第一篇：C46500黃銅抗脫鋅生產(chǎn)

C46500黃銅抗脫鋅生產(chǎn)

黃銅在我國(guó)的歷史已經(jīng)非常悠久，隨著現(xiàn)在新材料的廣泛興起，對(duì)于黃銅的抗脫鋅等性能的要求也越來越高，各個(gè)企業(yè)也在加速對(duì)黃銅新型合金材料-C46500的研發(fā)，目前由于工藝的不穩(wěn)定，很多廠家還存在一些技術(shù)工藝上的細(xì)節(jié)把控不足，導(dǎo)致生產(chǎn)不穩(wěn)定，成本浪費(fèi)嚴(yán)重。以下的幾點(diǎn)是我個(gè)人在生產(chǎn)和前期開發(fā)的一些經(jīng)驗(yàn)，希望可以對(duì)廣大銅加工企業(yè)有所幫助！

1、黃銅脫鋅腐蝕的特征

黃銅脫鋅是選擇性腐蝕,即合金中活性較強(qiáng)組元的選擇性溶解,組元可以是單相固溶體合金中的一種元素,也可以是多相合金中的某一相。選擇性腐蝕發(fā)生在二元或多元合金中,其中電極電位較負(fù)的組元或相優(yōu)先溶解,如黃銅脫鋅。黃銅脫鋅腐蝕的發(fā)生與Cu-Zn合金中的鋅含量有關(guān),當(dāng)鋅含量低于15%時(shí),一般不產(chǎn)生脫鋅腐蝕,但合金的抗沖蝕性能差,增加鋅含量有利于提高合金的強(qiáng)度和抗沖蝕性能,但發(fā)生脫鋅腐蝕的傾向增加。當(dāng)黃銅的含鋅量大于20%時(shí),在水溶液中鋅元素易優(yōu)先溶解,而留下多孔的銅,這種腐蝕是黃銅冷凝管主要的破壞形式,其結(jié)果使黃銅的強(qiáng)度降低,大大縮短冷凝管的使用壽命。黃銅脫鋅腐蝕主要呈現(xiàn)兩種形態(tài):一種是均勻的層狀脫鋅,多發(fā)生于含鋅量較高的黃銅,且總在酸性介質(zhì)中;另一種是塞狀脫鋅,多發(fā)生于含鋅量較低的黃銅,且在一些微酸性、中性或堿性介質(zhì)中用作海水熱交換器的黃銅經(jīng)常出現(xiàn)這類脫鋅。影響黃銅脫鋅腐蝕的因素主要有合金組織結(jié)構(gòu)和外部環(huán)境。從相組成看,含鋅量大于20%的單相A黃銅,脫鋅后留下多孔的銅;而A+B雙相黃銅的脫鋅,首先是從B相開始的,B相完全轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷傻你~后,再擴(kuò)展到A相;含鋅量更高的E相或C相黃銅,由于脫鋅會(huì)發(fā)生EvCvBvA相轉(zhuǎn)變,轉(zhuǎn)變的程度依據(jù)脫鋅時(shí)間、介質(zhì)和外加電位等外部條件的變化而改變;同時(shí)也發(fā)現(xiàn)黃銅中含鋅量越高,越容易產(chǎn)生脫鋅的現(xiàn)象。黃銅的脫鋅不僅能在中性的海水、河水、工業(yè)水中發(fā)生,也能在酸性較強(qiáng)的介質(zhì)及堿性介質(zhì)中發(fā)生,溶液的pH值對(duì)黃銅的脫鋅影響不大。黃銅在各種鹽類如CuC12,CuSO4,(NH4)2SO4,NaC1的溶液中也能發(fā)生脫鋅,就形貌特征看,含鋅量較高的黃銅在酸性介質(zhì)中易產(chǎn)生層狀脫鋅;含鋅量較低的黃在中性、堿性介質(zhì)中易發(fā)生塞狀脫鋅,隨介質(zhì)溫度的升高,黃銅的脫鋅速度加快。過電位也影響黃銅的脫鋅過程和脫鋅產(chǎn)物,如E相黃銅在低電位下,由于脫鋅會(huì)發(fā)生EvC相轉(zhuǎn)變,而在高電位下,E相黃銅會(huì)直接變成疏松的銅或富銅的A相。此外,脫鋅速率也會(huì)受到冷加工變形的影響,不同種類的黃銅,其脫鋅速率受冷加工變形影響的程度有所不同。

2、防止黃銅脫鋅腐蝕的措施

防止黃銅脫鋅腐蝕主要是從冶金方面入手,其次也可從改善環(huán)境方面考慮。改善腐蝕環(huán)境如采用陰極保護(hù)、降低介質(zhì)浸蝕性、添加緩蝕劑等,雖然是防止黃銅脫鋅較好的措施,但由于受工況條件的限制,并不能完全抑制黃銅的脫鋅。只有通過冶金化方法提高黃銅自身的抗脫鋅能力,才能從根本上杜絕黃銅脫鋅腐蝕的發(fā)生。如采用鋅含量較低的紅黃銅(Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%),這類合金幾乎不產(chǎn)生脫鋅,但卻不耐沖蝕;或在黃銅中加入砷、硼、銻、磷、錫、鋁、稀土等合金元素,這些元素都能在不同程度上防止A黃銅的脫鋅,但對(duì)A+B雙相黃銅的抑制效果不大,在這些元素中尤以加As,B的效果最佳,稀土元素也有較好地抑制脫鋅腐蝕的效果，（詳細(xì)生產(chǎn)指導(dǎo)QQ859284413），對(duì)于生產(chǎn)中如何加入，加入量；加入時(shí)間等等方面都需要給予明確。

3、黃銅脫鋅腐蝕的機(jī)理

對(duì)黃銅脫鋅腐蝕的機(jī)理,國(guó)內(nèi)外都做了一些研究,提出了各種研究結(jié)論,但目前還不十分完善,主要理論有優(yōu)先溶解和溶解-再沉積機(jī)制、雙空位機(jī)制和滲流機(jī)制 [1-2]。2.1 優(yōu)先溶解和溶解一再沉積機(jī)制 優(yōu)先溶解機(jī)制認(rèn)為,黃銅腐蝕過程中,合金表面的鋅從黃銅中優(yōu)先溶解,然后合金內(nèi)部的鋅通過空位擴(kuò)散繼續(xù)溶解,電位較正的銅被遺留下來,呈疏松狀的銅層。但這種理論難以說明脫鋅造成的脆性開裂深度與鋅在室溫下擴(kuò)散系數(shù)太低之間的矛盾。LANGENEGGER認(rèn)為[2] 在黃銅表面與溶液接觸處發(fā)生了鋅選擇性溶解,被腐蝕的鋅由合金晶格上鋅原子的擴(kuò)散所補(bǔ)償,鋅在活性脫鋅前沿被選擇性侵蝕,這個(gè)前沿不斷地向內(nèi)部移動(dòng)。按照作者的觀點(diǎn),脫鋅相只是在初始黃銅母體的骨架結(jié)構(gòu)中出現(xiàn),它容許鋅離子自由向外擴(kuò)散,黃銅的脫鋅阻力依賴于鋅外層電子離開鋅原子的難易程度。溶解-再沉積機(jī)制認(rèn)為,黃銅表面上的鋅和銅一起溶解,鋅留在溶液中而銅在靠近溶解處的表面上迅速析出從而重新沉積在基體上,但這種機(jī)制無法圓滿地解釋銅不可能溶解時(shí)的脫鋅現(xiàn)象。因?yàn)殇\溶解的電位遠(yuǎn)低于銅的陽極溶解電位,銅和鋅的同時(shí)溶解不可能在任何情況下都能發(fā)生。PURSHPA在硫酸中進(jìn)行了研究,認(rèn)為最初階段由于建立了(Cu-Zn)原電池,鋅在溶液中優(yōu)先溶解,但當(dāng)多孔的銅-氧化銅膜在電極表面形成時(shí),脫鋅速度下降,銅、鋅同時(shí)溶解。這時(shí)鋅的溶解速度受鋅從樣品內(nèi)部通過晶格空位的擴(kuò)散速度所控制,在這個(gè)階段銅的溶解速度也由于CuO膜的形成而減少,這是因?yàn)镃uO膜提供了暫時(shí)的、不連續(xù)的表面保護(hù)在腐蝕過程中,以上兩種脫鋅機(jī)理哪一個(gè)處于決定性地位取決于腐蝕條件,比如在稀鹽酸中會(huì)發(fā)生鋅的選擇性溶解,而在濃度較高的鹽酸或海水中則發(fā)生銅重新析出的脫鋅腐蝕,另外,脫鋅機(jī)制還受到溶解溫度、浸泡周期長(zhǎng)短的影響。銅和鋅是否同時(shí)溶解,可以將它們的電位-pH圖重疊后預(yù)測(cè)

4、成分: C46500加錫抗脫鋅黃銅

標(biāo)準(zhǔn)：ASTM B432-1991(1992、1993年版)●化學(xué)成分： 銅 Cu：59.0~62.0 鉛 Pb：≤0.20 鐵 Fe：≤0.10 錫 Sn：0.50~1.0 鋅 Zn：余量 砷 As：0.02~0.10

