第一篇：骨髓間充質(zhì)干細胞向視網(wǎng)膜光感受器樣細胞誘導(dǎo)分化探討

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骨髓間充質(zhì)干細胞向視網(wǎng)膜光感受器樣細胞誘導(dǎo)分化探討

作者：陳金國 徐國興 白 月 徐 巍 郭 健

來源：《海峽科學(xué)》2010年第05期

[摘要] 目的：探討體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rat mesenchymal stem cells，rMSCs)誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜光感受器樣細胞的能力。方法：用貼壁篩選法分離、培養(yǎng)SD大鼠骨髓MSC細胞，經(jīng)流式細胞儀鑒定后，利用光感受器細胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)MSC細胞14 d。用免疫細胞化學(xué)染色和Rt-PCR觀察誘導(dǎo)后的細胞是否表達視紫紅質(zhì)（Rhodopsin）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）。結(jié)果：誘導(dǎo)細胞14d后即可見有神經(jīng)元樣細胞出現(xiàn)，實驗組MSC的Rhodopsin表達率為35.1%±6.2 %，而對照組中無Rhodopsin陽性的細胞, 實驗組MSC的NSE表達率為33.6%±4.0 %，對照組為10.6%±5.0%, 實驗組MSC的GFAP表達率為9.6%±1.5 %，對照組為13.7%±3.0 %。RT-PCR鑒定結(jié)果分析示實驗組MSC的GFAP、NSE、Rhodopsin mRNA均有表達，而對照組的只表達GFAP和NSE，未見Rhodopsin條帶。結(jié)論：體外培養(yǎng)的rMSC，經(jīng)過視網(wǎng)膜光感受器細胞培養(yǎng)上清液導(dǎo)，可以分化為視網(wǎng)膜光感受器樣細胞。

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細胞 光感受器細胞 誘導(dǎo)分化

骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)，是一群具有多向分化潛能的均質(zhì)性成體干細胞，它具有兩項干細胞最顯著的生物學(xué)特性：自我更新(self-renewa1)能力及多向分化潛能。1968年, Friedenstein[1]等學(xué)者首先報告骨髓中存在一種細胞具有高度的自我更新能力和多向分化潛能,他們認為這種細胞可能是間充質(zhì)細胞的前體。隨著研究的發(fā)現(xiàn)，MSC具有向中內(nèi)外胚層組織細胞分化的能力 ,可以在體外被誘導(dǎo)分化為肌肉細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、肝細胞、上皮細胞、神經(jīng)細胞等[2, 3]。近年來，BMSCs向神經(jīng)元細胞的分化的研究成為了研究的熱點。可利用抗氧化劑、生長因子、維甲酸、共培養(yǎng)等將骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)成神經(jīng)樣細胞[4-6]。本文探索了利用視網(wǎng)膜光感受器培養(yǎng)上清液體外誘導(dǎo)BMSCs分化為視網(wǎng)膜光感受器樣細胞的可行性。材料和方法

1.1 材料

清潔級健康Sprague-Dawley（SD）大鼠20只40眼，重量100~125g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司； DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，Neurobasal培養(yǎng)基（美國

Invitrogen公司），B27(美國Invitrogen公司)，胎牛血清（美國Hyclone公司），0.25％胰蛋白酶（美國Hyclone公司），木瓜蛋白酶（美國sigma公司），多聚賴酸（美國sigma公司），小鼠抗大鼠單CD34-FITC、CD44-PE和CD90-PE，以及相應(yīng)同型對照單抗小鼠IgG1-

FITC, IgG1-PE和IgG2a –PE（Beckman-Coulter公司），神經(jīng)元特異性標志小鼠抗大鼠醇化酶（美國 Fisher Scientific公司），光感受器特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體視紫質(zhì)(Rhodopsin)（RET-P1，美國Millipore公司），星形膠質(zhì)細胞特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)（美國 Fisher Scientific公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司），總抽提試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），THERMO FORMA 3111 CO2培養(yǎng)箱（美國），OLYMPUS 1×70熒光倒置式相差顯微鏡（日本），OLYMPUS BH-2型光學(xué)顯微鏡（日本），Beckman-Coulter Epics XL 流式細胞儀（美國），臺式高速冷凍離心機（上海），Gene Amp 9700型PCR 擴增儀（美國），Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)（Gel DOC2000）（美國），AIR-TECH BCM-1000A型生物潔凈工作臺（蘇州）。

