第一篇：豬細(xì)小病毒論文：豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

豬細(xì)小病毒論文：豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

【中文摘要】豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是當(dāng)前影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的3種重要的病原。由于PPV、PRV、PCV-2單獨(dú)感染或混合感染均能引起豬發(fā)病,造成母豬的繁殖障礙或(和)感染豬的免疫抑制,為其他病原的繼發(fā)感染提供了便利,甚至?xí)斐韶i群中疫病的流行,使養(yǎng)殖效益蒙受損失。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)具有快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn),自發(fā)明以來(lái)在病原的特異性檢測(cè)方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì),在動(dòng)物疫病診斷和病原檢測(cè)上也得到廣泛地應(yīng)用,對(duì)疫病防控起到了重要的作用。由于當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)中豬群中多種病原混合感染病例的增多,單一病原PCR檢測(cè)方法也表現(xiàn)出自身的不足,需要對(duì)一種病料進(jìn)行多次PCR檢測(cè),使得檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng),耗費(fèi)人力,成本也高。多重PCR不僅保持了普通PCR敏感性高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),而且還具有一個(gè)PCR反應(yīng)就同時(shí)檢測(cè)多種病原,具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏等優(yōu)點(diǎn),能滿足生產(chǎn)上同時(shí)對(duì)多種疾病進(jìn)行快速診斷的要求。本研究基于前期對(duì)陜西省部分養(yǎng)殖企業(yè)豬群中病毒性病原的調(diào)查檢測(cè),發(fā)現(xiàn)常有PPV、PRV和PCV-2的單純或混合感染,為此我們擬建立PPV、PRV和PCV-2檢測(cè)的多重PCR方法,以期為生產(chǎn)中這3種病原的快速檢測(cè)提供可用方法。本研究獲得了以下結(jié)果:(1)根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的PPV、PRV和PCV-

2的全基因序列,利用DNAStar和Oligo6.0軟件,針對(duì)病毒的保守性基因序列,分別設(shè)計(jì)了檢測(cè)引物,通過(guò)對(duì)引物濃度、退火溫度、PCR組分等條件的優(yōu)化建立起鑒別PPV、PRV和PCV-2多重PCR方法,方法敏感性試驗(yàn)表明,PRV、PCV-2在多重PCR反應(yīng)中的敏感性到達(dá)pg級(jí),而PRV在多重PCR反應(yīng)中的敏感性少了一個(gè)數(shù)量級(jí),其最低檢測(cè)量也達(dá)到了10pg級(jí)。以PCV-

1、牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、大腸埃希菌、PPV、PRV、PCV-2為模板分別進(jìn)行多重PCR檢測(cè),結(jié)果表明只有PPV、PRV和PCV-2多重PCR及單個(gè)病毒的PCR均擴(kuò)增出各自的特異性條帶。(2)用建立的方法對(duì)采自陜西省部分豬場(chǎng)的286份病料及血樣進(jìn)行病毒檢測(cè),從臨床健康豬全血樣品中PPV、PRV和PCV-2的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,PCV-2在正常豬群中有一定比例的存在,同時(shí)在個(gè)別豬場(chǎng)也存在PRV和PCV-2雙重感染的現(xiàn)象;從臨床患病豬病料中進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PRV和PCV-2混合感染較嚴(yán)重,并有PPV+PRV+PCV-2三重感染發(fā)生;多重PCR檢測(cè)結(jié)果與單項(xiàng)PCR檢測(cè)結(jié)果的符合率達(dá)99%以上,說(shuō)明建立的多重PCR檢測(cè)方法可用于臨床樣品的檢測(cè),為這3種疫病的診斷提供依據(jù)。