中間還需要加入多種小金屬、溫度控制和輔助材料生產(chǎn)！

第二篇：出口危險(xiǎn)貨物生產(chǎn)企業(yè)聲明磷化鋅

出口危險(xiǎn)貨物生產(chǎn)企業(yè)聲明

本企業(yè)出口的化工產(chǎn)品磷化鋅共400件，經(jīng)海運(yùn)出口至緬甸金額為：USD41000.00該批危險(xiǎn)貨物已嚴(yán)格按《國(guó)際海運(yùn)危險(xiǎn)貨物規(guī)則》、SN /T 0370.3《出口危險(xiǎn)貨物包裝檢驗(yàn)規(guī)程第進(jìn)行包裝,經(jīng)自我鑒定合格，完全符合運(yùn)危險(xiǎn)貨物規(guī)則》、SN /T 0370.3《出口危險(xiǎn)貨物包裝檢驗(yàn)規(guī)程第上述內(nèi)容真實(shí)無誤，如有虛假，愿承擔(dān)全部責(zé)任。

特此聲明。

法定代表人（簽字）

出口企業(yè)（蓋章）

2013-2-17

第三篇：出口脫水果蔬生產(chǎn)企業(yè)注冊(cè)衛(wèi)生規(guī)范

出口脫水果蔬生產(chǎn)企業(yè)注冊(cè)衛(wèi)生規(guī)范

（2003年9月10日由國(guó)家認(rèn)監(jiān)委國(guó)認(rèn)注［2003］51號(hào)文件公布）

1制定依據(jù)

本規(guī)范根據(jù)《出口食品生產(chǎn)企業(yè)衛(wèi)生要求》制定。

2適用范圍

2.1 本規(guī)范適用于出口脫水蔬菜、脫水果蔬、脫水湯料、脫水調(diào)味料（不包括晾曬品）等食品生產(chǎn)企業(yè)的衛(wèi)生注冊(cè)。

2.2 脫水果蔬是指用各類新鮮蔬菜、新鮮水果為主要原料、配以輔料或其他農(nóng)產(chǎn)品等原料經(jīng)熱風(fēng)干燥、低溫真空冷凍干燥或其它干燥方式加工而成的食品。

3衛(wèi)生質(zhì)量管理體系

3.1 出口脫水果蔬生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)建立保證出口食品衛(wèi)生的質(zhì)量體系，并制定體現(xiàn)和指導(dǎo)質(zhì)量體系運(yùn)轉(zhuǎn)的質(zhì)量體系文件。

3.2 出口脫水果蔬生產(chǎn)企業(yè)的衛(wèi)生質(zhì)量體系應(yīng)當(dāng)包括下列基本內(nèi)容：

3.2.1 衛(wèi)生質(zhì)量方針和目標(biāo)；

3.2.2 組織機(jī)構(gòu)及其職責(zé)；

3.2.3 生產(chǎn)、質(zhì)量管理人員的要求；

3.2.4 環(huán)境衛(wèi)生的要求；

3.2.5 車間及設(shè)施衛(wèi)生的要求；

3.2.6 原料、輔料衛(wèi)生的要求；

3.2.7 生產(chǎn)、加工衛(wèi)生的要求；

3.2.8 包裝、儲(chǔ)存、運(yùn)輸衛(wèi)生的要求；

3.2.9 有毒有害物品的控制；

3.2.10 檢驗(yàn)的要求；

3.2.11 保證衛(wèi)生質(zhì)量體系有效運(yùn)行的要求。

3.3 低溫真空冷凍干燥產(chǎn)品加工企業(yè)必須按照《國(guó)際食品法典委員會(huì)危害分析和關(guān)鍵控制點(diǎn)（HACCP）體系及其應(yīng)用準(zhǔn)則》的要求建立和實(shí)施HACCP體系。

4衛(wèi)生質(zhì)量方針和目標(biāo)

4.1 出口脫水果蔬生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)制定本企業(yè)的衛(wèi)生質(zhì)量方針、目標(biāo)和責(zé)任制度，并貫徹執(zhí)行。

4.2 企業(yè)最高管理者應(yīng)確保衛(wèi)生質(zhì)量方針、目標(biāo)和責(zé)任制度的有效實(shí)施。

4.3 生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立保持文件化的質(zhì)量體系，確保出口脫水食品的生產(chǎn)符合本規(guī)范的要求。5組織機(jī)構(gòu)及其職責(zé)

5.1 出口脫水果蔬生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)建立與生產(chǎn)相適應(yīng)的、能夠保證其產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量的組織機(jī)構(gòu)，并規(guī)定其職責(zé)和權(quán)限。

5.2 出口脫水果蔬生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立一級(jí)（直屬工廠最高領(lǐng)導(dǎo)）品管機(jī)構(gòu)，對(duì)工廠監(jiān)管負(fù)全面管理職責(zé)。

5.3 品管部門有充分權(quán)限以執(zhí)行品質(zhì)管理任務(wù)，其負(fù)責(zé)人有停止生產(chǎn)或出貨的權(quán)力。

5.4 品質(zhì)管理部門應(yīng)有食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)，衛(wèi)生管理機(jī)構(gòu)，作業(yè)現(xiàn)場(chǎng)品質(zhì)人員配置。

5.5 生產(chǎn)負(fù)責(zé)人與品質(zhì)管理負(fù)責(zé)人不得兼任。

5.6 低溫真空冷凍干燥企業(yè)品質(zhì)管理部門應(yīng)設(shè)立HACCP領(lǐng)導(dǎo)小組。，6生產(chǎn)、質(zhì)量管理人員衛(wèi)生的要求

6.1 與食品生產(chǎn)有接觸的人員必須經(jīng)體檢合格后方可上崗。

6.2 生產(chǎn)、質(zhì)量管理人員每年進(jìn)行一次健康檢查，必要時(shí)做臨時(shí)健康檢查；凡患有影響食品衛(wèi)生的疾病者，必須調(diào)離食品生產(chǎn)崗位。

6.3 生產(chǎn)、質(zhì)量管理人員保持個(gè)人清潔，不得將與生產(chǎn)無關(guān)的物品帶入車間；工作時(shí)不得戴首飾、手表，不得化妝；進(jìn)入車間時(shí)洗手、消毒并穿著工作服、帽、鞋，離開車間時(shí)換下工作服、帽、鞋。

6.4 清潔區(qū)、非清潔區(qū)加工人員及檢驗(yàn)人員工作服、帽應(yīng)用不同顏色加以區(qū)分，集中管理，統(tǒng)一清洗、消毒、發(fā)放。

6.5 清潔區(qū)加工人員還應(yīng)戴口罩和發(fā)罩。

6.6 生產(chǎn)、質(zhì)量管理人員應(yīng)當(dāng)定期接受加工衛(wèi)生、衛(wèi)生質(zhì)量體系等內(nèi)容的培訓(xùn)，并經(jīng)過考核合格后上崗。

6.7 配備足夠數(shù)量的、具備相應(yīng)資格的專業(yè)人員從事衛(wèi)生質(zhì)量管理工作和實(shí)驗(yàn)室技術(shù)檢測(cè)工作。7環(huán)境衛(wèi)生的要求

7.1 出口脫水果蔬生產(chǎn)企業(yè)不得建在有礙食品衛(wèi)生的區(qū)域，廠區(qū)外周圍環(huán)境應(yīng)清潔衛(wèi)生，無物理、化學(xué)、生物等污染源，空氣、地表和地下水潔凈無污染。

7.2 廠區(qū)內(nèi)不得兼營(yíng)、生產(chǎn)、存放有礙食品衛(wèi)生的其他產(chǎn)品。

7.3 廠區(qū)路面平整、無積水，廠區(qū)無易起灰塵的地面。主要通道硬化，非通道地面適當(dāng)綠化。

7.4 廠區(qū)衛(wèi)生間有沖水、洗手、防蠅、防蟲、防鼠設(shè)施，墻裙以淺色、平滑、不透水、無毒、耐腐蝕的材料修建，并保持清潔。

7.5 生產(chǎn)中產(chǎn)生的廢水、廢料的排放或者處理符合國(guó)家有關(guān)規(guī)定。

7.6 廠區(qū)建有與生產(chǎn)能力相適應(yīng)的符合衛(wèi)生要求的原料、輔料、化學(xué)物品、包裝物料儲(chǔ)存等輔助設(shè)施和廢物、垃圾暫存設(shè)施。

7.7 根據(jù)工藝要求需設(shè)立原料前處理場(chǎng)所的，不得對(duì)廠區(qū)環(huán)境造成污染。

7.8 生產(chǎn)區(qū)與生活區(qū)隔離。鍋爐房應(yīng)設(shè)在下風(fēng)向位置。

8車間及設(shè)施衛(wèi)生的要求

8.1 車間面積與生產(chǎn)能力相適應(yīng)，布局合理，排水暢通，通風(fēng)良好。

8.2 車間地面用防滑、堅(jiān)固、不透水、耐腐蝕的無毒材料修建，平坦、無積水并保持清潔；車間出口及與外界相連的排水、通風(fēng)處安裝防鼠、防蠅、防蟲等設(shè)施。