1.2 方法

1.2.1骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定

取清潔級SD大鼠，4mL／kg水合氯醛(100g/L)進行腹腔麻醉。碘伏消毒，無菌條件下取出大鼠的雙側(cè)脛骨和股骨，分別剪斷股骨干和脛骨中間及兩端的干骺剪斷，用含有肝素的培養(yǎng)液10mL進行反復(fù)沖洗骨髓腔，沖洗液經(jīng)200目不銹鋼標準篩網(wǎng)過濾組織塊以及已凝血塊后，進行離心后用20%FBS的DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液接種于25cm2 培養(yǎng)瓶中，24h后首次換液去除未貼壁細胞，以后每2d換液一次，換液前PBS洗去部分未貼壁細胞，當70％～80％細胞達到融合時用0.25%胰蛋自酶消化傳代，進行擴增培養(yǎng)。用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34、CD44和CD90的表達[7]。

1.2.2視網(wǎng)膜光感受器細胞的分離培養(yǎng)和鑒定

在暗環(huán)境下無菌取下清潔級SD大鼠的眼球，游離出完整的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層。利用木瓜蛋白酶進行消化分離出光感受器細胞，用Neurobasal培養(yǎng)基A 1mL（加入1:50的B27和

0.5mM L-glutamine）進行避光培養(yǎng)，兩天換液一次，將視網(wǎng)膜光感受器細胞培養(yǎng)換液的上清液收集于干凈玻璃瓶中，通過0.22um過濾篩過濾后按2:3比例與DMEM培養(yǎng)液混合后備用。分別把消化前和消化后的視網(wǎng)膜片進行HE染色,在顯微鏡下觀察，同時對分離的光感受器細胞進行免疫細胞化學(xué)鑒定。

1.2.3對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞進行誘導(dǎo)以及鑒定

將3代的rMSCs接種在6孔板中。分為2個對照組，4個實驗組。實驗組加入光感受器細胞上清液與10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（2:3）進行誘導(dǎo)，對照組用Neurobasal培養(yǎng)基A與10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（2:3）進行培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長及分化情況，誘導(dǎo)后14天，行免疫細胞化學(xué)和Rt-PCR鑒定，免疫細胞化學(xué)：PBS洗滌3次，多聚甲醛固定，0.2％Triton-X作用10 min，過氧化酶阻斷，非免疫動物血清孵育 10 min，加Rhodopsin(1:100), NSE(1:200),GFAP(1:100)抗

體，4℃過夜，加入生物素標記的第二抗體，鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶溶液，DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察。RT—PCR法檢測實驗組和對照當中的GFAP，NSE，Rhodopsin的表達。Rhodopsin引物上游引物

ATGTTCGTGGTCCACTTCA3’，下游引物5’ CGTTGTCCTCA

GCCGATG 3’，擴增長度為107bp；NSE引物上游引物：5’ CTGTGGTGGAGCAGGAGA 3’，下游引物5’ GGGAGATAGC

GGTGTAAC 3’，擴增長度為156bp；GFAP引物上游引物：

5’TAGGAGTGGTAGGGCAGACTTG3’，下游引物5’GCAACC

AGGAATAGACCTTCACAA 3’，擴增長度為482bp；內(nèi)參Rat GAPDH 為

5’CAGTGCCAGCCTCGTCTC 3’，BC050110為5’ AGGGGCCATCCACAGTCTTC 3’，擴增長度為595bp。參照TRIZOL試劑說明書對誘導(dǎo)的MSC分別提取總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄、PCR擴增，將 PCR產(chǎn)物電泳后進行圖像分析儀采集圖像。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包(statistical package for the social science)分析，采用t檢驗。結(jié)果

2.1骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定

培養(yǎng)的大鼠的BMSCs接種后24小時開始貼壁，前3天細胞增殖慢，數(shù)量比較少，第3開始細胞的增長速度明顯增加，7天后就達到融合狀態(tài)，呈現(xiàn)漩渦狀、菊花狀。第三代時，細胞仍呈梭形，生長旺盛。BMSCs標志鑒定結(jié)果表明，培養(yǎng)的第三代BMSCs干細胞表面標志CD90陽性（CD90+/CD34-：92%），基質(zhì)細胞表面標志CD44陽性（CD44+/CD34-：93%）（見圖1）。

