第一篇：基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)鑒定，第1節(jié)：蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)簡(jiǎn)介

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)鑒定，第 1 節(jié)：蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)簡(jiǎn)介

蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）的分析一般可分為四類(lèi)分析方法：（i）快速而簡(jiǎn)單的分析方法，用于從復(fù)雜混合物中純化少量蛋白質(zhì)；（ii）快速而靈敏的方法，可從目標(biāo)蛋白質(zhì)中獲取少量但足夠的結(jié)構(gòu)信息（iii）獲取拓展的蛋白質(zhì)或 DNA 序列數(shù)據(jù)庫(kù)，以及（iv）能夠通過(guò)計(jì)算機(jī)算法將DNA 序列信息與各種類(lèi)型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息結(jié)合起來(lái)，例如 N 末端蛋白質(zhì)或內(nèi)部肽序列，氨基酸組成，肽質(zhì)量指紋圖，MS 片段圖譜或所選肽的序列標(biāo)簽。

高分辨率凝膠電泳（2-D 凝膠電泳是目前最有效的蛋白質(zhì)分離方法），自 70 年代后期就已經(jīng)被用作分析工具。但一直到蛋白質(zhì)樣品制備方法和測(cè)序工具得到了相當(dāng)大的改進(jìn)之后，二維凝膠電泳才發(fā)展成為制備性的蛋白質(zhì)純化程序。蛋白質(zhì)能夠通過(guò)電印跡法轉(zhuǎn)到化學(xué)惰性的膜上，可能是蛋白質(zhì)微量樣品制備中最重要的步驟之一，因?yàn)樗鼘⒏叻直媛誓z電泳（純化步驟）和氣體色譜（分析步驟）直接聯(lián)系在了一起。電印跡法又可以結(jié)合基于膜的埃德曼化學(xué)法形成 N 末端或內(nèi)部肽序列。這種組合技術(shù)現(xiàn)在通常稱(chēng)為微測(cè)序，因?yàn)榕c早期技術(shù)相比，它使樣品制備的靈敏度提高了至少 100 倍，從而可以分析低至 pmole 或 μg 級(jí)別的蛋白質(zhì)。這項(xiàng)技術(shù)在 80 年代后期開(kāi)始流行，當(dāng)時(shí)聚二氟乙烯（PVDF）印跡膜已經(jīng)成功商業(yè)化。同一時(shí)期，第一個(gè) 2-D 凝膠蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)（實(shí)際蛋白質(zhì)組學(xué)的祖先）也誕生了。但是，由于當(dāng)時(shí)已知的蛋白質(zhì)或 DNA序列數(shù)量很少，這些數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息非常有限。因此，微測(cè)序法更常被用作 cDNA 克隆的起始點(diǎn)，而不是用于通過(guò)同源性進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。

隨著蛋白質(zhì)，DNA 和表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）等數(shù)據(jù)庫(kù)信息在 90 年代以來(lái)的迅速增長(zhǎng)。從頭測(cè)序變得不再那么常見(jiàn)，而重測(cè)序或通過(guò)比較法進(jìn)行測(cè)序變得更加重要。這是生物質(zhì)譜（MS）技術(shù)進(jìn)入測(cè)序領(lǐng)域的正確時(shí)機(jī)。質(zhì)譜 MS 是非?？焖凫`敏的技術(shù)方法，即使到了現(xiàn)在，MS 技術(shù)的分析速度和靈敏度仍未達(dá)到其極限。MS 技術(shù)的兩大主要領(lǐng)域是：基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間（MALDI-TOF）質(zhì)譜和電噴霧電離（ESI）質(zhì)譜，這兩種方法的區(qū)別在于其電離分析物的方法，相關(guān)的樣品制備程序也不同。因此 ESI 主要與液相色譜儀器相結(jié)合，而 MALDI-TOF更適合于高通量檢測(cè)，更適合于大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。隨著快速蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的發(fā)展，對(duì)高度可重復(fù)的，可比較的，大規(guī)模二維凝膠電泳方法的需求穩(wěn)步增長(zhǎng)，也通過(guò)引入可固定的pH 梯度法得以實(shí)現(xiàn)。

最后，還需要將所有的數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)。氨基酸序列，肽質(zhì)量指紋或肽 MS 片段數(shù)據(jù)需要被翻譯為帶注釋或無(wú)注釋基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的 DNA 序列。每個(gè) DNA 序列可以從兩端和三個(gè)不同的開(kāi)放閱讀框進(jìn)行讀取。在某些表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，使得搜索變得困難。而計(jì)算機(jī)算法可以成功地解決遇到的這些挑戰(zhàn)，可以匹配到最接近MS 分析獲取的結(jié)構(gòu)信息對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)或 DNA 序列片段。

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)鑒定系列總結(jié)，將主要集中在兩個(gè)部分：（i）如何從凝膠純化的蛋白質(zhì)樣品中獲得必要的結(jié)構(gòu)信息，（ii）以及如何使用此類(lèi)信息鑒定蛋白質(zhì)。第 2 節(jié)簡(jiǎn)要介紹了基于常規(guī)Edman 的 N 末端或內(nèi)部肽測(cè)序的方法。

在第二部分中，我們重點(diǎn)介紹基于 MALDI-TOF 的蛋白質(zhì)分析方法，并簡(jiǎn)要回顧將 MS 生成的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)中存儲(chǔ)的序列進(jìn)行匹配的算法。

本文由百泰派克生物科技整理編輯。未經(jīng)許可，不得轉(zhuǎn)載。

北京百泰派克公司采用高分辨率質(zhì)譜平臺(tái)技術(shù)，包括 Thermo Fisher 的 Q Exactive 質(zhì)譜儀，LTQ Orbitrap Velos 質(zhì)譜儀，以及 AB SCIEX 的 6500 Q TRAP 質(zhì)譜儀，結(jié)合 Nano-LC 高通量液相色譜技術(shù)，能夠?qū)?SDS-PAGE 蛋白條帶、2D 蛋白膠點(diǎn)等樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行高效精準(zhǔn)鑒定。膠條、膠點(diǎn)蛋白質(zhì)譜鑒定服務(wù)可保證 100%的鑒定率，否則不收任何費(fèi)用。

文獻(xiàn)參考：Protein identification methods in proteomics.Electrophoresis, 2000.

第二篇：可溶性還原糖脂肪蛋白質(zhì)的鑒定

學(xué)案六實(shí)驗(yàn)一可溶性還原糖脂肪蛋白質(zhì)的鑒定

一、解讀兩綱

1.識(shí)記鑒定實(shí)驗(yàn)所用的材料，懂得選材的要求。

2.掌握實(shí)驗(yàn)原理、步驟，理解實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒎椒ā?/p>

3.學(xué)會(huì)制備生物組織樣液，正確選用鑒定試劑，并能按規(guī)范的要求操作，獨(dú)立完成鑒定工作。

4.明確觀察對(duì)象，正確說(shuō)出鑒定過(guò)程中樣液的顏色變化，并能用準(zhǔn)確的語(yǔ)言解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，作出實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

5.能熟練制作徒手切片，臨時(shí)裝片和使用低倍顯微鏡，了解高倍顯微鏡的使用方法。

6.具備驗(yàn)證相關(guān)生物學(xué)事實(shí)的能力，并能對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果進(jìn)行解釋、分析和處理；能對(duì)一些生物學(xué)問(wèn)題進(jìn)行初步的探究性研究。

二、高考熱線

1.題型以選擇題為主，也可能以簡(jiǎn)答題出現(xiàn)，重點(diǎn)是以對(duì)比的方式考查相關(guān)實(shí)驗(yàn)的異同點(diǎn)。

2.以教材實(shí)驗(yàn)為依據(jù)，設(shè)置實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)題是今后考查的重點(diǎn)，如“設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)證明淀粉酶是蛋白質(zhì)”，就是依據(jù)教材中的實(shí)驗(yàn)3的原理和步驟。

三、學(xué)法指點(diǎn)

1.運(yùn)用對(duì)比的方法認(rèn)識(shí)三種物質(zhì)的鑒定原理、過(guò)程及注意事項(xiàng)。

2.對(duì)比三種物質(zhì)鑒定過(guò)程中的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)，重點(diǎn)掌握試劑使用上的區(qū)別。

3.根據(jù)所學(xué)的原理鑒定類(lèi)似物質(zhì)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)程序。

四、教材梳理

（一）實(shí)驗(yàn)原理

生物組織中含有可溶性還原糖（如_______、_______、________）、脂肪、蛋白質(zhì)等化學(xué)成分，可分別與某些化學(xué)試劑作用產(chǎn)生特定的_____________。

(1)可溶性還原糖+__________試劑—→磚紅色沉淀

可溶性還原糖+班氏糖定性試劑—→__________

(2)脂肪+__________________染液—→染成橘黃色

脂肪+蘇丹Ⅳ染液———————→染成______

(3)蛋白質(zhì)+________________試劑—→溶液呈紫色

(二)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.初步掌握鑒定可溶性還原糖、脂肪、蛋白質(zhì)的基本方法。

(三)實(shí)驗(yàn)材料

(四)方法步驟

1.可溶性還原糖的鑒定

(1)制備組織樣液：蘋(píng)果切塊、研磨、________。

(2)鑒定組織樣液：1 支試管+2mL_____________+2mL________________，振蕩試管，（溶液_______色?），________2min左右，觀察溶液顏色變化。（________色→棕色→_________色）。

2.脂肪的鑒定

(1)切片制作：用花生子葉作徒手切片。

(2)染色：1塊載玻片+切片+ 3滴________染液，3min后吸去染液+ 2滴50%________溶液去浮色，吸去后+ 2滴__________，蓋蓋玻片。

(3)鏡檢鑒定：先用低倍鏡觀察，找到子葉最薄處，再用高倍鏡觀察。（圓形的脂肪顆粒為_(kāi)____色）。

3.蛋白質(zhì)的鑒定

(1)制備樣液：大豆切片、________、_______。

(2)鑒定：1 支試管+2mL黃豆組織樣液+2mL________________，振蕩試管（溶液_____色），+4滴______________，________試管，觀察溶液顏色變化。（______色→______色→_______色）。

（五）結(jié)論與討論

1.結(jié)論：從斐林試劑與蘋(píng)果樣液作用、蘇丹III染液與花生種子作用、雙縮脲試劑與大豆樣液作用

1的顏色變化可以得出：___________________________________________________________。

2.討論鑒定依據(jù)。因?yàn)槟承┗瘜W(xué)試劑與生物組織中的有關(guān)_________發(fā)生一定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生有固定顏色的新化合物。故可根據(jù)待檢物與某些化學(xué)試劑反應(yīng)的____________,如橘黃色、_________色、______色等，鑒定生物組織中含有_______、可溶還原糖和___________。

五、疑難精析

1．生物組織中的還原糖是指分子結(jié)構(gòu)中含有還原性基團(tuán)(如游離醛基或酮基)的糖，如葡萄糖、麥芽糖、果糖，淀粉、蔗糖不具有還原性，斐林試劑只能檢驗(yàn)可溶性還原糖的存在，而不能鑒定可溶性非還原糖或不溶性糖。

2．可溶性還原糖鑒定實(shí)驗(yàn)的選材原則。選用可溶性還原糖含量較高的生物組織，而且組織的顏色較淺，或近于白色。常用的植物組織是：蘋(píng)果、梨、白色甘藍(lán)葉、白蘿卜。雙子葉植物光合作用的主要產(chǎn)物為淀粉，其葉不理想。有些單子葉植物，如韭菜、鳶尾等，其葉內(nèi)含有大量的可溶性單糖，但由于葉片中葉綠素顏色較深，影響鑒定時(shí)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的觀察，也不宜作實(shí)驗(yàn)材料。

3．可溶性還原糖鑒定實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵性的步驟在于斐林試劑現(xiàn)用現(xiàn)配及用量。很不穩(wěn)定，故應(yīng)將組成斐林試劑的甲液(0.1g／mL的NaOH溶液)和乙液(0.05g／mL的CuS04溶液)分別配制、儲(chǔ)存；使用時(shí)，再臨時(shí)配制，將4～5滴乙液滴入2mL甲液中，配完混合均勻后[得到淡藍(lán)色的Cu(OH)2沉淀的懸濁液]立即使用。如果過(guò)早混合會(huì)產(chǎn)生Cu(OH)2沉淀，加入到組織樣液中并加熱時(shí)會(huì)產(chǎn)生黑色CuO沉淀。而臨時(shí)混合所得斐林試劑立即用于實(shí)驗(yàn)，即可使新制的Cu(OH)2作氧化劑與可溶性還原糖發(fā)生氧化-還原反應(yīng)，生成磚紅色的Cu2O沉淀。溶液的變化過(guò)程：淡藍(lán)色→棕色→磚紅色沉淀。

4．在可溶性還原糖的鑒定中，在對(duì)盛有組織樣液與斐林試劑混合物的試管直接用酒精燈加熱易破，因?yàn)樵嚬苁軣岵痪鶆?，若要避免此現(xiàn)象產(chǎn)生應(yīng)改用水浴加熱。此時(shí)試管底部不要觸及燒杯底部，試管口不要朝向?qū)嶒?yàn)者，以免溶液沸騰時(shí)沖出試管造成燙傷。

5．雙縮脲試劑并不是雙縮脲分子。所謂雙縮脲是由兩分子尿素經(jīng)脫氨縮合而成的化合物。該化合物在堿性溶液中能與CuSO4反應(yīng)產(chǎn)生紫色絡(luò)合物，此反應(yīng)稱(chēng)雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有許多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應(yīng)。特別要提醒學(xué)生的是實(shí)驗(yàn)桌上兩瓶不同濃度的CuS04溶液，避免拿錯(cuò)。

6．蛋白質(zhì)鑒定實(shí)驗(yàn)中，最好選用富含蛋白質(zhì)的生物組織，植物材料常用的是大豆，動(dòng)物材料常用的是雞蛋。其關(guān)鍵性步驟在于先加雙縮脲試劑A(0.1g/mLNaOH溶液)再加雙縮脲試劑B(0.01g/mLCuSO4溶液)。如果用雞蛋白稀釋液，則濃度不宜過(guò)大，以免實(shí)驗(yàn)后粘住試管壁，不易洗凈。

7.脂肪的鑒定實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)材料最好選用富含脂肪的種子，其關(guān)鍵性步驟在于子葉要削成理想薄片。為了作好徒手切片，種子浸泡的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。也可改成刮取種子子葉泥制作臨時(shí)裝片，易做，效果又好。

8.填表比較實(shí)驗(yàn)1和3：

9.本實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，也用注意對(duì)照。如在鑒定可溶性還原糖和蛋白質(zhì)時(shí)，鑒定之前需留一部分樣液，以便與鑒定后樣液顏色變化作對(duì)比。

