第一篇：基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)的長(zhǎng)豇豆種子純度快速鑒定技術(shù)_圖文_百(精)

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) A cta A gricult urae Zhejiangens is 22(6:727~730, 2010 基于 SSR 分子標(biāo)記技術(shù)的長(zhǎng)豇豆種子純度快速鑒定技術(shù) 魯忠富 , 徐 沛 , 汪寶根 , 劉永華 , 吳曉花 , 胡婷婷 , 李國(guó)景 *(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所 , 浙江 杭州 310021 收稿日期 :2010-06-17 基金項(xiàng)目 :浙江省科技廳重大優(yōu)先主題項(xiàng)目(2008C120031 作者簡(jiǎn)介 :魯忠富(1963-, 男 , 浙江杭州人 , 農(nóng)藝師 , 主要從事蔬 菜育種 和栽 培 技術(shù) 研究 工作。E m ai:l l u zf @zaas.org;T e:l 0571 86404223 *通 訊 作 者 , 李 國(guó) 景 , E m a i :l Guoji ng _li@yahoo.co m.cn;T el(摘 要 :當(dāng)前生產(chǎn)上應(yīng)用的長(zhǎng)豇豆品種眾多 , 且商業(yè)品種間的遺傳相似性愈來(lái)愈高 , 種子質(zhì) 量糾紛時(shí) 有發(fā)生。本研究以 44份核 心長(zhǎng)豇豆種質(zhì)為試材 , 利用普通豇豆 DNA 序列 信息 , 通過(guò) 生物信息 學(xué)方法自主 設(shè)計(jì)開發(fā)適 用于長(zhǎng)豇豆研究的 SS R 引物 , 從中篩選出 10對(duì) 診斷性引物 , 在此基礎(chǔ)上 建立基于 SSR 分子 標(biāo)記技 術(shù)的長(zhǎng)豇 豆種子純度快速檢測(cè)方 法 , 可滿足長(zhǎng)豇豆種子產(chǎn)業(yè)化的需要。關(guān)鍵詞 :長(zhǎng)豇豆;SSR;純度鑒定;遺傳指紋圖譜 中圖分類號(hào) :S 643 4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :A 文章編號(hào) :1004-1524(2010 06-0727-04 A rapid and precise SSR based procedure for seed quality surveying of Vigna un guiculata ssp.sesqui p edalis(L.Verd.L U Zhong f u , XU Pe, i WANG Bao geng , LI U Yong hua , WU X iao hua , Hu T i n g ti n g , LI Guo ji n g *

(Instit ute of Vegetab les, Zhejiang A cade my of A gricult ural Sciences , H angzhou 310021, Chi na Abstrac t :Current applica tion of l a rge nu mber o f comm erc i a l asparagus bean culti va rs w it h v ery hi gh g enetic si m ilar i ty causedm ore andm o re d isputes on seed qua lity.In t h is research , a set of SS R ma rkers for asparagus bean w ere de ve l oped based on a b i o i n f o r m ati cs based approach.T en o f t hese ma rkersw ere defi ned as diagnosti c m arkers by geno typ i ng a core co llecti on o f asparagus bean consisti ng of 44li nes.Based on t h is , a rap i d and prec i se SSR based proce dure f o r asparagus bean seed qua lity survey i ng w as estab lished , w hich wou l d m eet t he de m and o f rap i d l y deve l op i ng asparagus bean i ndustry.K ey word s :asparagus bean;SS R;purity s urvey i ng;genetic fi ngerpri nt 長(zhǎng)豇 豆(Vi g na unguiculata ssp.sesqui p edalis(L.V er d.嫩莢供食 , 是 我國(guó)重要的夏季豆類 蔬菜之一。我國(guó)從事長(zhǎng)豇豆育種、種子生產(chǎn)和經(jīng) 營(yíng)的科研院所、企業(yè)眾多。當(dāng)前生產(chǎn)上應(yīng)用的長(zhǎng) 豇豆品種眾多 , 年用種量大 , 商業(yè)品種間的遺傳 相似性愈來(lái)愈高 , 同種異名、同名異種現(xiàn)象日益 嚴(yán)重 , 種子質(zhì)量糾紛時(shí)有發(fā)生。目前我國(guó)蔬菜品 種真?zhèn)闻c純度鑒定大多依靠田間表現(xiàn)型鑒定 , 鑒

定所需時(shí)間長(zhǎng)(一般需 50~60d, 并受季節(jié)的限 制 , 而且作物的表現(xiàn)型易隨環(huán)境條件的變化而變 化 , 特別是對(duì)于一些形態(tài)差異較小的品種間鑒定 難度更 大。因此 , 很 有必要 研究 開發(fā) 一種 能早 期、周年、快速、準(zhǔn)確鑒定長(zhǎng)豇豆品種真?zhèn)魏图兌?的檢測(cè)方法。

