第一篇：豬源TTV論文：豬源TTV ORF 熒光定量PCR 多克隆抗體

豬源TTV論文：豬源TTV轉(zhuǎn)錄本的鑒定及熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

【中文摘要】TTV(Torque teno virus)屬于環(huán)病毒科指環(huán)病毒屬成員,為單股、環(huán)狀、負(fù)鏈的DNA病毒,正20面體對(duì)稱結(jié)構(gòu),無(wú)囊膜。人源TTV基因組大小約為3900bp,豬源TTV約2700bp。到目前為止,尚未發(fā)現(xiàn)豬源TTV與任何一種豬病有必然聯(lián)系,但是與一些豬病的發(fā)生有一定的相關(guān)性,如斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥、豬皮炎腎炎綜合癥等,因此,研究豬源TTV對(duì)于預(yù)防其潛在的致病性有重要意義。

1、由于還沒(méi)有找到適合在體外培養(yǎng)TTV的細(xì)胞系,其基因組結(jié)構(gòu)及復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)制尚不清楚。本研究利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有TTV2基因組三種不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒pSK+1TTV2(含有1個(gè)TTV2基因組拷貝的pSK載體)、pSK+1.3TTV2(含有1.3個(gè)TTV2基因組拷貝的pSK載體)、pSK+2TTV2(含有2個(gè)TTV2基因組拷貝的pSK載體),將其轉(zhuǎn)染至張氏肝細(xì)胞,48小時(shí)后,提取總的RNA,用DpnI消化其中可能存在的DNA,然后利用預(yù)測(cè)的閱讀框ORF1、ORF2、ORF3的擴(kuò)增引物,確證其中的DNA已經(jīng)消除干凈。RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后,用這三對(duì)引物擴(kuò)增基因片段,經(jīng)克隆和測(cè)序,結(jié)果發(fā)現(xiàn):ORF1確實(shí)發(fā)生了轉(zhuǎn)錄,但轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并非O...【英文摘要】TTV(Torque teno virus), a small, non-enveloped virus, has a single-stranded circular DNA genome and is currently classified into the family Anelloviridae.Viral DNA of both porcine TTV species(TTV1 and TTV2)has a high

prevalence in both healthy ans diseased pigs worldwide and multiple infection of porcine TTV species with distinct genotypes or subtypes of the same species has been documented in China.Human TTV genome has 3900bp and porcine TTV 2700bp.So far, no porcine diseases have been found a reason...【關(guān)鍵詞】豬源TTV ORF 熒光定量PCR 多克隆抗體

【英文關(guān)鍵詞】porcine TTV ORF fluorescence quantitative PCR polyclonal antibody 【索購(gòu)全文】聯(lián)系Q1：138113721 Q2：139938848 同時(shí)提供論文寫作一對(duì)一輔導(dǎo)和論文發(fā)表服務(wù).保過(guò)包發(fā)

【目錄】豬源TTV轉(zhuǎn)錄本的鑒定及熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立摘要6-817-29

Abstract8-9

第一章 緒論

1.2 人TTV 的研

1.2.2 1.1 TTV 的發(fā)現(xiàn)及概況17-19究進(jìn)展19-251.2.1 人TTV 流行情況的調(diào)查19人TTV 的分子生物學(xué)特征19-242

41.2.3 人TTV 的致病性

1.3 豬源TTV 研1.2.4 人TTV 感染的診斷24-25究現(xiàn)狀25-272

51.3.1 豬源TTV 的流行病學(xué)調(diào)查

1.3.3 豬源TTV 1.3.2 豬源TTV 的基因型25-26

26的分子生物學(xué)特征26-27

1.3.4 豬源TTV 的致病性

1.3.6 TTV 研究第二章 豬源TTV

2.1.1 質(zhì)1.3.5 豬源TTV 的檢測(cè)方法

1.4 目的和意義的前景展望2727-29轉(zhuǎn)錄本的鑒定29-472.1 材料與方法29-37

粒、菌株和細(xì)胞2929-3030

2.1.2 試驗(yàn)試劑和主要儀器設(shè)備2.1.3 CaCl_2 法制備大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞2.1.4 陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞30

