第一篇：microRNA反轉(zhuǎn)和定量引物設(shè)計(jì)(看完就會(huì)設(shè)計(jì)自己的引物)

以hsa-miR-145為例設(shè)計(jì)引物，其成熟體序列為：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU

一 設(shè)計(jì)引物反轉(zhuǎn)錄之后擴(kuò)增所需引物設(shè)計(jì)

反向引物（反轉(zhuǎn)之后跑PCR所需的引物）：每個(gè)反向引物的都帶有一段固定的序列，可以形成一個(gè)莖環(huán)，固定的序列為：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，在這個(gè)序列后加上八個(gè)堿基，這八個(gè)堿基是hsa-miR-145從后面數(shù)八個(gè)堿基的反向互補(bǔ)序列，就是GAAUCCCU的反向互補(bǔ)：AGGGATTC，最后得到的反向引物的序列為

5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGGGATTC-3，2定量引物設(shè)計(jì)

正向引物：每個(gè)正向引物也帶有一段固定的序列，固定的序列為：ACACTCCAGCTGGG

在這個(gè)序列后加上于成熟體除后面六個(gè)外剩下的堿基序列，成熟體除掉后面六個(gè)堿基后序列為：GUCCAGUUUUCCCAGGA，把U變成T即可，最后的序列為：

5，-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3，URP(unified reverse primer)：統(tǒng)一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCG

U6引物

上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA

下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT

二 使用方法：

1反轉(zhuǎn)錄之后跑PCR的引物：所有要做的miRNA反向引物的混合，每個(gè)10微升RT-PCR的引物：50微升的體系，30微升的水，10微升的正向引物，10微升的URP（內(nèi)參50微升的體系，30微升的水，10微升U6的正向引物，10微升U6的下游引物）

第二篇：引物設(shè)計(jì)-hyb總結(jié)

引 物 設(shè) 計(jì)

一.引物設(shè)計(jì)原則

首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。

二.引物設(shè)計(jì)注意的要點(diǎn)

1.引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。

3.引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。

4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5.引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)。

6.ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端ΔG值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），而5’端和中間ΔG值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的ΔG值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。

7.引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高（超過(guò)4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。

8.對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。

三.引物設(shè)計(jì)的步驟

1.打開(kāi)NCBI的主頁(yè)，選擇UniSTS,填寫(xiě)目的基因，選擇符合要求的引物，導(dǎo)入blast和primer5檢測(cè)是否符合要求，如果不符合要求再自己重新設(shè)計(jì)。

2.打開(kāi)NCBI頁(yè)面，選擇Gene,填寫(xiě)需要查找的基因及源種（例如小鼠mus）,找到mRNA的序列號(hào)，點(diǎn)擊打開(kāi)，找到相應(yīng)的mRNA，把序列或者mRNA的accession序號(hào)導(dǎo)出到word里面，找出含有內(nèi)含子的位置，做好標(biāo)記(從進(jìn)入Gene頁(yè)面后，點(diǎn)擊Genbank,可以了解這個(gè)基因的大小，以及內(nèi)含子與外顯子的大小)或者把mRNA的accession序號(hào)導(dǎo)入priemer Designing tool里面，擴(kuò)增產(chǎn)物是200-250，TM 58-62，至少包含一個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子長(zhǎng)度可慢慢調(diào)試，最終要求Tm,GC%都比較接近，同時(shí)self3complementarity的值不能超過(guò)3，self complementarity不能超過(guò)6，這2個(gè)值越低越好。

3.根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，從mRNA序列中找相應(yīng)的序列作為引物，上引物是5到3，下引物就是與mRNA序列反向互補(bǔ)的。

4.把設(shè)計(jì)的引物導(dǎo)入blast里檢測(cè)下在所有基因中是否有非特異性擴(kuò)增。

5.把全部mRNA序列導(dǎo)入primer5中，查看引物的Tm,GC%含量，是否有發(fā)夾結(jié)構(gòu)與二聚體結(jié)構(gòu)，以及錯(cuò)配率，得分，確定引物的可用性。

1.引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產(chǎn)，無(wú)論采用什么機(jī)器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個(gè)循環(huán)用時(shí)的多少。

亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過(guò)3'→5'磷酸二酯鍵連接。

第一步是將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5'-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5'-羥基；

第二步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。

第三步，帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5'-羥基沒(méi)有參加反應(yīng)(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉。第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。

經(jīng)過(guò)以上四個(gè)步驟，一個(gè)脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過(guò)程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。

通過(guò)氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來(lái)，通過(guò)OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮,脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測(cè)定OD260定量，根據(jù)定單要求分裝。

2.引物純化方式有哪些，如何選擇？

◆ C18柱脫鹽：有人稱(chēng)其為簡(jiǎn)易反相柱，它對(duì)DNA有特異性的吸附，可以被有機(jī)溶解洗脫，但不會(huì)被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實(shí)際上，它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會(huì)對(duì)普通PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。對(duì)于需要用于測(cè)序、克隆的引物不能使用這個(gè)級(jí)別。

◆ OPC純化： OPC純化是根據(jù)DNA保護(hù)基（DMTr基）和Cartridge柱中樹(shù)脂間的親合力作用的原理進(jìn)行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大于95%。適用于40mer以下引物的純化?！?PAGE純：PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)DNA片段進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于95%，對(duì)長(zhǎng)鏈Oligo DNA(大于50mer)的純化特別有效。

◆ HPLC純化：HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對(duì)DNA片段進(jìn)行純化。純度可以大于

99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點(diǎn)是成本較高，批量生產(chǎn)效率不高。

3.引物的OD數(shù)如何定量？

答：引物合成引物OD數(shù)是這樣測(cè)定的：用紫外分光光度計(jì)，波長(zhǎng)260nm，石英比色杯，光程為1厘米，測(cè)定溶液的光密度。測(cè)定時(shí)溶液的光密度最好稀釋到0.2-1.0之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用1ml水稀釋測(cè)OD值。需要根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出母液的OD值。4.需要什么級(jí)別的引物？

答：引物常用的純化方式C18脫鹽，OPC純化，PAGE純化，HPLC純化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，確定訂購(gòu)引物的純度級(jí)別。

應(yīng)用 引物長(zhǎng)度要求 純度級(jí)別要求 一般PCR擴(kuò)增 < 45base OPC >45 base PAGE 診斷PCR擴(kuò)增 < 40base OPC, PAGE DNA測(cè)序 20base左右 OPC 亞克隆，點(diǎn)突變等 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定 OPC, PAGE，HPLC 基因構(gòu)建（全基因合成）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定 PAGE 反義核酸 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定 PAGE 修飾引物 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定 PAGE, HPLC

5.最長(zhǎng)可以合成多長(zhǎng)的引物？

答：引物越長(zhǎng)，出現(xiàn)問(wèn)題的概率就越大。我們合成過(guò)120base的引物，但是產(chǎn)率很低。除非需要，建議合成片段長(zhǎng)度不要超過(guò)80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗產(chǎn)品，全長(zhǎng)（還不一定正確）引物的百分比不會(huì)超過(guò)40%，后續(xù)處理還有丟失很多，最后的產(chǎn)量是很低。

6.需要合成多少OD數(shù)？

答：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定。一般PCR擴(kuò)增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構(gòu)建的引物都比較長(zhǎng)，但是我們有些研究人員也要求高OD數(shù)。片段越長(zhǎng), 最后全長(zhǎng)得率就越低，出錯(cuò)的幾率就越大。超出需要之外的OD數(shù)要求，其實(shí)也是對(duì)社會(huì)資源的一種浪費(fèi)，同時(shí)也從一個(gè)側(cè)面反映了部分研究人員，特別是新手的自信心不足，總覺(jué)得需要重復(fù)多次才能成功。

7.如何檢測(cè)引物的純度？

答：實(shí)驗(yàn)室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后(約2-3小時(shí))，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測(cè)帶型，在主帶之下沒(méi)有雜帶，說(shuō)明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。

8.如何計(jì)算引物的濃度？

答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。引物一般配制成10-50pmol/ul。溶解前您需要核對(duì)合成報(bào)告單和引物標(biāo)簽上的引物OD數(shù)是否一致。如果不一致，請(qǐng)和我們聯(lián)系。我們可以根據(jù)生產(chǎn)記錄查到實(shí)際產(chǎn)量是多少。