DNA 分子標(biāo)記技術(shù)在國(guó)內(nèi)外已被用于鑒別 不同品種 之間在分子水平上的差異

[1-3]。由于

在同一物種的各個(gè)品種間存 在有大量的多態(tài)性 標(biāo)記 , 每一品種均存在有區(qū)別于其他品種的獨(dú)特 標(biāo)記 , 即一些特異性 DNA 片段 , 稱為該品種的指 紋 , 各品種獨(dú) 特的指紋 片段組合 構(gòu)成該物 種的 DNA 指紋圖譜。與傳統(tǒng)的依據(jù)表型性狀鑒定相 比 , 以在植株生長(zhǎng)的 任何階段進(jìn)行 , 鑒定快速 , 并不 受基因表達(dá)和環(huán)境條件的影響等優(yōu)點(diǎn)。

SSR 分子標(biāo)記技術(shù)利用 真核生物基 因組中 存在的大量微衛(wèi)星重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物 , 通過(guò) PCR 擴(kuò)增串聯(lián)的重復(fù)序列 , 并依據(jù)微衛(wèi)星的重復(fù)次數(shù) 在同一物種不同基因型間 的差異揭示長(zhǎng)度多態(tài) 性 [4]。SSR 由于分布廣、穩(wěn)定性和多態(tài)率高 , 操 作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、對(duì) DNA 質(zhì)量要求較低 等 , 被 譽(yù)為第二代分子標(biāo) 記的明星。SSR 分 子標(biāo)記技 術(shù)克服了 RAPD 穩(wěn)定性和 重復(fù)性差 , AFLP 技術(shù) 費(fèi)用昂貴、操作復(fù)雜、對(duì) DNA 的純度和內(nèi)切酶的 質(zhì)量要 求很 高等缺 點(diǎn)。為此 , 本 研究 建立 基于 SSR 分子標(biāo)記技術(shù)的種子純度快速檢測(cè)方法 , 現(xiàn) 將結(jié)果報(bào)道如下。材料與方法 1.1 材料

供試材料由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬 菜研究所 提供 , 共 44份 , 包括我國(guó)當(dāng)前生 產(chǎn)上主栽品種、代表不同地域分布和具有 植物學(xué)多態(tài)性的材料 37份 , 來(lái)自美國(guó)和非洲的材料 7份。SSR 反應(yīng)用 試劑 , T ris、硝酸銀、尿素等生化試劑購(gòu)自北京鼎 國(guó)生物技術(shù)有限公司 , E co R , M se 內(nèi)切酶購(gòu)自 上海生物工程技術(shù)有限公司 , Taq 酶、dNTP 等購(gòu) 自 Pro m ega 公司。

1.2 方法

1.2 1 豇豆 DNA 數(shù)據(jù)庫(kù) 的下載、序 列處 理和 SSR 引物設(shè)計(jì)

從 CGKB 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(http ://co w peageno m ics.m ed.v irg i n ia.edu /CGKB/下載豇豆基因組序列 , 從 H ar vEST 數(shù)據(jù)庫(kù)(http ://harves.t ucr.edu /下 載長(zhǎng)豇 豆 EST

序 列;運(yùn) 行 V ecScreen 程 序(ht tp ://004km.cnb i nati ons for as paragus bean 序號(hào) 引物名稱 正向序列(5?-3? 反向序列(5?-3?

1CPL031CGCTCTTCGTTGATGGTTATG GTGTTCTAGAGGGTGTGATGGTA 2CPL053ACAGGTTCCTTGTGAAGCAC GCCATACGCAACTCAGCTAT 3CPL078GAACAGCTTCCTGAACCTCA GCTTTCATCTGCTCCAGGTA 4CPL112AACCCAGCATACCTGCATAA CTCGCCAATGATTCTGAGAT 5CPL114AATGTTTGGACTGGTCAGGA GAGGACAAGTCAGGAAGCAA 6CPL135GGTGGAAATCAGGTTGTTTG AGCCAATTGTCAAGTTCAGC

7CPL333TCGATCAAATTTTCCTCTGC TGCCACCATCTTTCATTTCT 8CPL420CGCGTACAACATCTCTTCCT GTGCCAATGGATCAGGTAAC 9CPL840TAGCATAGAAGAAGCAATCGT CTGGAATCTGGAAGGAGAA 10 CPL865 CTCTCTCTCTCCACATCTCAA