例1 用下列實(shí)驗(yàn)材料做特定實(shí)驗(yàn)，從理論上講能否成功?說(shuō)明依據(jù)的道理。

(1)用韭菜葉片做可溶性還原糖的鑒定實(shí)驗(yàn)；

(2)用蓖麻種子做脂肪鑒定實(shí)驗(yàn)；

(3)用卵白做蛋白質(zhì)鑒定實(shí)驗(yàn)。

[解析] 此題是要求根據(jù)課本實(shí)驗(yàn)原理進(jìn)行拓展和應(yīng)用，這也是近幾年高考的一個(gè)趨勢(shì)。韭菜在進(jìn)行光合作用時(shí)并不能將光合作用的產(chǎn)物葡萄糖轉(zhuǎn)變成淀粉，因此葉內(nèi)含有大量的可溶性還原糖，但是，由于葉片中葉綠素含量較多，綠色較深，對(duì)于鑒定時(shí)的顏色反應(yīng)起著掩蓋作用，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯，因此不宜用這些單子葉植物作此實(shí)驗(yàn)材料；后兩個(gè)實(shí)驗(yàn)材料從理論上說(shuō)是可行的。

答案：(1)用韭菜葉片做還原糖實(shí)驗(yàn)不能成功，因?yàn)槿~片內(nèi)雖然含有大量可溶性還原糖，但葉片中葉綠素含量較多，顏色較深，對(duì)鑒定時(shí)的顏色反應(yīng)起著遮蓋作用；(2)若用蓖麻種子做脂肪鑒定實(shí)驗(yàn)，從理論上說(shuō)可以成功，因?yàn)樵摲N子含較多的脂肪，種子也比較大，便于進(jìn)行徒手切片；(3)由于卵白中含有大量的蛋白質(zhì)，從理論上講做蛋白質(zhì)鑒定實(shí)驗(yàn)是會(huì)成功的。

六、趁熱打鐵

（一）選擇題

1．將面團(tuán)包在紗布中在清水中搓洗，鑒定黏留在紗布上的黏稠物質(zhì)和洗出的白漿用的試劑分別是

()

A.碘液、蘇丹Ⅲ溶液B．雙縮脲試劑、碘液

C.亞甲基藍(lán)溶液、蘇丹ⅢD．碘液、斐林試劑

2．蛋白質(zhì)的鑒定時(shí)，事先留出一些黃豆組織樣液的目的是()

A.與反應(yīng)后混合液的顏色做對(duì)比B．失敗后重做一遍

C.鑒定可溶性還原糖用D.留下次實(shí)驗(yàn)用

3．用斐林試劑鑒定可溶性還原糖時(shí)，溶液的顏色變化過(guò)程為()

A.淺藍(lán)色→棕色→磚紅色B．無(wú)色→淺藍(lán)色→棕色

C.磚紅色→淺藍(lán)色→棕色D.棕色→綠色→無(wú)色

4．在鑒定可溶性糖的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)試管中的溶液進(jìn)行加熱時(shí)，操作不正確的是()

A.將這支試管放進(jìn)盛開(kāi)水的大燒杯中B．試管底部不要觸及燒杯底部

C.試管口不要朝向?qū)嶒?yàn)者D.試管底部緊貼燒杯底部

5．現(xiàn)有如下實(shí)驗(yàn)材料：①西瓜汁②菜籽③豆?jié){④草莓果實(shí)⑤花生仁 ⑥雞蛋清，它們與斐林試劑作用呈磚紅色、與蘇丹Ⅲ試劑作用呈橘黃色、與雙縮脲試劑作用呈紫色的實(shí)驗(yàn)材料分別為()

A.①④、②⑤、⑤⑥B．①④、②⑤、③⑥

C.①④、②③、⑤⑥D(zhuǎn)．②④、③⑤、③⑥

6.青蘋(píng)果汁遇碘液顯蘭色，熟蘋(píng)果汁能與斐林試劑作用產(chǎn)生磚紅色沉淀，這說(shuō)明()

A.青蘋(píng)果汁含有淀粉，不含有糖類(lèi)B．熟蘋(píng)果汁含有糖類(lèi)，不含有淀粉

C．蘋(píng)果成熟時(shí)，淀粉水解成單糖D.蘋(píng)果成熟時(shí)，單糖合成淀粉

7.下列關(guān)于生物組織中三大有機(jī)物的鑒定操作步驟，正確的是()

A.用于鑒定可溶性還原糖的斐林試劑，可直接用于蛋白質(zhì)的鑒定

B．脂肪的鑒定需要用顯微鏡才能看到被染成橘黃色脂肪滴

C.鑒定可溶性還原糖時(shí)，要加入斐林試劑甲液搖均后再加入乙液

D.用于鑒定蛋白質(zhì)的雙縮脲試劑A液與B液要混合均勻后，再加入含樣品的試管中，且必須現(xiàn)配現(xiàn)用

8．某同學(xué)在顯微鏡下觀察被蘇丹Ⅲ染液染色后的花生種子子葉切片，當(dāng)轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)焦距時(shí)，有一部分細(xì)胞看得很清楚，另一部分細(xì)胞較模糊，這是由于（）

A.反光鏡沒(méi)調(diào)好B．標(biāo)本切得厚薄不均勻

C.顯微鏡物鏡損壞D．細(xì)準(zhǔn)焦螺旋未調(diào)好

9．可溶性還原糖的鑒定中，制備生物組織樣液時(shí)加入少許石英砂，其目的是()

A.研磨充分B.防止糖被破壞C．防止反應(yīng)D.無(wú)作用

10.在過(guò)氧化氫酶溶液中加入雙縮脲試劑，其結(jié)果應(yīng)是（）

A.產(chǎn)生氣泡B.溶液呈紫色C.溶液呈藍(lán)色D.產(chǎn)生磚紅色沉淀

11.雙縮脲試劑可以鑒定蛋白質(zhì)是因?yàn)椋ǎ?/p>

A.蛋白質(zhì)都有肽鍵B.蛋白質(zhì)都有氨基酸

C.蛋白質(zhì)都有羧基D.蛋白質(zhì)都有氨基

12.(多選)下列物質(zhì)用斐林試劑檢測(cè)時(shí)可能出現(xiàn)磚紅色沉淀的是()

A.葡萄糖B．果糖C．麥芽糖D．淀粉

13.(多選)下列各組中前項(xiàng)為所鑒定的物質(zhì)，中項(xiàng)為所使用試劑，后項(xiàng)為所產(chǎn)生的顏色。正確的是

()

A.葡萄糖、斐林試劑、橘黃色B.脂肪、蘇丹Ⅲ染液、磚紅色

C.蛋白質(zhì)、雙縮脲試劑、紫色D.淀粉、碘液、藍(lán)色

二、非選擇題

14．做“生物組織中可溶性還原糖、脂肪、蛋白質(zhì)的鑒定”實(shí)驗(yàn)時(shí)，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇不同的實(shí)驗(yàn)材料。請(qǐng)根據(jù)下表所列各種材料回答問(wèn)題：

(1)其中適合于鑒定糖的是_______，理由是_____________________________________________。

(2)小麥種子不如花生種子更適合用來(lái)鑒定脂肪，這是因?yàn)開(kāi)_______________________________。但小麥種子中糖類(lèi)化合物___________含量很高，卻不適合用來(lái)鑒定________，這是因?yàn)開(kāi)_________ __________________________________。

15．在做“可溶性還原糖的鑒定”實(shí)驗(yàn)時(shí):

(1)所用斐林試劑甲液的質(zhì)量濃度為_(kāi)___g／mL，乙液的質(zhì)量濃度為_(kāi)___g/mL，如何用這兩種溶液配制斐林試劑(簡(jiǎn)要步驟)__________________________________________________。

(2)斐林試劑甲液與乙液混合后產(chǎn)生_________色沉淀，它與葡萄糖在加熱條件下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生_________色沉淀。

(3)請(qǐng)解釋為什么斐林試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，不能放置太久____________________________________。

(4)做此實(shí)驗(yàn)時(shí)，試管直接用酒精燈加熱易破，其原因是____________，若要避免此現(xiàn)象產(chǎn)生應(yīng)改用_________________。

16．用蘋(píng)果和黃豆做實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，都需將其研磨碎，在研磨時(shí)加入少量石英砂的作用是___________；在研磨后二者都需要對(duì)研磨液進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾的目的是除去_________________，在過(guò)濾中為什么只用一層紗布，不用濾紙?______________________________________________________________________。

17．（設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，論證結(jié)論）請(qǐng)根據(jù)下列材料和實(shí)驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)一個(gè)證明淀粉酶是蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)。

(1)實(shí)驗(yàn)器材：雞蛋、人的唾液、清水、0.1g/mLNaOH溶液、0.01g/mLCuSO4溶液、小燒杯、玻璃棒、試管和滴瓶。

(2)實(shí)驗(yàn)原理：雞蛋的蛋清主要成分是蛋白質(zhì)，在堿性條件下，蛋白質(zhì)與CuSO4反應(yīng)產(chǎn)生紫色物質(zhì)，即雙縮脲反應(yīng)。如通過(guò)實(shí)驗(yàn)再證明淀粉酶能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，即可證明淀粉酶是蛋白質(zhì)。

(3)實(shí)驗(yàn)步驟：

第一步：制備蛋清液。取雞蛋一個(gè)，打破蛋殼（不破壞蛋黃），取少許蛋清注入小燒杯中，加入30mL清水，用玻璃棒攪拌均勻備用。

第二步：_____________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________。

第三步：_____________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________。

(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：_______________________________________________________________________。

(5)結(jié)果分析：_______________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________。

第三篇：蛋白質(zhì)-配基相互作用的鑒定

10.蛋白質(zhì)－配基相互作用的鑒定

Timothy Palzkill 張曉君、毛躍建、李旻、張晶、趙琴麗、徐靈筠譯；申劍初校；張曉君修校

10.1 前言

基因組測(cè)序計(jì)劃已鑒定了大量的以前未知的基因。然而，甚至對(duì)于已被深入研究的模式生物，如大腸桿菌和釀酒酵母，大約三分之一的基因的功能仍未知。了解基因組中所有基因的功能的挑戰(zhàn)促進(jìn)了高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，并因此推動(dòng)了大規(guī)模描繪蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)－配基的相互作用。

蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用在功能性細(xì)胞內(nèi)扮演著重要的角色。在基因組規(guī)模上確定蛋白質(zhì)的相互作用可建立蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，這種網(wǎng)絡(luò)可為基因產(chǎn)物的功能提供重要的線索。例如，如果一個(gè)未知功能的蛋白可與已知功能的一族蛋白相互作用，說(shuō)明這個(gè)蛋白與它們具有相同的功能（Schwikowski等，2000）。蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的鑒定可以通過(guò)提供它們與復(fù)合體的結(jié)合模式為生物學(xué)過(guò)程的機(jī)制的了解提供新觀點(diǎn)。例如，即使知道一類(lèi)蛋白參與某個(gè)生物學(xué)過(guò)程，我們也不知道這些蛋白是否或怎樣與復(fù)合體相互作用以實(shí)現(xiàn)它們的功能。蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)作用譜圖提供了蛋白質(zhì)相互作用的詳細(xì)信息因此提供復(fù)合體組織的精確信息。

本章綜述了在基因組規(guī)模上蛋白質(zhì)相互作用的研究方法。包括如酵母雙雜交系統(tǒng)的在體方法和一些體外方法，如質(zhì)譜、噬菌體展示和蛋白芯片等。10.2 開(kāi)放閱讀框的高通量克隆

測(cè)定基因組規(guī)模的蛋白功能的功能基因組研究依賴于開(kāi)放閱讀框的高效克隆。開(kāi)放閱讀框必須被克隆到可以大規(guī)模表達(dá)或便利地對(duì)編碼蛋白進(jìn)行功能性分析的質(zhì)粒載體。由于所有蛋白不可能在一個(gè)系統(tǒng)中得到一樣好的表達(dá)，對(duì)所感興趣的基因應(yīng)構(gòu)建到多個(gè)蛋白表達(dá)系統(tǒng)。例如，用各種細(xì)菌的啟動(dòng)子測(cè)定可以確定哪個(gè)系統(tǒng)最適合表達(dá)。此外，對(duì)于功能分析，將感興趣的基因插入載體用于噬菌體展示、雙雜交分析或谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）融合。如果我們使用傳統(tǒng)的采用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的克隆技術(shù)，構(gòu)建這樣一套載體所用的時(shí)間和費(fèi)用將是不可想象的。但是，替代的新方法已可以便利地快速克隆PCR產(chǎn)物。10.2.1 λ噬菌體att重組克隆 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 λ噬菌體位點(diǎn)專(zhuān)一重組系統(tǒng)已被用于創(chuàng)建有效的克隆系統(tǒng)。λ噬菌體具有裂解和溶源循環(huán)。在溶源循環(huán)，噬菌體不復(fù)制而將DNA整合到宿主的染色體上（Ptashne，1992）。一旦λ噬菌體感染后，溶源過(guò)程馬上開(kāi)始，λDNA環(huán)化、Int蛋白啟動(dòng)環(huán)狀DNA整合入染色體。Int蛋白催化λ噬菌體結(jié)合位點(diǎn)（aatP）和E.coli結(jié)合位點(diǎn)(aatB)的位點(diǎn)專(zhuān)一的重組。一個(gè)稱(chēng)為整合宿主因子（IHF）的E.coli宿主蛋白對(duì)λDNA的整合也是必需的（Landy,1989）。整合反應(yīng)具有高度的序列專(zhuān)一性，沒(méi)有任何核苷酸的冗余與缺少。這個(gè)位點(diǎn)專(zhuān)一的重組并非同源重組，因?yàn)閍ttB和attP有很大差異。這個(gè)位點(diǎn)有15個(gè)堿基對(duì)的核心序列5＇-GCTTTTTTATACTAA。由于同源的區(qū)域很小，在沒(méi)有Int蛋白時(shí)重組無(wú)法進(jìn)行。attB和attP 重組后的位點(diǎn)稱(chēng)為attL和attR（圖10.1）(Landy,1989).λ噬菌體DNA 保持為前噬菌體狀態(tài)直到宿主細(xì)胞被損壞（Ptashne，1992）。DNA損傷引發(fā)λint和xis基因的表達(dá)。Int和Xis表達(dá)產(chǎn)物催化細(xì)菌染色體上λDNA的剪切。在aatL和aatR位點(diǎn)的剪切產(chǎn)生aatB和aatP位點(diǎn)。剪切反應(yīng)并非整合反應(yīng)的簡(jiǎn)單的逆向反應(yīng)，除了Int和IHF蛋白還需要Xis蛋白（Landy，1989）。所以，利用適當(dāng)?shù)闹亟M蛋白可以控制重組反應(yīng)的方向。

