第一篇：牛奶中阿維菌素類藥物殘留檢測(cè)——高效液相色譜法(SOP)修改版-新

牛奶中阿維菌素類藥物殘留檢測(cè)—高效液相色譜法 安全要求

該檢驗(yàn)的提取、凈化步驟應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，操作中需著工作服、戴口罩手套，避免溶劑氣體吸入和皮膚接觸；廢棄的化學(xué)試劑收集到專用容器集中處理。急救措施

皮膚觸到有機(jī)溶劑或酸,用清水清洗，濺入眼中用純水灌洗。適用范圍

該操作規(guī)程適用于牛奶中阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素殘留量的制樣及測(cè)定。職責(zé)

進(jìn)行該項(xiàng)檢驗(yàn)的檢驗(yàn)員必須按該操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)，質(zhì)量監(jiān)督員負(fù)責(zé)監(jiān)督該操作規(guī)程的正確執(zhí)行。

檢測(cè)原理

用乙腈提取試料中殘留的阿維菌素類藥物，加水稀釋，加三乙胺使溶液呈弱堿性，C18固相萃取柱凈化，加三氟乙酸酐和N-甲基咪唑衍生化。高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定，外標(biāo)法定量。方法靈敏度

本方法在牛奶中阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素的檢測(cè)限均為1μg/kg，定量限均為2μg/kg。

注意事項(xiàng)

7.1 整個(gè)凈化步驟控制C18柱流速約在1～2 mL/min； 7.2 C18柱使用過(guò)程中除特別說(shuō)明外，應(yīng)避免柱床干涸。材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求

除特別注明外，以下所用試劑均為分析純；水為超純水。8.1 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品

含量≥95.7% 8.2 多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)品

含量≥92.6% 8.3 伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品

含量≥93.9% 8.4 乙腈

色譜純 8.5 甲醇

色譜純 8.6 三氟乙酸酐 8.7 三乙胺

8.8 異辛烷

8.9 N-甲基咪唑

8.10 C18固相萃取柱 500 mg/6 cc，或相當(dāng)者

8.11 固相萃取柱洗滌液；取乙腈30 mL、水70 mL和三乙胺20 μL，混勻。8.12 衍生化試劑

a)A液：N-甲基咪唑-乙腈（1+1，v/v）。現(xiàn)用現(xiàn)配。b)B液：三氟乙酸酐-乙腈（1+2，v/v）?，F(xiàn)用現(xiàn)配。8.13 1 mg/mL 阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液：

分別稱取阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，精密稱定，于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度。配制成阿維菌素類藥物濃度為1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-20℃保存，有效期6個(gè)月。

8.14 10 μg/mL 阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：

準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.25 mL，于25 mL量瓶中,用乙腈稀釋并配制成阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素濃度為10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20 ℃保存，有效期1個(gè)月。8.15 1 μg/mL 阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：

準(zhǔn)確量取10 μg/mL阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液2.5 mL，于25 mL量瓶中,用乙腈稀釋配制成阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素濃度為1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20 ℃保存，有效期1個(gè)月。

8.16 高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器）8.17 分析天平

感量0.00001 g 8.18 天平

感量0.01 g 8.19 振蕩器

8.20 離心機(jī) 8.21 渦旋混合儀

8.22 聚丙烯離心管

mL

8.23 氮吹儀

8.24 C18固相萃取柱 500 mg/6 cc，或相當(dāng)者 8.25 微孔濾膜

0.45 μm 檢驗(yàn)步驟 9.1 試料的制備

9.1.1 取混勻后的供試樣品，作為供試試料。

9.1.2 取混勻后的空白樣品，作為空白試料（陰性對(duì)照）。

9.1.3 取混勻后的空白樣品5 g,添加1 μg/mL的工作液0.05 mL，作為空白添加試料。

9.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取1 μg/mL阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.02、0.05、0.1 mL，于10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度；精密量取10 μg/mL阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.25 mL，于50 mL量瓶中，0.1、0.3 mL至10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，配制成濃度分別為2、5、10、50、100、300 ng/mL的阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1.0 mL于各自的10 mL試管中，于50 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，按衍生化步驟處理后，將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜測(cè)定，從低濃度到高濃度依次測(cè)定，每一濃度進(jìn)樣3針。以測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

9.3 提取

9.2.1 稱取(5±0.05)g試料，于50 mL離心管中，加乙腈8 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，5000 r/min離心10 min。

