第一篇：環(huán)境水體中腸的道感染菌群與幾種典型致病菌的QPCR檢測及相關(guān)性分析

環(huán)境水體中腸道感染菌群與幾種典型致病菌的QPCR檢

測及相關(guān)性分析

第 卷 第 期 生 態(tài) 科 學(xué) :.年 月

張愛寧,劉麗,史艷丹,劉永軍.環(huán)境水體中腸道感染菌群與幾種典型致病菌的 檢測及相關(guān)性分析.生態(tài)科學(xué)，:.?， ,.., , :.環(huán)境水體中腸道感染菌群與幾種典型致病菌的 檢測及相關(guān) 性分析

張愛寧,劉 麗,史艷丹,劉永軍

西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,教育部西北水資源生態(tài)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安

【摘要】利用定量 方法,對環(huán)境水體中的腸道感染菌群及幾種致病菌進(jìn)行 個(gè)月的連續(xù)檢測。結(jié)果表明:在污染

嚴(yán)重的水體中,埃希氏大腸菌 是水中腸道感染菌群的主體,其強(qiáng)度接近于用通用引物檢測出的腸道感染菌群強(qiáng)度。

當(dāng)腸道感染菌群拷貝數(shù)超過 時(shí),沙門氏菌 和志賀氏痢疾桿菌 也持續(xù)被 檢出,可以認(rèn)為是水體病原污染的標(biāo)志之一:在輕度污染和清潔水體中,當(dāng)腸道感染菌群拷貝數(shù)低于時(shí),通

過通用引物檢測到的腸道感染菌群主要是上述 種病原細(xì)菌以外的細(xì)菌,且 種病原細(xì)菌的出現(xiàn)頻度和強(qiáng)度與腸道感染菌群之 間沒有明顯的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞:地表水;腸道感染菌群;病原細(xì)菌;定量;相關(guān)性:./......中圖分類號:.文獻(xiàn)標(biāo)識碼: 文章編號: ?.?.，.,‘ :.,.,..。~..,‘ 一,..: ，,收稿日期:?.收稿, ? 接受

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 ,陜西省教育廳項(xiàng)目 ,陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目作者簡介:張愛寧 ?,女,學(xué)士,工程師,研究方向?yàn)槲廴经h(huán)境的分析與評價(jià).?通訊作者,劉永軍 一 ,博士,教授,研究方向:環(huán)境生物技術(shù)與應(yīng)用.: 期 張愛寧,等:環(huán)境水體中腸道感染菌群與幾種典型致病菌的 檢測及相關(guān)性分析引言 下游: ’..’;痢疾桿菌

上游: 由于水環(huán)境污染而引起的病原體感染仍是當(dāng)今 一

世界上危害范圍最廣的環(huán)境問題,全世界每年由于腸 ’,下游: ’..’;道感染引起痢疾的病例多達(dá) 億人次,死亡人數(shù)多 傷寒沙門氏菌【’上游: ’.達(dá)萬人,成為全球疾病之首【。由此,水域性病.’,下游: ’..’:大腸桿菌 ,上游: 原菌的常規(guī)監(jiān)測,對于公共健康來說是非常重要的。

據(jù)統(tǒng)計(jì),在中國發(fā)生的腸道傳染病主要有 種, ’..’,下游: ’..’。包括甲類傳染病中的霍亂,乙類傳染病中的傷寒、細(xì) 菌性痢疾、阿米巴痢疾和甲、戊型病毒性肝炎,丙類

傳染病中的除霍亂、痢疾、傷寒、副傷寒以外的感染.品處理 性腹瀉病,年平均發(fā)病率為每 萬人有.例, % 標(biāo)準(zhǔn)菌株:本研究所用的沙門氏菌

以上的腸道傳染病是細(xì)菌性痢疾。其次是甲肝和傷寒,標(biāo)準(zhǔn)菌株購自美國菌種保藏中心,痢疾

霍亂一直處于散發(fā)流行狀態(tài)。近年來,其它感染性腹 桿菌 和大腸桿菌 購白 瀉病發(fā)病率有上升趨勢【】。然而這些病原細(xì)菌潛在的 陜西省微生物研究所,細(xì)菌培養(yǎng)用 肉湯培養(yǎng)基致病風(fēng)險(xiǎn),沒有列入常規(guī)水質(zhì)評價(jià)指標(biāo)之內(nèi)。水中 蛋白胨, , 酵母膏 在。下

對于水體中病原菌的檢測主要基于選擇性培養(yǎng) 培養(yǎng)后,離心.收集菌體。和標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)方法,但這些方法存在一系列的缺 細(xì)菌的提取:菌株培養(yǎng)液.或

陷【。人們開始研究分子生物學(xué)方法的可行性,以求 地表水樣用滅菌離心管離心., 縮短檢測和報(bào)告時(shí)間【。其中之一就是定量聚合酶鏈 后,棄去上清液:沉淀物加入 的裂解緩沖液