λ重組克隆系統(tǒng)方法就是將兩端帶有att重組位點(diǎn)的DNA和載體與整合蛋白一起保溫使DNA片段插入載體（Hartley等，2000）。這個(gè)系統(tǒng)被稱(chēng)為重組克隆(RC)（Hartley等，2000）。此系統(tǒng)可被用于直接將PCR片段克隆到載體而無(wú)需DNA連接酶。插入PCR片段的反應(yīng)是attB＋attP>attL＋attR，與λ噬菌體插入相似也是被另加的Int和IHF蛋白催化。反應(yīng)底物是帶有attB位點(diǎn)的PCR片段和兩端帶有attP的選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒（圖10.1）。與λ噬菌體插入不同的是，此反應(yīng)用了兩個(gè)attB 和兩個(gè)attP，此外，att位點(diǎn)被突變使attB1只能與attP1而非attP2重組。att位點(diǎn)的改造使得PCR片段可以直接克隆到載體（圖10.1）(Hartley等，2000)。

以RC法克隆PCR片段的最后結(jié)果是載體帶有兩端含attL位點(diǎn)的標(biāo)記基因。此質(zhì)粒被稱(chēng)為起始克隆(Entry clone)，因?yàn)樗梢酝ㄟ^(guò)重組反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生各種功能載體（Hartley等，2000）。用于載體轉(zhuǎn)換的反應(yīng)是attL+attR>attB+attP, 類(lèi)似于λ噬菌體被Int、Xis和IHF蛋白剪切（Landy，1989）。通過(guò)對(duì)兩種載體和Int、Xis及IHF蛋白的共同溫育，起始克隆的基因被轉(zhuǎn)到帶轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和蛋白標(biāo)簽的60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 目的載體。該反應(yīng)不同于λDNA從染色體的切除，因?yàn)槠鹗伎寺蓚€(gè)attL位點(diǎn)且目的載體帶兩個(gè)attR位點(diǎn)（Hartley等，2000）。att位點(diǎn)被突變以保證只在attL1和attR1 及attL2與attR2之間發(fā)生重組。重組反應(yīng)通過(guò)形成一個(gè)復(fù)合體來(lái)進(jìn)行，而且最終將形成一個(gè)帶有感興趣的基因及啟動(dòng)子和標(biāo)簽序列的目的載體圖10.1)。

RC 系統(tǒng)最近被用于幾個(gè)大規(guī)?？寺」こ?。例如，從Caenorhabditis elegans中克隆基因以酵母雙雜交系統(tǒng)構(gòu)建用于蛋白質(zhì)表達(dá)和分析蛋白質(zhì)相互作用的載體（walhout等，2000）。到最近為止已用此系統(tǒng)克隆了超過(guò)12000個(gè)C.elegans的基因（Reboul等，2003）。此外，大于100個(gè)人cDNA已用此法克隆創(chuàng)建了一套起始克隆。這些克隆以適合的載體轉(zhuǎn)為GFP融合載體，測(cè)定了這些cDNA表達(dá)的蛋白的細(xì)胞定位（Simpson等，2000）。10.2.2 拓?fù)洚悩?gòu)酶法克隆

痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶I載體

另一條避免DNA連接酶的克隆途徑是拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的克隆。此法利用痘病毒DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I以很高的序列專(zhuān)一性切斷和連接DNA鏈（Shuman，1992a,b）。反應(yīng)時(shí)，酶識(shí)別5’-CCCTT序列并在末尾的T切開(kāi)，在斷開(kāi)鏈的3’磷酸基團(tuán)與酶分子的酪氨酸殘基之間形成共價(jià)鍵（圖10.2）。共價(jià)復(fù)合物可以與帶5’羧基并與復(fù)合物的尾部互補(bǔ)的異源受體DNA形成重組分子（Shuman，1994）。

拓?fù)洚悩?gòu)酶I克隆利用上述的反應(yīng)將DNA片段連接到帶5’羧基并可與拓?fù)洚悩?gòu)酶共價(jià)結(jié)合的受體質(zhì)粒。反應(yīng)只在有自由的5’羧基的DNA存在時(shí)才會(huì)發(fā)生，這很有利于克隆PCR產(chǎn)物，因?yàn)楫?dāng)用不帶5’磷酸的引物擴(kuò)增的產(chǎn)物都不帶5’磷酸基團(tuán)（Shuman，1994）。最近這個(gè)方法被用于從釀酒酵母克隆了6035個(gè)開(kāi)放讀碼框到一個(gè)酵母蛋白表達(dá)質(zhì)粒和一個(gè)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體（Heyman等，1999）。原始的拓?fù)洚悩?gòu)酶克隆方法的缺點(diǎn)是PCR產(chǎn)物可以任意方向插入?？寺∠到y(tǒng)最近被改進(jìn)可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定向克?。▓D10.2）。該系統(tǒng)僅需要在設(shè)計(jì)引物時(shí)在引物的5’末端加入5’CACC。5’CACC序列與質(zhì)粒－拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)合體的5’端互補(bǔ)，由此控制PCR產(chǎn)物的插入方向（圖10.2）。此系統(tǒng)被用于從梅毒病源Treponema pallidum的基因組克隆了99％的開(kāi)放讀碼框（McKevitt等，2003）。拓?fù)洚悩?gòu)酶I克隆方法提高了克隆的效率，可以將大量的開(kāi)放讀碼框插入到質(zhì)粒89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 載體。

10.2.3 酵母的在體重組克隆

通過(guò)轉(zhuǎn)化克隆

上述的λ重組克隆系統(tǒng)利用體外重組然后轉(zhuǎn)化到E.coli細(xì)胞。替代的體內(nèi)方法利用酵母高效的同源重組機(jī)制克隆了大于99％的釀酒酵母基因（～6000）（Uetz等，2000）。這用兩步PCR完成，首先，一套大約6000個(gè)引物對(duì)從釀酒酵母中擴(kuò)增它的開(kāi)放讀碼框,每個(gè)正向引物有特定開(kāi)放讀碼框的序列和5’端22堿基的所有引物相同的序列，反向引物有特定開(kāi)放讀碼框序列和20堿基的共有序列（圖10.3）。6000個(gè)開(kāi)放讀碼框隨后被分別擴(kuò)增得到一套PCR產(chǎn)物。第二套PCR反應(yīng)引物以第一套PCR所用引物中的共有序列為基礎(chǔ)。正向引物取22堿基共有序列，反向引物取20堿基共有序列，另外還帶有50堿基與作為受體質(zhì)粒的酵母載體克隆位點(diǎn)兩側(cè)的序列同源的序列（Hudson等，1997；Uetz等，2000）。PCR產(chǎn)物將在兩端各帶有70堿基的序列，它們與受體載體的克隆位點(diǎn)兩側(cè)的70堿基同源。

每個(gè)PCR產(chǎn)物與被限制性內(nèi)切酶在克隆位點(diǎn)切開(kāi)而線性化的受體載體一起轉(zhuǎn)化到酵母（圖10.3）。在PCR產(chǎn)物的兩端70堿基的同源序列足以使酵母的同源重組系統(tǒng)將PCR插入到載體中（Hudson等，1997；Ma等1987）。10.2.4 重組克隆系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)

每個(gè)重組克隆方法都是將PCR產(chǎn)物克隆入期望的載體序列的有效手段。拓?fù)洚悩?gòu)酶克隆的主要優(yōu)點(diǎn)是對(duì)擴(kuò)增每個(gè)ORF所用的引物的5’端所需要的額外序列最小。只需要在正向引物5’端加四個(gè)堿基即可有效地進(jìn)行定向克隆，而不需在反向引物添加額外核苷酸。但以λ重組克隆系統(tǒng)克隆PCR產(chǎn)物卻需要在正向和反向引物都加25個(gè)額外的核苷酸（Hartley等，2000）。

以酵母重組克隆PCR產(chǎn)物的主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行。但是由于需要在PCR產(chǎn)物的兩端帶有至少50bp的與載體的序列同源的序列，因此需要進(jìn)行兩輪的PCR反應(yīng)。多輪PCR反應(yīng)會(huì)增加PCR產(chǎn)物的序列發(fā)生突變的可能性。此外，第一輪PCR反應(yīng)的引物在每個(gè)ORF之外又額外增加了20到22個(gè)堿基序列，這將會(huì)增加引物合成的成本。

總之，重組的克隆方法極大地便利了大量的開(kāi)放讀碼框的高通量克隆。而這又使下面討論的功能基因組實(shí)驗(yàn)變得可行。118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 10.3 酵母雙雜交選擇系統(tǒng)

酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)相互作用的有力工具。它是基于位點(diǎn)專(zhuān)一的轉(zhuǎn)錄激活子的模塊特性（Fields和Song，1989）。雜交蛋白由蛋白X 與DNA結(jié)合域的融合及蛋白Y與轉(zhuǎn)錄激活域的融合組成。如果蛋白X和蛋白Y發(fā)生相互作用，將會(huì)重建轉(zhuǎn)錄因子并導(dǎo)致報(bào)告基因的表達(dá)（圖10.4）。DNA結(jié)合域常被稱(chēng)為“誘餌”，而激活域被稱(chēng)為“陷阱”。

數(shù)個(gè)不同版本的雙雜交系統(tǒng)被廣泛地使用。大多使用DNA結(jié)合域與Gal4轉(zhuǎn)錄因子的融合。另一個(gè)版本利用將E.coli LexA的DNA結(jié)合域融合到感興趣的蛋白的氨基端來(lái)創(chuàng)建‘陷阱’。這個(gè)系統(tǒng)需要在報(bào)告基因的上游設(shè)置一個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)。陷阱由Gal4激活域或另外的酸性激活域組成，如E.coli序列的B42。這個(gè)陷阱可以與Gal4或LexA的DNA結(jié)合域“誘餌”搭配（Brent和Finley，1997）。各種誘餌的常用的報(bào)告基因是E.coli的lacZ基因，它編碼半乳糖苷酶。Gal4或LexA的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)置于lacZ基因的上游。蛋白的相互作用以激活域與DNA結(jié)合域共同激活lacZ基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行檢測(cè)（Fields和Song，1989）?；蚣せ羁赏ㄟ^(guò)β半乳糖苷酶的產(chǎn)物使克隆在X－Gal平板上顯藍(lán)色來(lái)檢測(cè)。

使用雙雜交系統(tǒng)的難點(diǎn)在于消除假陽(yáng)性。假陽(yáng)性克隆來(lái)自于誘餌和陷阱蛋白的非專(zhuān)一的結(jié)合所導(dǎo)致的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄的激活。例如，任何誘餌蛋白的自我激活轉(zhuǎn)錄就會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。但自我激活轉(zhuǎn)錄可以通過(guò)用構(gòu)建的誘餌克隆篩選報(bào)告基因的激活而消除。某些報(bào)告系統(tǒng)具有很高的假陽(yáng)性背景（James等，1996）。為克服這些問(wèn)題，新版的雙雜交系統(tǒng)使用多個(gè)表型的報(bào)告基因檢測(cè)基因的激活。在一個(gè)新的版本中，使用了HIS3、ADE2和lacZ為報(bào)告基因（James等，1996）。此外，此系統(tǒng)利用不同的Gal4啟動(dòng)子，使HIS3處于Gal1的啟動(dòng)子的控制之下，ADE2處于Gal2啟動(dòng)子控制，LacZ處于Gal7啟動(dòng)子控制。蛋白質(zhì)相互作用以酵母在缺乏組氨酸的平板上的生長(zhǎng)來(lái)鑒定。假陽(yáng)性通過(guò)用克隆顏色篩選來(lái)評(píng)定腺嘌呤和lacZ標(biāo)記來(lái)消除（James等，1996）。使用受不同啟動(dòng)子控制的多報(bào)告基因可以提供高靈敏度和低假陽(yáng)性背景值（Brent和Finley，1997;James等，1996）。雙雜交法最流行的用途就是從與LexA和Gal4的融合誘餌作用的激活域文庫(kù)中分離新蛋白。激活域文庫(kù)可由從插在激活域C末端的cDNA或基因組DNA片段組成。新的相互作用蛋白通過(guò)將激活域文庫(kù)引入含有融合到DNA結(jié)合域的感興147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 趣的蛋白的酵母株中并以上述的報(bào)告系統(tǒng)分離克隆來(lái)進(jìn)行鑒定（Bai和Elledge，1997）。許多實(shí)驗(yàn)室使用了此方法并鑒定了很多新的相互作用蛋白（Schwikowski等，2000）。

10.3.1 酵母中基因組范圍的蛋白質(zhì)相互作用分析

高通量酵母雙雜交篩選

釀酒酵母全基因組序列的公布推動(dòng)了在基因組范圍用雙雜交方法和從所有酵母ORF擴(kuò)增克隆的基因來(lái)繪制蛋白質(zhì)相互作用譜（Hudson等，1997;Uetz等，2000）。已大規(guī)模實(shí)施了兩類(lèi)雙雜交實(shí)驗(yàn)。用芯片法，融合到Gal4的DNA結(jié)合域或激活域的每個(gè)ORF被排列到芯片上，與其作用的反向融合分別以芯片進(jìn)行篩選以鑒定相互作用克隆。而復(fù)雜的文庫(kù)篩選方法用一套克隆的ORF創(chuàng)建融合文庫(kù)，每個(gè)ORF融合與文庫(kù)雜交來(lái)鑒定相互作用克隆。

在第一個(gè)大規(guī)模芯片實(shí)驗(yàn)中，一套大約6000個(gè)基因分別被克隆融合到GAL4激活域（Hudson等，1997）并轉(zhuǎn)化入雙雜交報(bào)告株。每個(gè)菌株分別接入384孔板的一個(gè)孔內(nèi)，16個(gè)這種板裝有大約6000株克隆并組成了一個(gè)活的蛋白矩陣（Uetz等，2000）。一套192個(gè)酵母基因分別被融合到Gal4 DNA結(jié)合域并轉(zhuǎn)化到相反雜交型的報(bào)告株，以此作為激活域克隆系列。192個(gè)誘餌株的每一個(gè)與約6000個(gè)陷阱株分別在芯片上進(jìn)行交配以系統(tǒng)地篩選蛋白質(zhì)相互作用（Uetz等，2000）（圖10.5）。發(fā)現(xiàn)192個(gè)DNA結(jié)合域融合中有87個(gè)參與了蛋白質(zhì)相互作用，一共有281個(gè)作用對(duì)。