8.3 車間內(nèi)墻壁、屋頂或者天花板使用無毒、淺色、防水、防霉、不脫落、易于清洗的材料修建，墻角、地角、頂角具有弧度。

8.4 車間窗戶有內(nèi)窗臺(tái)的，內(nèi)窗臺(tái)下斜約45°；車間門窗用淺色、平滑、易清洗、不透水、耐腐蝕的堅(jiān)固材料制作，結(jié)構(gòu)嚴(yán)密。

8.5 按照加工流程，根據(jù)不同的清潔程度，分設(shè)與加工間相連的更衣室，更衣室內(nèi)配備有更衣鏡及與加工人員數(shù)目相適應(yīng)的便鞋架、水鞋架及掛衣帽架等更衣設(shè)施，要避免個(gè)人衣物與工作服形成交叉污染；更衣室設(shè)有更衣柜的，應(yīng)采用不發(fā)霉、不生銹、易清潔的材料制作，并保持干燥；更衣室應(yīng)有消毒措施，清潔衛(wèi)生，通風(fēng)良好，有適當(dāng)照明。

8.6 視需要設(shè)立與更衣室相連接的衛(wèi)生間。衛(wèi)生間有沖水裝置、洗手消毒設(shè)施及換氣裝置，備有洗滌用品和不致交叉污染的干手用品，水龍頭為非手動(dòng)開關(guān)，門窗不直接開向車間，室內(nèi)應(yīng)保持清潔，通風(fēng)良好。衛(wèi)生間外備有拖鞋架和專用拖鞋。

8.7 加工間入口處設(shè)有靴鞋消毒設(shè)施。加工間入口處和加工間內(nèi)適當(dāng)?shù)奈恢迷O(shè)足夠數(shù)量的洗手消毒設(shè)施，備有洗滌用品及消毒液，水龍頭為非手動(dòng)開關(guān)。

8.8 加工間內(nèi)工序布局合理，清潔加工區(qū)、非清潔加工區(qū)之間應(yīng)嚴(yán)格分開，不形成交叉污染。

8.9 加工間內(nèi)操作臺(tái)、工器具、傳送帶（車）、擺料盤用無毒、不生銹、易清洗消毒、堅(jiān)固耐用的材料制作。烘干機(jī)、凍干機(jī)內(nèi)不得有生銹、油漆、網(wǎng)帶脫落破損等有可能污染產(chǎn)品的部件，干燥室內(nèi)壁光滑，不易脫落。

8.10 蒸煮、油炸、煙熏、烘烤加工設(shè)施的上方，應(yīng)設(shè)與之相適應(yīng)的排油煙和通風(fēng)裝置，加工車間天花板不得存有凝結(jié)水。

8.11 易產(chǎn)生粉塵的加工工序應(yīng)相對(duì)隔離，并配備相應(yīng)的除塵設(shè)施。

8.12 挑選包裝間溫度符合產(chǎn)品要求，一般不高于零上20攝氏度；空氣干濕度要符合產(chǎn)品要求；挑選包裝間應(yīng)有良好的空氣殺菌設(shè)施和充足照明設(shè)施。挑選包裝工人必須戴口罩，穿白色軟底鞋；包裝物料進(jìn)口和產(chǎn)品出口等通道設(shè)置必要的防護(hù)設(shè)施，防止倉(cāng)庫(kù)操作工人及其他非清潔區(qū)人員出入包裝間。

8.13 包裝間光線充足。車間內(nèi)位于工作區(qū)域照明設(shè)施的照度不低于220 Lux，包裝間、檢驗(yàn)臺(tái)上方的照度不低于540Lux。車間照明設(shè)施應(yīng)裝有防護(hù)罩。

8.14 烘干機(jī)、凍干機(jī)及有溫度要求的成品庫(kù)應(yīng)安裝溫度顯示和自動(dòng)記錄裝置；各部位溫度必須控制在加工工藝要求的范圍之內(nèi)。

8.15 加熱和制冷設(shè)備的溫度計(jì)、顯示裝置、壓力表須符合要求，并經(jīng)定期校準(zhǔn)。

8.16 在加工間內(nèi)適當(dāng)位置設(shè)工、器具清洗消毒處或消毒間，供有82℃的熱水或消毒劑，使用消毒劑的必須配備相應(yīng)的充足清潔水容器以沖凈工器具上的消毒劑。

8.17 加工過程中相關(guān)工序應(yīng)設(shè)立除磁性金屬物設(shè)施。

9原料、輔料衛(wèi)生的要求

9.1 原料應(yīng)來自經(jīng)檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)備案的種植基地、或者具備農(nóng)藥檢測(cè)合格證明、或者具備產(chǎn)地環(huán)境無污染證明。

9.2 企業(yè)應(yīng)建立完善的農(nóng)殘監(jiān)控體系，確保原料農(nóng)殘符合進(jìn)口國(guó)有關(guān)要求。

9.3 蔬菜、水果、其他植物產(chǎn)品原料必須采用新鮮或冷藏的。成熟適度，風(fēng)味正常，無病蟲害，無腐爛。半成品原料必須來自出口食品衛(wèi)生注冊(cè)、登記企業(yè)。

9.4 輔料應(yīng)當(dāng)符合國(guó)家有關(guān)衛(wèi)生規(guī)定，有生產(chǎn)廠檢驗(yàn)合格證；嚴(yán)禁使用進(jìn)口國(guó)不允許使用的輔料。原料、輔料進(jìn)廠后應(yīng)專庫(kù)存放，經(jīng)過進(jìn)廠驗(yàn)收合格后方準(zhǔn)使用；超過保質(zhì)期的原料、輔料不得用于食品生產(chǎn)。

9.5 加工用水（冰）符合國(guó)家《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》或者其他必要的標(biāo)準(zhǔn)，每年對(duì)水質(zhì)的公共衛(wèi)生防疫衛(wèi)生檢測(cè)不少于兩次，每周一次微生物檢測(cè)，每天一次余氯檢測(cè)。自備水源應(yīng)當(dāng)具備有效的衛(wèi)生保障設(shè)施。

10生產(chǎn)、加工衛(wèi)生的要求

10.1 生產(chǎn)設(shè)備布局合理，并保持清潔和完好。

10.2 應(yīng)確定加工過程的關(guān)鍵工序，制定操作規(guī)程并得到連續(xù)有效的監(jiān)控，對(duì)監(jiān)控失效期間的產(chǎn)品應(yīng)及時(shí)隔離處理，并采取有效的糾偏措施。

10.3 對(duì)加工過程的食品接觸表面如切菜機(jī)、凍干機(jī)、烘干傳送網(wǎng)帶、前加工流水線、操作臺(tái)、工具、容器手推車輛和工人的手、工作服等應(yīng)定時(shí)清洗、沖霜、消毒，并定期做微生物檢測(cè)。

10.4 不便于直接清洗的加熱蒸發(fā)排管、成品冷藏間地面應(yīng)定期維護(hù)和消毒。

10.5 班前班后進(jìn)行衛(wèi)生清潔工作，專人負(fù)責(zé)檢查，并作檢查記錄。

10.6 對(duì)加工過程中產(chǎn)生的不合格品、跌落地面的產(chǎn)品和廢棄物，在固定地點(diǎn)用有明顯標(biāo)志的專用容器分別收集盛裝，并在檢驗(yàn)人員監(jiān)督下及時(shí)處理，其容器和運(yùn)輸工具及時(shí)消毒。

10.7 應(yīng)當(dāng)對(duì)不合格品產(chǎn)生的原因應(yīng)當(dāng)進(jìn)行分析，并及時(shí)采取糾正措施。

10.8 加工間原料入口、廢料出口應(yīng)有防蚊蠅設(shè)施；廢料出口盡可能遠(yuǎn)離原料進(jìn)口，廢料應(yīng)及時(shí)、妥當(dāng)?shù)赝ㄟ^合理渠道處理到廠外；廢料運(yùn)輸車輛不得污染廠區(qū)。

10.9 成品應(yīng)經(jīng)金屬探測(cè)器檢驗(yàn)合格。金屬探測(cè)器應(yīng)定時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。

10.10 挑選包裝間應(yīng)采取適宜的消毒措施。

11包裝、儲(chǔ)存、運(yùn)輸衛(wèi)生的要求

11.1 用于包裝食品的物料符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)并且保持清潔衛(wèi)生，不得含有有毒有害物質(zhì)，不易褪色。11.2 包裝物料間干燥通風(fēng)，內(nèi)、外包裝物料分別存放，不得有污染。

11.3 運(yùn)輸車輛定期消毒，保持干燥、衛(wèi)生、無污染及異味；制冷、保溫車狀態(tài)良好。

11.4 成品專庫(kù)儲(chǔ)存，未經(jīng)包裝的產(chǎn)品不得進(jìn)入成品庫(kù)。

11.5 原料庫(kù)、烘干機(jī)、凍干機(jī)、冷凍間、成品庫(kù)的溫度符合工藝要求，庫(kù)內(nèi)保持清潔，定期消毒，有防霉、防鼠、防蟲設(shè)施。

11.6 庫(kù)內(nèi)成品與墻壁距離至少30厘米，與地面距離至少15厘米，與頂棚距離至少60厘米。垛位之間至少能使工人通過，垛位有管理卡。庫(kù)內(nèi)不得存放有礙衛(wèi)生的物品；同一庫(kù)內(nèi)不得存放可能造成相互污染或者串味的食品。

12有毒有害物品的控制

12.1脫水食品生產(chǎn)企業(yè)要建立有毒有害物品的專用儲(chǔ)存庫(kù)，標(biāo)識(shí)清楚，專人管理。

12.2殺蟲劑及其他化學(xué)藥品的使用必須經(jīng)過批準(zhǔn)，未經(jīng)批準(zhǔn)不得使用。

12.3 嚴(yán)格執(zhí)行有毒有害物品的儲(chǔ)存和使用管理規(guī)定，確保廠區(qū)、車間和化驗(yàn)室使用的洗滌劑、消毒劑、殺蟲劑、燃油、潤(rùn)滑油和化學(xué)試劑等有毒有害物品得到有效控制，避免對(duì)產(chǎn)品、產(chǎn)品接觸表面和包裝物料造成污染。

12.4脫水食品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)列出有毒有害物品清單，建立使用記錄。

13檢驗(yàn)的要求

13.1 企業(yè)有與生產(chǎn)能力相適應(yīng)的內(nèi)設(shè)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)和具備相應(yīng)資格的檢驗(yàn)人員。檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)直接由廠長(zhǎng)領(lǐng)導(dǎo)，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量有否決權(quán)。

13.2 企業(yè)內(nèi)設(shè)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)具備相適應(yīng)的微生物、農(nóng)殘、二氧化硫等檢驗(yàn)工作所需要的標(biāo)準(zhǔn)資料、檢驗(yàn)設(shè)施和儀器設(shè)備，檢驗(yàn)儀器按規(guī)定進(jìn)行計(jì)量檢定，檢驗(yàn)要有檢測(cè)記錄。

13.3 企業(yè)內(nèi)設(shè)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)必須對(duì)原料、輔料、半成品按標(biāo)準(zhǔn)取樣檢驗(yàn)，并出具檢驗(yàn)報(bào)告。

13.4 對(duì)檢驗(yàn)不合格的原料、半成品、成品應(yīng)及時(shí)出具報(bào)告并隔離不合格品，督促指導(dǎo)相應(yīng)管理者在加工過程中及時(shí)采取糾偏措施。

13.5 成品出廠前必須按生產(chǎn)批次進(jìn)行檢驗(yàn)，出具檢驗(yàn)報(bào)告；檢驗(yàn)報(bào)告應(yīng)按規(guī)定程序簽發(fā)及保存。13.6 使用社會(huì)實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)企業(yè)衛(wèi)生質(zhì)量檢驗(yàn)工作的，應(yīng)當(dāng)簽有合同，并且該實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)具有相應(yīng)的資格。

14保證衛(wèi)生質(zhì)量體系有效運(yùn)行的要求

14.1 制定原料、輔料、半成品、成品及生產(chǎn)過程衛(wèi)生控制程序，并有效執(zhí)行，做好記錄。

14.2 建立并執(zhí)行衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)操作程序并做好記錄，確保加工用水（冰）、食品接觸表面、有毒有害物質(zhì)、蟲害防治等處于受控狀態(tài)。

14.3 對(duì)影響食品衛(wèi)生的關(guān)鍵工序，要制訂明確的操作規(guī)程并得到連續(xù)的監(jiān)控，對(duì)關(guān)鍵工序的監(jiān)控必須有記錄。

14.4 制定和執(zhí)行對(duì)不合格品的控制制度，制度包括不合格品的標(biāo)識(shí)、記錄、評(píng)價(jià)、隔離處置和可追溯性等內(nèi)容。

14.5 制定產(chǎn)品標(biāo)識(shí)、質(zhì)量追蹤和產(chǎn)品召回制度，以保證出廠產(chǎn)品在出現(xiàn)安全衛(wèi)生質(zhì)量問題時(shí)能夠及時(shí)召回。

14.6 制定和執(zhí)行加工設(shè)備、設(shè)施的維護(hù)程序，保證加工設(shè)備、設(shè)施滿足生產(chǎn)加工的需要。14.7 制定和實(shí)施職工培訓(xùn)計(jì)劃并做好培訓(xùn)記錄，保證不同崗位的人員熟練完成本職工作。14.8 建立內(nèi)部審核制度，每半年進(jìn)行一次內(nèi)部審核，一年進(jìn)行一次管理評(píng)審，并做好記錄。

14.9 對(duì)反映產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量情況的有關(guān)記錄，制定標(biāo)記、收集、編目、歸檔、存儲(chǔ)、保管和處理的程序，并貫徹執(zhí)行；所有質(zhì)量記錄必須真實(shí)、準(zhǔn)確、規(guī)范并具有衛(wèi)生質(zhì)量的可追溯性，保存期不少于2年。

第四篇：迎“疫”而上奮力奪取抗疫生產(chǎn)“雙勝利”

油田局（分公司）迎“疫”而上

奮力奪取抗疫生產(chǎn)“雙勝利”

2020年新春伊始，油田局(分公司)在市局（公司）堅(jiān)強(qiáng)領(lǐng)導(dǎo)下，在疫情防控和企業(yè)復(fù)工復(fù)產(chǎn)“雙線戰(zhàn)役”中，統(tǒng)一思想、堅(jiān)定信心，明確任務(wù)、落實(shí)責(zé)任，咬定目標(biāo)任務(wù)不放松，奮力奪取疫情防控和生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)“雙勝利”?，F(xiàn)匯報(bào)如下：

一、工作開展情況

（一）疫情防疫戰(zhàn)一線

共產(chǎn)黨員沖向前。面對(duì)突如其來的新型冠狀肺炎疫情,1月26日晚,接到官莊工區(qū)黨工委命令后,局（分公司）主要負(fù)責(zé)同志第一時(shí)間到崗，立即向黨支部20名黨員,下達(dá)緊急召集令；1月27日八點(diǎn)，支部20名黨員全部返崗，投入到疫情防控的主戰(zhàn)場(chǎng)。20名黨員兵分兩路，分包恒山小區(qū)和運(yùn)輸南苑兩個(gè)近5000人的居民區(qū)值守點(diǎn)，實(shí)行領(lǐng)導(dǎo)帶班，黨員輪流值班，做好車輛人員出入登記、測(cè)量體溫等工作，成立黨員突擊隊(duì)，先后發(fā)放宣傳材料4000余份,制作標(biāo)語10余幅，勸返1000多人次，所包居民區(qū)無一例疫情發(fā)生，構(gòu)建了一道疫情防護(hù)的“安全墻”。

防疫物資早準(zhǔn)備。為保證“疫”線干部職工安全，油田局（分公司）及早入手、多方協(xié)調(diào)、積極采購(gòu)，1月27日上午，第一批一次性口罩1000個(gè)，84消毒液50斤，酒精50斤及時(shí)購(gòu)置到位。隨后，根據(jù)疫情進(jìn)展以及企業(yè)復(fù)工復(fù)產(chǎn)，陸續(xù)分批購(gòu)進(jìn)一線作業(yè)防護(hù)面罩、測(cè)溫儀、N90防護(hù)口罩、一次性醫(yī)用口罩、84消毒液和酒精等防疫物品，切實(shí)做好防疫卡點(diǎn)值班和企業(yè)復(fù)工復(fù)產(chǎn)的防疫物資儲(chǔ)備工作，充分保障員工人身健康安全。

（二）卷煙營(yíng)銷勇爭(zhēng)先

部署謀劃早。2月7日，油田分公司在市局微信調(diào)查問卷的基礎(chǔ)上，再次組織卷煙營(yíng)銷人員通過微信問卷調(diào)查、電話直接溝通等形式扎實(shí)開展“線上”調(diào)研，迅速、準(zhǔn)確的收集轄區(qū)零售客戶現(xiàn)有庫(kù)存、銷售需求、開門復(fù)工等信息，通過數(shù)據(jù)信息分析，初步研判疫情對(duì)轄區(qū)卷煙市場(chǎng)影響的程度，及時(shí)為復(fù)工復(fù)產(chǎn)營(yíng)銷策略制定及調(diào)整做好精準(zhǔn)服務(wù)準(zhǔn)備。

工作執(zhí)行快。牢固樹立“效率就是效益”的理念。接到市局（公司）復(fù)工通知后，局（分公司）主要負(fù)責(zé)人于2月14日向官莊工區(qū)黨工委書記和工區(qū)分管領(lǐng)導(dǎo)當(dāng)面匯報(bào)，協(xié)調(diào)辦理物流配送車輛通行證1份，單位生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)用車和私家車通行證6份，充分做好卷煙配送復(fù)工復(fù)產(chǎn)準(zhǔn)備。

