第一篇：手性高效液相色譜法檢測恩替卡韋中光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)的含量

手性高效液相色譜法檢測恩替卡韋中光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)的含量

作者單位：(浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物分析和藥物代謝研究室，杭州 310031)【摘要】 采用chiralpak adh手性柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，建立了正相高效液相色譜(nphplc)法直接拆分恩替卡韋與其光學(xué)異構(gòu)體的方法?？疾炝肆鲃酉嘟M成、酸堿性對柱效、分離度、保留時間等參數(shù)的影響。經(jīng)優(yōu)化，以正己烷異丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.05∶0.05，v/v)為流動相，流速0.5 ml/min;檢測波長261 nm。在此條件下，恩替卡韋與光學(xué)異構(gòu)體分離度>4.2;光學(xué)異構(gòu)體的檢出限為0.12 mg/l，在0.25～4.0 mg/l濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系;日內(nèi)與日間精密度rsd<4.0%;按標(biāo)準(zhǔn)加入法計算，加樣回收率在87.0%～100.8%之間;rsd<3.0%;按外標(biāo)法計算，加樣回收率在98.2%～110.4%之間;rsd<3.0%。本方法可作為恩替卡韋原料藥中光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)限量的控制方法。

【關(guān)鍵詞】 恩替卡韋，光學(xué)異構(gòu)體，高效液相色譜法，手性拆分

引 言

慢性乙肝病毒感染一直是全球公共衛(wèi)生的難題，開發(fā)抗乙肝病毒藥物也一直是個熱點(diǎn)。目前，我國臨床上應(yīng)用的抗病毒治療藥物主要有兩類： α干擾素和核苷或核苷酸類似物，主要包括拉米夫定、阿德福韋和阿昔洛韋[1,2]。2005年3月美國fda批準(zhǔn)了新一代抗hbv核苷類似物恩替卡韋(entecavir，etv，商品名baraclude)上市[3]。恩替卡韋是一種鳥嘌呤核苷類似物(圖1)，圖1 恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)

fig.1 structures of entecavir and its optical isomer在磷酸激酶的作用下在體內(nèi)形成活性三磷酸化合物，拮抗hbv所需天然底物脫氧鳥苷三磷(dgtp)，抑制hbvdna聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，阻斷hbv復(fù)制。細(xì)胞內(nèi)作用半衰期為15 h，在人體內(nèi)不被肝細(xì)胞代謝，主要從腎臟排出體外。同時，其耐藥性好，可有效治療慢性乙型肝炎，臨床應(yīng)用前景良好[4,5]。

由于手性藥物在合成過程中可能引入光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)，故采用手性分離方法檢查合成產(chǎn)品中光學(xué)異構(gòu)體含量。恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體手性分離方法未見報道。本研究采用直接手性hplc法拆分兩光學(xué)異構(gòu)體，建立恩替卡韋中光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)限量檢查方法。

實驗部分

2.1 儀器、試劑及材料

lc10a型高效液相色譜儀、spd10a型紫外可見光檢測器(日本島津公司);chiralpak adh手性柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本diacel 公司)。乙醇(tedia)、正己烷(burdick & jackson)及異丙醇(tedia)均為色譜純;三氟乙酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);三乙胺(分析純，上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)五聯(lián)化工廠);恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體(99.87%，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠)。

2.2 色譜條件

色譜柱：chiralpak adh手性柱;流動相：正己烷異丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.05∶0.05，v/v);流速0.5 ml/min;檢測波長261 nm;柱溫：室溫;靈敏度：0.005 aufs;進(jìn)樣量20 μl。

2.3 溶液制備

2.3.1 恩替卡韋供試液及自身對照液的制備 準(zhǔn)確稱取適量恩替卡韋于50 ml容量瓶中，加乙醇超聲溶解，定容，作為儲備液(500 mg/l)。準(zhǔn)確移取儲備液2 ml于10 ml容量瓶中，加正己烷異丙醇(50∶50，v/v)混合溶液(以下簡稱混合稀釋液)定容，得恩替卡韋的供試品溶液(100 mg/l)。取適量供試品溶液，用混合稀釋液稀釋100倍作為自身對照溶液。

2.3.2 光學(xué)異構(gòu)體對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取適量異構(gòu)體于100 ml容量瓶中，加乙醇超聲溶解，定容，作為異構(gòu)體的儲備液(50 mg/l)。準(zhǔn)確移取儲備液2 ml于10 ml容量瓶中，加混合稀釋液定容，作為異構(gòu)體的對照品溶液(10 mg/l)。

2.3.3 恩替卡韋與異構(gòu)體混合溶液的制備 取2 ml恩替卡韋供試品溶液和4 ml異構(gòu)體的儲備液于10 ml容量瓶中，加混合稀釋液定容，即得濃度各為20 mg/l的混合溶液。

結(jié)果與討論

3.1 不同極性調(diào)節(jié)劑對保留時間、柱效和分離度的影響

由表1可見，當(dāng)流動相為正己烷和異丙醇時，調(diào)節(jié)比例，樣品和異構(gòu)體未達(dá)基線分離。加入三氟乙酸，保留時間隨著三氟乙酸的增加有所減少，仍未達(dá)基線分離，但峰型好。加入三乙胺，兩者未分開，但能使異構(gòu)體的保留時間縮短。再改變正己烷和異丙醇比例，兩者分離，但是分離度僅為1.18，理論塔表1 流動相的優(yōu)化板數(shù)都小于650。在流動相中加入乙醇后發(fā)現(xiàn)流動相中的乙醇含量明顯影響保留時間、分離效果和理論塔板數(shù)。乙醇含量越高，理論板數(shù)越大。同時乙醇和異丙醇的比例也明顯影響分離效果，乙醇比例增高，分離度和理論板數(shù)提高，保留時間也增加。當(dāng)流動相為正己烷異丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.1∶0.05，v/v)時，分離效果理想(圖2c)。

3.2 酸堿性對柱效、分離度和保留時間的影響

3.2.1 三乙胺的影響 固定流動相中正己烷異丙醇乙醇三氟乙酸(70∶12∶18∶0.1, v/v)的比例，改變?nèi)野酚昧?，考察三乙胺含量對樣品和光學(xué)異構(gòu)體柱效、分離度和保留時間的影響。由表2可知，隨著三乙胺含量增加，理論板數(shù)和分離度逐漸提高，保留時間稍有縮短。當(dāng)流動相中三乙胺比例為0.05%和0.1%時，理論板數(shù)、分離度和保留時間基本一致?？紤]到堿性大對手性柱的損害大，故選擇三乙胺用量為0.05%。

3.2.2 三氟乙酸的影響 固定流動相中正己烷異丙醇乙醇三乙胺(70∶12∶18∶0.05, v/v)的比例，改變?nèi)宜嵊昧?，考察三氟乙酸含量對樣品和光學(xué)異構(gòu)體柱效、分離度和保留時間的影響。由表2可知，隨著三氟乙酸含量的增加，分離度逐漸降低，但均大于3.5。保留時間逐漸變小，理論板數(shù)變化不明顯。綜合考慮選擇三氟乙酸含量為0.05%。圖2 流動相對恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體分離的影響

a.正己烷異丙醇三氟乙酸(nhexane: isopropyl alcohol: trifluoroacetic acid)(60∶40∶0.05，v/v);b.正己烷異丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(nhexane: isopropyl alcohol: ethanol: trifluoroacetic acid)triethylamine(tea)(75∶20∶5∶0.1∶0.05，v/v);c.正己烷異丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(nhexane: isopropyl alcohol: ethanol: trifluoroacetic acid: tea)(70∶12∶18∶0.1∶0.05, v/v)。表2 流動相中三乙胺和三氟乙酸含量對恩替卡韋光學(xué)異構(gòu)體拆分的影響

3.3 系統(tǒng)適用性、檢出限和線性關(guān)系

取配制的恩替卡韋與異構(gòu)體的混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，得恩替卡韋峰面積rsd為2.3%，光學(xué)異構(gòu)體rsd為3.1%;分離度為4.3;恩替卡韋的保留時間約為21～23 min;光學(xué)異構(gòu)體的保留時間約為30～33 min。理論板數(shù)按恩替卡韋峰計>2200，色譜圖見圖3。

取混合溶液(恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體各約20 mg/l)，用混合稀釋液逐步稀釋，測得恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體的檢出限均為0.12 mg/l(s/n=3)。

外標(biāo)法：精確移取適量異構(gòu)體對照液至10 ml容量瓶中，用混合稀釋液定容，制成異構(gòu)體濃度分別為4.08, 2.04, 1.02, 0.51和0.255 mg/l的系列溶液進(jìn)樣。標(biāo)準(zhǔn)加入法：精確移取異構(gòu)體對照液4, 2, 1, 0.5和0.25 ml，分別置于10 ml容量瓶中，每份加入恩替卡韋儲備液2.00 ml，用混合稀釋液定容，所得系列溶液中恩替卡韋濃度為100 mg/l，光學(xué)異構(gòu)體濃度分別為4.08, 2.04,圖3 恩替卡韋及其光學(xué)異構(gòu)體的色譜圖

a.恩替卡韋和光學(xué)異構(gòu)體的混合溶液(mixture of entecavir and optical isomer);b.光學(xué)異構(gòu)體(optical isomer);c.恩替卡韋(entecavir)。1.02, 0.51和0.255 mg/l，進(jìn)樣，記錄色譜圖。以濃度(x)對峰面積(y)作線性回歸，外標(biāo)法回歸方程為y=27206x-2387.3，r=0.9992;標(biāo)準(zhǔn)加入法回歸方程為y=27005x+58.287，r=0.9998。光學(xué)異構(gòu)體在0.25～4 mg/l濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。由曲線的斜率可知，兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎平行，說明恩替卡韋的存在對微量光學(xué)異構(gòu)體的測定影響不大。

3.4 穩(wěn)定性實驗、精密度與相對保留時間

取恩替卡韋(100 mg/l)和光學(xué)異構(gòu)體(1.0 mg/l)混合液，于0, 15和25 h進(jìn)樣測定，觀察光學(xué)異構(gòu)體峰面積變化情況。結(jié)果測得峰面積rsd為2.1%，表明測定溶液室溫放置25 h穩(wěn)定。

取適量恩替卡韋儲備液9份，分別加入不同量的光學(xué)異構(gòu)體溶液，用混合稀釋液稀釋，制成恩替卡韋濃度各為100 mg/l，含光學(xué)異構(gòu)體高、中、低濃度分別為2.0, 1.0和0.5 mg/l的測定液，每個濃度平行3份，每份重復(fù)進(jìn)樣2次，取平均峰面積計算。同法于不同天操作，計算日間精密度。測得日內(nèi)精密度rsd<1.5%，日間精密度rsd<4.0%(n=3)。

光學(xué)異構(gòu)體的相對保留時間(tr1)以恩替卡韋峰的保留時間(tr2)為參比，計算光學(xué)異構(gòu)體的相對保留值(r= tr1/tr2)。光學(xué)異構(gòu)體相對于恩替卡韋的保留值為1.429±0.004，rsd<1.0%。

3.5 光學(xué)異構(gòu)體的濃度校正因子

準(zhǔn)確稱取適量恩替卡韋和光學(xué)異構(gòu)體，分別加乙醇溶解、定容，制成儲備液。準(zhǔn)確量取各儲備液適量，加混合稀釋液稀釋成濃度各為20 mg/l的混合溶液。再逐步稀釋成4, 2, 1, 0.5和0.25 mg/l，進(jìn)樣，記錄色譜圖。根據(jù)不同濃度下恩替卡韋和光學(xué)異構(gòu)體所得色譜峰面積，按下列公式計算光學(xué)異構(gòu)體的濃度校正因子(f)。測得該光學(xué)異構(gòu)體的濃度校正因子f=1.10±0.04，rsd=3.96%。f=(a樣/a異)·(c異/c樣)3.6 回收率實驗

按日內(nèi)精密度測定項下方法配制溶液，根據(jù)測得濃度和理論濃度分別計算標(biāo)準(zhǔn)加入法和外標(biāo)法回收率，結(jié)果見表3，獲得滿意的回收率。表3 光學(xué)異構(gòu)體的回收率實驗

3.7 恩替卡韋原料藥中光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)的檢查

取適量恩替卡韋，加乙醇制成0.5 g/l儲備液，取該溶液適量，用混合稀釋液稀釋5倍作為供試品溶液。取供試品溶液適量，用混合稀釋液稀釋100倍作為自身對照溶液。取對照溶液20 μl進(jìn)樣，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高為滿量程的10%左右;再精密量取供試品溶液和對照溶液各20 μl，進(jìn)樣，記錄色譜圖至40 min。如果在相對恩替卡韋峰保留時間(1.43±5)%處出現(xiàn)色譜峰，峰面積乘上1.10后與自身對照溶液比較，不得大于對照溶液主成分峰面積(<1%)。結(jié)果3批樣品均未檢出光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)。

【參考文獻(xiàn)】

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