最早實(shí)施的復(fù)雜文庫(kù)篩選將6000個(gè)克隆的Gal4激活域融合分別地收集入單個(gè)的池（pool）（Uetz等，2000）。然后6000個(gè)酵母基因分別融合入Gal4 DNA 結(jié)合域。成組的激活域融合與6000個(gè)Gal4 DNA 結(jié)合蛋白融合分別進(jìn)行雜交（圖10.5）?？赡艿南嗷プ饔靡詧?bào)告基因鑒定，12個(gè)產(chǎn)生相互作用的克隆測(cè)定了序列以對(duì)激活域融合進(jìn)行鑒定。在692個(gè)蛋白質(zhì)相互作用對(duì)中共發(fā)現(xiàn)817個(gè)ORF參與（Uetz等，2000）。有趣的是，192個(gè)蛋白中的45％在蛋白芯片實(shí)驗(yàn)中發(fā)生相互作用，而5345個(gè)可能的ORF中只有8％在用6000個(gè)陷阱高通量篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)了相互作用。因此，盡管芯片篩選為低通量，它可產(chǎn)生相對(duì)更多的相互作用子。這可能是由于在高通量實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，把所有的激活域克隆都用于篩選相互作用時(shí)，其中也包括了生長(zhǎng)遲緩和交配能力降低的細(xì)胞（Uetz等，2000）。結(jié)果表明，兩176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 種方法篩選鑒定得到的相互作用系列有所不同，具有方法上的差異性。Ito和他的同事（2001）提出一個(gè)高通量復(fù)雜文庫(kù)篩選方法。構(gòu)建了酵母6000個(gè)ORF的DNA結(jié)合域融合和激活域融合（圖10.6）。DNA結(jié)合域和激活域融合轉(zhuǎn)化到相反交配型的酵母受體株并組成62套每套96個(gè)ORF的融合。為測(cè)定可能的相互作用，在DNA激活域和結(jié)合域間實(shí)施了3844個(gè)（62×62）交配反應(yīng)。交配后，包含相互作用的蛋白的二倍體以多個(gè)報(bào)告基因進(jìn)行篩選。PCR擴(kuò)增DNA結(jié)合域與激活域融合的插入片段，測(cè)序后鑒定相互作用的克隆。結(jié)果總共發(fā)現(xiàn)了3268個(gè)酵母蛋白參與了4549對(duì)相互作用（Ito等，2001）。當(dāng)作者只考慮那些至少出現(xiàn)三次的相互作用時(shí)，構(gòu)成一個(gè)由797個(gè)蛋白和806對(duì)相互作用對(duì)的核心群組（Ito等，2001）。

對(duì)上述的高通量文庫(kù)篩選法鑒定的相互作用的比較顯示驚人的少的重復(fù)。只有大約20％的相互作用是相同的（Ito等，2001；Uetz等，2000）。缺乏重復(fù)說(shuō)明文庫(kù)的篩選實(shí)驗(yàn)方法還不成熟。所選擇的克隆組不能發(fā)現(xiàn)高比例的潛在的相互作用，這并不奇怪。要篩選所有可能的ORF間的相互作用需要測(cè)試6000×6000=36×107對(duì)組合。即使我們已知很多蛋白具有多個(gè)相互作用，實(shí)際的相互作用的數(shù)目可能還要遠(yuǎn)大于此。

計(jì)算機(jī)輔助的雙雜交篩選

僅通過(guò)鑒定盤(pán)繞的蛋白線團(tuán)介導(dǎo)的相互作用的計(jì)算機(jī)輔助篩選進(jìn)一步證明酵母基因組雙雜交篩選低估了總的相互作用（Newman等，2000）。盤(pán)繞的線團(tuán)是一種由兩個(gè)或更多α螺旋相互盤(pán)繞組成的蛋白質(zhì)相互作用（Cohen和Parry，1994）?？梢孕纬蔁o(wú)規(guī)線團(tuán)的序列以簡(jiǎn)單的重復(fù)模式為特征，由此設(shè)計(jì)了可以通過(guò)蛋白序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定無(wú)規(guī)線團(tuán)的電腦程序（Berger等，1995；Wolf等，1997）。以這些程序在酵母ORF中鑒定無(wú)規(guī)線團(tuán)，發(fā)現(xiàn)基因組編碼的大約300個(gè)蛋白為兩條鏈的無(wú)規(guī)線團(tuán)，另250個(gè)蛋白有三條鏈的無(wú)規(guī)線團(tuán)（Newman等，2000）。也即大約每11個(gè)酵母蛋白中有一個(gè)就有無(wú)規(guī)線團(tuán)。Newman和他同事（2000）用雙雜交系統(tǒng)檢查了162個(gè)預(yù)測(cè)的無(wú)規(guī)線團(tuán)區(qū)之間的相互作用?？偣?6×16＝26244對(duì)測(cè)試鑒定出來(lái)自77個(gè)不同蛋白的213對(duì)相互作用，其中100對(duì)為無(wú)規(guī)線團(tuán)。

奇怪的是用無(wú)規(guī)線團(tuán)方法鑒定的相互作用無(wú)一可用前述的雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。此結(jié)果說(shuō)明雙雜交篩選存在很高的假陽(yáng)性。這個(gè)結(jié)果與前述的結(jié)果相似，當(dāng)用激活域205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 文庫(kù)克隆進(jìn)行配對(duì)雙雜交篩選實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)相互作用的頻率很高（Uetz等，2000）。除配對(duì)篩選外，由于只有酵母蛋白的無(wú)規(guī)線團(tuán)區(qū)被用于篩選，無(wú)規(guī)線團(tuán)實(shí)驗(yàn)可能也鑒定出更多的相互作用子。雙雜交實(shí)驗(yàn)使用全長(zhǎng)蛋白可能掩蓋一些只有用蛋白質(zhì)片段才能發(fā)現(xiàn)的相互作用子。例如，全長(zhǎng)蛋白可能包含被遮蔽的相互作用位點(diǎn)，只有當(dāng)發(fā)生構(gòu)象變化時(shí)才可以暴露出來(lái)（Hu，2000）?？傊?，實(shí)驗(yàn)表明只用雙雜交測(cè)定的酵母相互作用子是被低估了的。而計(jì)算機(jī)輔助篩選，如無(wú)規(guī)線團(tuán)篩選可能提供文庫(kù)篩選得不到的信息。

酵母蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將雙雜交方法在基因組規(guī)模測(cè)定的酵母蛋白質(zhì)相互作用的分析結(jié)果與生物化學(xué)方法測(cè)定的相互作用結(jié)合起來(lái)可顯示出整個(gè)蛋白組的更復(fù)雜的相互作用譜。Schwikowki及其同事（2000）分析了2709個(gè)已發(fā)表且可在公共數(shù)據(jù)庫(kù)和大規(guī)模雙雜交實(shí)驗(yàn)中獲得的相互作用，其中包括2039個(gè)酵母蛋白。他們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)包括1548個(gè)蛋白構(gòu)成的2358對(duì)相互作用的大網(wǎng)絡(luò)及幾個(gè)小網(wǎng)絡(luò)（Schwikowki等，2000）。

相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)有很多有趣的特性。首先，相似功能的蛋白在網(wǎng)絡(luò)內(nèi)趨于聚為簇。例如，89％的已注釋為染色質(zhì)相關(guān)的蛋白都定位在染色質(zhì)相關(guān)的蛋白簇內(nèi)（Schwikowki等，2000）?？傆?jì)63％的相互作用發(fā)生在一般常用功能蛋白之間。其次，一般亞細(xì)胞定位的蛋白在網(wǎng)絡(luò)內(nèi)趨于聚為簇（Schwikowki等，2000）。第三，相互作用網(wǎng)絡(luò)揭示一些相互作用與細(xì)胞過(guò)程關(guān)聯(lián)，這揭示了細(xì)胞組件之間的互作。例如，細(xì)胞周期控制蛋白展示了大部分的細(xì)胞過(guò)程之間的相互連接。測(cè)定了細(xì)胞周期控制簇的蛋白、有絲分裂相關(guān)蛋白、蛋白降解、交配反應(yīng)、DNA合成、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其它過(guò)程相關(guān)的蛋白的相互作用（Schwikowki等，2000）。這些相互聯(lián)系反應(yīng)了細(xì)胞周期控制蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞其它過(guò)程中的作用。最后，網(wǎng)絡(luò)還提供了一些未知功能的蛋白質(zhì)的信息。網(wǎng)絡(luò)方法進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，如鑒定未知蛋白的相互作用伙伴的最一般功能、假定感興趣的蛋白具有相同或相關(guān)的功能（Mayer和Hieter，2000;Schwikowki等，2000）。確定相互作用伙伴的蛋白功能的限制性因素是缺少基因組內(nèi)蛋白功能的知識(shí)。例如，Schwikowki及其同事（2000）發(fā)現(xiàn)的大網(wǎng)絡(luò)中未知功能的554個(gè)蛋白中只有69個(gè)有2或多個(gè)已知功能的伙伴。當(dāng)對(duì)某機(jī)體的蛋白質(zhì)功能的認(rèn)識(shí)提高后，可以從相互作用網(wǎng)絡(luò)分析得到的蛋白功能將會(huì)隨之增加。234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的組織

酵母蛋白質(zhì)相互作用的大網(wǎng)絡(luò)的組織已有詳細(xì)的研究(Jeong等,2001;Maslov and Sneppen,2002)。已分析的網(wǎng)絡(luò)由大于1500個(gè)蛋白組成并由大于2000個(gè)相互作用聯(lián)結(jié)在一起。這些研究的一個(gè)目的是測(cè)定網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)是否可由一致指數(shù)拓?fù)鋵W(xué)(Uniform exponential topology)(即所有蛋白都與其它蛋白具有相同數(shù)目的連接)或異質(zhì)無(wú)標(biāo)度拓?fù)鋵W(xué)(蛋白質(zhì)連接顯示出極大的差異)來(lái)描述。相互作用的可能性的分析表明了一個(gè)高度異源的無(wú)極網(wǎng)絡(luò)，少數(shù)高度連接的蛋白在介導(dǎo)大量的低連接蛋白間的相互作用中發(fā)揮重要的作用（Jeong等，2001）。這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)正如其它復(fù)雜的系統(tǒng)（如互聯(lián)網(wǎng)和代謝網(wǎng)絡(luò)）一樣，都遵循能量分布規(guī)律（Barabasi和Albert，1999；Jeong等，2000）。蛋白網(wǎng)絡(luò)的另一個(gè)特性是高度連接的蛋白主要都與低連接性的蛋白連接在一起（Maslov和Sneppen，2002）。這種組織方式降低了細(xì)胞不同功能模塊間的相互對(duì)話的可能性，而通過(guò)定位有害突變的效應(yīng)增加了網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)固性（Maslov和Sneppen，2002）。

網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)表明它們可以允許隨機(jī)的突變，因?yàn)榇蟛糠值膫梢园l(fā)生在與其它蛋白沒(méi)有太多聯(lián)系的蛋白上（Jeong等，2001）。然而，位于節(jié)點(diǎn)的高連接蛋白一旦突變這個(gè)網(wǎng)絡(luò)將異常脆弱。此想法通過(guò)用根據(jù)所有相互作用蛋白所具有的連接數(shù)確定的級(jí)別，并將它們的級(jí)別與從基因組刪除相應(yīng)基因的表型效應(yīng)進(jìn)行關(guān)聯(lián)（Jeong等，2001）。從系統(tǒng)的酵母基因刪除實(shí)驗(yàn)獲得的大規(guī)模數(shù)據(jù)表明了它們的相關(guān)性（Ross-Macdonald 等，1999；Winzeler等，1999）。實(shí)驗(yàn)表明蛋白質(zhì)去除對(duì)細(xì)胞的致死的可能性是與該蛋白具有的連接數(shù)相關(guān)的（Jeong等，2001）。例如，93％的酵母蛋白是具有5個(gè)或更少相互作用的蛋白質(zhì)，我們有它們的基因去除數(shù)據(jù)，只有21％的蛋白是必需的。相反，只有0.7%的酵母蛋白具有15個(gè)以上的連接，但其中62％的蛋白的去除對(duì)細(xì)胞是致死的（Jeong等，2001）。因此，在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中高連接的蛋白比連接較少的蛋白更為關(guān)鍵。10.3.2 對(duì)其他生物基因組范圍的酵母雙雜交分析

病毒系統(tǒng)中蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的雙雜交分析

已經(jīng)利用病毒、細(xì)菌和動(dòng)物基因組的ORFs（開(kāi)放閱讀框）對(duì)雙雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了全面、廣泛的演示（Bartel et al.，1996；McCraith et al.，2000；Rain et al.，2001；Walhout et al.，2000）。在病毒系統(tǒng)中，T7噬菌體和牛痘病毒的基因組已經(jīng)被檢測(cè)過(guò)了。使用病毒基因組263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 的好處是可以系統(tǒng)的檢測(cè)所有可能的兩兩相互作用。例如，一組266個(gè)來(lái)自牛痘病毒的潛在ORFs與Gal4的激活區(qū)域及DNA結(jié)合區(qū)域分別融合后進(jìn)行了克?。∕cCraith et al.，2000）。利用每個(gè)與DNA結(jié)合區(qū)域的相連的融合子與由266個(gè)與激活區(qū)域相連的融合子芯片進(jìn)行配對(duì)，來(lái)檢驗(yàn)蛋白間70756種兩兩結(jié)合的所有可能?？偣仓粰z測(cè)到37個(gè)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的相互作用，其中有28個(gè)是以前所未知的（McCraith et al.，2000）。正如McCraith及他的同事所指出的那樣，這些作用可能只是病毒感染過(guò)程中的一小部分。這種低數(shù)量的相互作用的一個(gè)理由可能是大量的牛痘蛋白都是膜相關(guān)蛋白。這些蛋白質(zhì)都是以全長(zhǎng)的ORFs表達(dá)的，因此不可能到達(dá)酵母的核中來(lái)參與雙雜交作用（McCraith et al.，2000）。全長(zhǎng)ORFs的表達(dá)可能也屏蔽了某些特定的作用，導(dǎo)致了高幾率的假陰性反應(yīng)（Hu，2000）。從這些實(shí)驗(yàn)中獲得的重要信息是即使一個(gè)膜上所有的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)兩兩相互結(jié)合已經(jīng)飽和，僅使用雙雜交篩選很難把其中很大比例的相互作用檢測(cè)出來(lái)。細(xì)菌中蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的雙雜交分析

幽門(mén)螺桿菌的基因組的大小為2Mb，它編碼了1742個(gè)ORFs。用這些ORFs進(jìn)行雙雜交獲得的文庫(kù)和上面所說(shuō)的酵母實(shí)驗(yàn)不同，在那個(gè)實(shí)驗(yàn)中所使用的GAL4激活區(qū)域文庫(kù)包含超過(guò)1千萬(wàn)個(gè)隨機(jī)的基因組片斷（Rain et al.,2001）。因此，降低了全長(zhǎng)的ORFs屏蔽蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)作用的潛在問(wèn)題?？偣灿昧?61個(gè)ORFs來(lái)和GAL4的DNA結(jié)合區(qū)域進(jìn)行融合來(lái)作為餌。這些ORFs的選擇都避開(kāi)那些無(wú)法進(jìn)入酵母核內(nèi)的疏水性蛋白（Rain et al.,2001）。261個(gè)含DNA結(jié)合區(qū)域的融合子激活結(jié)構(gòu)域的文庫(kù)進(jìn)行配對(duì)來(lái)檢測(cè)蛋白間的相互作用。總共鑒定了1200個(gè)相互作用，將近是基因組的50％。這個(gè)方法似乎可以非常有效的防止ORF配對(duì)篩選中出現(xiàn)的問(wèn)題。另外，從激活結(jié)構(gòu)域文庫(kù)中檢測(cè)到的反應(yīng)子中的片斷序列的數(shù)據(jù)積累起來(lái)了。片斷的配對(duì)使得我們可以定位蛋白質(zhì)的作用區(qū)域（Rain et al.,2001）。