一般情況下，我們建議將引物的濃度配制成50pmol/ul，加水的體積（微升）按下列方式計(jì)算：V(微升)= OD數(shù)*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 /(除)引物的分子量。引物的分子量可以從合成報(bào)告單上獲得。如果需要配制成其他濃度，按上述公式換算。注意：1 OD260= 33 ug/ml.9.如何計(jì)算引物的Tm值？

答：引物設(shè)計(jì)軟件都可以給出Tm，引物長(zhǎng)度，堿基組成，引物使用緩沖的離子強(qiáng)度有關(guān)。長(zhǎng)度為25mer以下的引物，Tm計(jì)算公式為：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)對(duì)于更長(zhǎng)的寡聚核苷酸，Tm計(jì)算公式為：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41(%GC)– 600/size 公式中，Size = 引物長(zhǎng)度。

Tm的定義：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand.In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature.The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature.The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.10.引物（含修飾）的分子量是如何確定的？

答：非修飾的引物的Molecular Weight在隨引物提供的報(bào)告單上都有明確的標(biāo)示。如果需要估計(jì)一個(gè)引物的分子量按每個(gè)堿基的平均分子量為324.5，引物的分子量=堿基數(shù) x 堿基的平均分子量?；虬聪铝泄接?jì)算MW=(NA * WA)+(NC * WC)+(NG * WG)+(NT * WT)+(Nmod * Wmod)＋（Nx * Wx）+(Ni* Wi)+16* Ns– 62.NA, NG, NC, NT, Ni分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數(shù)量，WA, WC, WG, W, Wi分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分別為修飾基團(tuán)的數(shù)目和分子量。

對(duì)于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數(shù)，例如G+A混合的分子量為（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns為硫代數(shù)目，硫代每個(gè)位置增加分子量16。常規(guī)堿基分子量 Base Molecular Weight A 313.21 C 289.18 G 329.21 T 304.19 I 314.2 U 290.17

常規(guī)修飾基團(tuán)分子量

5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60 5’-(6 FAM)537.46 3’-Dabsyl 498.49 5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM)569.46 5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07 5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18 5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12

11.如何溶解引物？

答：干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開(kāi)蓋前最好離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據(jù)計(jì)算出的體積加入去離子無(wú)菌水或10mM Tris pH7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因?yàn)橛行┱麴s水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩(wěn)定。

12.如何保存引物？

答：引物合成后，經(jīng)過(guò)一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。引物在溶解前，室溫狀態(tài)下可以長(zhǎng)期保存。溶解后的引物-20度可以長(zhǎng)期保存。如果對(duì)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性要求較高，合成的OD數(shù)較大，建議分裝，避免反復(fù)凍融。修飾熒光引物需要避光保存。

13.合成的引物5’端是否有磷酸化

答：合成的引物5’為羥基，沒(méi)有磷酸基團(tuán)。如果需要您可以用多核苷酸激酶進(jìn)行5'端磷酸化，或者要求我們合成時(shí)直接在5'或3'端進(jìn)行磷酸化，需要另外收費(fèi)。

14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問(wèn)題？

連接反應(yīng)需要引物的5’磷酸基團(tuán)。如果需要將合成的引物退火直接連接相應(yīng)的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產(chǎn)物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，退火的難度較大，退火時(shí)需要提高退火溫度。

15.測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物有突變是怎么回事？

答：測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是40個(gè)堿基以下的引物, 發(fā)生的概率不大，但是肯定也會(huì)發(fā)生。用戶(hù)一般可以放心，引物序列一般都是通過(guò)電腦直接將您的序列COPY到合成儀的，堿基輸錯(cuò)的機(jī)會(huì)不多。我們有一套控制辦法，預(yù)防堿基輸入錯(cuò)誤。發(fā)生這種突變的原因有很多解釋?zhuān)藗冞€沒(méi)有辦法徹底解決這個(gè)問(wèn)題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機(jī)器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國(guó)公司提供的，所有每個(gè)合成服務(wù)商遇到的問(wèn)題也基本類(lèi)似，沒(méi)有人可以超脫。

