第一篇：生物制品學實驗報告----三價副豬嗜血桿菌油乳劑滅活疫苗的制備及檢驗（小編推薦）

三價副豬嗜血桿菌油乳劑滅活疫苗的制備及檢驗

副豬嗜血桿菌是豬格拉澤氏病(Glasser’s disease)的病原菌，屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬，是一種多形態(tài)、非溶血性、不運動、NAD 依賴型、革蘭氏陰性細小桿菌。對營養(yǎng)要求比較苛刻，培養(yǎng)時必須供給含有V 因子（NAD）或（NADP)的新鮮血液才能生長。此菌有多種血清型，其中強毒力的有1、5、10、12、13、14型，?？芍滤绖游铮恢械榷玖Φ挠?、4、8、15型，多表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎，不致死；低毒力的有3、6、7、9、11型，常無臨床表現(xiàn)和病變。在中國，4型和5型是主要分離株，而澳大利亞和丹麥的主要血清型為5型和13型。在研究2、4、5、12、13和14型間的交叉保護性時發(fā)現(xiàn)，除了血清12型制備的單菌和血清2、12型制備的二價苗外，其他型都能對同源菌株產(chǎn)生保護；用血清4型制備的菌苗，可以保護血清5型的攻擊；用血清4、5型制備的二價菌苗，可以抵抗血清13、14型的攻擊（仔豬病變的嚴重性和病死率明顯降低）。三價滅活疫苗主要用于預防豬副嗜血桿菌病。該苗針對性強，安全可靠，能有效降低發(fā)病率和死亡率。一、實驗目的 了解副豬嗜血桿菌油乳劑滅活苗制作的流程。2 掌握副豬嗜血桿菌油乳劑滅活苗制作的操作技術(shù)。

二、乳化的原理

乳化劑能降低分散物的表面張力，在微滴（粒）表面形成薄膜或雙片層，以阻止微滴（粒）的相互凝結(jié)。

三、材料，試劑，培養(yǎng)基

（1）器材：不銹鋼鍋（或瓷鍋）、電爐、乳化器、量筒、玻璃棒、離心機、吸管等。

（2）試劑：、甲醛（滅活劑）、白油（抗原油相）、Span-80（油相乳化劑）、Tween-80（抗原水相乳化劑）、硬脂酸鋁（穩(wěn)定劑）、4、5、13型分離菌株（抗原）。（3）培養(yǎng)基的制備：

1、配制0.2%的V因子

準確稱0.2g的NAD（輔酶I）加入100mlddH2O，用0.22um的細菌過濾器過濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

2、制備TSA培養(yǎng)基

稱16gTSA加入348ml雙蒸水，121°C高壓滅菌20min，當溫度到50°C左右時（放入50°C水浴鍋）加入0.2%的V因子，使V因子濃度達100ug/ml，然后加入32ml的滅活新生牛血清

100ml----4g TSA-----5ml V因子-------8ml血清

3、TSB培養(yǎng)基

稱3gTSB于87 ml雙蒸水中溶解。121°C高壓滅菌15min，冷卻至50°C左右，加入已配制的0.2%的V因子5ml，再加入滅活的新生小牛血清8ml，使血清濃度達0.8% 100ml-------3g TSB----5ml V因子----8ml血清

四、實驗內(nèi)容

（1）菌株菌液制備及培養(yǎng)繁殖 將副豬嗜血桿菌三株菌種按分別劃線接種于TSA固體培養(yǎng)基平板上，37°C恒溫培養(yǎng)18-24h，挑取單個菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12-16 h后，再將此菌液按l%的比例加入新配制的TSB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h后，按平板菌落計數(shù)法計數(shù)。培養(yǎng)24h后，收集菌液，用分光光度計法測定細菌總菌含量。經(jīng)檢驗合格者作為制苗抗原。（2）制苗抗原的濃縮和細菌的滅活

將純檢合格的制苗抗原培養(yǎng)物以超濾器濃縮，作為制苗用濃縮抗原。然后按TSB液體培養(yǎng)基總體積加入終濃度為0.2%的甲醛（先10倍稀釋），充分搖勻后，37°C溫箱中滅活14h或分別在4、8、12、16、20h和24h取滅活菌液于TSA固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，置普通恒溫箱中37℃培養(yǎng)48h，觀察細菌滅活效果。37°C滅活14h可達到較好的效果。（3）制苗用水相的制備

根據(jù)培養(yǎng)24h后的分光光度計法或麥氏比濁管測定的總菌數(shù)結(jié)果，參照培養(yǎng)12-16h的平板菌落計數(shù)法計數(shù)結(jié)果。取滅活的三種血清型按照一定的比例（等量）混合抗原液96份，然后過濾, 除去沉渣及雜物, 加入4份即終濃度為4%滅菌的Tween-80(96∶4)充分混勻, 邊加邊攪拌，使其充分融化（可加熱助溶，溫度低于37℃）, 作為制苗用水相，水相要搖勻，讓吐溫-80充分溶解。（4）制苗用油相的制備