線蟲(chóng)中蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的雙雜交分析

相對(duì)于病毒和細(xì)菌系統(tǒng)，線蟲(chóng)的基因組比較大，大概編碼了20000個(gè)預(yù)測(cè)的ORFs。這些所有的ORFs的兩兩配對(duì)需要4×108次匹配，這在目前的技術(shù)條件下是不可行的。然而，已做過(guò)一個(gè)直接的檢測(cè)，使用了27個(gè)已知的參與vulval發(fā)展過(guò)程的蛋白質(zhì)與GAL4的DNA結(jié)合域融合，線蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)與GAL4 的292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 激活域融合（Walhout et al.,2000）。這個(gè)雙雜交鑒定了包含124個(gè)不同蛋白的148個(gè)相互作用。為了測(cè)定已鑒定的相互作用的生物學(xué)關(guān)系，作者從其他生物中搜尋同源蛋白中的保守相互作用。這樣的保守相互作用用interlogs標(biāo)記，這代表了一種增加相互作用有效性和可信度的新方法。另外，Walhout和他的同事還用了一個(gè)系統(tǒng)的聚類(lèi)分析來(lái)搜尋形成閉合環(huán)的網(wǎng)狀的相互作用，說(shuō)明在這個(gè)環(huán)中的ORFs在生物學(xué)重要相互作用中有更高的相似性（Walhout et al.,2000）。

從來(lái)自幾個(gè)生物的大量的數(shù)據(jù)可以明顯的看出雙雜交是一種高效自動(dòng)的、也是高通量的在基因組范圍內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的有效的方法。然而，高比例的假陽(yáng)性和假陰性也始終難以避免。事實(shí)上，以功能無(wú)關(guān)的蛋白和來(lái)自細(xì)胞不同部分的蛋白的關(guān)聯(lián)頻率來(lái)評(píng)估，估計(jì)目前所有的高通量的相互作用預(yù)測(cè)方法的預(yù)測(cè)結(jié)果都有超過(guò)一半是假的（von Mering et al.,2002）。因此，其他鑒定蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的方法都要求同時(shí)做雙雜交數(shù)據(jù)的有效性分析和新的相互作用的鑒定。

10.4 使用噬菌體展示來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)－配體的相互作用 10.4.1 在M13纖維狀噬菌體中展示蛋白

噬菌體展示已成為一種強(qiáng)大的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)－配體相互作用研究的工具（reviewed in Smith and Petrenko,1997）。這個(gè)方法最基本的操作是把肽鏈或蛋白質(zhì)融合到纖維狀噬菌體的外殼蛋白上。肽鏈和蛋白質(zhì)一般都是融合到噬菌體的III或VIII蛋白的N末端的（Smith,1985）。III蛋白是一個(gè)低拷貝的外殼蛋白（大約3～5個(gè)拷貝），它位于噬菌體的頂部，負(fù)責(zé)噬菌體感染細(xì)菌的過(guò)程中使噬菌體吸附到F菌毛上（Riechmann and Holliger,1997）。VIII蛋白是一種主要外殼蛋白，每個(gè)噬菌體微粒大概有2700個(gè)拷貝(Rasched and Oberer,1986)。因?yàn)榛蚓幋a的融合蛋白是包裝在同一個(gè)噬菌體微粒上的，所以各種表現(xiàn)型（也就是展示蛋白和這個(gè)展示蛋白的基因序列的配體結(jié)合特征）之間具有直接的聯(lián)系。這就允許隨機(jī)氨基酸序列的多肽的大文庫(kù)能夠快速篩選特定的配體結(jié)合特征（Fig.10.7）（Smith,1985）。另外，也可以從大量展示蛋白的突變體中篩選配體結(jié)合特征發(fā)生改變的突變體（Katz,1997）。

噬菌體展示的一個(gè)重要應(yīng)用是繪制蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)。例如，隨機(jī)的多肽文庫(kù)用來(lái)鑒定單克隆抗體的抗原決定簇和多克隆抗體（Felici et 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 al.,1993;Folgori et al.,1994;Yao et al.,1995）。根據(jù)他們結(jié)合抗體的能力，從隨機(jī)序列的噬菌體展示多肽中進(jìn)行選擇，選擇的多肽通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定。經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)一些序列和一些感興趣的抗原區(qū)域結(jié)合。這種方法的一個(gè)變種是利用DNAseI對(duì)感興趣的蛋白的基因隨機(jī)酶切后構(gòu)建多肽的文庫(kù)，然后用霰彈法(shotgun)把這些小片段基因克隆到噬菌體展示載體上（Petersen et al.,1995）。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是如果結(jié)合的多肽是已知的，它們就會(huì)結(jié)合到我們感興趣的蛋白區(qū)域。這個(gè)方法已經(jīng)用來(lái)繪制除了抗體－抗原以外其他的一些相互作用了。例如，用來(lái)定位β內(nèi)酰胺酶抑制蛋白的結(jié)合決定區(qū)，這個(gè)區(qū)域?qū)Y(jié)合到β內(nèi)酰胺酶上非常重要（Rudgers and Palzkill,2001）。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在某些時(shí)候這個(gè)方法可以以構(gòu)象特征鑒定結(jié)合域（Williamson et al.,1998）。

用Shotgun克隆打斷的基因到噬菌體展示載體中已經(jīng)擴(kuò)展到了細(xì)菌的全基因組（Jacobsson and Frykberg,1995,1996;Jacobsson et al.,1997）。在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，Staphylococcus aureus的全基因組DNA用超聲波破碎后克隆到了基因III和基因VIII的噬菌體展示載體上。這個(gè)方法的潛力在實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證，通過(guò)固定的IgG蛋白的結(jié)合富集噬菌體從Staphylococcus aureus基因組文庫(kù)中選擇編碼蛋白A的基因片段（Jacobsson and Frykberg,1995,1996）。這個(gè)系統(tǒng)也已經(jīng)被用來(lái)從Staphylococcus epidermidis中克隆纖維蛋白結(jié)合蛋白（Nilsson et al.,1998），還有來(lái)自結(jié)合α巨球蛋白、血清蛋白和IgG的C群鏈球菌的表面蛋白（Jacobsson et al.,1997）。這個(gè)方法的一個(gè)局限性是DNA的隨機(jī)片斷必須在信號(hào)序列和基因III編碼的蛋白（g3p）或基因VIII編碼的蛋白（g8p）間克隆。因此，只有1/18的克隆將含有一個(gè)有正確方向的融合子及同時(shí)含有信號(hào)序列和噬菌體外殼蛋白。標(biāo)準(zhǔn)的噬菌體展示系統(tǒng)也不合適用來(lái)構(gòu)建真核生物cDNA文庫(kù)，因?yàn)樵赾DNA中基因編碼末端的終止子的存在排除了它與外殼蛋白的結(jié)合的可能。這個(gè)問(wèn)題利用在裂解噬菌體的外殼蛋白上展示蛋白或片段就可以避免。10.4.2 T7噬菌體的蛋白展示

使用裂解噬菌體載體，如λ（Maruyama et al.,1994;Santini et al.,1998），T4（Ren et al.,1996），T7（Rosenberg et al.,1996）的噬菌體展示系統(tǒng)的發(fā)展已經(jīng)提供了一種不依賴E.coli分泌機(jī)制的替代法。所有這些系統(tǒng)的額外的優(yōu)點(diǎn)是克隆的蛋白是融合在噬菌體外殼蛋白的C端的，這樣方便了基因組和cDNA文庫(kù)的350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 構(gòu)建。在T7 上展示cDNA文庫(kù)最近已經(jīng)被用來(lái)鑒定信號(hào)蛋白在EFG－受體信號(hào)通路中的作用了（Zozulya et al.,1999）。另外，利用cDNA文庫(kù)，T7系統(tǒng)已經(jīng)被用來(lái)鑒定蛋白質(zhì)和小分子間的相互作用。這些研究說(shuō)明噬菌體展示可以用作高通量的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的研究。

基因組或cDNA噬菌體展示文庫(kù)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是同一個(gè)文庫(kù)可以用來(lái)分離很多不同配體的結(jié)合蛋白。另外，用來(lái)掃描的配體并不局限于其它蛋白，任何可以被固定的分子都可能作為一個(gè)測(cè)試的目標(biāo)。這使得文庫(kù)能用來(lái)搜索那些可以結(jié)合DNA、RNA、蛋白質(zhì)、糖、氨基酸或其他小分子物質(zhì)的蛋白質(zhì)。多肽噬菌體展示文庫(kù)甚至已經(jīng)被用來(lái)探索活的動(dòng)物的脈管系統(tǒng)（Pasqualini and Ruoslahti,1996）。這就是把噬菌體庫(kù)注射到小鼠的循環(huán)系統(tǒng)中，等一段時(shí)間后收集感興趣的器官和組織，利用勻漿混合物感染E.coli來(lái)擴(kuò)增結(jié)合在這些組織上的噬菌體（Pasqualini and Ruoslahti,1996）。這個(gè)方法已經(jīng)被用來(lái)鑒定對(duì)不同組織和腫瘤的脈管系統(tǒng)特異性的多肽（Arap et al.,2002;Pasqualini and Ruoslahti,1996;Rajotte et al.,1998）。結(jié)果表明大部分組織的脈管系統(tǒng)表現(xiàn)出組織特有的標(biāo)記。利用來(lái)自病原微生物的基因組或cDNA文庫(kù)來(lái)做這個(gè)體內(nèi)噬菌體展示實(shí)驗(yàn)，以檢查由微生物的ORFs介導(dǎo)的目標(biāo)組織將是非常有意思的。

鑒定很多種配體的結(jié)合蛋白的能力將使噬菌體展示成為蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)有用的工具?；蚪M測(cè)序已經(jīng)鑒定很多沒(méi)有功能的開(kāi)放閱讀框?；蚪M噬菌體展示文庫(kù)可以被用來(lái)利用結(jié)合功能對(duì)ORFs進(jìn)行分類(lèi)。例如，基因組DNA可以被固定到小珠上，就可以從基因組噬菌體展示文庫(kù)中篩選出一組DNA結(jié)合蛋白。使用不同類(lèi)型的配體就可能根據(jù)結(jié)合能力把大量的ORFs進(jìn)行分門(mén)別類(lèi)。10.4.3 酵母雙雜交和噬菌體展示相結(jié)合

酵母雙雜交和噬菌體展示系統(tǒng)都共同具有的一個(gè)缺點(diǎn)是都產(chǎn)生高比例的假陽(yáng)性數(shù)據(jù)。因?yàn)檫@兩個(gè)技術(shù)相當(dāng)不同，即酵母雙雜交系統(tǒng)是一個(gè)體內(nèi)的分析，而噬菌體展示是體外的，因此結(jié)合這兩種方法可能會(huì)產(chǎn)生更有用的生物學(xué)數(shù)據(jù)。該途徑的強(qiáng)大能力最近已經(jīng)被含有SH3結(jié)構(gòu)域的酵母蛋白的研究很好的闡明了（Tone et al.,2003）。SH3結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)識(shí)別分子，它介導(dǎo)很多參與特殊生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的相互作用（Pawson and Scott,1997）。為了鑒定和酵母中發(fā)現(xiàn)的SH3結(jié)構(gòu)域發(fā)生作用的蛋白質(zhì)，總共在E.coli中表達(dá)了24個(gè)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 407 酶融合并以可溶狀態(tài)出現(xiàn)的SH3結(jié)構(gòu)域（Tone et al.,2002）。這些蛋白被用作噬菌體展示的目標(biāo)來(lái)從隨機(jī)氨基酸序列的九肽文庫(kù)中選擇SH3結(jié)構(gòu)域的配體。在多方面富集多肽配體之后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，分析了20個(gè)不同的SH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合配體的一致序列（Tone et al.,2002）。這些相同的序列就被用來(lái)搜尋酵母蛋白組中潛在的天然SH3配體。發(fā)現(xiàn)含有天然SH3 結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)形成了一個(gè)網(wǎng)狀的相互作用。為了證明這個(gè)發(fā)現(xiàn)，以18個(gè)不同的SH3結(jié)構(gòu)域和幾個(gè)富含脯氨酸的目標(biāo)為餌進(jìn)行一系列的雙雜交后建立了第二個(gè)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)（Tone et al.,2002）。最后，利用噬菌體展示和酵母雙雜交相互作用網(wǎng)絡(luò)中的交叉點(diǎn)找到了它們的共有組分?？偣灿?9個(gè)噬菌體展示網(wǎng)絡(luò)中的相互作用在酵母雙雜交相互作用網(wǎng)也得到印證（Tone et al.,2002）。其中的一些作用已經(jīng)用免疫共沉淀在體內(nèi)進(jìn)行了證明。利用來(lái)自多種試驗(yàn)方法得到的多組試驗(yàn)數(shù)據(jù)是一種評(píng)估一種特定辦法的產(chǎn)生偏差的有用的辦法。10.5 在蛋白片段互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)相互作用 10.5.1 簡(jiǎn)介

蛋白片段互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)是以酶的重裝配策略為基礎(chǔ)的：蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的相互作用能促進(jìn)有效的再折疊和酶片段互補(bǔ)來(lái)恢復(fù)成為活性酶。這個(gè)方法起初是用復(fù)原的泛素作為蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用傳感器。泛素是一種由76個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，獨(dú)立或與其它蛋白共價(jià)連接存在于細(xì)胞中（Johnsson and Varshavsky,1994）。泛素與其他蛋白的融合蛋白會(huì)很快的被泛素特異性蛋白酶降解，這個(gè)酶識(shí)別泛素的折疊構(gòu)象。如果泛素和一個(gè)報(bào)告蛋白一起融合表達(dá)，那么降解反應(yīng)后就能在體內(nèi)釋放報(bào)告子（Johnsson and Varshavsky,1994）。然而，泛素的C末端片段與報(bào)告子的融合蛋白和泛素的N末端片段在同一個(gè)細(xì)胞中分別表達(dá)，這種降解將不會(huì)發(fā)生。如果兩個(gè)相互作用的蛋白質(zhì)分別與泛素的C端片段和N端片段融合，并在同一細(xì)胞表達(dá)，則完整的泛素將會(huì)被復(fù)原，降解效應(yīng)將發(fā)生（Fig.10.8）。因此蛋白質(zhì)的相互作用可以在體內(nèi)把他們分別融合到泛素的C端片段和N端片段并測(cè)定報(bào)告蛋白的釋放來(lái)檢測(cè)。就像下面討論的那樣，這個(gè)方法已經(jīng)被擴(kuò)展到了其他系統(tǒng)，現(xiàn)在已經(jīng)成為酵母雙雜交和噬菌體展示的可行的替代方法在體內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的相互作用。