引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng)，合成效率最高也就是99%，副產(chǎn)品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復(fù)，一般認(rèn)為，偶連過(guò)程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導(dǎo)致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認(rèn)為是一般認(rèn)為是帶帽(capping)反應(yīng)不徹底造成的，Caping反應(yīng)主要是封閉極少數(shù)5'-羥基沒(méi)有參加反應(yīng)單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時(shí)將不能繼續(xù)參與合成。對(duì)于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是堿基不能100%脫保護(hù)，即引物上可能含有殘留保護(hù)基團(tuán)，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補(bǔ)鏈配對(duì)，當(dāng)擴(kuò)增的產(chǎn)品被亞克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，可能被細(xì)菌中修復(fù)系統(tǒng)補(bǔ)上了非配對(duì)的堿基。置換突變通常發(fā)生在G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體（脫嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA復(fù)制和擴(kuò)增過(guò)程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測(cè)序就會(huì)發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫嘌呤現(xiàn)象在富含嘌呤的引物中發(fā)生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護(hù)階段如果被降解，測(cè)序就會(huì)發(fā)現(xiàn)堿基G或A的缺失。

引物合成過(guò)程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發(fā)生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，還沒(méi)有能夠應(yīng)用到規(guī)模化生產(chǎn)中。

16.長(zhǎng)鏈引物為什么出錯(cuò)的幾率非常高？

答：引物合成時(shí)，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到100%，產(chǎn)生堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀

條件都有一直存在。引物鏈越長(zhǎng)，突變的頻率累加起來(lái)就越高。研究人員總希望合成的引物萬(wàn)無(wú)一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴(kuò)增，不可能絕對(duì)保證擴(kuò)增產(chǎn)物中沒(méi)有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯(cuò)誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴(kuò)增過(guò)程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長(zhǎng)鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。

17.如果測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？

答：對(duì)您遇到的困惑，我們表示同情。遇到這種情況，首先和我們?nèi)〉寐?lián)系，我們的生產(chǎn)人員會(huì)檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對(duì)合成序列是否和定單一致，我們?cè)陔娔X中保留所有原始數(shù)據(jù)。如果確認(rèn)引物合成序列沒(méi)有輸錯(cuò)，我們建議重新挑取克隆測(cè)序，您可能會(huì)找到正確克隆的。根據(jù)我們經(jīng)驗(yàn)，40個(gè)堿基以下的引物，測(cè)1-2個(gè)克隆就可以了；40個(gè)以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測(cè)一些了。一般情況下，每個(gè)克隆突變的位點(diǎn)都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費(fèi)重合一次，不過(guò)重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會(huì)因?yàn)橹睾系囊锞蜏p少您的遇到問(wèn)題的幾率。基因拼接過(guò)程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點(diǎn)不多，就多測(cè)幾個(gè)，否則就重合一下引物。

18.引物是經(jīng)過(guò)PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？

答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個(gè)堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時(shí)的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時(shí)，很難說(shuō)不割到差別僅幾個(gè)堿基的引物。國(guó)內(nèi)有一個(gè)不好的現(xiàn)象，PAGE純化的引物，特別是長(zhǎng)引物要的量都比較高，導(dǎo)致割的條帶有時(shí)可能比較寬。建議：您如果減少OD數(shù)，引物遇到的問(wèn)題可能就會(huì)少一些。

19.TaqMan 探針設(shè)計(jì)的基本原則是什么？ 答：下列原則供您參考。

◆TaqMan 探針位置盡可能靠近擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物50-150bp），但不能與引物重疊?！糸L(zhǎng)度一般為18-40mer。◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)?！粼谝锏?’端避免使用G。◆選用比較多的堿基C。

◆退火溫度Tm控制在 68-70C左右。

有用的熒光染料參數(shù)

Name Name 吸收波長(zhǎng) 發(fā)射波長(zhǎng) colors 6-FAM 6-carboxy-fluorescein 494nm 518nm Green TET 5-tetrachloro-fluorescein 521nm 538nm Orange HEX 5-hexachloro-fluorescein 535nm 553nm Pink TAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm 582nm Rose ROX 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 607nm Red Cy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm Red Cy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violet

20.Primer設(shè)計(jì)的基本原則是什么？

答：引物設(shè)計(jì)的下列原則供您參考?！粢镩L(zhǎng)度一般在18-35mer?！鬐-C含量控制在40-60%左右?！舯苊饨?’端有酶切位點(diǎn)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

