第一篇：植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生物質的最新研究進展和產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀

植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生物質的最新研究進展和

產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀

摘要：本文將對植物的大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生物質的最新研究進展及產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀進行簡要介紹。

關鍵詞：植物細胞培養(yǎng)；次生物質；研究進展；產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀

1．引言

植物組織細胞培養(yǎng)技術是應用生物工程研究成果，在細胞水平上生產(chǎn)植物生物制品的技術。自從TalⅪta M．由紫草細胞培養(yǎng)提取出紫草寧成為第一個植物細胞培養(yǎng)技術商品至今，國內(nèi)外動、植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)研究很快遍布各個醫(yī)藥領域。植物的次級代謝產(chǎn)物是藥物和一些工業(yè)原料的重要資源，其中許多是難以人工合成但具有顯著藥用或經(jīng)濟價值的特殊物質。該技術尤其適合于資源短缺、采集困難、種植要求高的名貴藥材。運用植物細胞培養(yǎng)技術研制與開發(fā)現(xiàn)代天然產(chǎn)物是當今國際細胞培養(yǎng)技術產(chǎn)業(yè)化的熱點問題和主要發(fā)展方向之一，也是我國實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化，開創(chuàng)低成本、高產(chǎn)出、無污染的工業(yè)化生產(chǎn)天然植物藥的新路子。

2、植物次生代謝產(chǎn)物植物次生代謝產(chǎn)物是植物對環(huán)境的一種適應，是在長期進化過程中植物與生物和非生物因素相互作用的結果。在對環(huán)境脅迫的適應、植物與植物之間的相互競爭和協(xié)同進化、植物對昆蟲的危害、草食性動物的采食及病原微生物的侵襲等過程的防御中起著重要作用。

次生代謝過程被認為是植物在長期進化中對生態(tài)環(huán)境適應的結果，它在處理植物與生態(tài)環(huán)境的關系中充當著重要的角色。許多植物在受到病原微生物的侵染后，產(chǎn)生并大量積累次生代謝產(chǎn)物，以增強自身的免疫力和抵抗力。植物次生代謝途徑是高度分支的途徑，這些途徑在植物體內(nèi)或細胞中并不全部開放，而是定位于某一器官、組織、細胞或細胞器中并受到獨立的調(diào)控。

它們是細胞生命活動或植物生長發(fā)育正常運行的非必需的小分子化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發(fā)育時期的特異性。３．通過植物細胞培養(yǎng)獲取次生代謝產(chǎn)物的研究歷史

4自1902 年Haberlant 預言高等植物細胞具有全能性以來, 植物細胞培養(yǎng)開

始被用于研究植物的生物合成。用細胞懸浮培養(yǎng)來研究植物代謝物的合成和生產(chǎn), 是50 年代末期才開展起來的工作。1956 年Routie 讓和Nickel l首次提出用植物

細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)有用的次生物質。steward 和shantzv 1956 年進行胡蘿卜根愈

傷組織的液體培養(yǎng), 發(fā)現(xiàn)其游離組織和小細胞團的懸浮液可以進行長期繼代培

養(yǎng), 并于1958 年以胡蘿卜根的懸浮細胞誘導分化成完整的小植株。日本人借助

于他們在發(fā)酵技術上的優(yōu)勢, 曾努力把這一技術應用于植物次生代謝物質的商

業(yè)性生產(chǎn)。1982 年, 在日本召開的第五屆國際植物組織和細胞培養(yǎng)會議上, 372

篇論文中大約有70 篇是關于植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生物質方面的報告, 有幾篇是

關于它們在商業(yè)上應用的可行性研究報告.1975-1985年間用于促進細胞生長和產(chǎn)

物形成的方法開始有所進展。1985 年T abata和Fujita 將提高產(chǎn)量的多種方法相

結合實現(xiàn)了第一次商業(yè)性的植物細胞培養(yǎng)。隨后, 人們在植物細胞培養(yǎng)次生代榭

物的產(chǎn)生動力學和復抗的累積杖式方面做了大量研究。Heike Dor nen bu g 和

Dietrich Knor : 等人在1997 年設計出了適用于植物細胞培的特殊加工方法, 它

包括固定化, 體內(nèi)產(chǎn)物分離提取和連續(xù)操作。目前, 植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)植物次生

代謝產(chǎn)物已發(fā)展到全自動控制的大容積發(fā)酵罐大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的連續(xù)培養(yǎng)。４．植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生產(chǎn)物的研究進展

植物細胞培養(yǎng)始于本世紀初, 并不可爭議地具有工業(yè)化潛力。目前植物細胞

培養(yǎng)生產(chǎn)的化合物很多, 包括糖類、酚類、脂類、蛋白質、核酸以及帖類和生物

堿等初生和次生代謝產(chǎn)物, 植物細胞培養(yǎng)的應用主要包括以下3個方面: 有用物

質(次生代謝產(chǎn)物)的生產(chǎn);植物無性系的快速繁殖和遺傳突變體的篩選;植物細胞

遺傳、生理、生化和病毒方面的深入研究。但是由于植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術的局限性使得植物細胞仍難以實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn), 迫切需要進一步研究和發(fā)

展細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化控制及其工藝。目前, 世界上眾多研究工作集中在優(yōu)化細

胞培養(yǎng)環(huán)境、改變細胞特性、選用高產(chǎn)細胞系、改善生物反應器、提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)率并保證其生產(chǎn)穩(wěn)定性上。

4.1、植物細胞培養(yǎng)的特性

（1）植物細胞較微生物細胞大得多，有纖維素細胞壁．細胞耐拉不耐扭，抵抗

剪切力差；（2）培養(yǎng)過程生長速度緩慢，易受微生物污染，需用抗生素；（3）

細胞生長的中期及對數(shù)期．易凝聚為直徑達350JJm一400Pm的團塊，懸浮培

養(yǎng)較難；（4）培養(yǎng)時需供氧，培養(yǎng)液粘度大：（5）具有群體效應；（6）因

為有細胞壁, 培養(yǎng)細胞產(chǎn)物滯留于細胞內(nèi)，產(chǎn)量較低；（7）細胞培養(yǎng)過程有結

構與功能全能性,因而易分化,從而導致目的產(chǎn)物低于原植物體內(nèi)濃度；（8）懸

浮培養(yǎng)中要求有一定的細胞濃度，否則不生長（25000~50000個/ML）。

4.2、高產(chǎn)細胞系篩選

近幾十年來, 利用植物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究取得了飛速發(fā)

展, 人們已經(jīng)對1 000多種植物進行過細胞培養(yǎng)方面的研究, 從培養(yǎng)細胞中分離

得到600多種次生代謝產(chǎn)物, 有的已經(jīng)成為藥品投放市場.利用植物細胞培養(yǎng)技

術生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的關鍵步驟就是高產(chǎn)穩(wěn)定細胞系的獲得, 因此, 利用植物

細胞的變異性, 采取各種手段反復不斷地篩選出高產(chǎn)穩(wěn)定的細胞系, 對通過細

胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物具有重要意義.一個具有高產(chǎn)性能的細胞系的從頭篩

選, 除了整個過程培養(yǎng)條件的優(yōu)化之外, 還應滿足下列條件:

1)有足夠的變異源細胞群;2)可成功進行單細胞克隆;3)有簡單、快捷、靈

敏的產(chǎn)物分析方法;4)能進行細胞系穩(wěn)定性試驗[ 2].高產(chǎn)細胞系的篩選有很

多不同的方法, 如目視法、單細胞克隆法、小細胞團法、抗性篩選法、負篩選法

以及原生質培養(yǎng)法等.到目前為止, 已在很多植物培養(yǎng)細胞中篩選到具有高產(chǎn)

次生代謝產(chǎn)物特性的細胞系.高產(chǎn)細胞系篩選一般遵循以下思路進行

外植體

↓

愈傷組織小細胞團法

↙↘↑懸浮培養(yǎng)平板培養(yǎng) → 小細胞團

↓

單細胞誘變處理抗性篩選法

↓

原生質體原生質體培養(yǎng)

篩選植物高產(chǎn)細胞系常用的方法有目視法、放射免疫法(R IA)、酶聯(lián)免疫

法(EL IA)、高效液相色譜法(HPLC)等。目前國外還采用一種突變種篩選法, 其

原理是把一些細胞毒性抑制劑如p-氟苯丙氨酸(PFP)、5-甲基色氨酸、草苷磷、維生素H 等加入到要篩選的細胞培養(yǎng)體系中, 那些耐藥性強且經(jīng)過一段時間培

養(yǎng)生長正常的細胞系就可能是所要求的高產(chǎn)細胞系。例如從觀賞辣椒提取辣椒素

和牛舌草提取迷迭香酸的細胞系篩選就應用了PFP并獲得成功。

4.3、生物反應器

自從1960 年Tuleche 和Nickel 首次報道在134 L 生物反應器中成功培養(yǎng)

不同植物種類以來, 利用植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術為植物有用代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)

提供了有效生產(chǎn)途徑和生產(chǎn)方法。近幾年在這方面也取得了較大的發(fā)展,如日本的三井石油化學公司采用750 L 攪拌式反應器二步法培養(yǎng)紫草細胞, 實現(xiàn)了紫

