第一篇：放線菌抗生素的發(fā)酵及目的產(chǎn)物的提取實驗報告

放線菌抗生素的發(fā)酵及目的產(chǎn)物的提取

一、實驗?zāi)康?/p>

1、熟悉掌握土壤中分離抗生素及培養(yǎng)方法

2、了解和掌握種子制備和搖瓶發(fā)酵技術(shù)和方法

3、了解抗生素發(fā)酵的一般規(guī)律和代謝調(diào)控理論

4、了解小型發(fā)酵罐的基本結(jié)構(gòu)

5、熟悉掌握小型發(fā)酵罐的使用方法和保養(yǎng)

6.掌握抗生素生物效價測定的原理和方法；

7.掌握管碟法測定抗生素生物效價相關(guān)的操作方法。8.掌握放線菌次級代謝物的初步純化及牛津杯實驗的基

本原理和操作技術(shù)

二、實驗原理

①發(fā)酵罐是進(jìn)行液體發(fā)酵的特殊設(shè)備。生產(chǎn)上使用的發(fā)酵罐容積大，均用鋼板或不銹鋼板制成；供實驗室使用的小型發(fā)酵罐，其容積可從約lL至數(shù)百升或稍大些。一般來說，5L以下是用耐壓玻璃制作罐體，5L以上用不銹鋼板或鋼板制作罐體。發(fā)酵罐配備有控制器和各種電極，可以自動地調(diào)控試驗所需要的培養(yǎng)條件，是微生物學(xué)、遺傳工程、醫(yī)藥工業(yè)等科學(xué)研究所必需的設(shè)備。

②抗生素（antibiotics）是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。現(xiàn)臨床常用的抗生素有轉(zhuǎn)基因工程菌 培養(yǎng)液液中提取物以及用化學(xué)方法合成或半合成的化合物。

③放線菌發(fā)酵結(jié)束后，次級代謝物可能與菌體結(jié)合，工業(yè)上常采用草酸或磷酸等酸化劑處理，釋放與菌體結(jié)合的次級代謝物，并采用加熱發(fā)酵液70 ℃，2 min使蛋白凝固，所得酸性濾液，在經(jīng)堿處理，進(jìn)一步去除蛋白。

抗生素的效價常采用微生物學(xué)方法測定，它是利用抗生素對特定的微生物具有抗菌活性的原理來測定抗生素效價的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效價測定的國際通用方法，我國藥典也采用此法。管碟法是根據(jù)抗生素在瓊脂平板培養(yǎng)基中的擴(kuò)散滲透作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品和檢品兩者對試驗菌的抑菌圈大小來測定供試品的效價。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性試驗菌的瓊脂平板上放置小鋼管（內(nèi)徑6.0±0.l mm，外徑8.0±0.l mm，高10±0.lmm），管內(nèi)放人標(biāo)準(zhǔn)品和檢品的溶液，經(jīng)16~18小時恒溫培養(yǎng)，當(dāng)抗生素在菌層培養(yǎng)基中擴(kuò)散時，會形成抗生素濃度由高到低的自然梯度，即擴(kuò)散中心濃度高而邊緣濃度低。因此，當(dāng)抗生素濃度達(dá)到或高于MIC（最低抑制濃度）時，試驗菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現(xiàn)透明的無菌生長的區(qū)域，常呈圓形，稱為抑菌圈。根據(jù)擴(kuò)散定律的推導(dǎo)，抗生素總量的對數(shù)值與抑菌圈直徑的平方成線性關(guān)系，比較抗生素標(biāo)準(zhǔn)品與檢品的抑菌圈大小，可計算出抗生素的效價。

常用的管碟法有：一劑量法、二劑量法、三劑量法。后二法已經(jīng)列入藥典。二劑量法系將抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品各稀釋成一定濃度比例（2:1或4:1）的兩種溶液，在同一平板上比較其抗藥活性，再根據(jù)抗生素濃度對數(shù)和抑菌圈直徑成直線關(guān)系的原理來計算供試品效價。取含菌層的雙層平板培養(yǎng)基，每個平板表面放置4個小鋼管，管內(nèi)分別放入供試品高、低劑量和標(biāo)準(zhǔn)品高、低劑量溶液。先測量出四點的抑菌圈直徑，按下列公式計算出檢品的效價。