9.2.2 收集上清液于另一50 mL離心管中。殘?jiān)僦貜?fù)提取一次。9.2.3 合并兩次上清液，加水15 mL和三乙胺50 μl，混勻，備用。9.4 凈化

9.4.1 依次用乙腈5 mL、固相萃取柱洗滌液5 mL，活化C18固相萃取柱。9.4.2 將備用液過(guò)柱，抽干。加異辛烷3 mL洗滌，抽干。

9.4.3 用乙腈5 mL洗脫。收集洗脫液于10 mL試管中，50 ℃下用氮?dú)獯蹈?。備?/p>

9.5 衍生化

向試管中依次加入衍生化試劑A液100 μL和衍生化試劑B液150 μL，密閉，渦動(dòng)10 s，依次加冰醋酸、三乙胺各50 μL，渦動(dòng)10 s，密閉反應(yīng)30 min，加650 μL甲醇混勻。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜檢測(cè)。

9.6 測(cè)定 9.6.1 色譜條件

9.6.1.1 色譜柱：C18柱，（250×4.6 mm，粒徑5 μm）；或相當(dāng)者； 9.6.1.2 流動(dòng)相：乙腈+水（90+10，v/v）；

9.6.1.3 流速：1.8mL/min；

9.6.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)： 365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：475 nm； 9.6.1.5 柱溫：40 ℃； 9.6.1.6 進(jìn)樣量：20 μL。9.7 測(cè)定法

9.7.1 試樣溶液和50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作單點(diǎn)校準(zhǔn)，以峰面積計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液中阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)，試樣溶液測(cè)定過(guò)程中應(yīng)參插注入標(biāo)準(zhǔn)溶液，以便準(zhǔn)確定量?？瞻住⑻砑?、標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖見附錄及附加說(shuō)明。9.7.2 試劑空白試驗(yàn)

除不加試料外，采用完全相同的測(cè)定步驟進(jìn)行平行操作。9.8 結(jié)果計(jì)算和表述

試料中阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素的殘留量（μg/kg），按下式計(jì)算：

X = 式中:

X

——試料中相應(yīng)的阿維菌素類藥物的殘留量，μg/kg； C

——試樣溶液中相應(yīng)的阿維菌素類藥物的濃度，ng/mL； V

——衍生化后試樣的總體積，mL； m

——供試試料的質(zhì)量，g。

注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。9.9 結(jié)果判定

C?V m9.9.1 線性范圍

阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素在2～300 ng/mL范圍考察線性，計(jì)算回歸方程，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)≥0.995。9.9.2 準(zhǔn)確度

本方法在2～50 μg/kg添加濃度的回收率為70～120 %。9.9.3 精密度

本方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%。9.9.4 判定

當(dāng)方法學(xué)考察結(jié)果符合上述規(guī)定時(shí)，供試組織中阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素的殘留量單個(gè)及之和?Xi＜檢測(cè)限時(shí)，判定為未檢出；方法檢測(cè)限≤?Xi＜最高殘留限量時(shí), 判i?1i?1nn定為符合規(guī)定； ?Xi?1ni≥最高殘留限量時(shí)，判定為不符合規(guī)定。

注：僅當(dāng)Xi≥方法檢測(cè)限時(shí)，Xi為參與阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素總殘留量求和計(jì)算，故求和公式中0≤n≤3。

9.10 附錄及附加說(shuō)明

阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素在牛奶中的最高殘留限量

藥物名稱 阿維菌素 多拉菌素 伊維菌素

標(biāo)志殘留物 阿維菌素

多拉菌素 22，23-二氫伊維菌素

動(dòng)物品種

牛 牛 牛

組織

奶 奶 奶

MRL（μg/kg）不得檢出 不得檢出 10

附 錄 A（資料性附錄）高效液相色譜圖

LU ***00510152025

圖A.1 牛奶空白色譜圖

minLU ***200510152025min

圖A.2

阿維菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（50 ng/mL）

LU ***020510152025min3

圖A.3 牛奶中空白添加阿維菌素類藥物色譜圖（10 ng/g）

圖中色譜峰: 1-阿維菌素；2-多拉菌素；3-伊維菌素。

第二篇：手性高效液相色譜法檢測(cè)恩替卡韋中光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)的含量