312.1.6 陽(yáng)性質(zhì)粒的酶切鑒定

2.1.8 陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)

2.1.5 小量制備陽(yáng)性質(zhì)粒312.1.7 大量制備陽(yáng)性質(zhì)粒31-33

33-3

42.1.9 提取總?cè)局翉埵细渭?xì)胞系RNA34-3535段362.1.10 總RNA 中殘余DNA 的檢測(cè)

2.1.12 PCR 擴(kuò)增目的基因片

2.1.14 目的基因2.2.1 含TTV2 2.1.11 反轉(zhuǎn)錄35-362.1.13 PCR 產(chǎn)物的回收36-37

2.2 結(jié)果37-45片段的克隆與測(cè)序FJ2 基因組不同拷貝數(shù)的三種質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果37-382.2.2 含TTV2 FJ2 基因組不同拷貝數(shù)的三種質(zhì)粒的大

2.2.3 總RNA 反轉(zhuǎn)錄后目的基因的擴(kuò)增結(jié)

2.3 討論量抽提結(jié)果38-39果39-4145-4747-614747-48482.2.4 測(cè)序結(jié)果分析41-45第三章 豬源TTV2 ORF1 和ORF2 的多克隆抗體制備3.1 材料與方法47-543.1.2 試劑與儀器47

3.1.1 質(zhì)粒、菌株與載體3.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3.1.4 TSS 法制備BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞3.1.5 ORF1 全長(zhǎng)的體外表達(dá)48-49

3.1.6 ORF1 的3.1.7 B 細(xì)胞表位富集區(qū)和ORF2 全長(zhǎng)的體外表達(dá)49-53ORF1a 和ORF2 的多克隆抗體的制備53-54ORF2 多克隆抗體的ELISA 效價(jià)測(cè)定54

3.1.8 ORF1a 和3.2 結(jié)果

54-593.2.1 ORF1 的抗原性分析結(jié)果54-553.2.2 ORF1a 和ORF2 基因的PCR 擴(kuò)增5555-5656-5959

3.2.3 重組質(zhì)粒的鑒定3.2.4 ORF1a 和ORF2 重組蛋白的表達(dá)與純化3.2.5 ORF1a 和ORF2 多克隆抗體的ELISA 效價(jià)測(cè)定3.3 討論59-61

第四章 豬源TTV 熒光定量PCR 檢4.1 材料與方法61-644.1.2 試劑和儀器61-62

4.1.1 病4.1.3 引物

4.1.5 測(cè)方法的建立61-69料與核酸樣品61和探針設(shè)計(jì)62陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板的制備63636464-65驗(yàn)結(jié)果67結(jié)果67-6869-7081

4.1.4 病毒基因組DNA 的提取6262-63

4.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

4.1.8 敏感性試驗(yàn)4.1.7 特異性試驗(yàn)634.1.9 重復(fù)性試驗(yàn)63-644.2 結(jié)果64-68

4.1.10 病料的的檢測(cè)

4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

4.2.3 敏感性試4.2.5 樣品檢測(cè)4.2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果65-674.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果4.3 討論68-69參考文獻(xiàn)70-80

第五章 全文結(jié)論 致謝80-81

作者簡(jiǎn)歷

第二篇：豬源長(zhǎng)生態(tài)豬養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)分享

看到快樂(lè)養(yǎng)豬有的人可能會(huì)說(shuō)，我聽說(shuō)過(guò)生態(tài)養(yǎng)豬，但是什么是快樂(lè)養(yǎng)豬呢?養(yǎng)豬還能 快樂(lè)嗎，其實(shí)，快樂(lè)養(yǎng)豬更多的是改變?nèi)藗凁B(yǎng)豬的一種觀念和態(tài)度。