取10號白油93份（先加一部分，后補足）置于不銹鋼鍋中緩慢加熱后，加入硬脂酸鋁1份，邊加邊攪拌，直到透明為止，再緩慢加入6份Span-80(司本-80)，充分混勻，121℃高壓蒸汽滅菌3Omin，冷卻至室溫備用?；蛘甙幢壤龑⒐I(yè)白油94份置于不銹鋼鍋（或瓷鍋）中加熱后，緩慢加入6份 Span-80，混合后按總量加入2%硬脂酸鋁，溶化后，繼續(xù)升溫至160℃，維持10min，待冷卻后即可制苗。切勿用少量的白油與硬脂酸鋁混合后邊煮邊攪拌，那樣很容易燒焦冒煙。（5）疫苗的制備（乳化工藝）

按油相與水相2：1（v/v）混合乳化。即1份水相配2份油相在高速攪拌器中攪拌。先將處理好的油相2份置于高速攪拌器中，低速攪動油相，同時緩慢加入水相l(xiāng)份(油∶水= 2∶1)，乳化時膠體磨轉(zhuǎn)速由慢變快，最后以8，000一10，OO0r/mln高速乳化2一5min，使水油充分乳化。乳劑混勻，分裝于滅菌疫苗瓶中。在乳化過程中亦可根據(jù)乳劑黏稠度適當調(diào)整油、水相比。制成乳白色的W/O型油乳佐劑疫苗。

（6）油乳劑檢驗：油乳劑檢驗項目包括乳劑類型檢查、黏度測定、穩(wěn)定性測定、粒度大小及分布檢測等，生產(chǎn)實際中以黏度測定與穩(wěn)定性測定為主。在每批苗分裝過程的前、中、后各抽樣2瓶供物理性狀檢驗及安全檢驗。無菌檢驗： 將制備好的滅活油乳苗分別接種于普通肉湯培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基中 , 于37 ℃溫箱中培養(yǎng)10 d, 觀察有無細菌生長。均應(yīng)無菌生長方合格。物理性狀檢驗 : 觀察疫苗顏色：眼觀應(yīng)為均勻一致的乳白色黏稠乳劑。穩(wěn)定性檢測 ：1）離心加速法，將疫苗置于 10m l 離心管內(nèi), 3 000 r/min離心15min水油不分層，可保存1年以上不破乳。2）加速老化法，疫苗于37℃儲存10-30d不破乳，說明其穩(wěn)定性良好。黏度檢驗：最簡易的方法是在室溫條件下用吸管吸取1ml乳劑, 然后垂直放出, 記錄放出0.4ml所需時間。垂直放出0.4ml所需要的時間作為黏度單位，以0.4ml 2-6s為合格，說明黏度適中, 適合于注射應(yīng)用，不得多余10-15s。

5劑型檢測：將疫苗數(shù)滴滴于冷水表面, 觀察油滴擴散情況，即觀察疫苗滴于水中是否呈油滴狀且不分散。滴于水中油滴呈規(guī)則的圓形, 未見擴散現(xiàn)象, 說明疫苗為油包水劑型。

6安全檢驗：對最小使用日齡靶動物一次單劑量接種的安全性滅活疫苗接種途徑只有一種，就是肌肉注射。每批三價滅活苗隨機取樣3瓶,等量混合后接種兔2只,每只肌肉注射2mL；接種14日齡哺乳仔豬，每組5頭，每頭豬接種2ml，另設(shè)5頭豬作為陰性對照，于耳后肌肉注射5-10 mL, 觀察仔豬的臨床表現(xiàn)，并每日測定體溫，持續(xù)2周。

五、小結(jié)

（1）副豬嗜血桿菌對營養(yǎng)要求比較苛刻，培養(yǎng)時必須供給含有V 因子（NAD）或（NADP)的新鮮血液才能生長。且具有非常多的血清型，純化非常困難。故對菌的純化及滅活和疫苗的安全性試驗是生產(chǎn)滅活苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于副豬嗜血桿菌，在菌液制備的過程中容易生長雜菌，我們純化了很多次菌，液體仍然很渾濁，使得實驗進展延后。（2）注意事項： 細菌滅活過程中，甲醛濃度越高，堿性溶液中的抗原性損失就越大。故甲醛要注意適量 2 制備油相時，要使Span-80和硬脂酸鋁充分溶解。3 制備水相時，抗原與Tween-80充分混勻。乳化時，油相必須冷卻后方可與水相混和乳化，以防油溫過高使抗原性降低。5 注意先加入油相后再加入水相，充分攪拌。6 疫苗在4℃、暗處保存，切勿冰凍。7 一定要做好安全檢驗