CATCATCAATCACACAACTTC M.DNA M aeker;1.CPL112;2.CPL053;3.CPL114;4.CPL031;5.CPL135;6.CPL840;7.CPL420;8.CPL865;9.CPL078;10.CPL333;箭頭示各品種 DNA 指紋的主要差異之處

圖 1 我國(guó) 5個(gè)長(zhǎng)豇豆主栽品種的標(biāo)準(zhǔn) DNA 指紋 圖譜

F ig.1The standard DNA fi ngerpr i nts o f 5m a i n cu lti vars o f asparagus bean i n China % 729%魯忠富等 :基于 SSR 分子標(biāo)記技術(shù)的長(zhǎng)豇豆種子純度快速鑒定技術(shù) 增出的條帶數(shù)差異性大 , 特別是 #黑眉 ? 與其他 4品種間差異大;不同品種間差異 性條帶數(shù)不同 , #之豇 106? 與 #揚(yáng)早豇 1號(hào) ? 之間差異條帶數(shù)在

13條以上 , 完全可滿足區(qū)分不同品種的要求。

2.3 基于 SSR 分子標(biāo)記技術(shù)的豇豆種子純度快 速檢測(cè)方法

利用以上研究開發(fā)出的診斷性 SSR 引物進(jìn) 行長(zhǎng)豇豆種子純度檢測(cè) , 其主要步驟包括 : &DNA 提取 :將待檢種子散播于 裝有基質(zhì) V(蛭石 V(泥炭 =12的育苗穴盤中 , 置于 25 ~30!下育苗 , 待第一對(duì)真葉平展時(shí) , 單株取葉 片 0 1g , 加液氮研磨成粉末 , 用常規(guī) CTAB 法提 取 DNA。? SSR 引物擴(kuò)增 :用上述 10對(duì)診斷性 SSR 引物進(jìn)行 PCR 分析 , 反應(yīng)體 積為 12 5 L , PC R 反應(yīng)程 序同上。(電泳檢 測(cè) :將擴(kuò) 增產(chǎn)物 在 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離 , 然后進(jìn)行銀染顯 色 , 數(shù)碼相機(jī)照相記錄結(jié) 果 , 獲 得待檢材料的 DNA 指紋圖譜。DNA 指紋圖 譜比對(duì) :將待檢材料的 DNA 指紋圖譜 與該品種 標(biāo)準(zhǔn) DNA 指紋圖譜進(jìn)行 比對(duì) , 如兩者 的指紋圖 譜完全相吻合 , 則該待檢材料為真種子 , 否則為 偽種子。對(duì)于沒有標(biāo)準(zhǔn)圖譜的品種 , 按同樣方法 先建立標(biāo)準(zhǔn)圖譜。? 種子純度計(jì)算 : 種子純度 =(檢測(cè)所得真種子數(shù) /檢 測(cè)種子 總數(shù) ? 100% 3 討論 本研究的特點(diǎn) :

(1 應(yīng)用自主開發(fā)和篩選出的 10對(duì)診斷性 SSR 引物組合 , 增強(qiáng)了鑒別近似品種的能力。經(jīng) 過(guò)理論計(jì)算、近似品種擴(kuò)增比較(圖 1 及大量檢 測(cè)實(shí)踐證明這套引物能有 效區(qū)分長(zhǎng)豇豆不同基 因型 , 完全可以滿足對(duì)當(dāng)前生產(chǎn)上主要長(zhǎng)豇豆品 種進(jìn)行真?zhèn)螜z測(cè)的需要。

(2 直接鑒定遺傳物質(zhì) , 大大提高了鑒定的 準(zhǔn)確性。本研究使種子純度的鑒定在 DNA 水平上進(jìn)行 , 避免了表型鑒定、生化 鑒定等間接鑒定 方法所可能帶來(lái)的誤差 , 有操作方便 , 重復(fù)性好 的特點(diǎn) , 具有高度的可靠性和權(quán)威性。

(3 提 高了檢測(cè)的效率和標(biāo)準(zhǔn)化程度。利 用本技術(shù)進(jìn)行種 子純度檢測(cè) , 其結(jié)果穩(wěn) 定可靠 , 易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化 , 檢測(cè)時(shí)間僅需 4~5h , 一次可 對(duì)多達(dá)上百份樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。一般種子質(zhì) 檢室只需具備常規(guī)的分子生 物學(xué)設(shè)備就可按提 供的操作 程序進(jìn)行 實(shí)際檢測(cè) , PCR 反應(yīng)各 組分(MgC l 2, Bu ffer , d NTP , Taq 酶 購(gòu)置方便 , 檢測(cè)成 本低廉 , 僅為傳統(tǒng)表型鑒定的六分之一左右。認(rèn) 為該技術(shù)完全可用于生產(chǎn)上 種子純度快速鑒定 的需要。

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