積極協(xié)調(diào)轄區(qū)2個(gè)大型連鎖商超的負(fù)責(zé)人，向其講明情況，尋求幫助，對(duì)方答應(yīng)一旦卷煙開始配送，車輛調(diào)配不及，他們的民生物資保障用車提供給我們免費(fèi)使用，用于往返物流中心運(yùn)輸卷煙。

嚴(yán)格貫徹市局（公司）“卷煙”不過夜的要求，抽調(diào)銷售、專賣6人組成“黨員突擊隊(duì)”，駕駛單位公車、私家車以及三輪摩托將因卡點(diǎn)管控、道路封閉無法送貨到戶的卷煙，第一時(shí)間送到轄區(qū)村口，送到社區(qū)卡口，送到商店門口，確保卷煙不在單位過夜，迅速將卷煙由配送狀態(tài)轉(zhuǎn)化為消費(fèi)狀態(tài)。

營(yíng)銷服務(wù)準(zhǔn)。油田轄區(qū)現(xiàn)有人口12.5萬人，常住人口約7.8萬人，近5萬人常年外出務(wù)工。油田局（分公司）緊盯因疫情而無法外出務(wù)工人員這個(gè)龐大的消費(fèi)群體，及時(shí)調(diào)整卷煙營(yíng)銷策略。

對(duì)于7家準(zhǔn)予開門營(yíng)業(yè)的連鎖超市提供營(yíng)銷保障服務(wù)，積極向營(yíng)銷中心申請(qǐng)，增加訂貨頻度，最大限度滿足訂貨需求，通過他們民生保障配送渠道滿足油區(qū)中心區(qū)域和偏遠(yuǎn)農(nóng)村的卷煙消費(fèi)需求；對(duì)于32個(gè)居民小區(qū)門口的煙酒商行提供營(yíng)銷精準(zhǔn)服務(wù)，客戶經(jīng)理及時(shí)網(wǎng)上了解卷煙需求信息及復(fù)工狀態(tài)，給與一定程度的貨源傾斜，盡力保障其貨源供應(yīng)，切實(shí)滿足社區(qū)居民消費(fèi)需求；對(duì)于因疫情限制開門經(jīng)營(yíng)能力一般的商戶提供營(yíng)銷提醒服務(wù)，客戶經(jīng)理通過電話、微信進(jìn)行定期拜訪，關(guān)注復(fù)工狀態(tài)，宣傳貨源政策，促其及早訂貨，切實(shí)提高轄區(qū)商戶復(fù)工率和訂貨成功率。

截止3月11日，共銷售1052箱卷煙，占卷煙銷售計(jì)劃3230箱的32.6%，超全市平均進(jìn)度6個(gè)百分點(diǎn)。

（三）市場(chǎng)監(jiān)管盡主責(zé)

一是扎實(shí)開展市場(chǎng)經(jīng)營(yíng)狀況摸底排查，通過電話、微信及現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查相結(jié)合的方式，監(jiān)控市場(chǎng)動(dòng)態(tài)，有重點(diǎn)的指導(dǎo)、提醒、督查零售戶進(jìn)行規(guī)范經(jīng)營(yíng)，有針對(duì)性地對(duì)可疑零售戶進(jìn)行集中檢查和盯防，加大對(duì)違法違規(guī)大戶的管控力度，切實(shí)扎緊市場(chǎng)籬笆，嚴(yán)防卷煙非法流通。

二是配合送貨員跟班作業(yè)，既做好送貨到位督查，又了解轄區(qū)卷煙配送存在的實(shí)際困難，針對(duì)疫情防控封閉管理舉措，分層分級(jí)逐戶研究送貨對(duì)策，專銷協(xié)同發(fā)力，確保及時(shí)配送到戶。

三是加強(qiáng)與物流部門的溝通，進(jìn)行線上可疑快遞單號(hào)篩選，實(shí)地深入包裹分揀線、快遞代收點(diǎn)、快遞超市進(jìn)行有針對(duì)性排查，切斷疫情期間各類違法卷煙中轉(zhuǎn)、外流渠道。

二、存在的困難

一是受河南油田企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益影響，油區(qū)大量人員在新疆、中東地區(qū)進(jìn)行石油勘探外包工作，人口流動(dòng)性大，連續(xù)多年卷煙銷量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

二是2019年12月，轄區(qū)卷煙市場(chǎng)進(jìn)行重新劃分，城區(qū)、唐河、新野三地的近90戶農(nóng)村商戶并入我轄區(qū)，低檔位卷煙需求增多，卷煙結(jié)構(gòu)提升困難。

三、下一步工作打算

一是穩(wěn)定銷量。抓住外出務(wù)工人員出行、各行各業(yè)復(fù)工生產(chǎn)等機(jī)會(huì)，拓寬經(jīng)營(yíng)思路，最大程度地挖掘市場(chǎng)消費(fèi)潛力。特別是剛剛劃轉(zhuǎn)的農(nóng)村市場(chǎng)，積極與零售客戶溝通，密切關(guān)注客戶訴求，及時(shí)掌握并竭力幫助客戶解決經(jīng)營(yíng)中的難題，建立良好客我關(guān)系，確保量不流失，完成全年銷售目標(biāo)任務(wù)。

二是提升結(jié)構(gòu)。圍繞轄區(qū)實(shí)際，及時(shí)分析市場(chǎng)動(dòng)態(tài)，引導(dǎo)客戶優(yōu)化貨源結(jié)構(gòu)，做實(shí)事件營(yíng)銷、主題營(yíng)銷，以消費(fèi)升級(jí)帶動(dòng)結(jié)構(gòu)升級(jí)，同時(shí)，從4月份開始，向市公司營(yíng)銷中心申請(qǐng)，限制低三類以下卷煙的投放，推動(dòng)銷售結(jié)構(gòu)穩(wěn)步提升，確保單箱目標(biāo)任務(wù)的順利實(shí)現(xiàn)。

**油田煙草專賣局（分公司）

2020年3月12日

第五篇：利用基因工程酵母生產(chǎn)抗瘧疾藥物前體--青蒿酸

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)

利用基因工程酵母生產(chǎn)抗瘧疾藥物前體--青蒿酸

Dae-Kyun Ro1*, Eric M.Paradise2*, Mario Ouellet1, Karl J.Fisher6, Karyn L.Newman1, John M.Ndungu3, Kimberly A.Ho1, Rachel A.Eachus1, Timothy S.Ham4, James Kirby2, Michelle C.Y.Chang1, Sydnor T.Withers2,Yoichiro Shiba2, Richmond Sarpong3 & Jay D.Keasling1,2,4,5

（楊豫魯翻譯）

摘要：瘧疾這種疾病威脅著全球三至五億人的健康，并且每年殺死超過一百萬的人口。抗藥瘧原蟲突變系Plasmodium falciparum2,3的出現(xiàn)更嚴(yán)重阻礙了對(duì)這種疾病的控制。雖然人工合成的抗瘧藥以及相關(guān)疫苗已經(jīng)出現(xiàn)，但其針對(duì)瘧疾的治療效果仍需經(jīng)受嚴(yán)格的臨床檢驗(yàn)4，5。而青蒿素，一種從Artemisia annua L（菊科植物，俗稱青蒿）中提煉出來的倍半萜內(nèi)酯環(huán)內(nèi)過氧化物（C-15倍半萜），對(duì)抗藥性瘧原蟲Plasmodium spp的抑制效果非常明顯。可惜的是其供給量受自然因素等各方面限制，瘧疾患者大都難以承受其昂貴的價(jià)格6。青蒿素的人工全合成也非常困難，而且花費(fèi)很大7。不過利用微生物工程發(fā)酵合成其前體青蒿酸（一種合成青蒿素的可靠來源）,卻是一個(gè)相對(duì)來說比較廉價(jià)、環(huán)保和高效的辦法8，9。這里我們將介紹如何通過基因工程途徑改造啤酒酵母使其高效合成青蒿酸（最高可達(dá)100ug/L）：對(duì)其甲羥戊酸途徑進(jìn)行調(diào)控，并且轉(zhuǎn)入編碼amorphadiene（等價(jià)于amorpha-4,11-diene，合成青蒿酸及青蒿素的最直接的前體原料）合酶和一種特異的細(xì)胞色素P450酶(CYP71AV1)的基因。這兩種酶均源自青蒿，而且后者經(jīng)過三步氧化作用將amorpha-4,11-diene轉(zhuǎn)變成青蒿酸。青蒿酸合成后被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外并附著在酵母外表面上，這意味著通過簡(jiǎn)單且廉價(jià)的純化過程就可以獲得目標(biāo)產(chǎn)物。盡管這種基因工程酵母合成青蒿酸的能力相對(duì)于青蒿來說已經(jīng)十分顯著，仍需急切解決問題的是如何提高其生產(chǎn)效率從而擴(kuò)大至工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，以便可以生產(chǎn)出足夠多的青蒿酸來降低現(xiàn)有青蒿素的價(jià)格，讓青蒿素綜合療法可以廣泛地被應(yīng)用到對(duì)瘧疾的治療中去。