【英文摘要】Porcine parvovirus , porcine pseudorabies and porcine circovirus are three main threat to the development of swine-breeding industry.Beacause sigle or mixed infection of the three virus both can cause diseases which can give rise to reproductive failure or(and)immunosuppression, it provides a convenient chance for secondary infection by other pathogens

and enven causes epidemic diseases in pigs wich can lead to tremendous economic losses ,and may arise public health problems.PCR with rapid,specific and sensitive advantages exhibits obvious preponderance in specificit detection of infectious agents in animals since it was invent.And it is applied widely in animal disease diagnosis and pathogen detection which has made important contributions to disease prevention and control.At present,the cases of mixed infection of pathogen are increasing,and common分子molecular detection of pathogen has show its own shortage of time consuming ,high cost and labour power when we need detect one specimen repeatedly.Mutiplex PCR not only preserve advantages of routine PCR,but also owns advantages of convenience shortcut and sensitiveness which meet the need of fast diagonosis for multiple diseases in production.We found that sigle or mixed infection of PPV、PRV and PCV-2 is common in the course for the survey of viral pathogen in some breeding enterprises in this research.So we plan to establish the mutiplex PCR for detection of PPV、PRV and PCV-2,in purpose for providing fast detection of the three pathogens an available method.(1)Specific primers for DNA viruses, namely, porcine parvovirus(PPV), pseudorabies virus(PRV), porcine circovirus type 2

(PCV-2),were synthesized according to the published virus conserved gene sequence of PPV, PRV and PCV-2 in GenBank and used by DNAStar and Oligo 6.0 software.We establish a mutiplex PCR method for the detection of PPV, PRV and PCV-2 by optimizing concentration of primers,annealing temperature and component of PCR.Sensibility test shows that the susceptibility of PRV and PCV-2 reach the level of pg.With PCV-1, bovine viral diarrhea virus, classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine transmissible gastroenteritis virus, Escherichia coli, PPV, PRV, PCV-2 as a template for multiple PCR were detected,the results show that the only PPV, PRV and PCV-2 virus in a single or multiplex PCR were amplified by their specific band.(2)The blood samples collected from 286 pig farms in Shaanxi Province were viral detection by this method.Clinically healthy pigs from a blood sample PPV, PRV and PCV-2 test results indict that PCV-2 in normal pigs have a certain percentage of presence, meanwhile several farms also exist the phenomenon of the PRV and PCV-2 dual infection.Swine from the clinical illness were detected compound, It was serous of PRV+PCV-2 combined infection in diseased pigs,and PPV+PRV+PCV-2 combined infection also were detected in diseased pigs.The coincidence

rate of multiplex PCR test and single PCR test is more than 99%, illutstrating that The developed novel multiplex PCR will be a tool used for the detection of clinical samples for diagnosis reference.【關(guān)鍵詞】豬細(xì)小病毒 偽狂犬病病毒 豬圓環(huán)病毒2型 多重PCR 【英文關(guān)鍵詞】Porcine parvovirus(PPV)Pseudorabies virus(PRV)Porcine circovirus type 2 multiplex PCR(mPCR)【目錄】豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用綜述12-

31摘要6-8

ABSTRACT8-9

文獻(xiàn)

第一章 豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒

12-26

1.1 豬細(xì)小病毒

1.1.2 豬細(xì)小病毒的特性

1.1.4 PPV

1.2.1 2型檢測(cè)方法研究進(jìn)展12-1913-141.1.1 概述12-131.1.3 豬細(xì)小病毒病流行情況14-1

51.2 偽狂犬病病毒19-22的檢測(cè)方法研究15-19概述191.2.2 偽狂犬病病毒的特性19-20

1.2.4 偽狂犬病病毒檢測(cè)方法

1.3.1 概述

1.2.3 偽狂犬病流行情況2020-2222-231.3 豬圓環(huán)病毒22-261.3.2 豬圓環(huán)病毒的特性231.3.3 豬圓環(huán)病毒檢測(cè)方法23-26檢測(cè)上的應(yīng)用26-31PCR 技術(shù)26

第二章 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在動(dòng)物病原

2.1 PCR 技術(shù)概述26-27

2.1.1 2.2 主要的2.1.2 PCR 技術(shù)的發(fā)展26-27

PCR 技術(shù)27-31PCR(nested PCR)