圖1 大鼠MSC流式細胞儀檢測結(jié)果（A: CD90+/CD34-：92%;B: CD44+/CD34-：93%)

2.2 視網(wǎng)膜光感受器細胞的鑒定

取下來的視網(wǎng)膜在消化前后分別進行HE染色，消化前可以很清楚地觀察到九層細胞，說明取下來的是完整的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，不含有色素上皮，消化后的視網(wǎng)膜片，光感受器層的細胞變少，其它層細胞完整，光感受器細胞的免疫細胞化學(xué)示，光感受器細胞的特異標志物視紫紅質(zhì)的表達率達95%以上。

2.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的誘導(dǎo)

實驗組BMSCs誘導(dǎo)后的第4天細胞形態(tài)開始變化，可見小的突起。隨后細胞便圓，突起增長，出現(xiàn)少量神經(jīng)樣細胞的形態(tài)，到14天最為明顯，出現(xiàn)一、二級分支，相互之間連接呈網(wǎng)狀。對照組也有少量的細胞呈神經(jīng)樣的形態(tài)。誘導(dǎo)后的神經(jīng)元樣細胞GFAP，NSE，Rhodopsin呈強陽性。非神經(jīng)元樣細胞呈多邊形或梭形，上述抗體染色呈弱陽性。陰性對照未見染色。

免疫細胞化學(xué)鑒定，共培養(yǎng)2周后，陽性細胞計數(shù)結(jié)果顯示： rMSC的Rhodopsin表達率實驗組為35.1%±6.2 %（圖2A）,而對照組中無Rhodopsin陽性的細胞（圖2B），rMSC的NSE表達率實驗組為33.6%±4.0 %（圖3A），對照組為10.6%±5.0%（圖3B）, rMSC的GFAP實驗組的表達率為9.6%±1.5 %（圖4A），對照組為：13.7%±3.0 %（圖4B）； 對照組與實驗組進行兩樣本的t檢驗NSE：F =0.09，方差齊，P < 0.001，有統(tǒng)計學(xué)意義，GFAP：F =1.726，方差齊，P ＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。

A:實驗組大量表達Rhodopsin(×100)；B:對照組未表達Rhodopsin(×100)

圖2 免疫細胞化學(xué)rMSCs表達Rhodopsin結(jié)果

A:實驗組大量表達NSE(×100)；B:對照組少量表達NSE(×100)

圖3 免疫細胞化學(xué)rMSCs表達NSE結(jié)果

A:實驗組表達有GFAP(×100)；B：對照組表達有GFAP(×100)

圖4 免疫細胞化學(xué)rMSCs表達GFAP結(jié)果

RT-PCR鑒定結(jié)果分析顯示，實驗組MSC的GFAP、NSE、Rhodopsin均有表達，其中GFAP表達比較弱；而對照組的只表達GFAP和NSE，且均較弱，未見Rhodopsin條帶(圖5)。A:為實驗組，GFAP、NSE、Rhodopsin均有表達；B:為對照組，只表達GFAP和NSE。圖5 Rt-PCR檢測GFAP、NSE、Rhodopsin討論

本實驗?zāi)M視網(wǎng)膜體內(nèi)發(fā)育的微環(huán)境誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞成為視網(wǎng)膜細胞，利視網(wǎng)膜光感受器細胞培養(yǎng)上清液對骨髓間充質(zhì)干細胞進行向視網(wǎng)膜樣細胞誘導(dǎo)。本實驗關(guān)于視紫紅質(zhì)的檢測，實驗組表達率高達35.1 %±6.2 %，對照組沒有表達，說明其光感受器條件培養(yǎng)基能使MSC向光感受器細胞方向轉(zhuǎn)化。從而驗證了大鼠MSC確實可以在體外被誘導(dǎo)為表達視紫紅質(zhì)的光感受器樣細胞，Tomita M[8]研究表明不管是利用BDNF, NGF, and bFGF或與視網(wǎng)膜片共培養(yǎng)，均未發(fā)現(xiàn)表達Rhodopsin的證據(jù)。Anthony等[5]對BMSCs向視網(wǎng)膜光感受器細胞誘導(dǎo)分化進行了體內(nèi)外實驗。利用維甲酸、?；撬岷虴GF體外將小鼠 BMSCs成功誘導(dǎo)為視網(wǎng)膜光

感受器樣細胞，誘導(dǎo)后的細胞可以表達視網(wǎng)膜光感受器細胞特異性標志物：視紫紅質(zhì)、視蛋白和恢復(fù)蛋白，最近國內(nèi)學(xué)者單純用EGF也可以誘導(dǎo)rMSC表達Rhodopsin[9]。本實驗當中NSE表達率也明顯高于對照組，而GFAP，兩組表達并無差異，說明，光感受器條件培養(yǎng)基促進rMSC向神經(jīng)元細胞方向分化，而對于膠質(zhì)細胞方向分化并無誘導(dǎo)作用。本實驗的對照并未加誘劑的rMSC也能表達神經(jīng)元特異性標志，Tomita M[8] 研究說明沒有生長因子誘導(dǎo)的MSC沒有向神經(jīng)方向分的證據(jù)，強調(diào)生長因子在神經(jīng)分化中的重要地位，但是也有許多學(xué)者提出了在未誘的條件下仍發(fā)現(xiàn)神經(jīng)特異性標志物的表達，Tondreau T等[10]發(fā)現(xiàn)未誘的的MSC也可以表達神經(jīng)特異標記物，如Nestin和β微管蛋白Ⅲ，酪氨酸羥化酶等。Deng J[11]研究中也證實，體外培養(yǎng)大鼠的MSC具有自發(fā)表達早期的神經(jīng)標記物(如Nestin和β微管蛋白Ⅲ)，也有細胞表達成熟神經(jīng)細胞的標記物，如神經(jīng)微絲M（FNM），這些跟本實驗對照組仍能誘導(dǎo)的MSC能表達NSE相一致。

我們的實驗利用光感受器細胞上清液模擬視網(wǎng)膜體內(nèi)發(fā)育的微環(huán)境誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞成為視網(wǎng)膜光感受器樣細胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞培養(yǎng)上清液可能在骨髓間充質(zhì)干細胞的存活與分化方面起重要作用。盡管BMSC向神經(jīng)細胞分化的研究已獲得了一些令人鼓舞的結(jié)果，但是還面對了許多待進一步解決的問題：（1）對于BMSC的鑒定一直都沒有一個統(tǒng)一的說法，對BMSC的細胞學(xué)特點和分化各階段細胞標志物的進一步研究；（2）光感受器細胞在體外的外節(jié)容易脫落變性，如何進一步保持其完整性以及存活時間；（3）體外BMSC向視網(wǎng)膜樣細胞誘導(dǎo)分化模式和分子調(diào)控機制還不甚清楚，其誘導(dǎo)的微環(huán)境還比較復(fù)雜，有的學(xué)者直接采用雞尾酒式的加入好幾種生長因子進行誘導(dǎo)，對于其中各生長因子具體作用以及相互間的作用仍不清楚；（4）對于本實驗誘導(dǎo)出來表達視紫紅質(zhì)的MSC細胞的與真正的光感受器細胞之間不管是從形態(tài)上還是都有很大的差距，縮短這一差別，將MSC真正應(yīng)用于眼科臨床，還需進一步深入的研究探索。

參考文獻：

[1] Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI, et al.Heterotopic of bone marrow.Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues[J].Transplantation, 1968,6(2):230-247.[2] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science, 1999,284(5411):143-147.[3] Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, et al.Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications[J].Stem Cells, 2001,19(3):180-192.[4] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J].J Neurosci Res, 2000,61(4):364-370.[5] Kicic A, Shen WY, Wilson AS, et al.Differentiation of marrow stromal cells into photoreceptors in the rat eye[J].J Neurosci, 2003,23(21):7742-7749.[6] Ullian EM, Sapperstein SK, Christopherson KS, et al.Control of synapse number by glia[J].Science, 2001,291(5504):657-661.[7] 謝茂松,徐國興,李瓊,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)方法的比較[J].國際眼科雜志, 2007,7(5):1285-1287.[8] Tomita M, Mori T, Maruyama K, et al.A comparison of neural differentiation and retinal transplantation with bone marrow-derived cells and retinal progenitor cells[J].Stem Cells, 2006,24(10):2270-2278.[9] 張枝橋, 董方田, 等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)為光感受器樣細胞的研究[J].中華眼科雜志, 2008,44(6):540-544.[10] Tondreau T, Lagneaux L, Dejeneffe M, et al.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells already express specific neural proteins before any differentiation[J].Differentiation, 2004,72(7):319-326.[11] Deng J, Petersen BE, Steindler DA, et al.Mesenchymal stem cells spontaneously express neural proteins in culture and are neurogenic after transplantation[J].Stem Cells, 2006,24(4):1054-1064.

第二篇：骨髓間充質(zhì)干細胞在腦損傷中的臨床應(yīng)用

骨髓間充質(zhì)干細胞在腦損傷中的臨床應(yīng)用

【摘要】 目的 骨髓間充質(zhì)干細胞是存在于骨髓中區(qū)別于造血干細胞的一種多潛能干細胞，可作為多種疾病細胞替代治療和基因治療的載體。近年研究發(fā)現(xiàn)其可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存活并能分化為神經(jīng)樣細胞，在體外也可通過定向誘導(dǎo)向神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化，提示骨髓間充質(zhì)干細胞有可能取代神經(jīng)干細胞用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞治療和損傷的修復(fù)。由于其取材容易，能在體外迅速培養(yǎng)擴增，通過自體移植可避開免疫排斥反應(yīng)，且能以多種途徑包括靜脈注射、腦內(nèi)不同部位進行細胞移植，所以骨髓間充質(zhì)干細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中的臨床應(yīng)用前景廣闊。關(guān)鍵詞 骨髓間充質(zhì)干細胞 中樞神經(jīng)系統(tǒng) 誘導(dǎo)分化 細胞移植

長期以來中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）的損傷與再生一直是困擾人類健康的難題，也是科學(xué)家們致力于研究的焦點。曾經(jīng)認為人腦內(nèi)的神經(jīng)細胞缺乏再生能力，如果遇到損傷，受損的神經(jīng)細胞將會永遠喪失，由膠質(zhì)細胞充填。19世紀末至20世紀初，人們逐漸發(fā)現(xiàn)低等脊椎動物和兩棲類的中樞和外周神經(jīng)損傷后都能再生，而在哺乳動物中，斷定只有外周神經(jīng)系統(tǒng)（Peripheral nervous sysˉtem，PNS）損傷后可以再生，CNS則沒有再生能力。然而隨著近十余年對神經(jīng)干細胞研究的逐步深入，這一傳統(tǒng)認識現(xiàn)已被徹底打破。

神經(jīng)干細胞（Nerual stem cells，NSCs）的發(fā)現(xiàn)是在研究造血發(fā)生和神經(jīng)發(fā)育的基礎(chǔ)上開始的，于20世紀90年代初，Reynolds等 ［1］ 從成年小鼠腦紋狀體分離出能在體外不斷分裂增殖、具有多種分化潛能的細胞群，參照造血系統(tǒng)干細胞的性質(zhì)，正式提出了NSCs的概念，它是一類多能干細胞，能長期自我更新（復(fù)制），并具有分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞的多潛能特性。Gage ［2］ 于2000年在《Science》上發(fā)表文章指出，神經(jīng)干細胞通常具有:來源于神經(jīng)系統(tǒng)能產(chǎn)生神經(jīng)組織;有自我更新能力;能通過不對稱細胞分裂產(chǎn)生除自我子代（仍為干細胞）以外的其他類型的細胞（前體細胞））。通過大量試驗研究，目有NSCs的生物學(xué)特性可概括為:（1）能產(chǎn)生神經(jīng)組織或起源于神經(jīng)系統(tǒng);（2）有增殖能力;（3）在整個生命過程中能自我維持、自我更新;（4）能通過擴增祖細胞而產(chǎn)生大量的后代;（5）具有向多細胞系分化的能力;

（6）損傷或疾病能刺激干細胞分化。以往對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的移植治療，主要用胚胎神經(jīng)干細胞治療Parkinson病、缺血性疾病等，其不足包括組織來源缺乏、倫理學(xué)問題及免疫排斥等多方面問題。為避開胚胎來源NSCs的局限性，近年成人骨髓間質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞的分化及在神經(jīng)修復(fù)中的作用，因其獨有的優(yōu)勢，已成為NSCs的研究熱點。歷史回顧及研究意義

130年前，德國病理學(xué)家Cohnheim在研究傷口修復(fù)時，就提出骨髓中可能存在非造血組織的干細胞。直到20世紀70年代中期，F(xiàn)riedenstein等才首次報道，骨髓標本中小部分貼附細胞在培養(yǎng)過程中能夠分化形成類似骨或軟骨的集落 ［3］。后來的研究表明Friedenstein粗糙分離所得到的細胞是多能的，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和成肌細胞。因此，骨髓基