一、快樂(lè)養(yǎng)豬的關(guān)鍵點(diǎn)

快樂(lè)養(yǎng)豬的三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是生態(tài)養(yǎng)豬、高效養(yǎng)豬和掌控市場(chǎng)，那么怎樣才能做到呢，下面 分別介紹一下。

(一)生態(tài)養(yǎng)豬

對(duì)于豬場(chǎng)是否做到了生態(tài)養(yǎng)豬就看豬場(chǎng)的獸醫(yī)一天工作幾個(gè)小時(shí)，如果一天工作十幾個(gè) 小時(shí)的話，就趕緊開除，而對(duì)于每天無(wú)所事事的獸醫(yī)則要趕緊漲工資，因?yàn)轲B(yǎng)殖場(chǎng)主要做的 就是讓豬群健康成長(zhǎng)，而不是動(dòng)物醫(yī)院。

作為豬場(chǎng)有的一個(gè)獸醫(yī)主要做到三個(gè)方面就可以了，一是要有理論知識(shí)和操作技巧，對(duì) 于平時(shí)的疾病感染和疫苗接種要做到位：第二就是要有科學(xué)的數(shù)據(jù)和報(bào)告，不能憑著感覺(jué)說(shuō) 話。三是不能有自己的觀念只要執(zhí)行即可，而不能擅作主張。

(二)高效養(yǎng)豬

要想能做到快樂(lè)養(yǎng)豬，高效養(yǎng)豬很關(guān)鍵，比如，目前，我國(guó)的母豬的生產(chǎn)能力都很低，外國(guó)一頭母豬能提供23.8頭仔豬，而我國(guó)大多是提供 11-12 頭仔豬，能提供 15-16 頭的就屬

于較好的，17-18頭那是絕對(duì)的優(yōu)秀，生產(chǎn)性能這么差養(yǎng)豬虧本就是很正常的事情了，所以 要做到快樂(lè)養(yǎng)豬就要做到高效養(yǎng)豬。

(三)掌控市場(chǎng)

在這里想為大家講一個(gè)“老虎的故事”。有兩個(gè)人在森林里赤腳散步，有一個(gè)人隨身帶 著鞋子另一個(gè)人則沒(méi)有，突然有一只老虎從遠(yuǎn)處沖了過(guò)來(lái)，帶了鞋子的人穿上鞋子跑的更快，他的朋友對(duì)她說(shuō)“別穿了，你穿上鞋就能跑過(guò)老虎?”!正在穿鞋子的人說(shuō)能不能跑得過(guò)老虎 并不重要，重要的是能夠跑得過(guò)你!”

其實(shí)養(yǎng)豬也是一樣，打比方說(shuō)，如果豬價(jià)上漲是別人的豬都生病死掉，你的豬只要存活 就能買的好價(jià)錢，所以說(shuō)我們大家養(yǎng)豬你不要養(yǎng)到最好，只要能比你周圍的人養(yǎng)得好就行了。

那怎樣才能比別人養(yǎng)得好、虧得少呢，有兩個(gè)方法：

一是節(jié)流，即降低工資標(biāo)準(zhǔn)或獎(jiǎng)金或使用便宜的產(chǎn)品如飼料、疫苗，但是我需要說(shuō)明的 是小節(jié)約=大浪費(fèi)。有一個(gè)搞房地產(chǎn)的老板改行去養(yǎng)豬了，他就問(wèn)我，我怎樣才可以降低成 本呢，喂點(diǎn)便宜的飼料，用的便宜的疫苗可不可以，后來(lái)我就問(wèn)他，你以前搞地產(chǎn)的時(shí)候怎 么節(jié)流呀，是不是把粗的鋼筋換成細(xì)的，他說(shuō)，那可不行，那是要出人命的。其實(shí)養(yǎng)豬也一樣，錢是省不了的。