2.2.1 常規(guī)PCR272.2.2 套式

2.2.4 反

2.2.3 二溫式PCR27-28轉(zhuǎn)錄PCR(RT PCR)2828

2.2.5 反轉(zhuǎn)錄一復(fù)合套式聚合酶鏈反應(yīng)

2.2.7 競(jìng)爭(zhēng)PCR(compete

2.2.9 定量2.2.11 多

第三章 2.2.6 反向PCR28PCR)28-29PCR29

2.2.8 標(biāo)記PCR(LP-PCR)292.2.10 玻片PCR(Slide-PCR29-30

31試驗(yàn)研究31-45重PCR(Multiplex PCR)豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2 型 PCR 檢測(cè)方法的建立31-38313232-333.1 材料與方法31-3

33.1.1 主要試劑

3.1.3 引物設(shè)計(jì)3.1.5 PCR 反應(yīng)33

3.1.7 PCR 產(chǎn)物3.1.2 毒株、菌株和細(xì)胞31-323.1.4 病毒DNA 的提取323.1.6 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化的測(cè)序分析333333-343434-3636

3.1.8 PCR 反應(yīng)的敏感性和特異性分析

3.2.1 最佳PCR 退火溫度的確定3.2 結(jié)果33-363.2.2 PCR 反應(yīng)最佳引物體濃度的確定3.2.3 PCR 產(chǎn)物的鑒定3

43.2.4 PCR 反應(yīng)的敏感性3.2.5 PCR 反應(yīng)的特異性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)3.3 討論36-38

第四章 PPV , PRV和PCV 2多重PCR

38-4

54.1 材料與方法檢測(cè)方法的建立與臨床樣品檢測(cè)分析38-39384.1.1 主要試劑38

4.1.2 毒株、菌株、細(xì)胞38

4.1.4 多重PCR

4.2 結(jié)果4.1.3 臨床樣品及病料的采集反應(yīng)條件的優(yōu)化384.1.5 樣品檢測(cè)38-39

39-424.2.1 兩重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化39-40

4.2.3 樣品檢測(cè)41-42

參考文獻(xiàn)46-56

4.2.2 4.3 討致謝多重PCR 的建立40-41論42-4556-57結(jié)論

45-46作者簡(jiǎn)介57

第二篇：豬圓環(huán)病毒疫苗應(yīng)用現(xiàn)狀

豬圓環(huán)病毒疫苗應(yīng)用現(xiàn)狀

摘要

目前在國(guó)外只有梅里亞動(dòng)物保健公司生產(chǎn)全病毒滅活疫苗，使用于母豬免疫。

已經(jīng)注冊(cè)的國(guó)產(chǎn)圓環(huán)病毒疫苗均為全病毒滅活疫苗。分別由哈爾濱獸醫(yī)研究所用LG、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)用SH株研制而成。①哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；②上海海利生物藥品有限公司；③洛陽(yáng)普萊柯生物工程有限公司；④江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司4家公司生產(chǎn)。國(guó)產(chǎn)疫苗亟待提高純化工藝。水性佐劑要比礦物油佐劑疫苗對(duì)機(jī)體的刺激性小，副反應(yīng)小。疫苗免疫保護(hù)期為3—4月，貯存有效期為12—18月。

FLEX系列茵格發(fā)豬圓環(huán)病毒疫苗，是具有純化蛋白抗原的水性佐劑的亞單位滅活疫苗。形成形態(tài)、大小與活病毒相同的、具有高度免疫原性的純化抗原。該產(chǎn)品是目前所有豬圓環(huán)病毒疫苗中唯一的單針疫苗，具有抗原緩解效果，應(yīng)用時(shí)不必加強(qiáng)免疫。

在應(yīng)用圓環(huán)病毒疫苗后滿意度調(diào)查中，進(jìn)口圓環(huán)病毒疫苗滿意度最高。如何選擇疫苗、制定適合豬場(chǎng)實(shí)際的免疫程序、確定免疫時(shí)機(jī)適時(shí)免疫顯得尤為重要。

疫苗免疫哪些豬群？何時(shí)免疫？應(yīng)對(duì)豬場(chǎng)流行病學(xué)、臨床癥狀、剖檢變化、生產(chǎn)成績(jī)、病原和抗體的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)進(jìn)行評(píng)估后作出決定。豬場(chǎng)是否應(yīng)用疫苗，應(yīng)充分考慮本場(chǎng)發(fā)病情況、飼養(yǎng)管理狀況、生物安全、主要相關(guān)疫病免疫與控制狀況、藥物預(yù)防效果等因素基礎(chǔ)上綜合判斷。母豬是否需要免疫？倘若母豬群因PCV2感染而流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔的比例超出正常，或仔豬因PCV2感染在斷奶后1—2周發(fā)病，選擇母豬免疫就是正確的。進(jìn)口的疫苗可普免2—3次/年，在國(guó)產(chǎn)疫苗應(yīng)用安全的情況下可免疫3—4次/年。研究表明免疫母豬所產(chǎn)仔豬和非免疫母豬所產(chǎn)仔豬接種疫苗后，其免疫效應(yīng)均未受到母豬免疫的負(fù)面影響，盡管這一結(jié)果令人鼓舞，但還需進(jìn)行更多研究。

仔豬免疫的時(shí)間可據(jù)下游豬發(fā)病日齡確定。疫苗起效時(shí)間為2周，感染潛伏期約2周。當(dāng)母源抗體在3—8周下降到較低水平而環(huán)境中野毒感染壓力較大時(shí)，對(duì)于保育豬特別是10周齡后肥育豬是否獲得足夠保護(hù)？一般12周齡開(kāi)始感染。應(yīng)在豬群出現(xiàn)臨床癥狀至少4周前施行免疫注射。商品豬群只注射1次即可；1針免疫4個(gè)月后再進(jìn)行第2次免疫。在第1次免疫2周后加強(qiáng)免疫一次；在加強(qiáng)免疫的3—4個(gè)月后再免疫。

新生仔豬3—4周齡首免，第一次免疫后間隔3周加強(qiáng)免疫一次。

在制定免疫程序時(shí)，還應(yīng)注意與其它免疫的相互干擾作用。至少7d的間隔；若PRRS弱毒疫苗免疫在前，最好有10d以上的間隔再免PCV2疫苗。

圓環(huán)病毒疫苗免疫效果通過(guò)常規(guī)的抗體檢測(cè)目前難以給出正確評(píng)價(jià)，可通過(guò)臨床癥狀、生產(chǎn)成績(jī)予以評(píng)估，免疫后對(duì)豬的健康狀況和增重改善明顯。圓環(huán)病毒疫苗應(yīng)用于PCV2急性感染，仔豬群呼吸困難、消瘦、皮炎，母豬群流產(chǎn)、產(chǎn)弱仔等，可減少母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、弱仔的數(shù)量，可明顯降低保育及生長(zhǎng)育肥豬發(fā)病率、死淘率；明顯提高日增重、豬群整齊度，降低料肉比，減少皮炎發(fā)病率，縮短出生至出欄時(shí)間；還有助于豬瘟疫苗、豬藍(lán)耳病疫苗、偽狂犬病疫苗免疫效果的正常發(fā)揮，降低機(jī)體對(duì)飼料霉菌毒素的敏感度。

第三篇：豬圓環(huán)病毒2型疫苗最新研究進(jìn)展

豬圓環(huán)病毒2型疫苗最新研究進(jìn)展

豬圓環(huán)病毒病是公認(rèn)的免疫抑制病之一，造成豬場(chǎng)損失慘重，疫苗免疫成了救命的稻草。從2011年豬圓環(huán)疫苗上市至今，已有17家圓環(huán)產(chǎn)品先后上市，目前，出現(xiàn)嚴(yán)重供大于求的現(xiàn)象，同時(shí)，養(yǎng)殖場(chǎng)也面臨著幸福的煩惱，大量產(chǎn)品的上市，產(chǎn)品價(jià)格可能下降，但是，面對(duì)玲瑯滿目的產(chǎn)品，如何選擇疫苗成了養(yǎng)殖場(chǎng)一個(gè)重要的課題，針對(duì)這些煩惱，本文希望能夠?yàn)轲B(yǎng)殖場(chǎng)選擇疫苗帶來(lái)幫助，避免走彎路，為養(yǎng)殖場(chǎng)服務(wù)。