10.5.2 利用二氫葉酸還原酶的蛋白片段的互補(bǔ) 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 二氫葉酸還原酶參與了一碳化合物的代謝，是原核細(xì)胞和真核細(xì)胞生存所必須的。這個(gè)酶催化從二氫葉酸到四氫葉酸還原反應(yīng)，這個(gè)過(guò)程是絲氨酸、蛋氨酸、嘌呤、胸苷酸生物合成所必須的。老鼠的二氫葉酸還原酶（mDHFR）是一個(gè)較小的（21KD）單體酶，它和E.coli中的酶同源性很高（29％的序列一致性）（Pelletier et al.,1998）。DHFR的三位結(jié)構(gòu)說(shuō)明它由F[1]、F[2]、F[3]三個(gè)結(jié)構(gòu)片段組成（Gegg et al.,1997）。

E.coli的DHFR被抗生素甲氧芐氨嘧啶選擇性抑止。mDHFR和甲氧芐氨嘧啶的親和系數(shù)要比細(xì)菌的DHFR小12000倍。因此表達(dá)mDHFR的E.coli能在存在甲氧芐氨嘧啶時(shí)生長(zhǎng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mDHFR的F[1,2]、F[3]三個(gè)結(jié)構(gòu)域與寡聚亮氨酸拉鏈融合后分別表達(dá)，在體內(nèi)的重組導(dǎo)致了甲氧芐氨嘧啶抗性的E.coli細(xì)胞的產(chǎn)生（Pelletier et al.,1998）。該重組是由于亮氨酸拉鏈序列的相互作用拉近了mDHFR的F[1,2]、F[3]的片段使它們能夠折疊成單個(gè)有功能的酶。潛在蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的相互作用可以用下述方法來(lái)檢測(cè)：把一個(gè)蛋白與F[1,2]域融合并讓該蛋白的已知結(jié)合伙伴與F[3]融合，然后測(cè)試包含融合結(jié)構(gòu)的E.coli細(xì)胞的甲氧芐氨嘧啶抗性。這個(gè)系統(tǒng)與上面所描述的泛素系統(tǒng)比較類(lèi)似。

mDHFR蛋白片段互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的使用已經(jīng)擴(kuò)展到了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的mDHFR活性的恢復(fù)用缺少DHFR的細(xì)胞在缺失核苷酸中的生長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)（Remy and Michnick,1999）。這些細(xì)胞的生長(zhǎng)必須要有一個(gè)有活性的mDHFR酶，因?yàn)镈HFR的活性是合成嘌呤和嘧啶所必須的（Remy and Michnick,1999）。第二種在細(xì)胞培養(yǎng)中檢測(cè)mDHFR重組的方法是以熒光實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的，檢測(cè)在體內(nèi)熒光標(biāo)記的甲氨蝶呤（fMTX）結(jié)合到重組的mDHFR上。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)是當(dāng)mDHFR在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生重組，它就會(huì)以高親和力與fMTX結(jié)合生成1：1的復(fù)合物。結(jié)合了的fMTX會(huì)停留在細(xì)胞中，未結(jié)合的則排出細(xì)胞外。因此重組的mDHFR存在與否可以利用熒光顯微鏡、FACS或光譜進(jìn)行檢測(cè)（Remy and Michnick,1999）。

mDHFR蛋白互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被用來(lái)繪制原核生物翻譯起始的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)（Remy and Michnick,2001）。總共分析了35對(duì)全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，利用細(xì)胞在缺少核苷酸時(shí)存活的選擇性鑒定了14個(gè)相互作用。另外，利用fMTX試劑結(jié)合熒光顯微鏡來(lái)定位蛋白復(fù)合物在細(xì)胞中的位置（Remy and Michnick,2001）。mDHFR437 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460 461 462 463 464 465 蛋白互補(bǔ)系統(tǒng)相對(duì)于酵母雙雜交系統(tǒng)在檢測(cè)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用中有潛在的優(yōu)勢(shì)。例如，mDHFR系統(tǒng)可以在E.coli或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用（Pelletier et al.,1998;Remy and Michnick,1999）。當(dāng)試驗(yàn)哺乳動(dòng)物蛋白相互作用時(shí)，可能使用陰性系統(tǒng)更為有利。另外利用MTX試劑結(jié)合熒光顯微鏡在細(xì)胞中定位相互作用的能力提供了酵母雙雜交系統(tǒng)所無(wú)法提供的重要信息。因此，這種技術(shù)可能會(huì)在未來(lái)的蛋白組學(xué)研究中有很廣泛的應(yīng)用。

10.5.3 用β－半乳糖苷酶互補(bǔ)來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)的相互作用

β－半乳糖苷酶廣泛的被用作基因表達(dá)的報(bào)告子，因?yàn)樗到猱a(chǎn)色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）來(lái)產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物的能力。以經(jīng)典的內(nèi)部順?lè)醋踊パa(bǔ)的細(xì)菌基因表型為基礎(chǔ)，發(fā)展出了蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)（Mohler and Blau,1996）。在E.coli中去掉lacZ的N端或C端會(huì)產(chǎn)生一個(gè)沒(méi)有活性的酶，但是缺少不同末端的無(wú)活性酶共表達(dá)后互補(bǔ)。利用把缺失片段裝配到一個(gè)穩(wěn)定的八聚蛋白中產(chǎn)生互補(bǔ)，這個(gè)蛋白含有野生型所有的必須的結(jié)構(gòu)域（Mohler and Blau,1996）。參與互補(bǔ)的存在于突變體中的N端和C端結(jié)構(gòu)域就是我們所知的а和ω區(qū)域。相互作用的實(shí)驗(yàn)是基于這樣一個(gè)基礎(chǔ)上的，即當(dāng)缺少а結(jié)構(gòu)域（△а）和ω結(jié)構(gòu)域（△ω）的β-半乳糖苷酶共表達(dá)時(shí)互補(bǔ)產(chǎn)生有活性酶的效率是很高的（Mohler and Blau,1996）。當(dāng)△а和△ω的β-半乳糖苷酶突變體分別和相互作用的蛋白質(zhì)融合時(shí)，有利于△а和△ω片段的靠近，這樣就能產(chǎn)生高效的互補(bǔ)作用。因此，潛在的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用可以利用把感興趣的蛋白質(zhì)分別融合到△а和△ω的β-半乳糖苷酶突變體上，然后檢測(cè)酶利用X-Gal的活性（Mohler and Blau,1996;Rossi et al.,2000）。

β－半乳糖苷酶互補(bǔ)作用實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被應(yīng)用到了哺乳動(dòng)物細(xì)胞（Rossi et al.,1997）。熒光標(biāo)記的β－半乳糖苷酶的底物使得能夠用熒光顯微鏡和FACS來(lái)分析表達(dá)感興趣的融合蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。因此，類(lèi)似于mDHFR系統(tǒng)，β-半乳糖苷酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)可能會(huì)發(fā)展成為在基因組范圍內(nèi)研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的有用的工具。

10.6利用質(zhì)譜儀研究蛋白質(zhì)－蛋白相互作用的圖譜 10.6.1概論

蛋白質(zhì)的快速鑒定可以通過(guò)直接搜索蛋白質(zhì)和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)來(lái)獲得，466 467 468 469 470 471 472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 493 494 這些數(shù)據(jù)庫(kù)是由質(zhì)譜儀所產(chǎn)生的多肽質(zhì)量數(shù)據(jù)構(gòu)成的。鑒定蛋白復(fù)合物的組成是質(zhì)譜在蛋白－蛋白相互作用圖譜中最普遍的應(yīng)用。這些實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)應(yīng)用親和方法來(lái)分離完整的蛋白復(fù)合體來(lái)實(shí)現(xiàn)（圖.10.9）。而這通常需要了解蛋白質(zhì)復(fù)合物中至少一個(gè)蛋白的特性。這個(gè)蛋白可以通過(guò)親和處理來(lái)標(biāo)記，比如谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶、多聚組氨酸重復(fù)或者抗體的抗原決定簇如Flag 標(biāo)記。標(biāo)記蛋白可以在細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)，在非變性條件下進(jìn)行親和純化過(guò)程中與標(biāo)記蛋白相互作用的蛋白也一同被純化。復(fù)合物進(jìn)行洗提，蛋白組分用SDS－PAGE分離，條帶從凝膠中切割下來(lái)并進(jìn)行蛋白酶解，肽的精確的質(zhì)量可由質(zhì)譜儀來(lái)確定。搜索肽質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行比對(duì)可以鑒定復(fù)合物中的蛋白。這種常規(guī)的方法文獻(xiàn)中已有很多例子，包括研究核孔復(fù)合體、酵母Arp2/3復(fù)合體、TATA－結(jié)合蛋白關(guān)聯(lián)因子、酵母紡錘體復(fù)合物、剪切體組份以及結(jié)合到分子伴侶 GroEL的蛋白等。10.6.2 鑒定E.coli 的GroEL作用底物

分子伴侶 GroEL和它的輔因子GroES是E.coli生長(zhǎng)所必須的。GroEL的作用是通過(guò)限制聚合作用來(lái)促進(jìn)折疊。GroEL是一個(gè)由14個(gè)亞單位構(gòu)成的有2個(gè)大空穴的圓柱形的同源低聚體，底物蛋白通過(guò)GroEL復(fù)合物疏水表面結(jié)合在圓柱體空穴中間。GroES隨后結(jié)合在圓柱體的頂點(diǎn)表面上使底物被捕獲在阻止聚合作用的空穴內(nèi)。細(xì)胞中大概10％的新的翻譯的蛋白可以與GroEL相互作用，這一點(diǎn)是明確的，但是這些底物蛋白的身份知之甚少。

GroEL首選底物可通過(guò)脈沖－追蹤標(biāo)記生長(zhǎng)的E.coli細(xì)胞來(lái)鑒定的。在不同的追蹤時(shí)間，GroEL-底物復(fù)合物可以用 anti-GroEL 抗體免疫沉淀反應(yīng)分離出。沉淀下來(lái)的蛋白可通過(guò)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，通過(guò)胰酶對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行消化，隨后用MALLDA－TOF質(zhì)譜儀分析肽－質(zhì)量指紋就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的鑒定。利用這種方法，總共鑒定出了52個(gè)不同的GroEL的底物蛋白。分析這些蛋白與GroEL的相互作用為基礎(chǔ)的共同結(jié)構(gòu)模塊。發(fā)現(xiàn)GroEL底物比其它E.coli蛋白多具有幾個(gè)αβ域。這些試驗(yàn)說(shuō)明質(zhì)譜方法可以來(lái)確定蛋白－蛋白的相互作用。10.6.3啤酒酵母蛋白復(fù)合物的鑒定

質(zhì)譜儀最近用來(lái)系統(tǒng)分析酵母中蛋白－蛋白相互作用。這些研究與上述的雙雜交實(shí)驗(yàn)類(lèi)似，很重要的不同在于質(zhì)譜儀是研究蛋白復(fù)合物，而雙雜交方法是來(lái)檢測(cè)兩者間的相互作用。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，TAP用來(lái)純化589個(gè)蛋白復(fù)合物。TAP495 496 497 498 499 500 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 511 512 513 514 515 516 517 518 519 520 521 522 523 方法利用兩個(gè)親和標(biāo)記的結(jié)合來(lái)純化蛋白復(fù)合物。復(fù)合物在單向SDS－PAGE中分離，單個(gè)蛋白用MALDI－TOF質(zhì)譜儀來(lái)鑒定。589個(gè)純化的TAP標(biāo)記蛋白中，78％存在與之相結(jié)合的蛋白，表明這種方法可以有效純化復(fù)合物?？偣?45個(gè)純化復(fù)合物與酵母中98個(gè)已知的蛋白復(fù)合物是一致的，這證明了此方法的可靠性。另外242個(gè)純化復(fù)合物中鑒定出了134新的復(fù)合物。這些數(shù)據(jù)表明兩種不同的純化方法檢測(cè)到相同蛋白的可能性大概為70％。因此30% 的結(jié)果可能是有問(wèn)題的。.酵母中的蛋白復(fù)合物第二個(gè)系統(tǒng)研究是在餌蛋白上應(yīng)用單親和標(biāo)記來(lái)純化感興趣的復(fù)合物。在這些實(shí)驗(yàn)中，752種蛋白標(biāo)記為餌，相關(guān)的復(fù)合物被純化。復(fù)合物中的蛋白在SDS－PAGE中分離，從凝膠中挖出，用胰蛋白酶消化，然后利用串聯(lián)質(zhì)譜儀來(lái)鑒定。研究鑒定了1578個(gè)不同相互作用的蛋白，它們代表了25％的酵母蛋白質(zhì)組。

一個(gè)重要的問(wèn)題是數(shù)據(jù)的獲得是否是從高通量質(zhì)譜儀實(shí)驗(yàn)和利用雙雜交試驗(yàn)相交合的數(shù)據(jù)中獲得的。研究利用TAP標(biāo)記產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，只有7％是與雙雜交是重疊的。用兩種試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)相互作用的類(lèi)型表明是互補(bǔ)的。雙雜交方法不適用于檢測(cè)蛋白的復(fù)合物，它僅鑒定二元的作用。然而雙雜交試驗(yàn)對(duì)于鑒定兩者間的作用以及低親和力很有用。

10.7蛋白表達(dá)譜以及相互作用中的蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)芯片分析是另外一個(gè)新出現(xiàn)的熱點(diǎn)，針對(duì)檢測(cè)蛋白表達(dá)及相互作用的高通量技術(shù)?？梢跃哂胁煌姆绞降牡鞍踪|(zhì)芯片，如一套抗體可以排列于濾光器或者載玻片上，用來(lái)檢測(cè)蛋白表達(dá)的水平。另外一種方法包括來(lái)源于組織的蛋白直接放于玻璃載片、尼龍濾網(wǎng)或者微量滴定孔。這個(gè)方法可以用來(lái)定位蛋白－蛋白相互作用或者蛋白催化作用。

蛋白質(zhì)芯片試驗(yàn)的難點(diǎn)在于蛋白不如核酸那樣的均一。蛋白功能依賴于精確的脆弱的三維結(jié)構(gòu)，這在試驗(yàn)中很難保持。另外相互作用的強(qiáng)度和穩(wěn)定性不如核酸那樣標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)蛋白－蛋白相互反應(yīng)是專(zhuān)一的可以呈現(xiàn)一個(gè)寬范圍的親和力。目前蛋白表達(dá)的分析幾乎完全依賴雙向電泳以及質(zhì)譜儀。然而蛋白試驗(yàn)的發(fā)展，需要另外有力方法以便在更廣的基因范圍內(nèi)研究蛋白表達(dá)和蛋白－蛋白相互作用。524 525 526 527 528 529 530 531 532 533 534 535 536 537 538 539 540 541 542 543 544 545 546 547 548 549 550 551 552 10.7.1蛋白表達(dá)圖譜抗體試驗(yàn)

蛋白組學(xué)的一個(gè)目標(biāo)是檢測(cè)組織之內(nèi)或者之間蛋白表達(dá)水平。長(zhǎng)期以來(lái)抗體被用來(lái)檢測(cè)蛋白，如western雜交和ELISA等方法。然而檢測(cè)成千上萬(wàn)的蛋白用這種方法就很麻煩。一個(gè)替代的方法是抗體的芯片，待測(cè)組織中每種蛋白的專(zhuān)一抗體被置于濾膜或者玻片上。蛋白表達(dá)測(cè)定首先通過(guò)在目的組織中獲得天然蛋白裂解物并將蛋白用熒光標(biāo)記。蛋白混合物結(jié)合抗體芯片，目的組織中表達(dá)的蛋白在芯片上結(jié)合他們的同類(lèi)抗體。將非特異的蛋白洗掉，通過(guò)測(cè)定結(jié)合蛋白熒光來(lái)檢測(cè)結(jié)合蛋白類(lèi)型。這個(gè)方法本質(zhì)上是高通量 ELISA試驗(yàn)。這個(gè)試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于芯片結(jié)合之前不需要天然蛋白的分餾。另外可以實(shí)現(xiàn)應(yīng)用自動(dòng)化程序?qū)Χ喾N樣品進(jìn)行平行檢測(cè)。顯然這種方法的限制是需要對(duì)每一個(gè)蛋白專(zhuān)一抗體的研究。

對(duì)于大量的蛋白利用免疫處理動(dòng)物并純化蛋白來(lái)獲得抗體可能會(huì)比較困難且費(fèi)用昂貴。一個(gè)替代的方法是利用噬菌體展示庫(kù)分離專(zhuān)一的抗體?？贵w的噬菌體展示庫(kù)已經(jīng)廣泛的運(yùn)用于篩選單克隆抗體而不需要傳統(tǒng)的雜交技術(shù)。從單個(gè)噬菌體展示庫(kù)中眾多蛋白中分離專(zhuān)一抗體的技術(shù)已可以自動(dòng)化，因此在更廣的基因組范圍的項(xiàng)目中有很大的潛力來(lái)提供抗體。10.7.2 運(yùn)用肽、蛋白質(zhì)和小分子芯片進(jìn)行功能分析

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的目的之一是將基因組翻譯的所有蛋白排成芯片用于功能研究。對(duì)于蛋白質(zhì)功能的全局分析，過(guò)去已經(jīng)通過(guò)文庫(kù)篩選方法有所研究了。對(duì)于cDNA表達(dá)文庫(kù)等文庫(kù)篩選，可以成批地對(duì)某一種期望的生物學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)。例如，從λ噬菌體的噬菌斑中篩選出表達(dá)蛋白已經(jīng)被運(yùn)用了很多年了（Young and Davis，1983）。在這些實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)cDNA文庫(kù)插入到一個(gè)λ噬菌體載體中，這樣編碼的蛋白以一個(gè)與E.coli β－半乳糖苷酶融合蛋白的形式表達(dá)出來(lái)。噬菌體文庫(kù)感染E.coli后，在瓊脂平板上形成λ噬菌斑。每一個(gè)λ噬菌斑表達(dá)一種不同的融合蛋白，然后運(yùn)用這些蛋白質(zhì)特異抗體探查出這些噬菌斑中特異蛋白的存在（Young and Davis，1983）。挑出確定的陽(yáng)性噬菌斑，檢測(cè)插入片段的DNA序列從而確定相關(guān)的基因。通過(guò)這種方法，基于抗體－抗原的相互作用篩選并克隆基因成為可能。

蛋白質(zhì)芯片比文庫(kù)方法可能會(huì)有更多的優(yōu)點(diǎn)。芯片方式提供了一種精確的，空間定向的格子，允許芯片上的所有蛋白質(zhì)能夠并行的對(duì)比從而篩選出來(lái)。這種553 554 555 556 557 558 559 560 561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576 577 578 579 580 581 空間結(jié)構(gòu)也能夠確定出芯片中的一個(gè)克隆，該克隆是根據(jù)芯片中其所在的位點(diǎn)測(cè)試出為陽(yáng)性的。因此，這種方法確定蛋白質(zhì)相互作用中的一個(gè)蛋白質(zhì)比文庫(kù)篩選要省力。但是，蛋白質(zhì)芯片也有一個(gè)缺點(diǎn)，即與文庫(kù)（～109）相比，所能排列和篩選的蛋白質(zhì)較少（～104）。同樣，純化所要排列的成千上百個(gè)單個(gè)蛋白質(zhì)種類(lèi)也是一個(gè)技術(shù)上的挑戰(zhàn)。因此，可以有效測(cè)定的蛋白數(shù)目限制了蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用。

肽芯片

最早應(yīng)用芯片形式的是肽芯片。例如，合成肽的大頭針式方法就是在一個(gè)96微孔板內(nèi)平行合成肽。運(yùn)用Fluoenylmethoxycarbonyl（Fmoc）標(biāo)記氨基酸保護(hù)機(jī)制，肽在直徑為4mm的經(jīng)氨活化的聚乙烯大頭針上合成（Geysen et al，1984，1986）。每一個(gè)合成循環(huán)中，這些大頭針被浸入一種氨基酸溶液中。因?yàn)殡氖窃诠腆w支持相上合成的，因此在循環(huán)之間未反應(yīng)的多余氨基酸可以被完全洗脫下來(lái)，增加最后結(jié)果的純度。這種方法起初被用于檢測(cè)口蹄疫病毒VP1衣殼蛋白的抗原決定簇的結(jié)構(gòu)圖譜。存在于有218個(gè)氨基酸的VP1序列中的所有208種可能的重復(fù)的六肽通過(guò)與抗體的相互作用被合成并制成芯片。該方法中檢測(cè)出一個(gè)免疫結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而通過(guò)將單核苷酸依次替代肽所在的區(qū)域產(chǎn)生較好的圖譜。這是第一個(gè)使用高通量方法確定蛋白與蛋白之間的關(guān)系。

SPOT合成方法是另一種同時(shí)的、平行的在固相支持上合成肽的方法。這種方法運(yùn)用Fmoc化學(xué)保護(hù)法，但使用在纖維素膜上的羥基作為合成的固相支持（Frank，1992）。當(dāng)一小滴液體滲入多孔膜時(shí)，液體就會(huì)被吸收，形成一個(gè)圓點(diǎn)。通過(guò)使用一種包含合適反應(yīng)物的低揮發(fā)的溶劑，那么在逐步添加活性氨基酸至固定在支持膜上的化學(xué)基團(tuán)時(shí)每一個(gè)點(diǎn)就會(huì)形成一個(gè)開(kāi)放的反應(yīng)器（Frank，1992）。通過(guò)一個(gè)αN-Fmoc保護(hù)的氨基酸與纖維素膜上的羥基之間的酯化作用及隨后的Fmoc切除來(lái)為完成肽的組裝提供錨點(diǎn)（Frank and Overwin，1996）。Fmoc-β-丙氨酸是最常用的膜上的反應(yīng)物。去保護(hù)之后，β－丙氨酸游離的氨基部分可以作為肽芯片合成的模板（Frank，1992；Gausepohl et al，1992）。這種方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于描繪抗體－抗原的相互作用，同時(shí)也用于蛋白-DNA，蛋白-金屬，其他蛋白-蛋白之間的相互關(guān)系（Reineke et al，2001）。582 583 584 585 586 587 588 589 590 591 592 593 594 595 596 597 598 599 600 601 602 603 604 605 606 607 608 609 610

SPOT合成法最多的應(yīng)用是為確定線性B細(xì)胞抗原決定簇而制備肽芯片。如果抗原蛋白已知，那么包含整個(gè)序列的一系列重復(fù)的肽就可以很容易的合成并通過(guò)結(jié)合抗體進(jìn)行測(cè)定（Reineke et al，1999a）。對(duì)于結(jié)合起關(guān)鍵作用的單個(gè)殘基可以通過(guò)肽的SPOT合成法及氨基酸替代而被確定。該方法曾用于檢測(cè)抗李斯特菌細(xì)胞溶解素（listeriolysin）產(chǎn)生的六個(gè)單克隆抗體（MAbs）的抗原決定簇結(jié)合位點(diǎn)，李斯特菌細(xì)胞溶解素是由病原菌Listeria monocytogenes產(chǎn)生的一種毒素（Darji et al，1996）。MAbs的結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)SPOT合成法產(chǎn)生重復(fù)的肽而確定，這些肽可以覆蓋李斯特菌細(xì)胞溶解素分子的整個(gè)氨基酸序列。一共有166個(gè)肽，每個(gè)肽含12個(gè)氨基酸及一條含3個(gè)氨基酸的支鏈，在芯片中以點(diǎn)的形式合成（Darji et al，1996）。通過(guò)將一個(gè)MAb與固定化的肽孵育并用過(guò)氧化物酶連接的二抗檢測(cè)抗體的方法來(lái)檢測(cè)肽的結(jié)合。纖維素膜在洗脫掉結(jié)合抗體后可以重復(fù)使用數(shù)次。通過(guò)這種方法，六個(gè)MAb中的每一個(gè)含6～8個(gè)氨基酸的結(jié)合位點(diǎn)就可以被定位了（Darji et al，1996）。除此之外，有報(bào)道通過(guò)將抗體與每個(gè)MAb上已確定的結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的可溶的肽進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的方法，可以阻斷MAbs與膜的結(jié)合。

SPOT合成法也用于為繪制抗原決定簇圖譜，建立組合的肽文庫(kù)。例如，可以通過(guò)組合文庫(kù)確定被鼠抗p24的HIV-1單克隆IgG2a抗體CB4－1識(shí)別的肽抗原決定簇（Kramer et al，1997）。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，需要合成一個(gè)由68590個(gè)肽的混合物組成的復(fù)雜組合肽文庫(kù)XXXX[B1,B2,B3,B3,X1,X2,X3]XXXX。這個(gè)庫(kù)由10個(gè)含有不同六肽核心的亞庫(kù)組成，六肽核心分別為[XXB1B2B3XX],[XB1XB2B3X],[XB1B2XB3X],[XB1XXB2B3],[XB1XB2XB3], [XB1B2XXB3],[B1XXXB2B3],[B1XXB2XB3],[B1XB2XXB3],[B1B2XXXB3]，這些核心對(duì)應(yīng)于三個(gè)確定位點(diǎn)所有可能的距離模式(Kramer et al，1997）。根據(jù)與CB4－1的結(jié)合篩選纖維素結(jié)合位點(diǎn)篩選組合文庫(kù)，結(jié)果從68590個(gè)點(diǎn)上檢測(cè)到225個(gè)肽的混合物。將篩選出來(lái)的肽混合物去掉其隨機(jī)化的位點(diǎn)，確定了一條與p24有關(guān)的序列的肽段，同時(shí)還確定了三條完全不同的肽段(Kramer et al，1997）。肽結(jié)合的親和力及競(jìng)爭(zhēng)力實(shí)驗(yàn)顯示所有的肽可以結(jié)合到單克隆抗體的同一位點(diǎn)，但是親和力各有不同。另外，每一個(gè)肽段的替代分析清楚的顯示抗體識(shí)別的分子基礎(chǔ)對(duì)每一個(gè)確定的肽段是特異且唯一的（Kramer et al，1997）。這種替代分析611 612 613 614 615 616 617 618 619 620 621 622 623 624 625 626 627 628 629 630 631 632 633 634 635 636 637 638 639 也被用于確定supertope序列，該方法建立在氨基酸替代的基礎(chǔ)上，替代的氨基酸與p24單克隆抗體的結(jié)合位點(diǎn)相一致。例如，其中一條肽段的序列是GATPEDLNQKLAGN, 但是使用SPOT合成法進(jìn)行系統(tǒng)的氨基酸替代得到的的supertope序列為XXXXX[DE]L[HKNR]XX[IL]XXX, X為任意氨基酸（Kramer et al，1997）。與supertope一致的序列與SWISSPROT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)5517個(gè)配對(duì)的蛋白質(zhì)。其中一些已確定的蛋白質(zhì)純化后可與p24 單克隆抗體結(jié)合。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了P24MAb的多特異性，表明SPOT合成法也可以用于產(chǎn)生及尋找無(wú)偏的組合隨機(jī)序列文庫(kù)。

繪制非連續(xù)的抗原決定簇的結(jié)構(gòu)圖更要困難，因?yàn)榭贵w結(jié)合到來(lái)自抗原蛋白的不同區(qū)域的肽的親和力較低。SPOT合成法的一個(gè)有趣的應(yīng)用是繪制與IL－10結(jié)合的中性抗IL－10抗體即CB/RS/1結(jié)合位點(diǎn)的圖譜（Reineke et al，1999b）。IL－10序列上一段重復(fù)的肽段通過(guò)將一段15mer的肽段上的一個(gè)氨基酸替換掉而得到。肽芯片通過(guò)使用CB/RS/1抗體進(jìn)行探測(cè)，而結(jié)合抗體可以通過(guò)使用鼠IgG過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體而檢測(cè)到。發(fā)現(xiàn)CB/RS/1抗體與代表著蛋白質(zhì)兩個(gè)不同區(qū)域的肽段結(jié)合，這兩個(gè)區(qū)域在一級(jí)結(jié)構(gòu)中是分開(kāi)的，而在高級(jí)結(jié)構(gòu)中是連續(xù)的（Reineke et al，1999b）。那些結(jié)合在抗體上的肽段上的氨基酸殘基位點(diǎn)隨后被系統(tǒng)的一一替換，并通過(guò)點(diǎn)合成而排成芯片。對(duì)于與CB/RS/1抗體的結(jié)合很重要的肽段上的各個(gè)位點(diǎn)又可以通過(guò)檢測(cè)而確定。大量的替代可以增加抗體的結(jié)合。展示抗體結(jié)合能力的兩個(gè)區(qū)域位于同一條肽鏈，并且這條單個(gè)肽鏈與替代增加結(jié)合能力相適應(yīng)。然后用半胱氨酸替換這條單個(gè)肽鏈上的氨基酸形成二硫鍵，二硫鍵可能通過(guò)降低肽鏈的空間構(gòu)象而增加結(jié)合能力。這些多點(diǎn)合成實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果是得到一個(gè)在IL-10與CB/RS/1抗體之間的非連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)上的緊密結(jié)合的32氨基酸的虛擬肽段（Reineke et al，1999b）。這個(gè)研究也證明了SPOT合成法對(duì)于快速構(gòu)建及測(cè)試肽芯片的巨大作用。