式反應(yīng) 方法研究【,用這一方法可使從測樣.~ ,.,.乙酸鈉, 到出結(jié)果的時(shí)間縮短到幾個(gè)小時(shí)圳。本研究利用包括., ,反復(fù)吹打使之重懸,加入

痢疾桿菌,沙門氏菌 ?.混勻,.離心后

將上清轉(zhuǎn)入一只新管中,加入等體積的酚:氯仿:異戊醇 和大腸桿菌 類腸道病原細(xì)菌在

內(nèi)的腸道感染細(xì)菌通用引物【 同時(shí)利用上述幾種病: : 體積比 ,混勻,離心., 原細(xì)菌的特異性引物,通過定量方法檢測西安市;取上清后,加入.倍體積的異丙醇后離心;不同地表水體中多種病原菌的分布情況,為進(jìn)一步對 沉淀用 的%乙醇洗滌,離心棄乙醇。

水體進(jìn)行全面的病原性污染風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)奠定基礎(chǔ)。標(biāo)準(zhǔn)曲線:用 固體培養(yǎng)基經(jīng)平板計(jì)數(shù), 測得培養(yǎng)液中細(xì)菌的濃度。用上述苯酚.氯仿法提取 材料和方法細(xì)菌總,將總 倍梯度稀釋,以此為 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的摸板,每個(gè)稀釋梯度平行 組,.取樣地點(diǎn) 利用梯度稀釋的細(xì)菌提取物 檢測的 值

選取西安市區(qū)潔凈水體 水源水、輕度污染水 與相應(yīng)的細(xì)菌細(xì)胞密度對數(shù)值的離散與回歸分析繪

制標(biāo)準(zhǔn)曲線。腸道感染菌群 檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線 體 景觀水 和嚴(yán)重污染水體 納污水體和污水處理

廠出水 為研究對象。從 年 月~ 年 月,每 以大腸桿菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線代替。

個(gè)月的、、日分別從黑河、北湖、興慶湖、’產(chǎn) 河和北石橋污水處理廠采集水樣。采樣位點(diǎn)為水深.分析

/ 處。同時(shí)記錄每個(gè)被調(diào)查水樣的其它輔助資料, 在 體系中加入熒光試劑 ,利

包括、溫度、濁度、游人密度以及船只等。用熒光信號實(shí)時(shí)檢 進(jìn)程。熒光試劑盒購于天根

生化科技公司北京。反應(yīng)體系總體積,.引物合成

內(nèi)含× / ,上下游引物 腸道感染菌群通用引物】,上游: 分別為.? ~,模板。將反應(yīng)管放入定 / 一 ’, 量儀 美國.。擴(kuò)增條件:生 態(tài) 科 學(xué) 卷

表 地表水體中腸道感染細(xì)菌群與幾種病原細(xì)菌的檢出強(qiáng)度 ℃預(yù)變性, ℃, ℃, ℃ , 感染菌群的強(qiáng)度,平均檢出值為 ~.℃,共 個(gè)循環(huán)。每隔.讀數(shù)一次,閾值設(shè) ~;痢疾桿菌和沙門氏菌的平均檢出值

分 別 為和~ 定為最初的 ~ 個(gè)循環(huán)熒光值標(biāo)準(zhǔn)偏差的 倍。

用于水體病原細(xì)菌檢測的樣品平行 組,環(huán)境水一。種致病菌的總強(qiáng)度接近于腸道感染

樣中目標(biāo)細(xì)菌強(qiáng)度的確定是通過已知細(xì)胞模板拷貝 菌群強(qiáng)度。說明污染嚴(yán)重的水體中,病原細(xì)菌主要為

數(shù) 的病原細(xì)菌 標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷出的相 上述 種病原細(xì)菌。對數(shù)量。檢出頻率以陽性率來表示,是陽性樣本數(shù)與

總樣本數(shù)的比值。.地表水體中不同病原細(xì)菌檢出強(qiáng)度分布

圖 所示為不同地表水體中腸道感染菌群與結(jié)果與討論種病原細(xì)菌檢出強(qiáng)度的分布情況。在污染嚴(yán)重的水體 中 圖 , ,腸道感染菌群的檢出強(qiáng)度在

.地表水體中腸道感染菌群及病原細(xì)菌強(qiáng)度檢測 之間,大腸桿菌從各種水體檢出的強(qiáng)

度最高,分布在之間,沙門

對西安市潔凈水體、輕度污染水體和嚴(yán)重污染水

體共 個(gè)地表水體中腸道感染菌群和 種病原細(xì)菌利 氏菌和痢疾桿菌也持續(xù)被檢出,檢出強(qiáng)度分布在

用 法進(jìn)行連續(xù) 個(gè)月的檢測,檢測結(jié)果如表 之間, 種病原菌的總強(qiáng)度接 所示,每個(gè)水體的檢測樣本數(shù)分別為。近于用通用引物檢測出的腸道感染菌群強(qiáng)度。所以, 在潔凈水體中 黑河,腸道感染菌群的平均檢 對于污染嚴(yán)重的水體,大腸菌是水中腸道感染菌群的