1.PCV-2國(guó)內(nèi)外最新流行動(dòng)態(tài)

由PCV-2引發(fā)的疾病已成全球流行之勢(shì)，在加拿大首次報(bào)道該病原引起PMWS后[1]，學(xué)者通過(guò)調(diào)查本國(guó)包括SPF豬、部分散養(yǎng)豬以及育肥豬發(fā)現(xiàn)，豬群中PCV-2血清中抗體普遍存在，但目前該病在加拿大仍然只是散發(fā)。在英國(guó)和北愛(ài)爾蘭，豬群血清中PCV-2抗體陽(yáng)性率分別為86％和92％。美國(guó)、法國(guó)、丹麥、意大利、西班牙、荷蘭、新西蘭、日本、韓國(guó)、墨西哥等國(guó)家也相繼報(bào)道豬群中存在PMWS。在我國(guó)豬群中PCV-2感染情況也不容樂(lè)觀。2000年郎洪武等[2]在北京、河北、山東、天津、江西、吉林、河南等7省(市)的22個(gè)豬群采集了559份血清，用ELISA方法檢測(cè)PCV-2抗體，其陽(yáng)性率高達(dá)5l％，表明我國(guó)豬群中存在PCV-2的感染。王忠田等[3]用PCR方法對(duì)我國(guó)北京、山東、河北、深圳、山西、天津、廣東等省(市)的12個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)發(fā)病豬群進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2型感染的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明豬圓環(huán)病毒2型感染情況在我國(guó)豬群中相當(dāng)嚴(yán)重。李超等[4]在2010年對(duì)安徽省PCV-2流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明安徽省14個(gè)市(縣)的PCV-2抗體陽(yáng)性率平均為74.36％，表明安徽省豬群中普遍存在著PCV-2的感染。從上述報(bào)道表明PCV-2在我國(guó)豬群中廣泛存在。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，雖然豬群中PCV-2抗體陽(yáng)性率較高，但很大比例的抗體陽(yáng)性豬群并不表現(xiàn)出臨床癥狀。PCV-2與其他多種病原混合感染較為嚴(yán)重，調(diào)查發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等細(xì)菌性病原與PCV-2混合感染率達(dá)到了20％[5]。陜西省PCV-2與PRV混合感染率是21.7％[6]。2005年陳義祥等對(duì)廣西地區(qū)197份組織病料檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCV-2與PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染占總病料數(shù)量的57.73％。2003年王文軍等[7]對(duì)黑龍江地區(qū)PCV-2陽(yáng)性豬群的病料調(diào)查發(fā)現(xiàn)，藍(lán)耳病和豬瘟的陽(yáng)性率也較高。

哈爾濱獸醫(yī)研究所劉長(zhǎng)明[8]在2007年采用免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞染色試驗(yàn)（IPMA）對(duì)來(lái)自與黑龍江、吉林、河北、上海、內(nèi)蒙古、云南、江西等地的健康豬群480份血清和發(fā)病豬群424份血清，抗體陽(yáng)性率分別為79.2%和91.7%，表明PCV-2在豬群中感染率非常高。山東農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所吳家強(qiáng)博士檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)PCV-2防控比較糟糕，PCV-2，2010年檢出率為34.66%（124/357），2011年檢出率為25.59%(174/588)；2012年檢出率為2