◆如果可能避免在3’端最后5個(gè)堿基有2個(gè)以上的G或C?！羧绻赡鼙苊庠?’端最后1個(gè)堿基為A。

◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。◆退火溫度Tm控制在 58-60C左右。

◆如果是設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物，突變點(diǎn)應(yīng)盡可能在引物的中間。

21.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：我們多次接到類(lèi)似的投訴：引物應(yīng)該全是DNA,但是OD260/OD280的比值為什么那么低，怎么會(huì)有蛋白質(zhì)污染？遇到這樣的投訴有時(shí)我們感到很是為難。投訴者有時(shí)心情很不好，還不聽(tīng)解釋。撇開(kāi)其他不談，引物化學(xué)合成，哪里有機(jī)會(huì)污染到蛋白質(zhì)？

需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來(lái)衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過(guò)低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個(gè)20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions Base Composition A260/280 5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.50 5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.85 5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.15 5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.14 5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66

22.同樣的OD用PAGE檢測(cè)，EB染色為什么深淺不一？

答：通?？梢杂肊B染色的方法來(lái)判斷雙鏈DNA的量(如質(zhì)粒DNA)，因?yàn)镋B可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA，由于堿基組成不同，形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性不同，EB的染色程度也會(huì)有差異，比如Oligo(dT)等不形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來(lái)定量，而用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。同樣道理，用EB染色來(lái)照片不適合所有引物。

23.引物不純會(huì)有什么后果？

答：引物不純可能會(huì)導(dǎo)致：1)非特異性擴(kuò)增；2)無(wú)法用預(yù)先設(shè)計(jì)在引物5'端酶切位點(diǎn)的酶切開(kāi)，特別是沒(méi)有保護(hù)堿基的引物；3)用于測(cè)序出現(xiàn)雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。

24.為什么我們的引物重合了幾遍都擴(kuò)增不出來(lái)？

答：有些PCR擴(kuò)增沒(méi)有成功，懷疑是引物不好。PCR擴(kuò)增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)置對(duì)照來(lái)判定原因。

如果您懷疑引物的問(wèn)題，請(qǐng)您首先測(cè)定您溶解的引物的OD值，看實(shí)驗(yàn)時(shí)加入的引物量是否正確。如果量是正常的，請(qǐng)您告訴我司您的引物編號(hào)，我們會(huì)復(fù)查留存樣品。如不明原因，我們免費(fèi)為您重新合成一次。如果仍然不能擴(kuò)增，請(qǐng)您查找其它原因。

25.已經(jīng)溶解的引物，為什么原先使用正常，而過(guò)一段時(shí)間再使用就不好了？

答：如果您溶解引物的水PH過(guò)低或污染了菌或核酸酶，會(huì)使引物降解。使用時(shí)沒(méi)有充分解凍混合，液體不均勻也可能會(huì)造成引物加入量不準(zhǔn)確。建議分裝引物，避免反復(fù)凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物，因?yàn)橛行┱麴s水的pH值比較低（pH4-5）, 引物在這種條件下不穩(wěn)定。還有一種可能性是引物沒(méi)有問(wèn)題，而是PCR使用材料特別是模板的質(zhì)量與先前使用的不完全一致。

26.引物質(zhì)量好壞的判斷標(biāo)準(zhǔn)是什么？

答：合成的引物和您的定單序列一致，而不是能否擴(kuò)增出您所需要的產(chǎn)物。

27.PCR擴(kuò)增不出就引物有問(wèn)題嗎？

答：基本不是。當(dāng)今發(fā)展出各色各樣的PCR擴(kuò)增技術(shù)，各色各樣的高溫聚合酶，就是來(lái)解決PCR擴(kuò)增中遇到的擴(kuò)不出，擴(kuò)增效率低的問(wèn)題。如槽式PCR就是擴(kuò)增那些拷貝數(shù)很低的基因片段。有些重復(fù)片段的擴(kuò)增, GC含量高的片段，非要采用特殊擴(kuò)增手段才能擴(kuò)增出了。

