第一篇：實習指南實驗三、四： 亞硝酸鹽中毒復制和解救;亞硝酸鹽定性和定量分析

實驗三

亞硝酸鹽中毒的復制和解救

一、實驗目的

掌握亞硝酸鹽中毒的診斷要點。了解亞硝酸鹽中毒的解毒原理和治療措施。

二、實驗方法

教師講解后、學生分組操作。

三、實驗屬性和學時

驗證，3學時。

四、實驗材料和器械

兔若干只、一次性注射器、胃管、聽診器、體溫計、亞硝酸鹽鈉、美蘭、酒精棉球等。

五、實驗內(nèi)容

（一）高鐵血紅蛋白檢驗

1、原理

亞硝酸鹽（鉀）離子，在血液中使血紅細胞內(nèi)正常的低鐵血紅蛋白（氧化）氧化為異常的高鐵血紅蛋白（正鐵），從而失去攜氧作用。

2、方法

（1）取血5mL于試管中，在空氣中用力振蕩15min。在有高鐵血紅蛋白的情況下，血液仍保持棕色，健畜則由于血紅蛋白與氧結(jié)合而變?yōu)轷r紅色。

（2）取血5mL于試管中，滴加1%氰化鉀（鈉）溶液數(shù)滴，在有高鐵血紅蛋白的情況下，血液立即變?yōu)轷r紅色。

（3）血液分光鏡檢驗：取血用水稀釋10-20倍后置于分光鏡上檢驗，可在紅色區(qū)640-650nm波長發(fā)現(xiàn)高鐵血紅蛋白的吸光譜帶。當加入5%氰化鉀（鈉）溶液數(shù)低后，由于氰血蛋白形成，此吸光帶立即消失。但經(jīng)急救治療過的家畜，高鐵蛋白大部分已被還原，故用此法檢驗宜早進行。

（二）治療措施

可用特效解毒藥甲藍或甲苯胺蘭溶液靜脈注射，若與Vc和高滲葡萄糖（亦有較弱的還原作用）溶液合用，則療效更佳。

1、亞甲藍

又名美藍，為一種氧化還原劑，是治療本病的特效藥物。

原理

小劑量美藍進入機體，在還原型輔酶Ⅰ脫氫酶的作用下，還原成“白色美藍”，可使高鐵血紅蛋白還原為正常的低鐵血紅蛋白。在此同時，本身被氧化成美藍并重又參與反應，但大劑量美藍進入機體，卻養(yǎng)具有氧化作用，反使正常的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白。因此，治療只宜用小劑量。反映如下： 劑量

標準劑量為每公斤體重1-2mg，濃度為1%的酒精生理鹽水或水溶液。給藥途徑

靜脈注射或分點肌肉注射。

2、甲苯胺藍

原理

同美藍，但其還原高鐵血紅蛋白的速度比美藍快37%。劑量

每公斤體重5mg，濃度為5%。給藥途徑

靜脈注射或腹腔注射。

3、維生素C 原理

使高鐵血紅蛋白還原為正常的低鐵血紅蛋白，而脫氫的Vc又被體內(nèi)谷胱甘肽還原為Vc，又重新參與高鐵血紅蛋白的還原過程。但其作用不及美藍和甲苯胺藍迅速、徹底。故常與美藍或甲苯胺藍配合應用。

劑量

牛、馬0.5—2.0g，豬、羊0.1—0.5g。

（三）亞硝酸鹽中毒的復制與解放

復制方法

取試驗動物（兔）2只，分別稱量，并觀察記錄其呼吸、體溫及可視黏膜的顏色，然后，按每公斤體重58—77mg（豬）或100mg（兔）的4%亞硝酸鈉溶液靜脈注射。

解救

待亞硝酸鹽中毒癥狀出現(xiàn)后，一只用亞甲藍或甲苯胺藍溶液靜脈注射，觀察并記錄解毒效果。另一只使其自然發(fā)展，死亡后進行剖檢，以觀察記錄病理變化。

六、作業(yè)

1、如何用快速簡潔的實驗室方法診斷動物亞硝酸鹽中毒？

2、亞甲藍的解毒原理是什么？怎么使用？

3、根據(jù)各組實驗結(jié)果分析家兔亞硝酸鹽中毒死亡或存活的原因。

實驗四

亞硝酸鹽的定性與定量檢驗

一、實驗目的

熟悉亞硝酸鹽中毒的定性檢驗方法；掌握亞硝酸鹽中毒的定量檢驗方法。

二、實驗方法

教師講解后、學生分組操作。

三、實驗屬性和學時

驗證，3學時。

四、實驗材料和器械

可見光分光光度計、半自動生化分析儀、比色管、容量瓶、移液管、移液槍、燒杯、飼料等。

五、實驗內(nèi)容

（一）亞硝酸鹽的定性檢驗

對氨基苯磺酸重氮法（格林氏法）

1、原理

亞硝酸鹽在酸性溶液中與與對氨基苯磺酸作用生成重氮化合物，然后與α一萘胺偶合生成紫紅色偶氮染料。

2、試劑

（1）對氨基苯磺酸溶液。取0.5g對氨基苯磺酸溶于150mL12％醋酸溶液中。貯存于棕色瓶中。如溶液有顏色，臨用時加入少許活性炭加熱至80℃并過濾，即可脫色。

（2）α—萘胺溶液。取α一萘胺0.2g，加水20mL，微熱溶解，過濾。濾液加蒸餾水至100 mL，貯存棕色瓶中。對有色者可按上法脫色。

3、操作方法

取2mL濾液于小試管中，加對氨基苯磺酸溶液2～3滴。2～3分鐘后，再加入α—萘胺溶液2-3滴。數(shù)分鐘后，有亞硝酸鹽存在時則出現(xiàn)紫紅色，顏色的深淺表示亞硝酸鹽含量的多少。如將試管在70℃水浴中加熱數(shù)分鐘，顏色更明顯。粗略比例如下表。