（1）求出W和V： W=（SH+UH）-（SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL）(式 2.10-2)式中：UH：供試品高劑量之抑菌圈直徑； UL：供試品低劑量之抑菌圈直徑； SH：標(biāo)準(zhǔn)品高劑量之抑菌圈直徑； SL：標(biāo)準(zhǔn)品低劑量之抑菌圈直徑；

（2）求出θ： θ=D·antilog（IV/W）(式 2.10-3)式中：θ：供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的效價比；

D：標(biāo)準(zhǔn)品高劑量與供試品高劑量之比，一般為1 I：高低劑量之比的對數(shù)，即log2或log4。⑶求出

Pr

：

Pr

=

Ar

×

θ

(式 2.10-4)式中：Pr：供試品實際單位數(shù)； Ar：供試品標(biāo)示量或估計單位

④甲醛滴定法測定氨基氮含量：水溶液中的氨基酸為兩性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。用甲醛處理氨基酸,甲醛與氨基結(jié)合,可形成羥甲基衍生物，使NH3+上的H+游離出來，這樣就可用堿滴定NH3+放出的H+，從而計算出氨基氮含量。如樣品中只含有某一種已知氨基酸，由甲醛滴定的結(jié)果即可算出氨基氮的含量。如果樣品是多種氨基酸的混合物（如蛋白質(zhì)水解物），則滴定結(jié)果不能作為氨基酸的定量依據(jù)。甲醛滴定法常用于測定蛋白質(zhì)的水解程度，隨著水解程度的增加，滴定值增加，當(dāng)水解完全后，滴定值保持恒定。

甲基紅的變色范圍是PH4.4~6.2,意思是說: 1.其pH值在4.4~6.2區(qū)間時,呈橙色, 2.其pH值≦4.4時,呈紅色,因是靠近酸性強的一邊時的顏色,故又稱之為酸色。

3.其pH值≧6.2時,呈黃色，因是靠近堿性強的一邊時的顏色,故又稱之為堿色

二、儀器與材料

（一）培養(yǎng)基

高氏一號培養(yǎng)基：

可溶性淀粉 20.0g NaCl 0.5g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g 蒸餾水 1000ml，PH 7.4，發(fā)酵瓶培養(yǎng)基：

?淀粉3%,葡萄糖2%, 黃豆餅粉2.5%, 蛋白胨0.5% ，酵母粉0.5%, MgSO4 0.1%,(NH4)2SO4 0.3%, KH2PO4, 0.03%，CaCO3 0.4%, PH 6.0。

?黃豆餅粉 4g, 淀粉10g, 酵母粉0.25 g , 蛋白胨1.5g，MgSO4 0.025 g, CaCO3 0.4g,(NH4)2SO4 0.3 g，α-淀粉酶（105u/ml）0.01ml.100ml PH7.4-7.6 ?可溶性淀粉 2.0g，NaCl 0.05g，KNO3 0.1g, K2HPO4 0.05g，MgSO4.7H2O 0.05g，F(xiàn)eSO4.7H2O

0.001g，加蒸餾水至100ml，PH 7.4，牛肉膏蛋白胨

牛肉膏(5.0g），蛋白胨（10.0g），NaCl（5g），蒸餾水（1000mL），pH 7.2~7.4

發(fā)酵罐培養(yǎng)基(2L)：

黃豆餅粉 80g 淀粉 200g 酵母粉 5 g 蛋白胨 30g MgSO4 0.5 g CaCO3 8g(NH4)2SO4 6 g ?-淀粉酶（105u/ml）0.2ml（二)流加補料

碳源：葡萄糖（10%）300ml,控制1%；2000*1%=20g,200ml 氮源：硫酸銨（10%）250ml,控制16% 調(diào)PH值：0.1MHCl 0.1MNaOH（三)分析指標(biāo)及方法所用試劑及溶液

?測殘?zhí)?DNS法

1.3，5二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）：將6.3g的3，5二硝基水楊酸和2molNaOH溶液加到500ml含有182g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶苯酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容到1000ml

2.1.0mg/ml葡萄糖溶液：稱取1g葡萄糖，加蒸餾水定容到1L。

3.6mol/l氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉24g,加蒸餾水定容到100ml。

4.6mol/l的鹽酸：取濃鹽酸49.68ml,加蒸餾水定容到100ml。

?測殘氮的方法-甲醛法

1.甲基紅：0.1g甲基紅，用95%乙醇定容100ml。2.0.3mol/LHCL：取濃鹽酸2.48ml,加蒸餾水定容到100ml。3.0.02858mol/L NaOH：稱0.11432g,定容100ml。4.1%酚酞指示劑：稱取1g酚酞指示劑粉末。溶于100ml 95%乙醇溶液中。

5.95%乙醇：取乙醇96ml,倒入100ml容量瓶中定容值100ml。

6.18%中性甲醛：取48ml 38%的甲醛加入小于100ml容量瓶，往溶液中加兩滴酚酞用氫氧化鈉滴定剛好變紅，定容到100ml。

（四）器材

玻璃試管、試管架、吸管（1ml，2ml，10ml）、吸耳球、離心管、容量瓶、燒杯、三角瓶（250 ml，500ml）、量筒（250ml，500ml，1000ml）、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟（針）、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫箱、臺秤、5L-發(fā)酵罐，無菌室、培養(yǎng)皿（直徑9 cm）、陶瓦蓋、鋼管、鋼管放置器、恒溫培養(yǎng)室、滅菌刻度吸管、玻璃容器、稱量管、毛細(xì)滴管、天平、直尺或游標(biāo)卡尺、超凈工作臺，無菌培養(yǎng)皿，酒精燈，牛津杯，鑷子，移液器等等

（五）.生物效價測定所需材料

（1）菌種：大腸桿菌（Escherichia coli），菌液濃度約為

106個/mL。菌株保存的時間過久，影響其對抗生素的敏感度，導(dǎo)致抑菌圈變大、模糊或者出現(xiàn)雙圈。如若菌株不純，也會造成這樣的結(jié)果。因此，菌液在使用一段時間后，可以重新配制純化或者減小原來菌液在使用中的稀釋倍數(shù)。

（2）抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品：頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)品和供試品。（3）培養(yǎng)基：效價檢定用培養(yǎng)基1號。

（4）無菌緩沖液：稱取磷酸氫二鉀5.59g，磷酸二氫鉀0.41g，加水1000mL，即為pH 7.8的磷酸鹽緩沖液。制備緩沖液的試劑應(yīng)為分析純，配制后的緩沖液應(yīng)澄清，分裝于玻璃容器內(nèi)，經(jīng)121℃蒸氣滅菌30 min備用。（5）草酸，10 M NaOH

四、實驗步驟

⑴篩選高產(chǎn)放線菌

從土壤里篩選出高產(chǎn)放線菌，于斜面培養(yǎng)基中保藏

⑵接種

在超凈工作臺上，將長好的斜面孢子用無菌接種針挖塊約0.5×1cm，接種于滅過菌的高氏一號培養(yǎng)基中。

⑶培養(yǎng) 2 將接種好的種子搖瓶于28℃恒溫室搖床上，轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)48小時左右。

⑷實罐滅菌

1、將冷凝水管路斷開，拔下電極，打開罐蓋，將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐及補料瓶，易產(chǎn)生泡沫的培養(yǎng)基盡量不要超過兩升。

2、連接管路：取樣管路連接，補料管路連接；空氣過濾器用硅膠管與罐蓋空氣管連接，并用彈簧夾夾緊；排氣口與過濾器用硅膠管連接；安裝溫度電極、pH電極、溶氧電極，pH電極用們帽蓋緊電極上端口，溶氧 電極用鋁鉑紙包裹電極上端口，防止受潮。蓋緊其它罐蓋接口。

3、提起玻璃罐體及補料瓶放入滅菌鍋，蓋好牛皮紙，蓋好鍋蓋，確定發(fā)酵溫度及時間。

4、滅菌結(jié)束后，盡快將罐放回原位并盡快通入空氣。

⑸發(fā)酵操作

1、將滅菌后的罐體放回原位，連接冷凝水管路，通入冷凝水，連接通氣管路，調(diào)整通氣量至3～5L/min。

2、將溫度電極、pH電極、溶氧電極與控制器連接。

3、補料管連接：打開補料蠕動泵防護(hù)蓋，搬開進(jìn)出口處的白色管夾，將硅膠管嵌入入口處的管夾并夾緊，用手轉(zhuǎn)動泵頭，將硅膠管沿凹槽安裝直至出口處，開手動開關(guān)約十秒后夾緊出口處管夾，關(guān)手動開關(guān)；將酒精棉球放在罐蓋補料口內(nèi)，將針頭插入并穿透密封蓋； 打開蠕動泵手動開關(guān)，使輸液管中充滿料液，置于自動狀態(tài)。