內(nèi)容:我們通過三個(gè)步驟構(gòu)建能合成青蒿酸的基因工程酵母：（1）改造酵母焦磷酸法尼酯（FPP）生物合成途徑中的相關(guān)基因，增加FPP的合成并且設(shè)法減少它作為固醇類物質(zhì)的前體去合成固醇；（2）將青蒿中的amorphadiene合酶基因ADS轉(zhuǎn)入到高FPP生產(chǎn)株中，從而轉(zhuǎn)化FPP為amorphadiene；（3）克隆青蒿中特異的細(xì)胞色素P450酶基因（這種酶通過三步氧化將amorphadiene氧化成青蒿酸）并使其在amorphadiene生產(chǎn)株內(nèi)表達(dá)（見圖1）。青蒿素生物合成的第一步反應(yīng)由ADS10催化，它已經(jīng)被鑒定并且用于在大腸桿菌

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)

圖1| 圖中所示為同時(shí)表達(dá)CYP71AV1和CPR的基因工程啤酒酵母菌株EPY224中青蒿酸的合成途徑。藍(lán)顏色顯示的是啤酒酵母甲羥戊酸合成途徑中被直接正調(diào)節(jié)的基因；紫色顯示的是因upc2-1表達(dá)被間接正調(diào)節(jié)的基因； 紅線指示菌株EPY224中被抑制的ERG9；綠色箭頭指示從焦磷酸法呢酯到青蒿酸的生物合成途徑，這條途徑已經(jīng)從青蒿被完全引入到啤酒酵母當(dāng)中，在CYP71AV1和CPR共同作用下經(jīng)過三步氧化將amorphadiene轉(zhuǎn)變?yōu)榍噍锼帷Ｍ緩街虚g產(chǎn)物IPP, DMAPP和GPP分別代表異戊烯焦磷酸酯、二甲基丙烯焦磷酸酯和焦磷酸牻牛兒酯。

中合成amor phadiene11。為了確定對(duì)是否要促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)FPP的合成，我們將ADS基因插入由GAL1 啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)錄的pRS425質(zhì)粒中，然后在酵母細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果顯示單獨(dú)轉(zhuǎn)入ADS基因的酵

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)

母只合成少量的amorphadiene（圖2，菌株EPY201，4.4mg/L）。

圖2 |柱狀圖顯示基因改造過程不同階段啤酒酵母菌株的amorphadiene合成能力，這些菌株的詳細(xì)介紹請(qǐng)見正文。為減小實(shí)驗(yàn)誤差，均在同一條件下培養(yǎng)144小時(shí)后取樣測(cè)定，amorphadiene合成水平也被定量化?？v坐標(biāo)表示總產(chǎn)量，為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n =3)。

所以，為了提高啤酒酵母合成amorphadiene的能力，我們對(duì)FPP合成途徑進(jìn)行了總共五次的基因工程改造。幾個(gè)與FPP合成相關(guān)的基因的表達(dá)被正調(diào)控，而另外幾個(gè)促使FPP轉(zhuǎn)變成固醇的基因被負(fù)調(diào)控。同時(shí)為了保證宿主菌株的遺傳穩(wěn)定性，所有這些對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行的修飾都是通過染色體融合進(jìn)行的。具體過程如下：首先，將一種截短的水溶性酶3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶（我們所學(xué)生化書中為譯為β-羥基-β-甲基-戊二酰輔酶A還原酶，簡(jiǎn)稱HMGCoA還原酶，又簡(jiǎn)稱tHMGR12，是固醇合成的限速酶）過表達(dá)，可提高amorphadiene的合成產(chǎn)量近五倍（圖2，菌株 EPY208）；其次，利用一個(gè)methioninerepressible啟動(dòng)子(PMET3)13，通過對(duì)編碼鯊稀合酶（固醇生物合成途徑中FPP合成后第一步）的ERG9基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控，可將amor phadiene的合成量再增加兩倍（圖2，菌株EPY225）；然后，盡管upc2-1, 一個(gè)可以加強(qiáng)UPC２（啤酒酵母中調(diào)節(jié)固醇合成的一個(gè)的通用轉(zhuǎn)錄因子）14活性的半顯性突變體等位基因，在已有菌株 EPY208背景下過表達(dá)（圖2，菌株EPY210）對(duì)amorphadiene合成的提高起的作用并不顯著，但結(jié)合對(duì)ERG9基因的負(fù)調(diào)控，其過表達(dá)可將amorphadiene的合成量提高到105mg/L（圖2，菌株EPY213）；再次，在酵母染色體更遠(yuǎn)處在轉(zhuǎn)進(jìn)一個(gè)tHMGP拷貝可以將將其合成量再增加50%達(dá)到149mg/L（圖2，菌株 EPY 219）；最后，雖然編碼FPP合酶的

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)

基因（ERG20）過表達(dá)對(duì)amorphadiene合成總量（圖2，菌株 EPY224）的提高效果非常小，但在細(xì)胞密度降低的情況下其合成量卻可增加10%。將所有這些對(duì)基因的修飾綜合在菌株EPY224上，amorphad iene的合成量已經(jīng)達(dá)到了153mg/L , 是之前所報(bào)道這種倍半萜(烯)最大合成水平的幾乎500倍15。

（王易龍翻譯）

現(xiàn)在我們已經(jīng)得到了可以高效合成amorphadiene的酵母菌株，但為能將amor phadiene轉(zhuǎn)變成青蒿酸，我們還需要找到并分離出青蒿中編碼催化amorphadiene轉(zhuǎn)變成青蒿酸的酶的基因。青蒿素是一種倍半萜內(nèi)酯衍生物，這些衍生物在菊科植物中普遍存在，是一類十分有特性的細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物。我們假定菊科植物在半倍半萜內(nèi)酯的合成的前幾步中利用的是源于同一祖先的合成酶，據(jù)此對(duì)菊科植物進(jìn)行了一次基因組比較分析。由于先前已經(jīng)有文章報(bào)道過對(duì)青蒿的無細(xì)胞化驗(yàn)，并且證明在青蒿中是一種特異的細(xì)胞色素P450酶17對(duì)amorphadie ne進(jìn)行專一性羥化（圖1）。我們直接從由向日葵和萵苣這兩種菊科作物提供的基因數(shù)據(jù)構(gòu)建的已表達(dá)序列標(biāo)志（EST）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到細(xì)胞色素P450已表達(dá)序列標(biāo)志（ESTs）。然后通過使用針對(duì)CYP71和CYP82家族（P450酶在菊科植物中最多的兩個(gè)家族）高度特異的簡(jiǎn)并引物，從青蒿毛狀體細(xì)胞的互補(bǔ)DNA庫(kù)中分離出幾個(gè)特定的P450片段。接著利用BLAST分析法18將這些片段與向日葵和萵苣的ESTｓ比對(duì)，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)有一個(gè)青蒿P450基因片段與來自以上兩種植物的未知功能ESTs序列非常相似（氨基酸水平上達(dá)相似度達(dá)85-88%），而同其他非菊科植物的P450序列相似度較低（氨基酸水平上小于50%）。這表明相對(duì)于非菊科植物，P450基因在這三個(gè)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菊科植物屬中是高度保守的。因此，從青蒿中分離出的這段P450基因是編碼菊科保守性倍半萜內(nèi)酯生物合成酶一個(gè)非常好的候選者。

隨后相應(yīng)的完整P450cDNA（CYP71AV1），一個(gè)編碼495個(gè)氨基酸的開放閱讀框，成功從青蒿中分離獲得。系統(tǒng)進(jìn)化分析法顯示CYP71AV1和其他的P450s（像催化類單萜羥化的CYP71 D13/

18、催化倍半萜羥化的CYP71D20以及二萜類化合物羥化的CYP71D16）有很近的親緣關(guān)系。這進(jìn)一步表明從青蒿中獲得的P450在萜類化合物代謝中存在的潛在作用。為了保證異源表達(dá)的CYP71AV1可以發(fā)揮正常功能，協(xié)同它進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的天然配體，NADPH：細(xì)胞色素P450氧化還原酶（CPR），同樣從青蒿中成功分離，并且其生化活性已經(jīng)在體外被證實(shí)。(細(xì)胞色素c 和 NADPH 的米氏常數(shù)(Km)分別為4.3±0.7 μM 和 23.0±4.4 μM(平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差, n ＝3))。

在配體分子CPR的參與下，我們研究了在活細(xì)胞體內(nèi)CYP71AV1是否可以催化amorphadie 19

21微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)

ne轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗉?jí)氧化產(chǎn)物：轉(zhuǎn)基因酵母株EPY224中被轉(zhuǎn)入了一個(gè)整合有CPR和CYP71AV1基因并且由半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控的基因載體，經(jīng)半乳糖的誘導(dǎo)表達(dá)后，用醚對(duì)酵母細(xì)胞體和培養(yǎng)基分別進(jìn)行抽提，并對(duì)餾分進(jìn)行氣象色譜—質(zhì)譜聯(lián)合分析(GC–MS)。分析結(jié)果顯示，在同時(shí)表達(dá)CYP71AV1 和 CPR的細(xì)胞株EPY224細(xì)胞體及其培養(yǎng)基中，一個(gè)獨(dú)特的單色譜峰被檢測(cè)出，但是在只表達(dá)CPR的EPY224中并未檢測(cè)到這個(gè)峰，并且，幾乎95%的這種特異化合物是來源于細(xì)胞體的。而且這種化合物的電子碰撞質(zhì)譜和保留時(shí)間與從青蒿中提取的青蒿酸的完全吻合（圖 3）。在搖瓶培養(yǎng)條件下，同時(shí)表達(dá)CYP71AV1 和CPR的EPY224菌株青蒿酸產(chǎn)量為32 ± 13 mg/L(平均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差, n＝7)。更為重要的是，其中間代謝產(chǎn)物，青蒿醇和青蒿醛在細(xì)胞體和培養(yǎng)基中被檢測(cè)到的量幾乎可以忽略（青蒿醇的量比青蒿素酸的5%還少，并且根本沒有青蒿醛被檢測(cè)出）。

我們證實(shí)，通過用堿性緩沖液（pH為9的Tris-HCL緩沖液中添加1.2M的山梨醇）清洗胞體沉淀物，絕大部分合成的青蒿酸（>96%）可以而被分離出，而且沖洗之后細(xì)胞體和培養(yǎng)基中的殘留量?jī)H為2%。青蒿酸不僅可以被高效的轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，且在酸性條件下經(jīng)過質(zhì)子化后會(huì)被束縛在細(xì)胞表面。利用這個(gè)特點(diǎn)制定了一種便捷提純方法：用醚對(duì)清洗緩沖液進(jìn)行抽提，然后經(jīng)過一步簡(jiǎn)單的凝膠柱層析分離抽提物，就可以得到純度高于95%的青蒿酸。在一個(gè)一升發(fā)酵罐中，青蒿酸的產(chǎn)量為115mg，而通這種方法的，我們可以得到76mg的提純產(chǎn)物。最重要的是，經(jīng) 1H and13C原子核磁共振檢測(cè)顯示，這種酵母合成青蒿酸與從青蒿中直接提取的青蒿酸分子結(jié)構(gòu)完全一樣，并且同先前的文獻(xiàn)報(bào)道十分吻合22，23。因此，可以確定我們所得到的這株轉(zhuǎn)基因酵母能夠直接合成結(jié)構(gòu)功能上完全正確的青蒿酸。

（周景峰翻譯）

轉(zhuǎn)基因酵母在生產(chǎn)青蒿酸時(shí)需要的生物量與青蒿相比，其細(xì)胞體干重的4.5%相當(dāng)于青蒿中1.9%的青蒿酸和0.16%的青蒿素，但是所需的時(shí)間非常短（酵母4-5天，而青蒿則需要幾個(gè)月的時(shí)間）。因此，轉(zhuǎn)基因酵母菌珠的單位生產(chǎn)效率比青蒿高了近兩個(gè)數(shù)量級(jí)。

P450酶三步氧化法曾在植物赤霉素生物合成途徑中有過報(bào)道24，25。我們通過體外酶法檢測(cè)CYP71AV1是否在amorphadiene轉(zhuǎn)化為青蒿酸的三個(gè)過程中都起到催化作用。從啤酒酵母菌株YPH499中分離微體，這些微體僅表達(dá)CPR或者同時(shí)表達(dá)CPR和CYP71AV1。將微體在不同的合成途徑中間體（amorphadiene，青蒿醇，青蒿醛）條件下進(jìn)行培養(yǎng)（圖4）。對(duì)照組微體僅表達(dá)CPR，沒有催化任何合成途徑中間體以到更高級(jí)的氧化產(chǎn)物。但是我們發(fā)現(xiàn)包含CYP71AV1和CPR的微體將amorphadiene、青蒿醇和青蒿醛更加高效地轉(zhuǎn)化成了青蒿酸。這

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)

些體外實(shí)驗(yàn)毫無疑問地證明：重組CYP71AV1可以在amorphadiene的C12位置催化三次氧化反應(yīng)。雖然先前已經(jīng)有報(bào)道，使用青蒿蛋白提取物的體外酶法測(cè)定證明可溶性的醇醛脫氫酶和一種C11，13雙鍵還原酶（作用于醛）參與青蒿素的生物合成 17。我們不排除在青蒿中存在其他的醇醛脫氫酶參與的催化反應(yīng)，但是體外實(shí)驗(yàn)中重組的CYP71AV1將amorpha-4, 11-diene高效轉(zhuǎn)化為青蒿酸，完全顯示出膜結(jié)合、多功能的CYP71AV1是青蒿素的生物合成中的關(guān)鍵促成因素。

圖3：氣相層析質(zhì)譜法（GC-MS）分析從青蒿蒿和轉(zhuǎn)基因酵母中獲得的青蒿酸

a． 表達(dá)CPR或者CPR和CYP71AV1的啤酒酵母菌株細(xì)胞體使用堿性緩沖液沖洗后，經(jīng)酸化和醚抽提提純。青蒿酸用乙烷從青蒿的葉子里提取。在進(jìn)行GC-MS分析之前，每個(gè)樣品的甲酯化產(chǎn)物需經(jīng)三甲基硅烷-重氮甲烷提前處理。內(nèi)標(biāo)物（IS）是4-辛基苯甲酸的甲酯化物。

b，c．從酵母（b）和青蒿（c）中得到的青蒿酸的質(zhì)譜和保留時(shí)間。RT表示保留時(shí)間，以分鐘計(jì)。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)

圖4：體外酶法測(cè)定CYP71AV1的活性。從啤酒酵母菌株YPH499中分離獲得的微體表達(dá)CPR（對(duì)照組）或者CPR和CYP71AV1(CYP71AV1組)。

a-c．每一種酶的測(cè)定分別加入（a）10μM amorphadiene，（b）25μM 青蒿醇，或者（c）25μM 青蒿醛。底物的色譜峰用星號(hào)標(biāo)出。醚提取物經(jīng)過衍生，并用GC-MS在不同的粒子模式下分析（mlz：121，189，204，218，220和248）。酶反應(yīng)的產(chǎn)物按照預(yù)期得到：1，青蒿醇（保留時(shí)間13.20分鐘）；2，青蒿醛（保留時(shí)間11.79分鐘）；3，青蒿酸（保留時(shí)間13.58分鐘，甲酯化后檢測(cè)）

總的來說，我們采用改造FPP生物合成途徑的方法獲得了能高水平生產(chǎn)青蒿酸的啤酒酵母菌株。該方法通過表達(dá)amorphadiene合成酶，一種新型的細(xì)胞色素P450和與之相關(guān)的來自青蒿的氧化還原酶來提高青蒿酸的產(chǎn)量。據(jù)了解，相關(guān)轉(zhuǎn)化青蒿酸到青蒿素或其他派生物的化學(xué)方法可能還有許多待改進(jìn)之處8，9，但微生物法生產(chǎn)青蒿酸是獲得此類高效抗瘧疾藥物切實(shí)可行的方法。保守分析證明，在使產(chǎn)品效價(jià)最優(yōu)化的情況下，青蒿素結(jié)合治療法將會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)降低于現(xiàn)在用于瘧疾治療的價(jià)格。除了節(jié)省費(fèi)用之外，這種生物合成方法不會(huì)受到像天氣和政治氣候等因素的影響，但這些因素可能會(huì)對(duì)植物的培育造成影響。進(jìn)一步說，從微生物里得到的青蒿酸可以采用對(duì)環(huán)境友好的方式提取，而不用擔(dān)心像植物能夠產(chǎn)生其他的萜烯致使產(chǎn)物受到污染，從而減少了純化的費(fèi)用。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)

方法：

對(duì)于啤酒酵母的增殖與鑒定、CYP71AV1和 CPR基因的克隆以及青蒿醇和青蒿醛的半合成等實(shí)驗(yàn)過程中所使用的手段方法的詳細(xì)描述請(qǐng)見補(bǔ)充信息。

化學(xué)和植物材料：青蒿酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買于Apin Chemicals公司或者直接用己烷從青蒿葉片萃取。青蒿植株被栽培在加州大學(xué)伯克利分校的溫室當(dāng)中，并且都是從種子開始培育的。GC—MS法分析Amorphadiene：用GC—MS對(duì)不同株系的啤酒酵母的Amorphadiene合成量進(jìn)行測(cè)定，使用十二烷阻止Amorphadiene的揮發(fā)。為了定量衡量Amorphadiene產(chǎn)量水平，用于測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的Amorphadiene（90%純）是通過大腸桿菌菌株發(fā)酵制備的。