二是開源，越是在行情差的時(shí)候，越是要漲工資，以提高大家的生產(chǎn)積極性，從而達(dá)到 提高生產(chǎn)性的目的，如 7 日齡、20 日齡時(shí)仔豬受環(huán)境污染，很容易發(fā)生腹瀉性疾病，而且 一旦發(fā)生就很難控制，但是仔豬的蹋腹瀉病控制好了，斷奶時(shí)體重增加0.5千克，出術(shù)加5 千克，也就是說(shuō)經(jīng)濟(jì)效益能夠增加10 倍。

仔豬出現(xiàn)腹瀉時(shí)，其實(shí)前 2 天天就已經(jīng)有了炎癥，這時(shí)可能只;只有一些細(xì)微的變化，一旦發(fā)病后，要 2 天以后才能修復(fù)，結(jié)果就是本來(lái)體重會(huì)增加 1 千克，結(jié)果反而減少 0.25 千克。

如果豬場(chǎng)技術(shù)人員能夠提前發(fā)現(xiàn)病情，那么按 1窩豬 10頭來(lái)計(jì)算，每頭豬斷奶時(shí)體重 能增加 1.25 千克，出欄時(shí)每頭豬就能增加 12.5 千克，2 窩豬(20 頭)就，就可以增(增加加250

千克，如果以當(dāng)前的行情按每千克 12 元來(lái)計(jì)算的話，那么 250 x 12=3000 元，養(yǎng)這兩欄豬

就可以增加3000元的效益。如果能做到這一點(diǎn)的話，雖然你不能掌控市場(chǎng)的價(jià)格，但你可 以做到比別人少賠錢，或比別人多掙錢。

二、實(shí)現(xiàn)快樂(lè)養(yǎng)豬的方法

(一)努力學(xué)習(xí)科學(xué)養(yǎng)豬技術(shù)

應(yīng)用科學(xué)技術(shù)是第一生產(chǎn)生產(chǎn)力，學(xué)精通的目的就在于應(yīng)用，一定要活到老，學(xué)到老，而且還要用到老。

(二)建立正確的觀念

1.表面的節(jié)約往往是透支未來(lái)

永遠(yuǎn)不要在節(jié)約上面做文章，節(jié)約往往會(huì)透支未來(lái)。

2.敢于應(yīng)用新技術(shù)和新產(chǎn)品

新產(chǎn)品只有最先使用者才能額外受益，因?yàn)楫a(chǎn)品價(jià)格=該產(chǎn)品的平均社會(huì)成本(使用普通 方法產(chǎn)生的成本)+該產(chǎn)品的平均社會(huì)利潤(rùn)，產(chǎn)品的平均社會(huì)成本是可以變化的，比如，養(yǎng)一 頭豬的利潤(rùn)是150元，目前使用普通方法養(yǎng)一頭豬的成本，也就是平均社會(huì)成本是800元。那么豬這個(gè)產(chǎn)品的價(jià)格就是 800+150=950 元，如果這時(shí)你采用熱水豬的話成本可以降低為 700元，也就等于你比別人多盈利100元;

但是隨著大家對(duì)一種新事物的熟知，如果大家都采用 1水養(yǎng)豬的話，那么養(yǎng)豬的平均社 會(huì)成本就變?yōu)?700元，么這時(shí)的產(chǎn)品價(jià)格就是 700+150=850元，所以對(duì)新

產(chǎn)品的使用，受益的往往是最先使用者。

3.效果不好的才是最貴的有人買東西總是衡量?jī)r(jià)格的貴賤，其實(shí)效果不好的產(chǎn)品才是最貴的，比如有人送給你一

噸消毒劑(其實(shí)就是水)，你回去后拿去消毒，因?yàn)楫a(chǎn)品本身不好，所以就起不應(yīng)有的效果，這時(shí)候可不僅僅是沒(méi)花錢，有可能損失的是50 萬(wàn)，所以說(shuō)效果不好的才是最貴的。