⑹接種

將培養(yǎng)48小時的搖瓶種子接種于發(fā)酵罐中，使用接種圈放置酒精棉點燃，進(jìn)行無菌接種，接入100ml種子。接種后立即進(jìn)行第一次取樣。

⑺發(fā)酵生產(chǎn)

⑻發(fā)酵過程的測定：

?發(fā)酵液狀態(tài)觀察：粘度、顏色、氣味、菌絲形態(tài)

?發(fā)酵中殘?zhí)堑臏y定-DNS法：

1.取1.0mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按下表加入試劑。沸水浴加熱5min，冷水冷卻定容至25ml搖勻，在520nm按波長測吸光度。

編號

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液/ml

水/ml

溶液糖含量/mg

DNS試劑/ml 0 1 2 0 2 0 0.2 0.4 0.6

1.5 1.5 1.5 1.5 0.2

1.8 0.4

1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 3

0.6 4

0.8 5 1.0

0.8

1.5 1.0

1.5 1.2

1.5 1.5 1.5 6

1.2 7

1.4 8

1.6

0.6

1.4 0.4

1.6

2.取發(fā)酵液0.5ml置于50ml容量瓶中，加6mol/l的鹽酸溶液2ml，在沸水溶液中加熱15min水解，冷水冷卻后及時6mol/l氫氧化鈉溶液1.8ml，并定容到50ml的總糖水解液。

3.取總糖水解液2ml于25ml比色管中，加入DNS試劑1.5ml沸水浴中加熱5min，冷水冷卻后定容至25ml搖勻，以空白作對照在520nm波長測吸光度。

?氨基酸氮的測定：甲醛法(陳鈞鳴和徐玲娣,1991)。取2ml發(fā)酵液濾液于三角瓶內(nèi),加蒸餾水10ml,甲基紅指示劑2滴,用O.3MHCI調(diào)節(jié)pH至溶液呈紅色,再用0.02858MNaOH溶液調(diào)pH至溶液呈橙色(中性),加18%中性甲醛溶液4ml,搖勻,靜置10min,加l%酚酞指示劑8滴,用0.02858NNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點。氨基氮的計算公式為:氨基氮(mg/l00ml)=滴定體積*20。

⑼放線菌次級代謝物的初步純化及牛津杯實驗的

1、配制培養(yǎng)基高壓滅菌。

2、倒平板。

3、涂布指示菌。

4、以無菌操作在培養(yǎng)基表面直接垂直放上牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。

5、收集發(fā)酵液，緩緩加入草酸將發(fā)酵液酸化至pH 1.4-3.0左右，70 ℃，2 min，以10000 rpm離心20 min。

6、取上清加入水稀釋20%左右，在4℃，用10 M NaOH中和至pH6.4-6.8。

7、吸取中和液100 μL 加入牛津杯中，37℃培養(yǎng)16hr，觀察結(jié)果。

⑽效價測定 1.稱量

稱量前，將抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品從冰箱取出，使與室溫平衡，供試品應(yīng)放于干燥器內(nèi)至少30 min方可稱取。供試品與標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用同一天平；吸濕性較強的抗生素在稱量前1~2小時更換天平內(nèi)干燥劑。標(biāo)準(zhǔn)品稱量不可少于20 mg，取樣后立即將稱量瓶或適宜的容器及被稱物蓋好，以免吸水

稱樣量的計算W=V*C/P(式 2.10-4)式中：W：需稱取標(biāo)準(zhǔn)品或供試品的重量（mg）

V：溶解標(biāo)準(zhǔn)品或供試品制成濃溶液時用容量瓶的體積量（mL）

C：標(biāo)準(zhǔn)品或供試品高劑量的濃度（U/mL，μg/mL）P：標(biāo)準(zhǔn)品的純度或供試品的估計效價（U/mg，μg/mg）2.稀釋