測值為 ~,大腸桿菌,痢疾桿菌和 主體,沙門氏菌和痢疾桿菌強(qiáng)度盡管遠(yuǎn)低于大腸菌。

沙門氏菌的平均檢測值分別為.、在輕度污染水體 圖 ,和清潔水體中 圖

。和.~。該水體為西,腸道感染菌群的檢出強(qiáng)度在 ~ 安市飲用水源水,受到良好的保護(hù),水體沒有受到病 之間, 種病原細(xì)菌的強(qiáng)度都分布在

原體污染。左右,且不能連續(xù)檢出, 種病原

在輕度污染水體中 北湖、興慶湖 ,腸道感染 菌的總強(qiáng)度遠(yuǎn)低于用通用引物檢測出的腸道感染菌 菌群的平均檢出值為.~.× ~, 群強(qiáng)度。說明在輕度污染水體和清潔水體中,當(dāng)總的

大腸桿菌、痢疾桿菌和沙門氏菌的平均檢出值分別為 腸道感染菌群濃度低于 時(shí),通過

.~ ~、.~ 和 ~ 通用引物檢測到的腸道感染菌群主要是大腸桿菌、沙 門氏菌、痢疾桿菌以外的細(xì)菌。~。種致病菌的總和遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于腸道感染 菌群,說明在潔凈水體和輕度污染水體中,通過通用.腸道感染茵群與不同病原細(xì)菌檢測結(jié)果的離散 引物檢出的細(xì)菌絕大多數(shù)為 種致病菌以外的細(xì)菌。在嚴(yán)重污染水體中 污水廠出水、、產(chǎn)河 ,腸道 與回歸分析 圖 表示所有地表水樣申用 方法所測得 感 染 菌 群 的平均 檢 出值 為..×’ 的腸道感染菌群強(qiáng)度與不同病原細(xì)菌強(qiáng)度離散圖形.~,埃希氏大腸菌濃度很高,接近于腸道辟掣區(qū)

期 張愛寧,等:環(huán)境水體中腸道感染菌群與幾種典型致病菌的 檢測及相關(guān)性分析

一 ∞

∞ 鯽 ∞ 舯 ∞ 一邑 崔 崔 ‘罰 ’吾 昌..●

拷貝數(shù)對數(shù)值 拷貝數(shù)對數(shù)值 董 邑 皇薈 蠱 毫

●大腸桿菌.●沙門氏菌

●志賀氏菌注:.污水廠出水,.產(chǎn)河, 北湖,.興慶湖, 一黑河.:●病原菌群 ,? ， ?..拷貝數(shù)對數(shù)值不同地表水體中病原微生物檢出濃度分.能完全一一對應(yīng)七,目前還不能達(dá)到代替?zhèn)鹘y(tǒng)病原 及回歸分析結(jié)果。

污染指標(biāo)的地步,如果要用 方法對地表水體 在對 個(gè)地表水體監(jiān)測的 周內(nèi),腸道感染菌

群與大腸桿菌檢測值的秩相關(guān)系數(shù)為.,與 進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià),還需要進(jìn)一步收集 檢測

沙門氏菌的秩相關(guān)系數(shù)為.,與痢疾桿菌的秩 結(jié)果以及相關(guān)的衛(wèi)生學(xué)數(shù)據(jù)。

相關(guān)系數(shù)為.。腸道感染菌群與大腸桿菌之間

有較強(qiáng)的相關(guān)性,說明西安市地表水體中的腸道感染 結(jié)論 細(xì)菌主要是大腸菌群。這與傳統(tǒng)方法用大腸菌群來指

示水體病原菌污染狀況相一致。但是由于所建立的腸 大腸桿菌從各種水體檢出的頻度最高,在

道感染菌群通用引物 方法除了能檢測水體中 水體受到一定污染后即持續(xù)檢出。污染嚴(yán)重的水體, 存在的大腸菌群以外,還可以同時(shí)檢測到水體中痢疾 大腸桿菌是腸道感染菌群的主體,其強(qiáng)度接近于腸道

桿菌和沙門氏菌,和傳統(tǒng)方法相比,更能反映水體的 感染菌群檢出強(qiáng)度,二者的秩相關(guān)系數(shù)為.;真實(shí)污染狀況。加之 方法具有高敏感性以及在地表水體中,當(dāng)腸道感染菌群 檢

檢測時(shí)間短 在 之內(nèi)能夠完成檢測 等優(yōu)勢, 出值超過 時(shí),沙門氏菌和痢疾桿

所以在地表水體病原體污染監(jiān)測中, 方法檢測 菌也持續(xù)被檢出,雖然其強(qiáng)度遠(yuǎn)低于大腸桿菌,但這 結(jié)果極有可能與傳統(tǒng)的大腸菌群檢測結(jié)果一道,成為 些病原菌存在的可能性變得非常高,可以認(rèn)為是水體 水體病原污染風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的指標(biāo)。但由于兩種方法并不 病原污染的標(biāo)志之一: