核酸檢測基本知識
1.什么是核酸檢測
核酸的定義:核酸是由核苷酸或脫氧核苷酸通過3′,5′-磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子。
核酸具有非常重要的生物功能,主要是貯存遺傳信息和傳遞遺傳信息。
2.核酸的分類
核酸大分子可分為兩類:脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
3.核酸的組成DNA和RNA都是由一個(gè)一個(gè)核苷酸(nucleotide)頭尾相連而形成的,由C、H、O、N、P,5種元素組成。DNA是絕大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì),RNA是少數(shù)不含DNA的病毒(如HIV病毒,流感病毒,SARS病毒等)的遺傳物質(zhì)。RNA平均長度大約為2000個(gè)核苷酸,而人的DNA卻是很長的,約有3X10^9個(gè)核苷酸。
4.核酸的功能
在蛋白質(zhì)的復(fù)制和合成中起著儲存和傳遞遺傳信息的作用。核酸不僅是基本的遺傳物質(zhì),而且在蛋白質(zhì)的生物合成上也占重要位置,因而在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現(xiàn)象中起決定性的作用。
DNA與RNA都是核酸,它們在化學(xué)組成上有什么區(qū)別如下:
DNA與RNA的比較
DNA
RNA
主要存在部位
細(xì)胞核
細(xì)胞質(zhì)
基本組成單位
脫氧核苷酸
核糖核苷酸
堿基種類
A、G、C、T
A、G、C、U
五碳糖種類
脫氧核糖
核糖
核苷酸鏈
兩條脫氧核苷酸鏈
一條核糖核苷酸鏈
5.檢測方法
核酸檢測方法,主要通過同時(shí)進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增和可檢測信號的生成來檢測樣品中的靶核酸??蓱?yīng)用于臨床微生
物學(xué)、血液篩選、遺傳病診斷和預(yù)防、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的核酸檢測。
目前主要使用的方法有以下幾種:
a.核酸序列依賴性擴(kuò)增法
NASBA是由一對引物介導(dǎo)的、連續(xù)均一的、體外特異性核苷酸序列等溫?cái)U(kuò)增RNA的新技術(shù)。反應(yīng)在42℃進(jìn)行,可在2h內(nèi)將RNA模板擴(kuò)增約109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物進(jìn)行擴(kuò)增。整個(gè)反應(yīng)分非循環(huán)相和循環(huán)相:在非循環(huán)相中,引物I與模板RNA退火后在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA雜合體,隨即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ與cDNA退火,在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成第2條DNA互補(bǔ)鏈。雙鏈DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,經(jīng)其啟動(dòng)子序列起動(dòng)而轉(zhuǎn)錄RNA,RNA又可在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成DNA,進(jìn)入循環(huán)相,對模板進(jìn)行大量擴(kuò)增。
b.轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)
TMA技術(shù)原理與NASBA基本一致,略有不同之處是TMA利用的是MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及T7RNA聚合酶兩種酶,MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶既有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性又具有RNA酶H活性。反應(yīng)在41.5℃進(jìn)行,可在1h內(nèi)將RNA模板擴(kuò)增約109倍。
c.連接酶酶促鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)
LCR是基于靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種
探針擴(kuò)增技術(shù),是繼PCR后新發(fā)展的一種較有前景的體外擴(kuò)增技術(shù)。它的原理就是由2段寡核苷酸單鏈DNA探針與目標(biāo)序列雜交,當(dāng)該2段DNA探針與沒有發(fā)生突變的模板褪火后,如果2探針是緊鄰的,中間沒有核苷酸間隔,則可在連接酶作用下連接起來,連接以后的新鏈又可以作為模板,引導(dǎo)下一周期的連接產(chǎn)生新的子鏈。若連接區(qū)段發(fā)生核苷酸的堿基突變,則連接反應(yīng)不能發(fā)生,擴(kuò)增反應(yīng)終止。
d.多聚酶鏈反應(yīng)檢測法(PCR)
PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。
①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。
②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合。
③引物的延伸:DNA模板—引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成1條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈,重復(fù)循環(huán)變性—退火—延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次
循環(huán)的模板。每完成1個(gè)循環(huán)需2~4min,2~3h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。檢測HIVRNA,需要先利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA,繼而以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可,這樣的反應(yīng)稱為RT-PCR。
e.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
本技術(shù)的原理是使用熒光基團(tuán)標(biāo)記探針,5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)R,3′端標(biāo)記淬滅基團(tuán)Q,在沒有PCR擴(kuò)增時(shí),由于熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)空間距離很近,使熒光基團(tuán)被淬滅,不發(fā)熒光;而當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí),引物與熒光標(biāo)記的特異性探針同時(shí)結(jié)合在模板上,熒光標(biāo)記的探針與模板的結(jié)合位置位于上下游引物之間,利用Taq酶的5′3′外切酶活性,將熒光探針?biāo)?熒光基團(tuán)被釋放出來,由于在空間上與淬滅基團(tuán)分開,則發(fā)出熒光。發(fā)出的熒光可以被熒光探頭檢測到,一邊擴(kuò)增,一邊檢測,這樣就實(shí)現(xiàn)了“實(shí)時(shí)”檢測。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從半定量到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、有效解決了PCR污染問題等特點(diǎn)。
f.支鏈DNA檢測法——bDNA
bDNA是定量檢測血漿中的HIV1型RNA的一種方法。bDNA是指人工合成的帶有側(cè)鏈的DNA片段,在其每個(gè)側(cè)鏈上
都可以標(biāo)記被激發(fā)的標(biāo)記物。將HIV的RNA通過離心從病毒顆粒中釋放出來,然后用捕獲探針1將其捕獲到微孔中。捕獲探針2與病毒RNA的另一部分特異結(jié)合,又與預(yù)放大探針結(jié)合。后者再與放大探針即bDNA探針雜交。兩套靶探針分別與病毒RNA的pol基因的不同區(qū)域特異結(jié)合。在微孔中形成HIVRNA寡核苷酸復(fù)合物。再加入1種化學(xué)發(fā)光底物孵育后可放大化學(xué)發(fā)光信號。通過發(fā)光強(qiáng)度來定量,因?yàn)榘l(fā)光強(qiáng)度與樣品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在擴(kuò)增物的交叉污染,這較PCR是一大進(jìn)步。bDNA有數(shù)十個(gè)覆蓋整個(gè)基因組的探針,可以方便地檢測HIV某些變異株,但靈敏度不及PCR,提高bDNA靈敏度是一大難點(diǎn)。
檢測步驟
HIV核酸定性檢測技術(shù),其檢測過程分為核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、擴(kuò)增產(chǎn)物定性分和結(jié)果判定和完成報(bào)告單。
6.實(shí)驗(yàn)室檢測具體步驟如下:
a.核酸提取
使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動(dòng)化儀器等商品化試劑或設(shè)備并按說明書操作。提取RNA時(shí)應(yīng)注意防止RNA降解。DNA應(yīng)置于-20℃保存,RNA和需長期保存的DNA應(yīng)置于-80℃保存。
b.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴(kuò)增儀或水浴箱中,在規(guī)定的溫度和時(shí)間下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。建議使用商品化RT-PCR一步法試劑進(jìn)行第一輪擴(kuò)增反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴(kuò)增儀或水浴箱中,在規(guī)定的溫度和時(shí)間下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用商品化RT-PCR一步法試劑進(jìn)行第一輪擴(kuò)增反應(yīng)。
c.PCR擴(kuò)增反應(yīng)(使用二次擴(kuò)增的套式PCR擴(kuò)增方法)
PCR反應(yīng)需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶(如Taq酶等)、緩沖液、和適量無RNA/DNA酶超純水、以及模板(DNA或cDNA)。在擴(kuò)增儀中,按照設(shè)定的程序進(jìn)行擴(kuò)增。使用二次擴(kuò)增的套式PCR擴(kuò)增方法。
e.擴(kuò)增產(chǎn)物定性分析
擴(kuò)增產(chǎn)物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電泳法,與分子量標(biāo)準(zhǔn)比較,判斷擴(kuò)增片段是否在預(yù)期的分子量范圍內(nèi)。其它擴(kuò)增產(chǎn)物分析方法還有限制性內(nèi)切酶酶切分析、特異性探針雜交分析以及DNA序列分析等。自動(dòng)化核酸擴(kuò)增儀使用酶聯(lián)比色分析或熒光探針雜交等原理測定。
f.結(jié)果判定和完成報(bào)告單
(1)實(shí)驗(yàn)成立的條件:每一次檢測需同時(shí)做兩個(gè)陽性
對照、兩個(gè)陰性對照,只有陽性對照擴(kuò)增出預(yù)期的片段、陰性對照沒有擴(kuò)增出任何片段、雙份平行樣品結(jié)果一致的情況下實(shí)驗(yàn)才成立,可以作出核酸陽性或陰性反應(yīng)結(jié)果的判定。
(2)HIV核酸檢測陽性:發(fā)現(xiàn)核酸陽性反應(yīng),應(yīng)該重復(fù)采集樣品進(jìn)行復(fù)測,復(fù)測結(jié)果呈核酸陽性反應(yīng)則判定為核酸陽性,復(fù)測結(jié)果為核酸陰性反應(yīng)則判為不確定結(jié)果,需進(jìn)一步隨訪檢測。
(3)HIV核酸檢測陰性:只可報(bào)告本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性。
(4)應(yīng)在完成檢測后5個(gè)工作日內(nèi)發(fā)出檢測報(bào)告。