從冰箱中取出的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，必須先在室溫放置，使其溫度達(dá)到室溫后，方可量取。標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液的稀釋應(yīng)采用容量瓶，每步稀釋，取樣量不得少于2 mL，稀釋步驟一般不超過3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管2~3次，吸取樣品溶液后，用濾紙將外壁多余液體擦去，從起始刻度開始放溶液。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與供試品用的緩沖液應(yīng)同一批和同瓶，（預(yù)計不夠時，應(yīng)事先與另一瓶混勻后再用），以免因pH或濃度不同影響預(yù)定結(jié)果。稀釋時，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下，再準(zhǔn)確補加至刻度。標(biāo)準(zhǔn)品與供試品高低濃度之比為2:1或4:1，但所選用的濃度必須在劑量反應(yīng)直線范圍內(nèi)。3.雙碟制備

在超凈工作臺上，用滅菌大口吸管（20 mL），取已融化的培養(yǎng)基20 mL注入雙碟內(nèi)，作為培養(yǎng)基的底層，等凝固后更換干燥的陶瓦蓋覆蓋，放置20~30 min，備用。取出試驗用菌懸液，按已試驗適當(dāng)?shù)木浚ǜ邼舛人碌囊志χ睆?8~22 mm），用滅菌吸管吸取菌懸液加入已融化并保溫在水浴中（一般細(xì)菌48~50℃，芽孢可至60℃）的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻作為菌層用。用滅菌大口5mL吸管，吸取菌層培養(yǎng)基5 mL，使均勻攤布在底層培養(yǎng)基上，置水平臺上待凝固，用陶瓦蓋覆蓋，放置20~30 min，備用。4.放置鋼管

用鋼管放置器，或其他方法將鋼管一致、平穩(wěn)地放入培養(yǎng)基上，鋼管放妥后，應(yīng)使雙碟靜置5~10 min，使鋼管在瓊脂內(nèi)稍下沉穩(wěn)定后，再開始滴加抗生素溶液。5.滴加抗生素溶液

每批供試品取5~10個雙碟，滴加溶液用毛細(xì)滴管或定量加樣器，在滴加之前須用滴加液洗2~3次。在雙碟的4個鋼管中以對角線滴加標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的高、低二種濃度的溶液，滴加順序為SH→TH→SL→TL，也可用SL→TL→TH→SH。（S代表標(biāo)準(zhǔn)品，T代表供試品，H代表高濃度，L代表低濃度），滴加溶液至鋼管口平滿，注意滴加溶液間隔不可過長，因溶液的擴(kuò)散時間不同影響測定結(jié)果。滴加完畢，用陶瓦蓋覆蓋雙碟，平穩(wěn)置于雙碟托盤內(nèi)，雙碟疊放不可超過3個，避免受熱不均，影響抑菌圈大小，以水平位置平穩(wěn)移入35~37℃恒溫培養(yǎng)室，培養(yǎng)至所需時間。

6.抑菌圈測量

用直尺或游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑，以毫米為單位，誤差不超過0.1mm。

五、結(jié)果與計算

根據(jù)實驗測量的抑菌圈大小，計算抗生素供試品的效價單位。

第二篇：土壤中放線菌的采集、分離、培養(yǎng)、發(fā)酵及提取實驗報告

土壤中放線菌的采集、分離、培養(yǎng)、發(fā)酵及提取

實驗?zāi)康模?/p>

1、從土壤中分離產(chǎn)抗生素的放線菌

2、放線菌的培養(yǎng)

3、放線菌的發(fā)酵產(chǎn)生活性物質(zhì)

4、放線菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)提取。實驗原理：

放線菌是一類呈菌絲狀生長，主要以孢子繁殖。放線菌與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切，目前廣泛應(yīng)用的抗生素約80%是各種放線菌所產(chǎn)生的。

許多臨床應(yīng)用的抗生素均由土壤中分離的放線菌產(chǎn)生。采用選擇培養(yǎng)基可分離土壤中的放線菌。產(chǎn)抗生素的放線菌經(jīng)液體培養(yǎng)后，其分泌的抗生素存在于離心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌試驗進(jìn)行檢測，從而篩選到所需的抗生素產(chǎn)生菌，并對其進(jìn)一步培養(yǎng)，繁殖，發(fā)酵，最終提取我們所需的抗生素。實驗器材：