(三)改變態(tài)度

要想做到快樂(lè)養(yǎng)豬就要改變態(tài)度，怎樣改變態(tài)度呢?那就是把豬當(dāng)人待，比如，母豬的產(chǎn)房有沒(méi)有問(wèn)題，就自己去睡一晚上，這時(shí)候豬舍的空氣質(zhì)量、溫度、濕度是否合適，就都 明白了。

1.把仔豬當(dāng)兒女

給仔豬喝溫水豬是恒溫動(dòng)物，所有的豬都應(yīng)隨時(shí)隨喝到溫水，最適合的水溫就是豬的體 溫，水溫過(guò)高或過(guò)都會(huì)對(duì)豬產(chǎn)生負(fù)面影響，斷奶后喝冷水，會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重后果，打個(gè)比方說(shuō)，誰(shuí)會(huì)給自己家的小孩子喝冷水，其實(shí)對(duì)豬是一樣，一旦喝冷水，就會(huì)對(duì)仔豬產(chǎn)生不利影響，主要有下幾個(gè)方面：

產(chǎn)生冷應(yīng)激，使免疫力下降，抵抗力差，豬只易生病;

冷水刺激胃腸，還會(huì)引起腹瀉甚至脫水;

因冷水的口感差，可使小豬減少飲水量，從而影響采食量，直接影響生長(zhǎng)速度;

飲用冷水還會(huì)用飼料提供的熱能把冷水加熱到體溫(40℃左右)，從而消耗大量飼料，降 低經(jīng)濟(jì)效益。

給保育豬喝溫水，可使仔豬精神狀態(tài)好，很少生病，成活率顯著提高，日增重明顯提高，料肉比顯著降低。

為小豬提供最適生長(zhǎng)溫度 因?yàn)樨i是恒溫動(dòng)物，只有在適宜的溫度條件下才能正常生長(zhǎng)、發(fā)育，充分發(fā)揮其生產(chǎn)潛力，達(dá)到多成活、快生長(zhǎng)、多增重、少耗料、增產(chǎn)增效的目的。低溫會(huì)使仔豬成活率低，生長(zhǎng)發(fā)育慢，飼料利用率低、健康狀況差，容易發(fā)生疾病，因 此，做好保溫很關(guān)鍵。

保溫應(yīng)解決好三個(gè)方面的問(wèn)題：一是滿足仔豬不同階段對(duì)溫度的不同要求;二是保持恒 定溫度;三是要二次加溫，解決方案是利用微電腦技術(shù)或全自動(dòng)恒溫地暖系統(tǒng)。

仔豬創(chuàng)造干燥的環(huán)境仔豬環(huán)境的衛(wèi)生指標(biāo)有兩個(gè)，分別為干凈和干燥，因?yàn)椴≡鲋车?四大條件分別是空氣(氧氣)、營(yíng)養(yǎng)(有機(jī)物)、溫度和濕度，所以創(chuàng)造干凈和干燥的環(huán)境條件 即有利于減少病原的增殖。

2.把母豬當(dāng)老婆待確保母豬健康母豬健康的標(biāo)準(zhǔn)是什么?就是能吃、能睡、排泄好、皮膚紅潤(rùn)有彈性，皮

毛有光澤，沒(méi)有生殖系統(tǒng)炎癥。

疫抑制的重要原因是什么?主要有以下三個(gè)方面：

第一，免疫抑制性疾病普遍存在，如藍(lán)耳病病毒、圓環(huán)毒會(huì)直接破壞免疫系統(tǒng)，目前越 來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為豬瘟、支原體和豬流感也是免疫抑制性疾病;

第二，霉菌毒素會(huì)干擾免疫系統(tǒng);

第三，濫用抗生素破壞機(jī)體抵抗力、形成耐藥菌株、破體微生態(tài)平衡。目前很多豬場(chǎng)用 抗生素來(lái)做保健，要知道在人的保健品中沒(méi)有一個(gè)是抗生素，抗生素是用來(lái)治病的，不到萬(wàn) 不得已是不能用的，目前由于抗生素的大量應(yīng)用使豬的肝腎嚴(yán)重受損，從而使機(jī)體產(chǎn)生免疫 抑制，抵抗力下降，容易被大量病毒感染，從而繼發(fā)細(xì)菌性疾病，造成嚴(yán)重的損失，而出現(xiàn) 這種發(fā)病情況后，又不得不大量使抗生素，從而使養(yǎng)豬業(yè)形成惡性循環(huán)。