1.38%(147/683)，圓環(huán)病毒病依然嚴(yán)重，但有下降趨勢(shì)，這個(gè)和使用圓環(huán)疫苗免疫有關(guān)系。

第四篇：豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)衣殼蛋白表達(dá)綜述

PCV2是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬成員，為單股環(huán)狀負(fù)鏈無(wú)囊膜的DNA病毒, 為已知的最小動(dòng)物病毒之一，約17~ 20nm, 二十面體對(duì)稱(chēng)。根據(jù)病毒的抗原性和基因組成不同，可分為2種基因型或稱(chēng)血清型, 即PCV1型和PCV2型。PCV1無(wú)致病性。PCV2具有致病性，基因組全長(zhǎng)1767bp或1768bp，包括11個(gè)讀碼框，其中ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白)核衣殼蛋白(Cap)，其N(xiāo)端包含一個(gè)由41個(gè)氨基酸殘基組成的的核定位信號(hào)(Nuclear location signal，NLS)，與PCV2在細(xì)胞核內(nèi)定位有關(guān)。Mahe和Liu等分別在sf 9真核細(xì)胞及大腸桿菌中進(jìn)行了PCV2Cap蛋白的表達(dá), 但Cap蛋白的表達(dá)量較低。為了提高Cap蛋白的表達(dá)量, 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建去除NLS的重組質(zhì)粒, 并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)、純化、鑒定。

1材料和方法

1.1pcv-581重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.1.1PCR擴(kuò)增去除NLS基因的pcv-581

1.1.1.1引物的設(shè)計(jì)與合成: 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室保存毒株的測(cè)序結(jié)果, 用Oligo6.0設(shè)計(jì)刪除核定位信號(hào)特異引物(由大連寶生物工程公司合成), 并引入限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII(加下劃線表示)。上游引物: ACAGGATCCATGGCATCTTCAACAC;下游引物: GAAAGCTTT TCATTAAGGGTTAAGT;產(chǎn)物長(zhǎng)度581bp。

1.1.1.2PCV2核酸的提取: 取接種PCV2病毒的PK-15細(xì)胞懸液500uL, 常規(guī)方法提取, 最后加20uL滅菌去離子水溶解,-20度保存。

1.1.1.3PCR擴(kuò)增: PCR的反應(yīng)體系總體積25uL: 上、下游引物(10uLmol/L)各1.0uL，10×RCR Buffer2.5uL、dNTP3.0uL(2.5mM each)，提取的DNA2.0LL,Taq酶0.25LL(5U/ LL, TaKaRa), 去離

子水補(bǔ)到25LL。反應(yīng)參數(shù)為: 95e , 5min;94e, 45

s;55.9e, 45s;72e, 45s;30個(gè)循環(huán);72e , 7min。

取5LLPCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析(見(jiàn)圖1)。

1.1.1.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切、回收: 醇沉淀PCR

擴(kuò)增產(chǎn)物、酶切、回收。具體操作方法如下: PCR

產(chǎn)物補(bǔ)到100LL, 加入等體積異丙醇, 置-20e 靜

止過(guò)夜, 13 000r/ min離心15min棄上清, 加入

600LL75%乙醇, 7000r/min離心5min, 倒掉上清,晾干, 加入10LL滅菌去離子水溶解。將醇沉產(chǎn)物

進(jìn)行BamHI酶切, 體系為20LL: 10@buffer K2LL,BamHI 1LL(15U/ LL , TaKaRa), 醇沉產(chǎn)物10LL,H2O7LL, 37e 酶切1h。將酶切產(chǎn)物繼續(xù)醇沉淀

(方法步驟同上)后進(jìn)行HindIII(15U/ LL, TaKaRa)

單酶切, 酶切體系同上, 回收目的片段。

1.2pQE-pcv581重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定: 將載

體pQE-32(QIAGEN)質(zhì)粒用BamHI 和HindIII雙

酶切, 做100LL 酶切體系: 10@ buffer K10LL,BamHI2LL, HindIII 2LL, pQE-32質(zhì)粒70LL, H2O

16LL。37e 酶切2h15min, 用膠回收試劑盒回收

(TIANGEN, 操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行), 目的片段和載

體常規(guī)方法連接、轉(zhuǎn)化M15、篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒

pQE-pcv581。酶切鑒定(見(jiàn)圖2)。

1.3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

從含有氨芐抗性的瓊脂平板上挑取單個(gè)陽(yáng)性

菌落接種到5mL氨芐抗性(100Lg/ mL)的LB液體 培養(yǎng)基中, 37e 過(guò)夜振蕩培養(yǎng)、活化, 取過(guò)夜活化 的培養(yǎng)物按照的比例接種到5mL含氨芐抗性的液 體LB培養(yǎng)基, 37e 振蕩培養(yǎng), 培養(yǎng)至OD600nm達(dá) 0.4-0.6, 然后加入IPTG(TaKaRa)至終濃度為0.2mmol/ L、0.4mmol/ L、0.6mmol/ L、0.8mmol/ L、1.0mmol/L、1.2mmol/L繼續(xù)培養(yǎng), 分別在誘導(dǎo)前、誘 導(dǎo)1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h取樣, 取1mL菌液離心

第五篇：DNA病原—圓環(huán)病毒2型PCR檢測(cè)方法專(zhuān)題

豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測(cè)方法操作程序

廖榮斌，何啟蓋

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院）

一、原理

豬圓環(huán)病毒2型感染引發(fā)的仔豬斷奶衰竭綜合癥、腎炎與皮炎、增生性腸炎以及母豬繁殖障礙。通過(guò)病原檢測(cè)和病毒分離是確證本病的重要手段。豬圓環(huán)病毒分為2種，即圓環(huán)病毒1型和圓環(huán)病毒2型。前者不致病，后者可致病。豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的基因組大小為1768 bp或1767bp。其中，PCV2 ORF2基

因與免疫保護(hù)和毒力等重要特性有關(guān)，同時(shí)，此基因與PCV1的同源性較低，通

過(guò)合理設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增ORF2，從而可檢測(cè)并區(qū)分PCV2與PCV1。

PCR技術(shù)具有快速、敏感的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)用于許多動(dòng)物疾病病原的檢測(cè)。本試驗(yàn)是利用我們?cè)O(shè)計(jì)的引物，通過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，以感染豬組織或血液為模板，擴(kuò)增PCV2的ORF2基因，從而作出感染的結(jié)論。

二、材料準(zhǔn)備

1、手術(shù)器械：采樣用。根據(jù)樣品數(shù)量來(lái)確定。

2、微量移液器（規(guī)格：2.5?l，10?l，100?l，200?l，1000?l）

3、反應(yīng)引物

上游引物：CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT；

下游引物：CGC ACC TTC GGA TAT ACT GTC4、磁珠：用于吸附和分離DNA4、PCR儀：東勝創(chuàng)新

5、電泳儀：北京六一電子設(shè)備

6、紫外檢測(cè)儀：Bi0-RAD凝膠成像系統(tǒng)

7．相關(guān)溶液及配方：

1╳TAE buffer（電泳緩沖液）配方：（1）稱(chēng)量Tris：242g，Na2EDTA.2H2O：

37.2g，置于1L的燒杯中；（2）向燒杯中加入約800ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓?/p>

（3）加入57.1ml的醋酸，充分?jǐn)嚢?；?）加去離子水將溶液定容至1L后，室 1

溫保存；（5）使用時(shí)將室溫保存的該溶液稀釋50倍即可使用。

擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品緩沖液：全式金生物6╳Loading buffer。

三．樣品采集

感染豬或流產(chǎn)的胎兒的肺臟、淋巴結(jié)、脾臟和腎臟；發(fā)熱期豬的抗凝血或血

清；每個(gè)樣品用單獨(dú)的剪刀或刀片，避免交叉污染。

樣品置冷藏條件下送檢。也可放冷凍保存。

四、模板的制備（DNA提?。?/p>

*（注：所用DNA提取試劑盒為日本TOYOBO產(chǎn)品）

1、取組織100mg（或血液100ml）以下放入1.5ml離心管中，然后加入850?l的溶解吸附液，再使用勻漿器充分勻漿。

2、離心分離（10000rpm，5分鐘)后，將上清液吸入新的1.5ml的離心管內(nèi)。

3、加入40?l磁珠，然后使用渦旋振蕩器劇烈混合10分鐘（注意：加入磁珠前，要把磁珠混勻）。

4、將離心管置于磁性臺(tái)架上，放置30秒使磁珠聚集，然后去除上清液。

5、離心管中添加900?l 洗凈液，然后渦旋振蕩劇烈混合5秒。

6、將離心管置于磁性臺(tái)架上，放置30秒使磁珠聚集，然后去除上清液。

7、重復(fù)步驟5和6.8、離心管中添加900?l 70﹪的乙醇溶液，然后渦旋振蕩劇烈混合5秒。

9、將離心管置于磁性臺(tái)架上，放置30秒使磁珠聚集，然后去除上清液。

10、重復(fù)步驟8和9.11、添加100?l滅菌水后，劇烈震蕩10分鐘，使DNA溶出。

12、將試管置于磁性臺(tái)架上，通過(guò)放置30秒使磁珠聚集，然后將含有DNA的上

清液回收至新的1.5ml離心管內(nèi)，上清液即為DNA模板！

13、陰陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)立：利用滅菌三蒸水和PCV2陽(yáng)性病毒液（或者所保存的臨

床PCV2陽(yáng)性病料）與臨床送檢病料同步提取DNA，分別作為PCV2臨床檢測(cè)的陰性

對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

五、配置PCV2-PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系（單重?cái)U(kuò)增）：

10×擴(kuò)增緩沖液2.5ul

dNTP混合物2ul引物（10mM）各1ul

模板DNA4ul

Taq DNA聚合酶0.15ul

加滅菌三蒸水14.35ul

即總反應(yīng)體系25ul.六、擴(kuò)增

將配好樣品的PCR管放入PCR儀中選擇適合反應(yīng)條件的程序進(jìn)行擴(kuò)增。退

火溫度54°C。

反應(yīng)條件：按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增: 94℃變性5 min后,進(jìn)入循環(huán)94℃

30sec,54℃ 40sec, 72℃ 45sec,35個(gè)循環(huán)后,72℃延伸10 min。

七、配置瓊脂糖凝膠塊

1、材料：廣口瓶、瓊脂糖、電泳液

2、制作步驟：

（1）、稱(chēng)取瓊脂糖1克放入廣口瓶?jī)?nèi)。

（2）、取電泳液100ml加入廣口瓶，即為1﹪的瓊脂糖混合液。

（3）、然后放入微波爐中加熱2分鐘，取出后冷卻約56℃。

（4）、倒入容器中，混合液約占容器容積的1/2—2/3。

八、電泳

1、擴(kuò)增結(jié)束后，每只PCR管中都加入約2.5ul的6╳Loading buffer（電泳樣品

緩沖液）

2、將制備好的凝膠塊放入DNA電泳儀內(nèi)的電泳液中，膠塊有孔的一側(cè)靠近負(fù)極。

3、從滴加有電泳樣品緩沖液的樣品中分別取7ul注入膠塊相對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)。

4、注入5ul的分子量（DL Mark 2000）對(duì)照。

5、電泳到凝膠塊的1/2—2/3處。

九、圖片觀察

1、電泳結(jié)束的凝膠塊放入溴乙錠（熒光物質(zhì)）中浸泡10min。

2、放入成像系統(tǒng)中照膠。

3、結(jié)果判定（目的片段大小是494bp）如圖1.******8M bp

圖1.臨床病豬圓環(huán)病毒PCR檢測(cè)的凝膠成像圖片

1：陰性對(duì)照；2：陽(yáng)性對(duì)照；3—18：湖北某規(guī)模化豬場(chǎng)送檢病料；其中3—6，8，11—12，15—16為PCV2感染陽(yáng)性。其余被檢病料為PCV2感染陰性，M(分子標(biāo)記): DL Mark 2000。

4．結(jié)果分析

（1）感染的判定：PCR結(jié)果為陽(yáng)性，表明為PCV2感染；陰性表明無(wú)PCV2感染。

（2）疾病的判定：由于本病毒感染較廣，PCR陽(yáng)性結(jié)果需要與豬群的流行病學(xué)以及臨床表現(xiàn)（斷奶消瘦、咳嗽、體溫升高、腹股溝淋巴結(jié)腫大）等結(jié)合考慮。