1、土壤

2、培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基

3、其他：重鉻酸鉀、培養(yǎng)皿、牛津杯、接種環(huán)、酒精燈，無菌涂棒、三角錐瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、試管、牛皮紙、線繩等。實驗步驟：

一、土壤放線菌株的采集

采集樣品：選定取樣點（最好是有機質(zhì)含量高的菜地），按對角交叉（五點法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取2～10cm處的土壤。將5點樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等。

樣品（土壤）處理：室溫風(fēng)干

二、土壤中放線菌的分離、培養(yǎng)

1、配制淀粉培養(yǎng)基

淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏培養(yǎng)基）

可溶性淀粉2g；硝酸鉀0.1g；磷酸氫二鉀0.05g；氯化鈉0.05g；硫酸鎂0.05g；硫酸亞鐵0.001g；瓊脂2g；水100ml.先把淀粉放在燒杯里，用5ml水調(diào)成糊狀后，倒入95ml水，攪勻后加入其他藥品，使它溶解。加熱到煮沸時加入瓊脂，不停攪拌，待瓊脂完全溶解后，補足失水。調(diào)整PH到7.2-7.4，分裝后滅菌，備用。

2、土壤懸液梯度稀釋

① 將5.0g土壤加入到50ml滅菌的生理鹽水中，震蕩10min制備土壤懸液。

② 用無菌吸管吸取1ml土壤懸液，加入到9ml滅菌的生理鹽水中10倍稀釋。

③ 按1：:1稀釋至10-

3、10-

4、10-5，將3塊滅菌平板分別標(biāo)記10-

3、10-

4、10-5，稀釋過程應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。

3、將高氏一號培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至55-60℃時，加入3%的重鉻酸鉀數(shù)滴（大約100ml加0.3ml），混合均勻。分別吸取0.1ml稀釋液于滅菌平皿中，再加入10-15ml恒溫于55℃的含有重鉻酸鉀的淀粉瓊脂培養(yǎng)基中，輕輕旋轉(zhuǎn)混合均勻。

4、平皿倒置于培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)一周左右。

5、將平皿上的放線菌菌落跳去在淀粉瓊脂平皿上四區(qū)劃線進(jìn)行分離純化，28℃恒溫培養(yǎng)一周左右，觀察放線菌菌落特征。

6、將純化好的菌落轉(zhuǎn)入到斜面，4℃條件下進(jìn)行保存。

三、抗菌譜的測定

1、挑取一個放線菌的菌落接種到含有250ml淀粉液體培養(yǎng)基的三角瓶，28℃恒溫培養(yǎng)一周左右。

2、將2ml培養(yǎng)8h的大腸桿菌分別加到200ml滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中混合均勻，每培養(yǎng)皿中倒入20ml，凝固后待用。

3、在上面培養(yǎng)皿中均勻放入4個牛津杯，每個牛津杯中加入1ml放線菌發(fā)酵培養(yǎng)液。培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)12h。

4、測量抑菌圈的大小。

四、發(fā)酵

1、配制種子培養(yǎng)基

蔗糖22.5g，黃豆粉12.5g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣2g，蒸餾水1000ml，PH值7.2,121℃滅菌20min。

2、配制發(fā)酵培養(yǎng)基

蔗糖45g，黃豆粉25g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣3g，蒸餾水1000ml，PH7.2。121℃滅菌20min。

3、種子液的制備

將試管斜面菌種轉(zhuǎn)管活化，28℃培養(yǎng)7天后，以接種取一環(huán)孢子轉(zhuǎn)入裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-1 培養(yǎng)4天。

4、發(fā)酵培養(yǎng)

以6%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接入裝有50ml初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-

1培養(yǎng)4天。

5、活性檢測

發(fā)酵液經(jīng)4000r/ min-1 離心15min，取上清，杯碟法測定抗菌活性（同三）。

五、提取

1、發(fā)酵液經(jīng)4000r/ min-1 離心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例進(jìn)行萃取。

2、活性檢測

將萃取液濃縮，杯碟法測定抗菌活性（同三）。