解決措施就是解除母豬的免疫抑制、修復(fù)受損的免疫系統(tǒng)，提升母豬自身的抵抗力，方 案是實(shí)施真正意義上的保健，逐漸減少直至徹底取消抗生素的使用。

控制便秘，便秘是健康的殺手，它直接導(dǎo)致毒素在體內(nèi)的蓄積，進(jìn)而給機(jī)體帶來(lái)一系列 的嚴(yán)重危害，同時(shí)還會(huì)害母豬健康、使毒素危害胎兒、造成子宮炎癥和難產(chǎn)、引起產(chǎn)后泌乳 綜合征、仔豬頻繁下痢。

便秘的主要原因有飲水不足、膳食纖維不足、長(zhǎng)期大量投喂抗生素、某些營(yíng)養(yǎng)元素嚴(yán)重 不足、運(yùn)動(dòng)量不夠。

對(duì)于便秘的解決方案可以補(bǔ)充纖維素，補(bǔ)充青綠飼料，每天以 1-2 千克為宜，可適當(dāng)調(diào) 高纖維素含量較高的料的比例，如麥麩等;使用復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)便秘有一定的改善;也可以 飼喂無(wú)機(jī)鹽類制劑，如人工鹽及其衍生物。

第三篇：豬細(xì)小病毒論文：豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

豬細(xì)小病毒論文：豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

【中文摘要】豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是當(dāng)前影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的3種重要的病原。由于PPV、PRV、PCV-2單獨(dú)感染或混合感染均能引起豬發(fā)病,造成母豬的繁殖障礙或(和)感染豬的免疫抑制,為其他病原的繼發(fā)感染提供了便利,甚至?xí)斐韶i群中疫病的流行,使養(yǎng)殖效益蒙受損失。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)具有快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn),自發(fā)明以來(lái)在病原的特異性檢測(cè)方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì),在動(dòng)物疫病診斷和病原檢測(cè)上也得到廣泛地應(yīng)用,對(duì)疫病防控起到了重要的作用。由于當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)中豬群中多種病原混合感染病例的增多,單一病原PCR檢測(cè)方法也表現(xiàn)出自身的不足,需要對(duì)一種病料進(jìn)行多次PCR檢測(cè),使得檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng),耗費(fèi)人力,成本也高。多重PCR不僅保持了普通PCR敏感性高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),而且還具有一個(gè)PCR反應(yīng)就同時(shí)檢測(cè)多種病原,具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏等優(yōu)點(diǎn),能滿足生產(chǎn)上同時(shí)對(duì)多種疾病進(jìn)行快速診斷的要求。本研究基于前期對(duì)陜西省部分養(yǎng)殖企業(yè)豬群中病毒性病原的調(diào)查檢測(cè),發(fā)現(xiàn)常有PPV、PRV和PCV-2的單純或混合感染,為此我們擬建立PPV、PRV和PCV-2檢測(cè)的多重PCR方法,以期為生產(chǎn)中這3種病原的快速檢測(cè)提供可用方法。本研究獲得了以下結(jié)果:(1)根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的PPV、PRV和PCV-

2的全基因序列,利用DNAStar和Oligo6.0軟件,針對(duì)病毒的保守性基因序列,分別設(shè)計(jì)了檢測(cè)引物,通過(guò)對(duì)引物濃度、退火溫度、PCR組分等條件的優(yōu)化建立起鑒別PPV、PRV和PCV-2多重PCR方法,方法敏感性試驗(yàn)表明,PRV、PCV-2在多重PCR反應(yīng)中的敏感性到達(dá)pg級(jí),而PRV在多重PCR反應(yīng)中的敏感性少了一個(gè)數(shù)量級(jí),其最低檢測(cè)量也達(dá)到了10pg級(jí)。以PCV-

