第一篇：質(zhì)粒DNA的提取、定量與酶切鑒定實(shí)驗(yàn)報告-2015級預(yù)防醫(yī)學(xué)-第2實(shí)驗(yàn)室

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報告

姓 名：

學(xué) 號：

專業(yè)年級： 2015級預(yù)防

組 別： 第二實(shí)驗(yàn)室

生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心

實(shí)驗(yàn)名稱 質(zhì)粒DNA的提取、定量與酶切鑒定

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn) 指導(dǎo)老師

教師簽名

第二實(shí)驗(yàn)室 實(shí)驗(yàn)日期 2016-12-1 合作者 評分

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

批改日期

1.掌握PCR基因擴(kuò)增的原理和操作方法 2.掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法

3.了解紫外吸收法檢測DNA濃度與純度的原理、方法 4.學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳操作

二、實(shí)驗(yàn)原理

1.PCR反應(yīng)：加熱使模板DNA在高溫下90℃-95變性，雙鏈解鏈；降低溶液溫度使合成引物在低溫（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），與模板DNA互補(bǔ)退火形成部分雙鏈；溶液反應(yīng)溫度升至中溫72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板DNA的一條單鏈在解鏈和退火之后延伸為一條雙鏈。

2.堿裂解法：基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，細(xì)菌線性染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，而質(zhì)粒DNA大部分氫鍵也斷裂，當(dāng)pH調(diào)至4.8的時候線狀染色體DNA片段難以復(fù)性而成纏連網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性蛋白質(zhì)與細(xì)胞碎片纏繞在一起而沉淀，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，并溶解于液相中。

3.離心層析柱：硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，不吸附蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)；通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除；低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

4.紫外光吸收法：物質(zhì)在光的照射下會產(chǎn)生對光的吸收效應(yīng)，而且物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的，各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜。因?yàn)榻M成核酸的堿基(G,A,T,C）在260nm處具有強(qiáng)吸收峰，所以通過測定260nm的吸收峰即可對DNA進(jìn)行定量。

5.瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度；DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動；DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶(遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系)。

三、材料與方法：

材料與儀器：

PCR反應(yīng)：PCR儀、加樣槍、菌液（大腸桿菌DH5a菌株）、引物、2×Premix Taq、滅菌去離子水；

質(zhì)粒DNA的提取與鑒定：臺式離心機(jī)、含pMD19-T質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α、AXYGEN試劑盒質(zhì)粒提取試劑盒、溶液 P1（S1，50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)、10 mmol/L EDTA(pH8.0))、溶液 P2(S2，0.2 mol/ L NaOH、1% SDS）、溶液 P3（S3，5mol/L 乙酸鈉 60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5ml）、去蛋白液 PE（W1)、漂洗液 WB(W2）、洗脫液 EB（Eluent)；

紫外光吸收法：比色杯、紫外分光光度計；

酶切鑒定：無菌水、10×M酶切緩沖液、質(zhì)粒DNA（來自質(zhì)粒DNA提取步驟）、Hind III(15U/ul)、EcoR I(12U/ul)瓊脂糖凝膠電泳：電泳指示劑、Gelview、TBE、瓊脂糖、DNA Marker 5000

實(shí)驗(yàn)方法：

煮菌，PCR（PCR程序最后設(shè)4℃保溫）

↓約2小時收集PCR產(chǎn)物

質(zhì)粒DNA提取（約1小時）

↓ 紫外檢測定量

↓ 酶切步驟 ↓ 酶切約1~2小時

↓

電泳（樣品：質(zhì)粒DNA，PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物，Marker）

↓約30分鐘 觀察電泳結(jié)果、記錄、拍照、保存

1.PCR反應(yīng)：

菌液煮沸10min, 冷凍，室溫解凍后離心取上清

↓

取0.2 ml PCR反應(yīng)管一只，用微量加樣槍分別加入各試劑

↓

在PCR儀中94℃預(yù)變性5分鐘后開始循環(huán)（94℃30 秒，50℃30 秒，72℃↓(循環(huán)30次)72℃ 5 分鐘，4 ℃ 保溫

2.質(zhì)粒DNA提取與定量）1min

取1.5ml培養(yǎng)物加入Eppendorf管中

↓

9000rpm×30 s，棄上清

↓

加入250μl 溶液S1，吹打，使細(xì)菌沉淀分散，徹底懸浮

↓

加入250μl 溶液S2，顛倒6～10次混勻（不要劇烈振蕩），直到溶液變得清亮

↓

加入400μl 溶液S3，立即溫和混勻，室溫放置3-5min。13000rpm離心10min，小心取上清液（700-800μl）

↓

將吸附柱放于收集管中，將上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm離心3min，棄濾液

↓

加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm離心1min，棄濾液

↓

向吸附柱中加入700μl 漂洗液W2，13000rpm離心1min，棄濾液

↓ 重復(fù)步驟8一次

↓

空柱13000rpm離心2min，然后室溫放置3min，使殘留乙醇揮發(fā)

↓

取出吸附柱，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間加60μl-100μl洗脫緩沖液(Eluent)，室溫放置1min，13000rpm離心1min洗脫質(zhì)粒DNA，-20℃保存?zhèn)溆?/p>

酶切鑒定：

在一個潔凈的1.5mlEP管中按順序依次加入試劑

↓

移液槍輕輕混勻,37℃水浴1.5h 瓊脂糖凝膠電泳：

將PCR、酶切及提取的質(zhì)粒DNA分別點(diǎn)樣入凝膠電泳槽中

↓ 電泳 ↓ 取出觀察并拍照

四、結(jié)果與討論：

結(jié)果：在本次實(shí)驗(yàn)中，三種產(chǎn)物從左到右為酶切產(chǎn)物，質(zhì)粒，PCR,如圖1；

圖1 在質(zhì)粒DNA的提取中，經(jīng)第一次離心過后的樣品中沉淀附著于EP管壁下方；而在對提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行純度鑒定時，可根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)比值估計核酸的純度（Ratio=A260/A280），Ratio= 1.8表示DNA樣品較純,符合實(shí)驗(yàn)要求，Ratio＞1.9表示有RNA污染，而Ratio＜1.6則表示有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染，我們所測得的A260與A280的比值分別為1.82，1.79，1.75，如圖2、3、4.圖2

圖3

A280 0.026 0.022 0.017 0.022

圖4

Ratio(A260/A280)1.82 1.79 1.75 1.79

測量次數(shù) 質(zhì)粒DNA的濃度（ug/ml）A260 1 2 3平均值 119.5 100.5 73 97.67

0.048 0.040 0.029 0.039 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后制版上呈現(xiàn)顏色不同且移動路程不同的點(diǎn)，如圖。

討論：我們組的DNA純度較純，Ratio值為1.79，但未達(dá)到1.8，說明混入了蛋白質(zhì)或其他雜物，有可能是在吸取上清液的時候吸入了蛋白質(zhì)或者是在操作過程中操作不當(dāng)，引入了污染物；也有可能是，因?yàn)榍懊娴耐瑢W(xué)在進(jìn)行紫外分光光度法測DNA的濃度及Ratio時用手多次接觸比色杯的光滑面，造成了后來我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有錯誤。每組質(zhì)粒DNA的濃度都大于55ug/ml，說明DNA濃度較純。

從瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看我們組做的PCR反應(yīng)及酶切鑒定都很成功，美中不足之處是質(zhì)粒DNA的濃度不夠，現(xiàn)象不是很明顯，說明我們沒有盡可能的吸取上清液，導(dǎo)致DNA含量不足。思考題：

（1）在堿裂解法提取質(zhì)粒DNA時，溶液1的作用是：葡萄糖懸浮細(xì)胞，EDTA鰲合金屬離子使DNase失活；溶液2的作用是：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，使核酸和蛋白質(zhì)變性；溶液3的作用是在酸性條件下使質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白-SDS＋線性DNA沉淀，而Na則可中和DNA。

（2）為了提高限制性酶切的反應(yīng)效率，應(yīng)保證DNA的純度，DNA樣品中應(yīng)不含有蛋白質(zhì)、金屬離子等雜質(zhì)，選擇合適的反應(yīng)容器，并應(yīng)在合適的pH、溫度下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及保證適當(dāng)?shù)拿笣舛?。?/p>

第二篇：質(zhì)粒DNA提取定量酶切與PCR鑒定實(shí)驗(yàn)報告

粒 質(zhì)粒 DNA 的提取、定量、酶切與 PCR 判定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.學(xué)習(xí)并掌握用堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA 的要領(lǐng)； 2.學(xué)習(xí)并掌握了解質(zhì)粒酶切判定的要領(lǐng)； 3.學(xué)習(xí)并掌握紫外吸收檢測 DNA 濃度和純度的原理和要領(lǐng)； 4.學(xué)習(xí)并掌握 PCR 基因擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)原理和操縱要領(lǐng)； 5.學(xué)習(xí)并掌握水平式瓊脂糖凝膠電泳的原理和使用要領(lǐng)。

二、實(shí)驗(yàn)原理 1.PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒错?

在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，以 dNTP 為原料，通過變性、退火、延伸等步調(diào)，在體外（緩沖液中）復(fù)制 DNA，使目的 DNA 按 2 n 方法呈指數(shù)形式擴(kuò)增。

PCR 一次循環(huán)的具體反響步調(diào)為：

A.變性：加熱反響系統(tǒng)至 95℃，使模板 DNA 在高溫下完全變性，雙鏈解鏈。

B.退火：逐漸低落溶液溫度，使合成引物在低溫（35－70℃,一般低于模板 Tm 值的 5℃左右），與模板 DNA 互補(bǔ)退火形成部分雙鏈。

C.延伸：溶液反響溫度升至中溫 72℃，在 Taq 酶作用下，以 dNTP 為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板 DNA 的一條單鏈在解鏈和退火之后延伸為一條雙鏈。

2.質(zhì)粒 DNA 的提取與制備(1).堿裂解法：

染色體 DNA 與質(zhì)粒 DNA 的變性與復(fù)性存在差別：

A.高堿性條件下，染色體 DNA 和質(zhì)粒 DNA 均變性；

B.當(dāng)以高鹽緩沖液調(diào)治其 pH 值至中性時，變性的質(zhì)粒 DNA 復(fù)性并生存在溶液中，染色體 DNA 不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可通過離心形成沉沉淀去除。

(2).離心層析柱：

A.硅基質(zhì)膜在高鹽、低 pH 值狀態(tài)下可選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒 DNA，而不吸附溶液中的卵白質(zhì)和多糖等物質(zhì)； B.通已往卵白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌身分去除； C.低鹽，高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。

3.質(zhì)粒 DNA 的定量闡發(fā)（紫外分光光度法）：

A.物質(zhì)在光的照射下會產(chǎn)生對光的吸收效應(yīng)，且其對光的吸收是具有選擇性； B.種種差別的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜: DNA 分對波長 260nm 的紫外光有特異的吸收峰 卵白質(zhì)對波長 280nm 的紫外光有特異的吸收峰 碳水化合物對 230nm 的紫外光有特異的吸收峰 C.A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反響 DNA 的純度； A260/A280=1.8

DNA 純凈 A260/A280<1.8

體現(xiàn)樣品中含卵白質(zhì)（芳香族）或酚類物質(zhì)

A260/A280>1.8

含 RNA 雜質(zhì)，用 RNA 酶去除。

4.質(zhì)粒 DNA 的酶切判定：

限制性內(nèi)切酶是 DNA 重組操縱歷程中所使用的根本東西。限制性內(nèi)切酶能特異性地與一段被稱為限制酶識別序列的特殊 DNA 序列結(jié)合，或是與其四周的特異位點(diǎn)結(jié)合，并在結(jié)合位點(diǎn)切割雙鏈 DNA。

5.瓊脂糖凝膠電泳：

瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的巨細(xì)決定于瓊脂糖的濃度。

DNA 分子在堿性情況中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。

DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)：差別的 DNA，分子量巨細(xì)及構(gòu)型差別，電泳時的泳動率就差別，從而分出差別的區(qū)帶(遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比干系).三、質(zhì)料與要領(lǐng)：

：

（一）實(shí)驗(yàn)質(zhì)料：

：

1.PCR 儀器：PCR 儀、臺式離心機(jī)、微量加樣槍、滅菌的薄壁離心管 質(zhì)料：菌液【大腸桿菌 DH5a 菌株(pMD19-T 質(zhì)粒,含目的片段-綠色熒光卵白 GFP)】、無菌去離子水、2×Premix Taq、引物 2.質(zhì)粒 DNA 的提取與制備 儀器：恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機(jī)、離心層析柱、Eppendorf 管、微量加樣槍、離心管 質(zhì)料：溶液 P1（S1）、溶液 P2(S2）、溶液 P3（S3）、去卵白液 PE（W1）漂洗液WB（W2）、洗脫液 EB（Eluent)、含 pMD19-T 質(zhì)粒的大腸桿菌 DH5α 3.質(zhì)粒 DNA 的定量（紫外分光光度法）

儀器：比色杯、紫外分光光度計、微量加樣槍 質(zhì)料：蒸餾水、質(zhì)粒ＤＮＡ 4.質(zhì)粒 DNA 的酶切判定 儀器：1.5ml 的 EP 管、微量加樣槍 質(zhì)料：無菌水、10×M 酶切緩沖液 Buf R、質(zhì)粒 DNA、Hind III(15U/ul)、EcoR I(12U/ul)5.瓊脂糖凝膠電泳

儀器：凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng) 質(zhì)料：電泳指示劑、Gelview、TBE、瓊脂糖、DNA Marker 5000、電泳緩沖液（二）實(shí)驗(yàn)要領(lǐng)

1..PCR..質(zhì)粒 DNA 的提取與制備

準(zhǔn)備目的 DNA：菌液煮沸 10min，冷凍，室溫解凍后離心取上清液 取 0.2 ml PCR 反響管一只，用微量加樣槍按下述順序分別參加：滅菌去離子水5.5μl、2*Premix Taq12.5μl、引物 1(10 mol/L)1μl、引物 2(10 mol/L)1μl、菌液 5μl 將裝有 PCR 反響體系的 PCR 反響管放入 PCR 儀上進(jìn)行如下操縱：

①94℃預(yù)變性5分鐘后開始以下循環(huán) ②循環(huán)為94℃——30 秒，50℃——30 秒，72℃ ——1 分鐘。循環(huán)為 30 次 ③72℃ 5 分鐘 ④4 ℃

保溫 取 1.5ml 培養(yǎng)物參加 Eppendorf 管中 將擴(kuò)增后的基因用微量加樣槍加到電泳儀的凝膠孔中

13000rpm x 1min，棄上清

將 PCR 反響管置臺式離心機(jī)中瞬時離心

3.質(zhì)粒 DNA 的定量（紫外分光光度法）

參加 250μl 溶液 S1，吹打，使細(xì)菌沉淀疏散，徹底懸浮

參加 250μl 溶液 S2，顛倒 4～6 次混勻（不要劇烈振蕩），直到溶液變得清亮

參加 350μl 溶液 S3，立即溫和混勻 6~8 次。13000rpm 離心 10min，小心取上清液（500-800μl）

將吸附柱放于收集管中，將上一步所得上清液參加吸附柱中，13000rpm 離心 3min，棄濾液

參加 500μl 去卵白液(W1)，13000rpm 離心 1min，棄濾液

向吸附柱中參加 700μl 漂洗液 W2，13000rpm 離心 1min，棄濾液；重復(fù)一遍 空柱 13000rpm 離心 1min，然后室溫安排 3min，使殘留乙醇揮發(fā) 取出吸附柱，放入一個潔凈的離心管中，在吸附膜的中間加 50μl 洗脫緩沖液(Eluent)，室溫安排 1min，13000rpm 離心 1min 洗脫質(zhì)粒 DNA，-20℃生存?zhèn)溆?清洗比色皿：用微量加樣槍向比色皿參加適量的蒸餾水刷洗，2~3 次。并用濾紙擦拭潔凈 空白比較比色測定 向比色皿參加 98ul 蒸餾水，進(jìn)行 Blank 調(diào)零 再向比色皿參加 2ul 的質(zhì)粒 DNA，于紫外分光光度計上進(jìn)行‘sample’測定，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)

4..質(zhì)粒 DNA 的酶切判定

5.瓊脂糖凝膠電泳

四、結(jié)果與討論 ：

（一）實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象 1.參加溶液 P1，出現(xiàn)懸表現(xiàn)象； 2.參加溶液 P2,溫和混勻，溶液會變得清亮； 在一個潔凈的 1.5mlEP 管中按順序依次參加下述試劑

無菌水 9.0μl、10×M 酶切緩沖液 2.0μl、質(zhì)粒 DNA 7.0μl、Hind III(15U/ul)1.0μl、EcoR I(12U/ul)

1.0μl 小心混勻試劑，將 EP 管置于恒溫水浴箱中 37℃1.5 小時。

取質(zhì)粒 DNA、經(jīng)酶切反響后的 DNA 片段和 PCR擴(kuò)增的 DNA 各 6μl 于三個 EP 管中并做好標(biāo)記 往每個 EP 管中參加 1μlGelview 染料，室溫安排一分鐘 用微量加樣槍分別各吸取 10ul，按序號參加到電泳儀的凝膠孔中 電泳 30 分鐘

取出凝膠 紫外光下視察，拍照

3.參加溶液 P3,有白色絮狀沉淀生成； 4.電泳時，可視察到在電流作用下，點(diǎn)樣的溶液出現(xiàn)電泳現(xiàn)象，電泳速度差別。

在紫外檢測儀條件下，可以視察到差別的物質(zhì)出現(xiàn)差別的電泳帶。

（二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 丈量次數(shù)

質(zhì)粒 DNA 濃度（ug/ml）

Ratio 比值(A260/A280)

148

1.46

1.52

115

1.45平均值

123

1.47

電泳后的圖片

A:PCR 目的條帶

B:酶切片段

C:質(zhì)粒 DNA

（四）實(shí)驗(yàn)闡發(fā) 1.由上數(shù)據(jù)可知，Ratio=1.47

A260/A280<1.8

表明樣品中含有較多的卵白質(zhì)（芳香族）

2.在圖片中，其他三類 DNA 與 Maker 相比力，可知質(zhì)粒 DNA 的分子巨細(xì)在 2500bp-3500bp，酶切反響的質(zhì)粒 DNA 片段分子巨細(xì)在 2800-3000bp 和 400-500 左右，PCR 的 DNA 分子巨細(xì)在 400-500bp。根本切合預(yù)期。

（四）實(shí)驗(yàn)討論 1.質(zhì)粒 DNA 中出現(xiàn)三條帶，分別對應(yīng)超螺旋質(zhì)粒 DNA、線性 DNA 和開環(huán)狀質(zhì)粒 DNA。這三種差別構(gòu)型的分子有差別的遷移率，在一般情況下，遷移速度最快的為超螺旋型，其次為線性分子，最慢的為開環(huán)狀分子，所以條帶從上到下分別為：超螺旋型 DNA、線性分子、開環(huán)狀分子。, 2.對付實(shí)驗(yàn)結(jié)果中：A260/A280<1.8 的可能原因?yàn)椋?/p>

A.在質(zhì)粒 DNA 的提取實(shí)驗(yàn)的“取上清液”步調(diào)中吸入沉淀導(dǎo)致引入較多的卵白雜質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)中因卵白質(zhì)量較多而難以去除。

B.可能為試劑污染引起雜質(zhì)卵白的引入。

3.實(shí)驗(yàn)中需注意的事項：

用微量加樣槍加試劑時，同種試劑可以不消換吸頭，每次換差別試劑時要記得換一個新吸頭。

在 PCR 中，如果配好的反響液較多沾到管壁上，要將 PCR 反響管置臺式離心機(jī)中瞬時離心，使反響液會合于管底，然后才將反響管放到基因擴(kuò)增儀上。

在質(zhì)粒 DNA 提取的實(shí)驗(yàn)中，參加溶液 S2 時，時間不能太久，行動要溫柔，輕輕顛倒頻頻。

在電泳實(shí)驗(yàn)中，點(diǎn)樣時槍頭下伸，點(diǎn)樣孔內(nèi)不能有氣泡。

在電泳中，Geldview 有毒，切勿用手打仗。

思考題：

（1）堿裂解法提取質(zhì)粒時，溶液 I、II、III 的作用分別為？ 答：

溶液 I：螯合金屬離子，抑制脫氧核酸酶對 DNA 的降解作用；有利于溶酶體的作用。

溶液 II：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和卵白質(zhì)變性。

溶液 III：酸性條件下質(zhì)粒 DNA 復(fù)性，變性卵白-SDS+線性 DNA 沉淀，Na+可中和 DNA。

（2）結(jié)合實(shí)驗(yàn)情況，如何提高限制性酶切的反響效率？ 答：

①盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。

②酶量的選擇任何時候 2 種酶的總量不能凌駕反響體系的 1/10 體積，并且最大反響體系最好不要小于 20 ul，且酶切反響中甘油濃度應(yīng)低于 5%。

③底物 DNA 的純度：主要污染 DNA 的某些物質(zhì)，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反響應(yīng)盡量純化底物。

④反響系統(tǒng)：主要是反響緩沖液中的離子強(qiáng)度,如 NaCl 和 Mg2+, 符合離子強(qiáng)度可以引發(fā)酶切反響。