蛋白顆粒于試管中，加入少量水溶解。

取10ml酪蛋白溶液，加入茚三酮溶液5滴，振蕩，放入沸水浴中加熱2分鐘，溶液呈淡紫色。（茚三酮反應）

取10ml酪蛋白溶液，加入10% NaOH溶液2ml后，滴入1%CuSO4溶液1ml。振蕩試管，溶液呈藍紫色。（縮二脲反應）

取10ml酪蛋白溶液，加入濃硝酸2ml后加熱，有黃色沉淀生成。再加入10%NaOH溶液2ml，沉淀為橘黃色。（蛋黃顏色反應）

2.3.3 乳糖的分離

將2.3.1中濾液用傾潷法倒至蒸發(fā)皿中，用蒸汽浴濃縮至5ml后，將熱的混合物用布氏漏斗抽濾，除去沉淀的蛋白質(zhì)和殘余碳酸鈣。加熱濾液，在熱的溶液中加入95%乙醇18

ｍl，并繼續(xù)加熱，待其混合均勻后，趁熱過濾，濾液應澄清。把濾液移至錐形瓶中，加塞，放置 1-2天，讓乳糖充分結(jié)晶。抽濾，分離出乳糖晶體，并用冷的95%的乙醇水溶液洗滌產(chǎn)物，待其干燥后稱重。

3．結(jié)果與討論

3.1不同PH值的酪蛋白的實驗現(xiàn)象

PH值調(diào)到3.8的牛奶,酪蛋白迅速沉淀下來，抽濾的速度也很快，鑒定酪蛋白的幾個性質(zhì)試驗現(xiàn)象都十分明顯，而且濾液十分澄清，但濾液中只析出微量絮狀乳糖?？赡苁撬岬臐舛忍?，乳糖被大量水解。

PH值調(diào)到4.8的牛奶，酪蛋白的沉淀速度很慢，抽濾的速度也很慢，而且抽不干，濾液是渾濁的。

PH值調(diào)到4.6的牛奶，酪蛋白沉淀速度和抽濾速度處于上面兩種情況的中間，得到3.1g 酪蛋白，性質(zhì)試驗現(xiàn)象明顯。濾液略顯乳白色，得0.23g乳糖，乳糖呈片狀晶體。

3.2奶中脂肪的影響

脂肪也是牛奶的主要成分之一，約占牛奶的3.9%,在分離酪蛋白時，脂肪回夾雜在酪蛋白中一起沉淀出來。因此，在用乙醚洗滌酪蛋白時，應把任何形狀的酪蛋白搗碎，并用玻璃棒攪拌約10min，盡可能出去脂肪。否則，酪蛋白長時間放置后會焦化變黃。

3.3碳酸鈣的作用

本實驗中所使用的碳酸鈣，主要是用以中和過剩的乙酸，避免在后面的實驗中乳糖在酸性條件下水解，從而影響收得率。

乙醇混入水溶液中時,乳糖會結(jié)晶出來 ,從而達到

…?報名分離的目的。