1、牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、大腸埃希菌、PPV、PRV、PCV-2為模板分別進(jìn)行多重PCR檢測(cè),結(jié)果表明只有PPV、PRV和PCV-2多重PCR及單個(gè)病毒的PCR均擴(kuò)增出各自的特異性條帶。(2)用建立的方法對(duì)采自陜西省部分豬場(chǎng)的286份病料及血樣進(jìn)行病毒檢測(cè),從臨床健康豬全血樣品中PPV、PRV和PCV-2的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,PCV-2在正常豬群中有一定比例的存在,同時(shí)在個(gè)別豬場(chǎng)也存在PRV和PCV-2雙重感染的現(xiàn)象;從臨床患病豬病料中進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PRV和PCV-2混合感染較嚴(yán)重,并有PPV+PRV+PCV-2三重感染發(fā)生;多重PCR檢測(cè)結(jié)果與單項(xiàng)PCR檢測(cè)結(jié)果的符合率達(dá)99%以上,說(shuō)明建立的多重PCR檢測(cè)方法可用于臨床樣品的檢測(cè),為這3種疫病的診斷提供依據(jù)。

【英文摘要】Porcine parvovirus , porcine pseudorabies and porcine circovirus are three main threat to the development of swine-breeding industry.Beacause sigle or mixed infection of the three virus both can cause diseases which can give rise to reproductive failure or(and)immunosuppression, it provides a convenient chance for secondary infection by other pathogens

and enven causes epidemic diseases in pigs wich can lead to tremendous economic losses ,and may arise public health problems.PCR with rapid,specific and sensitive advantages exhibits obvious preponderance in specificit detection of infectious agents in animals since it was invent.And it is applied widely in animal disease diagnosis and pathogen detection which has made important contributions to disease prevention and control.At present,the cases of mixed infection of pathogen are increasing,and common分子molecular detection of pathogen has show its own shortage of time consuming ,high cost and labour power when we need detect one specimen repeatedly.Mutiplex PCR not only preserve advantages of routine PCR,but also owns advantages of convenience shortcut and sensitiveness which meet the need of fast diagonosis for multiple diseases in production.We found that sigle or mixed infection of PPV、PRV and PCV-2 is common in the course for the survey of viral pathogen in some breeding enterprises in this research.So we plan to establish the mutiplex PCR for detection of PPV、PRV and PCV-2,in purpose for providing fast detection of the three pathogens an available method.(1)Specific primers for DNA viruses, namely, porcine parvovirus(PPV), pseudorabies virus(PRV), porcine circovirus type 2

(PCV-2),were synthesized according to the published virus conserved gene sequence of PPV, PRV and PCV-2 in GenBank and used by DNAStar and Oligo 6.0 software.We establish a mutiplex PCR method for the detection of PPV, PRV and PCV-2 by optimizing concentration of primers,annealing temperature and component of PCR.Sensibility test shows that the susceptibility of PRV and PCV-2 reach the level of pg.With PCV-1, bovine viral diarrhea virus, classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine transmissible gastroenteritis virus, Escherichia coli, PPV, PRV, PCV-2 as a template for multiple PCR were detected,the results show that the only PPV, PRV and PCV-2 virus in a single or multiplex PCR were amplified by their specific band.(2)The blood samples collected from 286 pig farms in Shaanxi Province were viral detection by this method.Clinically healthy pigs from a blood sample PPV, PRV and PCV-2 test results indict that PCV-2 in normal pigs have a certain percentage of presence, meanwhile several farms also exist the phenomenon of the PRV and PCV-2 dual infection.Swine from the clinical illness were detected compound, It was serous of PRV+PCV-2 combined infection in diseased pigs,and PPV+PRV+PCV-2 combined infection also were detected in diseased pigs.The coincidence

rate of multiplex PCR test and single PCR test is more than 99%, illutstrating that The developed novel multiplex PCR will be a tool used for the detection of clinical samples for diagnosis reference.【關(guān)鍵詞】豬細(xì)小病毒 偽狂犬病病毒 豬圓環(huán)病毒2型 多重PCR 【英文關(guān)鍵詞】Porcine parvovirus(PPV)Pseudorabies virus(PRV)Porcine circovirus type 2 multiplex PCR(mPCR)【目錄】豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用綜述12-