手性高效液相色譜法檢測(cè)恩替卡韋中光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)的含量

作者單位：(浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物分析和藥物代謝研究室，杭州 310031)【摘要】 采用chiralpak adh手性柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，建立了正相高效液相色譜(nphplc)法直接拆分恩替卡韋與其光學(xué)異構(gòu)體的方法?？疾炝肆鲃?dòng)相組成、酸堿性對(duì)柱效、分離度、保留時(shí)間等參數(shù)的影響。經(jīng)優(yōu)化，以正己烷異丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.05∶0.05，v/v)為流動(dòng)相，流速0.5 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)261 nm。在此條件下，恩替卡韋與光學(xué)異構(gòu)體分離度>4.2;光學(xué)異構(gòu)體的檢出限為0.12 mg/l，在0.25～4.0 mg/l濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系;日內(nèi)與日間精密度rsd<4.0%;按標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算，加樣回收率在87.0%～100.8%之間;rsd<3.0%;按外標(biāo)法計(jì)算，加樣回收率在98.2%～110.4%之間;rsd<3.0%。本方法可作為恩替卡韋原料藥中光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)限量的控制方法。

【關(guān)鍵詞】 恩替卡韋，光學(xué)異構(gòu)體，高效液相色譜法，手性拆分

引 言

慢性乙肝病毒感染一直是全球公共衛(wèi)生的難題，開發(fā)抗乙肝病毒藥物也一直是個(gè)熱點(diǎn)。目前，我國(guó)臨床上應(yīng)用的抗病毒治療藥物主要有兩類： α干擾素和核苷或核苷酸類似物，主要包括拉米夫定、阿德福韋和阿昔洛韋[1,2]。2005年3月美國(guó)fda批準(zhǔn)了新一代抗hbv核苷類似物恩替卡韋(entecavir，etv，商品名baraclude)上市[3]。恩替卡韋是一種鳥嘌呤核苷類似物(圖1)，圖1 恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)

fig.1 structures of entecavir and its optical isomer在磷酸激酶的作用下在體內(nèi)形成活性三磷酸化合物，拮抗hbv所需天然底物脫氧鳥苷三磷(dgtp)，抑制hbvdna聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，阻斷hbv復(fù)制。細(xì)胞內(nèi)作用半衰期為15 h，在人體內(nèi)不被肝細(xì)胞代謝，主要從腎臟排出體外。同時(shí)，其耐藥性好，可有效治療慢性乙型肝炎，臨床應(yīng)用前景良好[4,5]。

由于手性藥物在合成過(guò)程中可能引入光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)，故采用手性分離方法檢查合成產(chǎn)品中光學(xué)異構(gòu)體含量。恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體手性分離方法未見報(bào)道。本研究采用直接手性hplc法拆分兩光學(xué)異構(gòu)體，建立恩替卡韋中光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)限量檢查方法。

實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑及材料

lc10a型高效液相色譜儀、spd10a型紫外可見光檢測(cè)器(日本島津公司);chiralpak adh手性柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本diacel 公司)。乙醇(tedia)、正己烷(burdick & jackson)及異丙醇(tedia)均為色譜純;三氟乙酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);三乙胺(分析純，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠);恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體(99.87%，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠)。

2.2 色譜條件

色譜柱：chiralpak adh手性柱;流動(dòng)相：正己烷異丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.05∶0.05，v/v);流速0.5 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)261 nm;柱溫：室溫;靈敏度：0.005 aufs;進(jìn)樣量20 μl。

2.3 溶液制備

2.3.1 恩替卡韋供試液及自身對(duì)照液的制備 準(zhǔn)確稱取適量恩替卡韋于50 ml容量瓶中，加乙醇超聲溶解，定容，作為儲(chǔ)備液(500 mg/l)。準(zhǔn)確移取儲(chǔ)備液2 ml于10 ml容量瓶中，加正己烷異丙醇(50∶50，v/v)混合溶液(以下簡(jiǎn)稱混合稀釋液)定容，得恩替卡韋的供試品溶液(100 mg/l)。取適量供試品溶液，用混合稀釋液稀釋100倍作為自身對(duì)照溶液。

2.3.2 光學(xué)異構(gòu)體對(duì)照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取適量異構(gòu)體于100 ml容量瓶中，加乙醇超聲溶解，定容，作為異構(gòu)體的儲(chǔ)備液(50 mg/l)。準(zhǔn)確移取儲(chǔ)備液2 ml于10 ml容量瓶中，加混合稀釋液定容，作為異構(gòu)體的對(duì)照品溶液(10 mg/l)。

2.3.3 恩替卡韋與異構(gòu)體混合溶液的制備 取2 ml恩替卡韋供試品溶液和4 ml異構(gòu)體的儲(chǔ)備液于10 ml容量瓶中，加混合稀釋液定容，即得濃度各為20 mg/l的混合溶液。