青蒿酸的胞內(nèi)發(fā)酵，純化及化學(xué)分析：將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的在600nm（A600）下吸光度達(dá)到0.05的EPY224菌株（已經(jīng)被轉(zhuǎn)入pESCURA::CPR 或者 pESCURA::CPR/CYP71AV1）接種到25ml合成培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基不含組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和尿嘧啶，但是添加有0.2%的葡萄糖、1.8%的半乳糖以及1mMol定量的甲硫氨酸。300C下恒溫培養(yǎng)120小時(shí)，然后將培養(yǎng)混合物進(jìn)行離心，留下細(xì)胞體。再用50mM Tris-HCl緩沖液（pH 9.0）沖洗細(xì)胞體，加入2M的HCl將緩沖液的pH調(diào)至2.0，用混入4-烷基苯甲酸（10ug/ml）的乙酸乙酯進(jìn)行萃取。萃取餾分經(jīng)50ul 2M的四甲基硅烷-重氮甲烷和10%的甲醇衍生。在進(jìn)行GC-MS分析前，產(chǎn)物還要經(jīng)過以（1：1）的醚和戊烷為洗脫劑的凝膠色譜提純。

（陽 震翻譯）

最后，提純的產(chǎn)物經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜儀（70eV，Agilent Technologies）分析，毛細(xì)管柱為DB5（0.25毫米內(nèi)徑 ×0.25μ×30m，J&W Scientific）。氣相色譜的加熱程序從80℃（保持2分鐘），以每分鐘20℃的梯度遞增到140℃。產(chǎn)品分離時(shí)由5℃/min的速度增加到220℃。采用火焰電離色譜檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)為了定量，沒有使用相同的氣相加熱程序?qū)χ舆M(jìn)行凈化。發(fā)酵及產(chǎn)物的核磁共振分析:使用1升的生物反應(yīng)器（New-Brunswick Scientific），在30℃的條件下，培養(yǎng)酵母菌93個(gè)小時(shí)。2%的半乳糖的誘導(dǎo)酵母細(xì)胞，600nm下測(cè)OD值為1.7，最終的細(xì)胞濃度OD值A(chǔ)600達(dá)到5.0。攪拌速度從100rmp變到500rmp，每分鐘通氧0.5L，使得溶氧量始終保持在40%，青蒿酸使用堿洗的方法從細(xì)胞沉淀物中提取出來，再使用含有78%的乙烷，20%的乙酸乙酯和2%的乙酸的硅膠管柱提純。分離得到的青蒿酸（純度大于95%）的結(jié)構(gòu)采用College of Chemistry NMR Facility at the University of California提供的1H和13C NMR500MHz核磁共振儀進(jìn)行分析。

體外酶法測(cè)定:用重組質(zhì)粒pESCURA::CPR或者pESCURA::CPR/CYP71AV1與1升的啤酒酵母

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)

YPH499培養(yǎng)物，加入2%的半乳糖轉(zhuǎn)化24小時(shí)。微體使用聚乙二醇法沉淀，然后超高速離心去除前面提到的細(xì)胞里的蛋白質(zhì)雜質(zhì)26。取大約500μg的微體蛋白，100mM pH 7.5的磷酸加緩沖液, 10或者25μM 的培養(yǎng)基，100μM NADPH和一個(gè)NADPH的重建體系（5mM 葡萄糖-6-磷酸和2個(gè)單位的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶）。反應(yīng)在24℃下輕微攪拌作用24小時(shí)。反應(yīng)完成之后加酸至pH 為2，然后使用乙醚抽提。產(chǎn)物采用與上面所述相同的氣相加熱程序。使用包含了相對(duì)于產(chǎn)物典型的六種離子（121，189，204，220和248）的固定離子檢測(cè)（SIM）法進(jìn)行檢測(cè)。

更過補(bǔ)充信息請(qǐng)查閱在線網(wǎng)頁004km.cn/nature.致謝：

感謝提供官方CYP數(shù)據(jù)的Nelson教授，進(jìn)行從青蒿中提純青蒿酸工作的Ockey教授和McPhee教授的。感謝提供pδ-UB的N.A.Da.Silva, 提供pRH127-3和pRH973的R.Y.Hampton,提供 pBD33 和 pBD36的 J.Rine。感謝菊科基因組計(jì)劃的R.Michelmore和其他成員對(duì)本項(xiàng)目的支持。最后感謝梅林達(dá)-比爾蓋茨基金會(huì)、美國(guó)農(nóng)業(yè)部、美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金會(huì)、Institute for OneWorld Health、Akibene Foundation、University of California Discovery Grant、the Diversa Corporation 提供資金支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] World Health Organization.World Malaria Report 2005.(WHO, Geneva, 2005).[2] Korenromp, E.L., Williams, B.G., Gouws, E., Dye, C.& Snow, R.W.Measurement of trends in childhood malaria mortality in Africa: Anassessment of progress toward targets based on verbal autopsy.Lancet Infect.Dis.3, 349–-358(2003).[3] Marsh, K.Malaria disaster in Africa.Lancet 352, 924(1998).[4] Hoffman, S.Save the children.Nature 430, 940–-941(2004).[5] Vennerstrom, J.L.et al.Identification of an antimalarial synthetic trioxolane drug development candidate.Na ture 430, 900–-904(2004).[6] Enserink, M.Infectious diseases: Source of new hope against malaria is in short supply.Science 307, 33(2005).[7] Schmid, G.& Hofheinz, W.Total synthesis of Qinghaosu.J.Am.Chem.Soc.105, 624–-625(1983).[8] Acton, N.& Roth, R.J.On the conversion of dihydroartemisinic acid into artemisinin.J.Org.Chem.57,3610 –-3614(1992).[9] Haynes, R.K.& Vonwiller, S.C.Cyclic peroxyacetal lactone, lactol and ether compounds.US patent 5,310,9 46(1994).[10].Mercke, P., Bengtsson, M., Bouwmeester, H.J., Posthumus, M.A.& Brodelius,P.E.Molecular cloning exp ression, and characterization of amorpha-4,11-diene synthase, a key enzyme of artemisinin biosynthesis in Art emisia annua L.Arch.Biochem.Biophys.381, 173–-180(2000).微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)

[11] Martin, V.J., Pitera, D.J., Withers, S.T., Newman, J.D.& Keasling, J.D.Engineering a mevalonate pathwa y in Escherichia coli for production ofterpenoids.Nature Biotechnol.21, 796–-802(2003).12.Donald, K., Ha mpton, R.& Fritz, I.Effects of overproduction of the catalyticdomain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzym e A reductase on squalenesynthesis in Saccharomyces cerevisiae.Appl.Environ.Microbiol.63, 3341–-3344 [13] Gardner, R.G.& Hampton, R.Y.A highly conserved signal controls degradation of 3-hydroxy-3-methylglut aryl-coenzyme A(HMG-CoA)reductase in eukaryotes.J.Biol.Chem.274, 31671–-31678(1999).1[4.]Davies, B.S.J., Wang, H.S.& Rine, J.Dual activators of the sterol biosynthetic pathway of Saccharomyces cerevisiae: Similar activation/regulatory domains but different response mechanisms.Mol.Cell.Biol.25, 7375–-7385(2005).[15]Jackson, B.E., Hart-Wells, E.A.& Matsuda, S.P.T.Metabolic engineering to produce sesquiterpenes in yeast.Org.Lett.5, 1629–-1632(2003).[16] Seaman, F.C.Sesquiterpene lactones as taxonomic characters in the Asteraceae.Bot.Rev.48, 121–-592(1982).[17]Bertea, C.M.et al.Identification of intermediates and enzymes involved in the early steps of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua.Planta Med.71,40–-47(2005).[18] Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W.& Lipman, D.J.Basic localalignment search tool.J.Mol.Biol.215, 403–-410(1990).[19] Lupien, S., Karp, F., Wildung, M.& Croteau, R.Regiospecific cytochrome P450limonene hydroxylases from mint(Mentha)species: cDNA isolation,characterization, and functional expression of(2)-4S-limonene-3-hyd roxylase and(2)-4S-limonene-6-hydroxylase.Arch.Biochem.Biophys.368, 181–-192(1999).[20]Ralston, L.et al.Cloning, heterologous expression, and functional characterization of 5-epi-aristolochene-1, 3-dihydroxylase from tobacco(Nicotiana tabacum).Arch.Biochem.Biophys.393, 222–-235(2001).[21] Wang, E.et al.Suppression of a P450 hydroxylase gene in plant trichomeglands enhances natural-product-based aphid resistance.Nature Biotechnol.19,371–-374(2001).[22] Elmarakby, S.A., El-Feraly, F.S., Elsohly, H.N., Croom, E.M.& Hufford, C.D.Microbiological transformations of artemisinic acid.Phytochemistry 27,3089–-3091(1988).[23]Kim, S., Han, J.& Lim, Y.Revised assignment of 1H-NMR signals of artemisinicacid.Planta Med.62, 480–-481(1996).[24] Helliwell, C.A., Poole, A., Peacock, W.J.& Dennis, E.S.Arabidopsisent-kaurene oxidase catalyzes three steps of gibberellin biosynthesis.PlantPhysiol.119, 507–-510(1999).[25]Helliwell, C.A., Chandler, P.M., Poole, A., Dennis, E.S.& Peacock, W.J.The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway.Proc.Natl Acad.Sci.USA 98,2065–-2070(2001).[26] Pompon, D., Louerat, B., Bronine, A.& Urban, P.Yeast expression of animaland plant P450s in optimized redox environments.Methods Enzymol.272,51–-64(1996).