31摘要6-8

ABSTRACT8-9

文獻(xiàn)

第一章 豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒

12-26

1.1 豬細(xì)小病毒

1.1.2 豬細(xì)小病毒的特性

1.1.4 PPV

1.2.1 2型檢測(cè)方法研究進(jìn)展12-1913-141.1.1 概述12-131.1.3 豬細(xì)小病毒病流行情況14-1

51.2 偽狂犬病病毒19-22的檢測(cè)方法研究15-19概述191.2.2 偽狂犬病病毒的特性19-20

1.2.4 偽狂犬病病毒檢測(cè)方法

1.3.1 概述

1.2.3 偽狂犬病流行情況2020-2222-231.3 豬圓環(huán)病毒22-261.3.2 豬圓環(huán)病毒的特性231.3.3 豬圓環(huán)病毒檢測(cè)方法23-26檢測(cè)上的應(yīng)用26-31PCR 技術(shù)26

第二章 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在動(dòng)物病原

2.1 PCR 技術(shù)概述26-27

2.1.1 2.2 主要的2.1.2 PCR 技術(shù)的發(fā)展26-27

PCR 技術(shù)27-31PCR(nested PCR)

2.2.1 常規(guī)PCR272.2.2 套式

2.2.4 反

2.2.3 二溫式PCR27-28轉(zhuǎn)錄PCR(RT PCR)2828

2.2.5 反轉(zhuǎn)錄一復(fù)合套式聚合酶鏈反應(yīng)

2.2.7 競(jìng)爭(zhēng)PCR(compete

2.2.9 定量2.2.11 多

第三章 2.2.6 反向PCR28PCR)28-29PCR29

2.2.8 標(biāo)記PCR(LP-PCR)292.2.10 玻片PCR(Slide-PCR29-30

31試驗(yàn)研究31-45重PCR(Multiplex PCR)豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2 型 PCR 檢測(cè)方法的建立31-38313232-333.1 材料與方法31-3

33.1.1 主要試劑

3.1.3 引物設(shè)計(jì)3.1.5 PCR 反應(yīng)33

3.1.7 PCR 產(chǎn)物3.1.2 毒株、菌株和細(xì)胞31-323.1.4 病毒DNA 的提取323.1.6 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化的測(cè)序分析333333-343434-3636

3.1.8 PCR 反應(yīng)的敏感性和特異性分析

3.2.1 最佳PCR 退火溫度的確定3.2 結(jié)果33-363.2.2 PCR 反應(yīng)最佳引物體濃度的確定3.2.3 PCR 產(chǎn)物的鑒定3

43.2.4 PCR 反應(yīng)的敏感性3.2.5 PCR 反應(yīng)的特異性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)3.3 討論36-38

第四章 PPV , PRV和PCV 2多重PCR

38-4

54.1 材料與方法檢測(cè)方法的建立與臨床樣品檢測(cè)分析38-39384.1.1 主要試劑38

4.1.2 毒株、菌株、細(xì)胞38

4.1.4 多重PCR

4.2 結(jié)果4.1.3 臨床樣品及病料的采集反應(yīng)條件的優(yōu)化384.1.5 樣品檢測(cè)38-39

39-424.2.1 兩重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化39-40

4.2.3 樣品檢測(cè)41-42

參考文獻(xiàn)46-56

4.2.2 4.3 討致謝多重PCR 的建立40-41論42-4556-57結(jié)論

45-46作者簡(jiǎn)介57