質(zhì)中的這種多能細胞，由于能夠分化成為多種中胚層來源的間質(zhì)細胞，而被稱為間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cell，MSCs）。1998年Azizi等 ［4］ 將人類的骨髓基質(zhì)細胞植入鼠的紋狀體，發(fā)現(xiàn)大約20%的植入細胞發(fā)生遷移。移植細胞的遷移路徑與已知的神經(jīng)干細胞及星形膠質(zhì)細胞的遷移路徑相同，即從腦室下帶沿著白質(zhì)束遷移到皮層、紋狀體、前腦和小腦等部位，未發(fā)現(xiàn)炎癥和免疫反應(yīng)，從而證明MSCs可用作自體移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞和基因治療的載體。2000年Woodbury等的研究結(jié)果顯示成年鼠和人的BMSCs能夠分化為神經(jīng)元 ［5］。人骨髓間充質(zhì)干細胞（hBMSCs）能夠分化為神經(jīng)元樣和神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞，其取材容易，體外可迅速培養(yǎng)、擴增，彌補了神經(jīng)干細胞的諸多缺點，自體MSCs移植又避免了移植后的免疫排斥反應(yīng)，因此BMSCs作為神經(jīng)細胞的另一來源，用于神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的細胞治療，具有明顯的臨床應(yīng)用價值。骨髓間充質(zhì)干細胞的研究方法

2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞的分離 Friedenstein首先通過貼壁培養(yǎng)的方法分離得到MSCs，他們將全骨髓組織用塑料培養(yǎng)皿培養(yǎng)4h后棄末貼壁細胞，貼壁細胞外觀呈多樣性，經(jīng)過2～4天的休眠期后迅速增殖，培養(yǎng)數(shù)代后形態(tài)趨于一致，呈紡錘形。目前多數(shù)實驗室分離MSCs是基于此方法。新鮮骨髓內(nèi)，造血干細胞所占比例較大，造血干細胞較難培養(yǎng)擴增，而非造血干細胞則易于分離擴增。原代培養(yǎng)2～3周后，大多數(shù)造血干細胞死亡，剩下的即為MSCs。Colter ［6］ 報道，MSCs在原代培養(yǎng)以低密度種植可形成單細胞克隆，并增殖迅速。細胞經(jīng)過5天遲滯期，5天對數(shù)生長期后，進入靜止期。高密度種植生長緩慢的原因與細胞間相互接觸抑制或細胞分泌的因子作用有關(guān)。

2.2 骨髓間充質(zhì)干細胞的誘導(dǎo)分化 MSCs在體外培養(yǎng)時，保持干細胞的特性自身不斷地增殖，在不同誘導(dǎo)條件下能夠向不同譜系分化。體外誘導(dǎo)神經(jīng)細胞分化的試劑有:維甲酸（RA）、生長因子、抗氧化劑、脫甲基試劑、可增加細胞內(nèi)cAMP的混合物和生理學(xué)上的神經(jīng)誘導(dǎo)劑及頭蛋白（noggin）等。已有許多實驗室在體外條件下利用堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）、維甲酸（RA）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF）、甲狀腺素3（T 3）、膠質(zhì)細胞系源神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）等作為增殖及分化誘導(dǎo)因子，對MSCs進行增殖培養(yǎng)，分化誘導(dǎo)，并通過免疫細胞化學(xué)法進行細胞性質(zhì)鑒定。結(jié)果證實MSCs在一定的培養(yǎng)條件下可以向神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)前體細胞及其終末細胞方向分化。將進行標記的MSCs及誘導(dǎo)后的神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞移植入腦損傷后功能缺失的動物模型上，已取得明顯的治療效果。

2.3 干細胞的鑒定 骨髓間質(zhì)來源的MSCs，形態(tài)成纖維樣，可聚集成均勻的集落，流式細胞術(shù)分析表明分離的細胞群體表型單一，細胞表面蛋白如SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等呈陽性，但CD14、CD34和CD45造血譜系標記則呈陰性。體外由BMSC分化成的神經(jīng)細胞很少表現(xiàn)出典型的成熟神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞的形態(tài)，而應(yīng)用免疫細胞化學(xué)技術(shù)可更準確、方便地鑒定各類培養(yǎng)細胞?？捎糜阼b定神經(jīng)干細胞的特異性分子標志物有巢蛋白（nestin）、波形蛋白（vimentin）和musashil蛋白;鑒定神經(jīng)元的標志物有神經(jīng)元特異性烯醇