草寧的工業(yè)化生產(chǎn)(Noguchi et al , 1977);Ulbrich 等(1985)分別用氣升

式及攪拌式反應器二步法大量生產(chǎn)迷迭香酸(rosmarinic acid);而Schiel 等

（1984)利用批式進料技術生產(chǎn)顯著提高了肉桂酰丁二胺(cinnamoyl

putrescines)在細胞中的積累。用于植物細胞培養(yǎng)的生物反應器是從培養(yǎng)微生物細胞反應器改進、發(fā)展而來的, 具有獨特的特點。

細胞自由培養(yǎng)：當前使用的反應器主要有攪拌式(STR)、氣升式(air_lift)、鼓泡式(bubble colum)、轉鼓式(rotating drum)

細胞固定化培養(yǎng)：根據(jù)載體的不同, 可將反應器類型主要分為膠粒固定反應器(gel_entrapped cell reactor)和膜反應器(membranereactor)

植物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)次生代謝物的增產(chǎn)策略。

5.植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生產(chǎn)物工業(yè)化現(xiàn)狀

目前利用植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的工作已經(jīng)取得很大進展。經(jīng)過對多種植物細胞培養(yǎng)的驗證試驗，植物組織或細胞培養(yǎng)物經(jīng)過篩選，就有可能生產(chǎn)幾倍于其完整植株所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，而且可以減少占用土地，不受季節(jié)、地域等環(huán)境的限制，還可排除病蟲害的干擾。但目前仍存在一些需要進一步研究和解決的問題：

5.1植物細胞培養(yǎng)需要解決的問題

（1）氧和二氧化碳的控制，過多氧過少氧均不利于生長；（2）營養(yǎng)物的供應；（3）細胞密度過高引起細胞團聚甚至分化（4）培養(yǎng)過程中細胞的分化的防止，（5）細胞取得中微生物的去除；（6）細胞壁脆性的存在要求培養(yǎng)體系剪切力要小；

5.2．植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)中的有關工程技術問題

（1）．懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)必須適應植物細胞特性（2）．植物細胞培養(yǎng)液的流變特性（3）．植物細胞培養(yǎng)過程中的氣體調(diào)節(jié)（4）．泡沫和表面粘附性（5）、剪切力對植物細胞的影響

6.展望

植物細胞培養(yǎng)中次生代謝物的產(chǎn)生被認為是生化水平上的分化過程, 而且取決于環(huán)境條件和培養(yǎng)材料的基因型。利用細胞培養(yǎng)技術商業(yè)化生產(chǎn)次生產(chǎn)物將主要取決于增加產(chǎn)物產(chǎn)量和縮短發(fā)酵時間的策略。目前提高產(chǎn)物含量的方法多是經(jīng)驗性的, 今后應重視以下幾方面的研究：

（1）、生產(chǎn)培養(yǎng)基的開發(fā), 目前使用的培養(yǎng)基多為培養(yǎng)物生長而設計的, 對次生代謝物的合成不一定合適。通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基組分,可以開發(fā)出適于次生代謝物合戌的生產(chǎn)培養(yǎng)基。

（2）、發(fā)展高產(chǎn)細胞株的選擇技術, 以縮短選擇高產(chǎn)細胞株的時間。Cocking等提出采用熒光激活細胞分選術選擇植物細胞, 以獲得高產(chǎn)細胞株。

（3）、植物細胞或關鍵酶的固相化。利用固相化植物細胞或酶進行次生代謝物的生物合成和生物轉化, 以提高生產(chǎn)率。

（4）、代謝途徑的調(diào)節(jié)。通過操作培養(yǎng)植物細胞次生代謝的表達, 可以提高產(chǎn)量, 促進產(chǎn)物釋放到培養(yǎng)基中, 通過代謝途徑的修飾進行新化合物的合成和轉化。

（5）、利用真菌誘發(fā)因子誘導或刺激植物細胞培養(yǎng)物次生代謝物的合成。

（6）、利用懸浮培養(yǎng)細胞產(chǎn)生的中間代謝物, 經(jīng)過化學或酶學方法處理獲得所需的最終產(chǎn)物, 以縮短生產(chǎn)時間。

隨著對培養(yǎng)植物細胞的生理、生化和遺傳特性的深入了解, 以及提高產(chǎn)物產(chǎn)量方法的發(fā)展, 利用植物細胞培養(yǎng)技術商業(yè)化生產(chǎn)天然產(chǎn)物必將在工業(yè)中得到廣泛的應用, 并獲得巨大的經(jīng)濟效益。