引物擴(kuò)增不出，主要是下列兩種情況比較常見(jiàn)（1）RT-PCR。請(qǐng)注意，很多基因通過(guò)常規(guī)RT –PCR方法是很難不增出來(lái)的。RT-PCR成功的關(guān)鍵在于RT的反應(yīng)的RNA質(zhì)量和目標(biāo)基因在特定組織和細(xì)胞中含量。（2）從基因組中擴(kuò)增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴(yán)格控制用量。基因組DNA過(guò)高，會(huì)影響反應(yīng)體系中的Mg和pH。

28.PCR擴(kuò)增有很強(qiáng)的非特異條帶，說(shuō)明引物有污染嗎？

答：不能。瞧，擴(kuò)增目標(biāo)很弱或沒(méi)有，道是非特異性條帶很亮，說(shuō)明引物不純或有污染。一些用戶(hù)如是說(shuō)。我們?cè)治鲞^(guò)一些非特異條帶，測(cè)序發(fā)現(xiàn)在這些非特異性片段的兩頭至少可以發(fā)現(xiàn)一條引物序列。我們只能說(shuō)非特異性擴(kuò)增一般是模板污染（如RNA中污染基因組）或擴(kuò)增條件不合適所致。

第三篇：PCR 引物設(shè)計(jì)的原則和要點(diǎn)

PCR 引物設(shè)計(jì)的原則和要點(diǎn)

BIOX.CN2005-5-13 9:13:57 來(lái)源：生物中國(guó)人

引物設(shè)計(jì)有3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意如下要點(diǎn)：引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3 個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加[2]。引物3’端的末位堿基對(duì)Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A 的錯(cuò)配效率明顯高于其他3 個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR 反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR 影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物[2]。引物序列的GC 含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。Tm 值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)。

6?G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G 值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），而5’端和中間?G 值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的?G 值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)[6]。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高（超過(guò)4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行[8]。對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR 產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。

第四篇：測(cè)序引物設(shè)計(jì)指引PCR引物設(shè)計(jì)方法1引物最好在cDNA的保守

測(cè)序引物設(shè)計(jì)指南

?PCR引物設(shè)計(jì)方法：

1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。

DNA序列的保守區(qū)是通過(guò)物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過(guò)序列分析軟件（比如DNAman）比對(duì)（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。

2.引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間。

引物長(zhǎng)度（primerlength）常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。

4.引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3位。

如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。

5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。

引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T(mén)時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G和C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。

6.堿基要隨機(jī)分布。

引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（Falsepriming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。

7.引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。

引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。

兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer與Crossdimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。

引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其△G值不要過(guò)高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。8.引物5′ 端和中間△G值應(yīng)該相對(duì)較高，而3′ 端△G值較低。

△G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性，△G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5′端和中間△G值相對(duì)較高，而3′端△G值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9）的引物。引物3′端的△G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（不同位置的△G值可以用Oligo6軟件進(jìn)行分析）

9.引物的5′ 端可以修飾，而3′ 端不可修飾。

引物的5′端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。

引物的延伸是從3′端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能。

10.擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。

某些引物無(wú)效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。

11.引物應(yīng)具有特異性。

引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。

值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿(mǎn)足條件。

做RealTime時(shí),用于SYBRGreenI法時(shí)的一對(duì)引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的。

?總結(jié)：

1)避免重復(fù)堿基，尤其是G.2)Tm=58-60度。

3）GC=30-80%.4)3端最后5個(gè)堿基內(nèi)不能有多于2個(gè)的G或C.5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。

6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150bp最為合適（可以延長(zhǎng)至300bp）。

7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；

要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。而且引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。

至于設(shè)計(jì)軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMEREXPRESS都應(yīng)該可以的。

做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對(duì)于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準(zhǔn)備---尋找合適的引物非常不容易。

關(guān)于BLAST的作用應(yīng)該是通過(guò)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)你所設(shè)計(jì)的這個(gè)引物，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并在GENEBANK中公開(kāi)的不物種基因序列當(dāng)中，除了和你的目標(biāo)基因之外，還有沒(méi)有和其他物種或其他序列當(dāng)中存在相同的序列，如和你的目標(biāo)序列之外的序列相同的序列，則可能擴(kuò)出其他序列的產(chǎn)物，那么這個(gè)引物的特異性就很差，從而不能用。