化酶（NSE）、神經(jīng)特異性核蛋白（NeuN）、中間神經(jīng)絲（NF-m）、tau蛋白和一些微管蛋白（tubulin-β、MAP-

2、TuJ-1）;常用于鑒定星形膠質(zhì)細胞的標志物是膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）;鑒定少突膠質(zhì)細胞的標志物有半乳糖苷酶（GalC）和碳酸苷酶Ⅱ（CAⅡ）。骨髓間充質(zhì)干細胞治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究現(xiàn)狀

3.1 BMSCs移植 骨髓間充質(zhì)干細胞具有自我更新和多向分化增殖潛能，已有研究表明，骨髓細胞是某些腦細胞如小膠質(zhì)神經(jīng)細胞和星形膠質(zhì)細胞的前體細胞 ［7］。Chopp等 ［8］ 多次將BMSCs應(yīng)用于腦外傷或腦缺血動物模型，發(fā)現(xiàn)hBMSCs約1%分化為神經(jīng)元，5%～8%分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞，并明顯促進神經(jīng)功能恢復(fù)。Schwarz等 ［9］ 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶酪氨酸羥化酶和鳥苷三磷酸水解酶Ⅰ，轉(zhuǎn)染給大鼠和人骨髓間充質(zhì)細胞，并將細胞移植到大鼠帕金森模型的紋狀體，觀察到細胞在移植的腦組織中存活至少87天，外源性基因能夠表達的時間達9天。Chen ［10］ 將BMSCs和BDˉNF（腦源性神經(jīng)生長因子）共同植入大鼠缺血模型的腦缺血邊緣，在包括運動、感覺、反射和旋轉(zhuǎn)的神經(jīng)功能評分中，接受移植的小鼠功能明顯改善。Chopp ［11］ 將MSCs植入脊髓損傷模型1周后的大鼠，發(fā)現(xiàn)在脊髓中有移植細胞表達神經(jīng)蛋白標志，并有功能恢復(fù)。Mahmood ［7，12］ 將MSCs或全骨髓直接或經(jīng)靜脈途徑植入大鼠創(chuàng)傷模型，14天或28天后神經(jīng)功能明顯改善，組織學(xué)檢查移植細胞有小部分表達NeuN、GFAP。

上述用于臨床前的動物實驗結(jié)果表明，MSCs移植無論是局部或靜脈途徑都能產(chǎn)生積極的治療作用。近年來，人們不斷地探索利用hBMSCs進行細胞治療和基因治療。只需通過局部麻醉，就可較容易地得到少量骨髓抽取物，而不影響人體的健康;而且將分離的hBMSCs在體外培養(yǎng)擴增和導(dǎo)入外源基因也相對方便。因此，hBMSCs在將來實際應(yīng)用時就具有潛在的優(yōu)勢。首先，可以用體外培養(yǎng)擴增的MSCs，作為細胞移植的種子細胞，修復(fù)損傷的腦組織。前述的動物實驗中已提及用體外培養(yǎng)擴增的MSCs來修復(fù)各種損傷，并且具有良好的效果。MSCs在體外培養(yǎng)過程中，可以保持未分化表型不斷增殖，達到所需的數(shù)目，然后經(jīng)誘導(dǎo)可定向分化為神經(jīng)元樣細胞等;而已分化的細胞來源有限，在體外培養(yǎng)時，增殖速度較慢，而且還存在去分化的問題。另外，MSCs可以很方便地通過抽取骨髓來得到，而不必通過手術(shù)從病人身上得到自身成熟細胞，避免了對病人 造成不必要的二次創(chuàng)傷。其次，可通過轉(zhuǎn)基因的方法，將外源基因?qū)隡SCs?？梢詫⒗诙ㄏ蚍只纳L因子基因轉(zhuǎn)入MSCs，促進定向分化，加快體內(nèi)神經(jīng)組織修復(fù)的進程。然而在MSCs安全有效地用于臨床之前，顯然需要解決大量有關(guān)的MSCs的基礎(chǔ)問題，比如組織相容性、優(yōu)化定向分化