結(jié)果與討論

3.1 不同極性調(diào)節(jié)劑對(duì)保留時(shí)間、柱效和分離度的影響

由表1可見，當(dāng)流動(dòng)相為正己烷和異丙醇時(shí)，調(diào)節(jié)比例，樣品和異構(gòu)體未達(dá)基線分離。加入三氟乙酸，保留時(shí)間隨著三氟乙酸的增加有所減少，仍未達(dá)基線分離，但峰型好。加入三乙胺，兩者未分開，但能使異構(gòu)體的保留時(shí)間縮短。再改變正己烷和異丙醇比例，兩者分離，但是分離度僅為1.18，理論塔表1 流動(dòng)相的優(yōu)化板數(shù)都小于650。在流動(dòng)相中加入乙醇后發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中的乙醇含量明顯影響保留時(shí)間、分離效果和理論塔板數(shù)。乙醇含量越高，理論板數(shù)越大。同時(shí)乙醇和異丙醇的比例也明顯影響分離效果，乙醇比例增高，分離度和理論板數(shù)提高，保留時(shí)間也增加。當(dāng)流動(dòng)相為正己烷異丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.1∶0.05，v/v)時(shí)，分離效果理想(圖2c)。

3.2 酸堿性對(duì)柱效、分離度和保留時(shí)間的影響

3.2.1 三乙胺的影響 固定流動(dòng)相中正己烷異丙醇乙醇三氟乙酸(70∶12∶18∶0.1, v/v)的比例，改變?nèi)野酚昧?，考察三乙胺含量?duì)樣品和光學(xué)異構(gòu)體柱效、分離度和保留時(shí)間的影響。由表2可知，隨著三乙胺含量增加，理論板數(shù)和分離度逐漸提高，保留時(shí)間稍有縮短。當(dāng)流動(dòng)相中三乙胺比例為0.05%和0.1%時(shí)，理論板數(shù)、分離度和保留時(shí)間基本一致?？紤]到堿性大對(duì)手性柱的損害大，故選擇三乙胺用量為0.05%。

3.2.2 三氟乙酸的影響 固定流動(dòng)相中正己烷異丙醇乙醇三乙胺(70∶12∶18∶0.05, v/v)的比例，改變?nèi)宜嵊昧?，考察三氟乙酸含量?duì)樣品和光學(xué)異構(gòu)體柱效、分離度和保留時(shí)間的影響。由表2可知，隨著三氟乙酸含量的增加，分離度逐漸降低，但均大于3.5。保留時(shí)間逐漸變小，理論板數(shù)變化不明顯。綜合考慮選擇三氟乙酸含量為0.05%。圖2 流動(dòng)相對(duì)恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體分離的影響

a.正己烷異丙醇三氟乙酸(nhexane: isopropyl alcohol: trifluoroacetic acid)(60∶40∶0.05，v/v);b.正己烷異丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(nhexane: isopropyl alcohol: ethanol: trifluoroacetic acid)triethylamine(tea)(75∶20∶5∶0.1∶0.05，v/v);c.正己烷異丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(nhexane: isopropyl alcohol: ethanol: trifluoroacetic acid: tea)(70∶12∶18∶0.1∶0.05, v/v)。表2 流動(dòng)相中三乙胺和三氟乙酸含量對(duì)恩替卡韋光學(xué)異構(gòu)體拆分的影響

3.3 系統(tǒng)適用性、檢出限和線性關(guān)系

取配制的恩替卡韋與異構(gòu)體的混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，得恩替卡韋峰面積rsd為2.3%，光學(xué)異構(gòu)體rsd為3.1%;分離度為4.3;恩替卡韋的保留時(shí)間約為21～23 min;光學(xué)異構(gòu)體的保留時(shí)間約為30～33 min。理論板數(shù)按恩替卡韋峰計(jì)>2200，色譜圖見圖3。

取混合溶液(恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體各約20 mg/l)，用混合稀釋液逐步稀釋，測(cè)得恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體的檢出限均為0.12 mg/l(s/n=3)。