溶 液 的 顏 色

NO2 –的含量（毫克/升）

剛剛呈現(xiàn)玫瑰紅

小于0.01

淡玫瑰色

0.01-0.1

玫瑰色

0.1-0.2

鮮艷玫瑰色

0.2-0.5

深紅色或橙黃色

大于0.5

格林氏粉法

1、原理

同對氨基苯磺酸重氮法（格林氏法）

2、試劑

對氨基苯磺酸

1.0g α—萘胺

0.1g

酒石酸

8.9g

研磨均勻，儲于棕色廣口瓶備用。

3、操作方法

取濾液1-2 mL于小試管中，然后加入少許試粉，搖勻，如濾液變紫紅色，表明檢材中有亞硝酸鹽存在。聯(lián)苯胺冰醋酸法

1、原理

亞硝酸鹽在酸性溶液中，將聯(lián)苯胺重氮化生成黃色或紅棕色顏料。

2、試劑

0.1％聯(lián)苯胺冰醋酸溶液：取0.1g聯(lián)苯胺溶于10mL冰醋酸中，加蒸餾水稀釋至100mL，過濾，濾液置于棕色瓶中備用。

3、操作方法

取對氨基苯磺酸重氮法樣品制備液2滴于濾紙或點滴板上，加聯(lián)苯胺一冰醋酸液2滴，如出現(xiàn)棕紅色則示有亞硝酸鹽存在。二苯胺濃硫酸反應

1、原理

由于亞硝酸鹽有氧化作用（有濃硫酸存在），可使二苯胺氧化，其氧化產(chǎn)物呈蘭色。

2、試劑

二苯胺濃硫酸溶液：二苯胺0.1g加100 mL濃硫酸溶解后儲存于棕色瓶中。

3、操作方法

取濾液1-2滴于點滴板上，加1-2滴二苯胺濃硫酸溶液，立即出現(xiàn)蘭色，證明有亞硝酸鹽存在。注意要點：

1、亞硝酸鹽在酸性條件下易分解，如送檢不及時，夏天往往在死后第二天就不易檢出。剩余飼料較易獲得陽性結(jié)果。

2、格林氏反應十分靈敏，反應很強烈時可以證明亞硝酸鹽中毒，反應微弱時，需用靈敏度較小的方法進行，一般要求兩種以上方法都呈現(xiàn)陽性，才能證明亞硝酸鹽中毒。同時需做空白對照，必要時可進行定量檢驗。

（二）亞硝酸鹽的定量檢驗------α－萘胺比色法

1、原理

在微酸性條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸作用生成重氮化合物，再與α一萘胺偶合而生成紫黃色偶氮染料。顏色強度與亞硝酸鹽含量成正比。

2、試劑

（1）α－萘胺溶液：同定性檢驗對氨基苯磺酸重氮法。（2）對氨基苯磺酸溶液：同定性檢驗對氨基苯磺酸重氮法。（3）亞硝酸鈉標準液：準確稱取0.1495g亞硝酸鈉溶于水中，稀釋至100mL。此液每mL相當于1mgNO2 –。臨用時，精確吸取1.00mL，加水稀釋至100mL。此液每毫升則相當手0.01mgNO2 –。（4）醋酸鈉緩沖液：取16.4g醋酸鈉溶于100mL水中。

3、操作方法

（1）取5－10g樣品置研缽中，加少許玻璃砂和少許70℃水，研成粥狀。分次加70℃左右熱水提取，將上清液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中。最后定容至刻度。（如顏色深，可加少許活性炭脫色），過濾，棄去最初幾毫升濾液。

（2）吸取續(xù)濾液10mL于25mL比色管中，加水至刻度。

（3）另取25mL比色管7支，依次加入0,0.002,0.005,0.01,0.015,0.020,0.025mgNO2 –.，加水稀釋至刻度。（4）于標準管和樣品管中分別加入0.05mL醋酸鈉緩沖液，對氨基苯磺酸液1mL，α—萘胺溶液1mL，搖勻。放置10分鐘后，以零管作參比，用1cm比色皿于波長525nm處測定吸光度，繪制工作曲線與之比較。

4、.結(jié)果計算

A 亞硝酸鹽含量（mg／kg）＝

M/10

式中：A—樣品管中測得含量，μg；M—稱取樣品量，g。

六、作業(yè)

1、亞硝酸鹽定性檢驗的方法有那些？其原理是什么？各有什么優(yōu)缺點？

2、在亞硝酸鹽可疑樣品的定量檢測中，要保證結(jié)果的準確，應注意那些問題？