外標(biāo)法：精確移取適量異構(gòu)體對(duì)照液至10 ml容量瓶中，用混合稀釋液定容，制成異構(gòu)體濃度分別為4.08, 2.04, 1.02, 0.51和0.255 mg/l的系列溶液進(jìn)樣。標(biāo)準(zhǔn)加入法：精確移取異構(gòu)體對(duì)照液4, 2, 1, 0.5和0.25 ml，分別置于10 ml容量瓶中，每份加入恩替卡韋儲(chǔ)備液2.00 ml，用混合稀釋液定容，所得系列溶液中恩替卡韋濃度為100 mg/l，光學(xué)異構(gòu)體濃度分別為4.08, 2.04,圖3 恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體的色譜圖

a.恩替卡韋和光學(xué)異構(gòu)體的混合溶液(mixture of entecavir and optical isomer);b.光學(xué)異構(gòu)體(optical isomer);c.恩替卡韋(entecavir)。1.02, 0.51和0.255 mg/l，進(jìn)樣，記錄色譜圖。以濃度(x)對(duì)峰面積(y)作線性回歸，外標(biāo)法回歸方程為y=27206x-2387.3，r=0.9992;標(biāo)準(zhǔn)加入法回歸方程為y=27005x+58.287，r=0.9998。光學(xué)異構(gòu)體在0.25～4 mg/l濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。由曲線的斜率可知，兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎平行，說(shuō)明恩替卡韋的存在對(duì)微量光學(xué)異構(gòu)體的測(cè)定影響不大。

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、精密度與相對(duì)保留時(shí)間

取恩替卡韋(100 mg/l)和光學(xué)異構(gòu)體(1.0 mg/l)混合液，于0, 15和25 h進(jìn)樣測(cè)定，觀察光學(xué)異構(gòu)體峰面積變化情況。結(jié)果測(cè)得峰面積rsd為2.1%，表明測(cè)定溶液室溫放置25 h穩(wěn)定。

取適量恩替卡韋儲(chǔ)備液9份，分別加入不同量的光學(xué)異構(gòu)體溶液，用混合稀釋液稀釋，制成恩替卡韋濃度各為100 mg/l，含光學(xué)異構(gòu)體高、中、低濃度分別為2.0, 1.0和0.5 mg/l的測(cè)定液，每個(gè)濃度平行3份，每份重復(fù)進(jìn)樣2次，取平均峰面積計(jì)算。同法于不同天操作，計(jì)算日間精密度。測(cè)得日內(nèi)精密度rsd<1.5%，日間精密度rsd<4.0%(n=3)。

光學(xué)異構(gòu)體的相對(duì)保留時(shí)間(tr1)以恩替卡韋峰的保留時(shí)間(tr2)為參比，計(jì)算光學(xué)異構(gòu)體的相對(duì)保留值(r= tr1/tr2)。光學(xué)異構(gòu)體相對(duì)于恩替卡韋的保留值為1.429±0.004，rsd<1.0%。

3.5 光學(xué)異構(gòu)體的濃度校正因子

準(zhǔn)確稱取適量恩替卡韋和光學(xué)異構(gòu)體，分別加乙醇溶解、定容，制成儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確量取各儲(chǔ)備液適量，加混合稀釋液稀釋成濃度各為20 mg/l的混合溶液。再逐步稀釋成4, 2, 1, 0.5和0.25 mg/l，進(jìn)樣，記錄色譜圖。根據(jù)不同濃度下恩替卡韋和光學(xué)異構(gòu)體所得色譜峰面積，按下列公式計(jì)算光學(xué)異構(gòu)體的濃度校正因子(f)。測(cè)得該光學(xué)異構(gòu)體的濃度校正因子f=1.10±0.04，rsd=3.96%。f=(a樣/a異)·(c異/c樣)3.6 回收率實(shí)驗(yàn)

按日內(nèi)精密度測(cè)定項(xiàng)下方法配制溶液，根據(jù)測(cè)得濃度和理論濃度分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)加入法和外標(biāo)法回收率，結(jié)果見表3，獲得滿意的回收率。表3 光學(xué)異構(gòu)體的回收率實(shí)驗(yàn)

3.7 恩替卡韋原料藥中光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)的檢查

取適量恩替卡韋，加乙醇制成0.5 g/l儲(chǔ)備液，取該溶液適量，用混合稀釋液稀釋5倍作為供試品溶液。取供試品溶液適量，用混合稀釋液稀釋100倍作為自身對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液20 μl進(jìn)樣，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高為滿量程的10%左右;再精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液各20 μl，進(jìn)樣，記錄色譜圖至40 min。如果在相對(duì)恩替卡韋峰保留時(shí)間(1.43±5)%處出現(xiàn)色譜峰，峰面積乘上1.10后與自身對(duì)照溶液比較，不得大于對(duì)照溶液主成分峰面積(<1%)。結(jié)果3批樣品均未檢出光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)。

【參考文獻(xiàn)】

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