SPOT合成法還用于其他很多研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用上。這些相互作用包括與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的蛋白質(zhì)之間的作用，如PDZ結(jié)構(gòu)域（Schultz等，1998）、SH3域（Cestra等，1999）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAFs）（Pullen等，1999）。此外，該法被用于確定細(xì)菌伴侶蛋白SecB的底物專(zhuān)一性（Knoblauch等，1999）。此研究極其有趣，因?yàn)榘閭H蛋白具有寬松的底物結(jié)合專(zhuān)一性，因此640 641 642 643 644 645 646 647 648 649 650 651 652 653 654 655 656 657 658 659 660 661 662 663 664 665 666 667 668 與大量的蛋白結(jié)合。SecB通過(guò)在翻譯中或翻譯后與新合成的前體蛋白聯(lián)系，協(xié)助前體蛋白穿過(guò)細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜，因而使這些前體蛋白保持一種可以轉(zhuǎn)移的狀態(tài)。但是SecB的底物特異性的決定因子還未確定（Knoblauch et al，1999）。為了解決這個(gè)問(wèn)題，合成并篩選出與SecB結(jié)合的來(lái)自23種不同蛋白質(zhì)的總數(shù)為2688條肽鏈（Knoblauch et al，1999）。這一系列蛋白質(zhì)包括已知的SecB的底物以及很多未知的蛋白。這個(gè)大的數(shù)據(jù)庫(kù)可以對(duì)被SecB識(shí)別的底物模體進(jìn)行可靠的統(tǒng)計(jì)分析。所有被篩選出來(lái)的肽鏈根據(jù)它們與SecB的親和力（高、中度、低、無(wú)親和力）被分為四組。親和力由合成的點(diǎn)的強(qiáng)度來(lái)決定（Knoblauch et al，1999）。與SecB結(jié)合和不與SecB結(jié)合的肽鏈其氨基酸分布存在著很大的差異。高親和力SecB結(jié)合肽富含基本氨基酸殘基（Arg和Lys）以及芳香族殘基（Phe，Tyr，Trp），而酸性殘基（Asp，Glu）卻非常少（Knoblauch et al，1999）。該結(jié)果可用于鑒定識(shí)別模塊，它又能夠準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)SecB結(jié)合肽。這些實(shí)驗(yàn)代表了SPOT合成法的應(yīng)用向蛋白組范圍上篩選結(jié)合特異性邁進(jìn)了一步。包含一個(gè)細(xì)菌的蛋白組所有重復(fù)的肽的SPOT芯片很快也將產(chǎn)生。這種芯片將會(huì)成為在蛋白組學(xué)水平上研究抗體－抗原及蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)有力的工具。

最近，SPOT法被推廣到產(chǎn)生一個(gè)包含837個(gè)不同的hYAP WW蛋白功能域的肽芯片（Toepert et al，2001）。之所以選擇WW結(jié)構(gòu)域作為模型，是因?yàn)樗挥写蠹s40個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。WW結(jié)構(gòu)域在很多具有不同功能的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，例如酵母、線蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物的結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白及信號(hào)蛋白中（Chen et al，1997a）。WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸序列的短片段結(jié)合來(lái)介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。WW結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)是已知的，一些定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能重要的殘基（Chen et al，1997）。WW結(jié)構(gòu)域的44個(gè)殘基的每一個(gè)逐一被19個(gè)L－氨基酸所替代（Toepert et al，2001）。結(jié)果與早先的突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，該結(jié)果是建立在結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，應(yīng)該是合理的。固相合成44個(gè)氨基酸的肽鏈有一個(gè)值得擔(dān)憂的是，一個(gè)點(diǎn)內(nèi)合成的肽鏈中有很大部分是不完全的產(chǎn)物?？梢允褂觅|(zhì)譜來(lái)確認(rèn)已合成的肽段的大?。═oepert et al，2001）。另外，所有可能的單個(gè)氨基酸的缺失都被合成在芯片中，與含有各種不同的全長(zhǎng)的肽段的突變體芯片不同，幾乎所有的缺失都是無(wú)活性的。這些結(jié)果提示在一個(gè)點(diǎn)里合成的大部分肽鏈都是全長(zhǎng)的（Toepert et al，2001）。該研究結(jié)合蛋白質(zhì)化學(xué)669 670 671 672 673 674 675 676 677 678 679 680 681 682 683 684 685 686 687 688 689 690 691 692 693 694 695 696 697 698 合成的快速發(fā)展，提示著SPOT法將會(huì)成為使用固相合成產(chǎn)生蛋白質(zhì)芯片的一種方法。

盡管SPOT合成法具有很大的實(shí)用性，但是濾膜上點(diǎn)的密度與DNA芯片或玻璃板上列的順序不同（Brown and Botstein，1999）。但是，有結(jié)果表明影印照相術(shù)可大大增加芯片上肽的密度（Fodor，1991）。這種方法與構(gòu)建高密度寡核苷酸芯片方法相似。光敏保護(hù)基團(tuán)被用于肽的合成。通過(guò)使用只允許光照射那些只加某種氨基酸的肽鏈的過(guò)濾罩，這樣肽鏈可以被選擇性的去保護(hù)。通過(guò)這種技術(shù)，肽的密度可達(dá)到250000/cm2（Fodor，1991）。上述所說(shuō)的芯片可以通過(guò)直接在固體支持相上合成肽鏈而構(gòu)建。目前，由于產(chǎn)物純化以及連接效率的困難，使得SPOT法局限于合成30～40個(gè)氨基酸的肽鏈（Molina et al，1996）。因此，通過(guò)直接合成構(gòu)建蛋白質(zhì)芯片是不可能的。相反，蛋白質(zhì)必須在芯片中表達(dá)、純化隨后使用。重組蛋白能夠在E.coli或S.cerevisiae 等一些有機(jī)體內(nèi)表達(dá)，或者通過(guò)組織培養(yǎng)得到。蛋白質(zhì)也可以選擇在體外轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)生。這些方法的困難是獲得用于芯片上的穩(wěn)定高級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。不正確的折疊及聚合是重組蛋白在異源系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)存在的普遍問(wèn)題。另外，蛋白質(zhì)體外表達(dá)缺乏特異的伴侶蛋白，也會(huì)導(dǎo)致一些不正確的折疊結(jié)構(gòu)的形成。這個(gè)問(wèn)題是蛋白質(zhì)芯片不同于DNA或寡核苷酸芯片的一個(gè)主要因素。所以，蛋白質(zhì)芯片發(fā)展的進(jìn)程一直以來(lái)都比DNA芯片慢。但無(wú)論如何，近年來(lái)的發(fā)展提示蛋白質(zhì)芯片還是可行的。

歸組的重組蛋白芯片

蛋白芯片發(fā)展中的第一個(gè)難題就是由生物體開(kāi)放閱讀框編碼的蛋白質(zhì)的大規(guī)模表達(dá)和純化。關(guān)于S.cerevisiae(Martzen et al., 1999)的工作表明了這種方法的可行性。在這些實(shí)驗(yàn)中，建立起一個(gè)由6,144個(gè)酵母菌株組成的芯片，每個(gè)菌株都包含一個(gè)質(zhì)粒，該質(zhì)粒在Pcup1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)不同的GST-ORF融合。因?yàn)榧兓?,144單個(gè)蛋白相當(dāng)困難，所以菌株被集中在64個(gè)組（pool），每個(gè)組有96個(gè)不同的GST融合菌株。每個(gè)組的GST融合蛋白用谷胱甘肽瓊脂糖樹(shù)脂為分離介質(zhì)進(jìn)行分批親和層析純化(Martzen et al., 1999)。然后這些組用作蛋白質(zhì)功能的生化測(cè)定。舉例來(lái)說(shuō)，GST融合組的測(cè)試證明了酵母中兩個(gè)預(yù)先知道的tRNA剪接反應(yīng)中的每一個(gè)只會(huì)基于ORF數(shù)量在預(yù)期組中出現(xiàn)。當(dāng)某組監(jiān)測(cè)出具有某種生化功能時(shí)，這個(gè)單獨(dú)的導(dǎo)致反應(yīng)的菌株需要進(jìn)行測(cè)定，699 700 701 702 703 704 705 706 707 708 709 710 711 712 713 714 715 716 717 718 719 720 721 722 723 724 725 726 727 由適當(dāng)?shù)?6孔板中制備和測(cè)定GST融合蛋白(Martzen et al., 1999)。運(yùn)用此法，生化檢驗(yàn)定出三個(gè)先前未知基因編碼的蛋白質(zhì)的假定功能，包括兩種涉及tRNA處理的環(huán)磷酸二酯酶和一個(gè)可修飾細(xì)胞色素c的轉(zhuǎn)甲基酶(Martzen et al., 1999)。原則上，如果我們假定融合蛋白是可溶的、折疊的和功能性的，成組的GST融合蛋白能用來(lái)識(shí)別任何生化反應(yīng)相關(guān)的蛋白。這個(gè)方法有個(gè)獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，那就是一旦GST融合克隆建立起來(lái)，這就是一項(xiàng)快速的技術(shù)。Martzen和同事宣稱(chēng)只要兩周就能純化64個(gè)組，同時(shí)檢驗(yàn)工作一天就能完成(Martzen et al., 1999)。此外，這個(gè)方法也是很靈敏的，因?yàn)橐淮沃挥?6個(gè)重組蛋白被測(cè)定而相比之下，用細(xì)胞溶解產(chǎn)物的話，溶液中會(huì)有成千上萬(wàn)的蛋白質(zhì)。這個(gè)方法使得每個(gè)蛋白有更高的濃度，因此大大地促進(jìn)生化反應(yīng)的檢測(cè)(Martzen et al., 1999)。

成組GST融合蛋白方法的強(qiáng)大能力可以推出新生化反應(yīng)劑和測(cè)定方法。生物過(guò)程的化學(xué)探針（又稱(chēng)化學(xué)生物學(xué)）的開(kāi)發(fā)是一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域。例如，化學(xué)合成一種活性位點(diǎn)指向的探針，可以用來(lái)識(shí)別絲氨酸水解酶家族成員，近來(lái)已經(jīng)有人描述過(guò)此過(guò)程了（Liu et al，1999）。探針的活性由絲氨酸水解酶的有效抑制和不可逆抑制決定的，抑制劑為熒光磷酸(FP)衍生物，如比二異丙基熒光磷酸。這個(gè)探針組成有一個(gè)生物素化的長(zhǎng)鏈熒光磷酸，稱(chēng)作FP-生物素（Liu et al.，1999）。FP-生物素已在來(lái)自各種大鼠器官的粗組織提取物上試驗(yàn)過(guò)了。這些實(shí)驗(yàn)顯示此試劑能與粗提取物中的大量絲氨酸水解物反應(yīng)，也能探測(cè)飛摩爾級(jí)（10-15 mol）的酶（Liu et al.，1999）。顯然，F(xiàn)P-生物素之類(lèi)試劑將能與成組GST融合物更好地反應(yīng)，因?yàn)槌山MGST融合物的蛋白濃度高于粗提取物的蛋白濃度（Martzen et al.，1999)。此類(lèi)化學(xué)探針很可能將在今后幾年內(nèi)得到發(fā)展。

蛋白微芯片 成組GST融合蛋白的運(yùn)用使得生化反應(yīng)的測(cè)試成為可能，但也不僅限于蛋白－蛋白或蛋白－小分子交互作用的識(shí)別。因?yàn)榇四康模斜匾潭ǖ鞍子诠腆w支撐基質(zhì)上，使得非結(jié)合蛋白能夠被洗去。同時(shí)也有必要讓蛋白連接到固體支撐基質(zhì)上后仍能保留它的折疊構(gòu)象。

已經(jīng)有一種方法可以高空間密度連接蛋白到玻片上(MacBeath and Schreiber,2000）。這樣的微芯片制做系統(tǒng)使用高精準(zhǔn)自動(dòng)機(jī)械臂來(lái)傳遞納升體積的樣品到玻片上，密度達(dá)到每平方厘米1,600個(gè)點(diǎn)。用含醛硅烷試劑預(yù)處理玻728 729 730 731 732 733 734 735 736 737 738 739 740 741 742 743 744 745 746 747 748 749 750 751 752 753 754 755 756 片蛋白質(zhì)才能共價(jià)連接其上(MacBeath and Schreiber,2000）。醛很容易與賴氨酸殘基以及蛋白質(zhì)N端的a氨基酸等主鏈胺反應(yīng)。因?yàn)橘嚢彼嵬ǔ?huì)出現(xiàn)在蛋白質(zhì)表面的多個(gè)位點(diǎn)，所以該蛋白能以多個(gè)方位連接。

高密度蛋白芯片是用來(lái)檢驗(yàn)蛋白－蛋白交互作用，三個(gè)已知會(huì)相互反應(yīng)的蛋白作用對(duì)被使用：蛋白G和IgG；p50和IkBa；以及FKBP12雷帕霉素結(jié)合域（FRB）和FKBP12(MacBeath and Schreiber,2000)。每一個(gè)此類(lèi)實(shí)驗(yàn)，兩結(jié)合蛋白中的一個(gè)被固定了，而另一個(gè)蛋白則用熒光標(biāo)記，可以結(jié)合到玻片上。清洗以后，被結(jié)合的蛋白可以通過(guò)滯留的熒光標(biāo)記檢測(cè)出(MacBeath and Schreiber,2000)。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)微芯片能用來(lái)有效地檢測(cè)極小樣品量的蛋白－蛋白交互作用。固化的蛋白以每毫升100ug的濃度分布。因?yàn)榻Y(jié)合反應(yīng)在納升體積中發(fā)生，所以需要檢測(cè)結(jié)合的溶液相蛋白的數(shù)量是很小的。例如，特定的結(jié)合能用pg量的FKBP12檢測(cè)FRB-FKBP12的相互作用(MacBeath and Schreiber,2000)。MacBeath和Schreiber（2000）提到，因?yàn)榻Y(jié)合所必要的溶液相蛋白的濃度相當(dāng)?shù)?，所以有可能在?xì)胞溶解產(chǎn)物中用熒光標(biāo)簽標(biāo)記蛋白，也可以用芯片來(lái)定量溶解物中特定蛋白的總量。因此，蛋白芯片能夠用作蛋白表達(dá)作圖和檢測(cè)蛋白－蛋白相互作用(MacBeath and Schreiber,2000)。通過(guò)相似的方法，研究顯示微芯片上小分子與蛋白的結(jié)合能被有效的檢測(cè)出。但是固定化的蛋白組分有多少還保留折疊結(jié)構(gòu)，對(duì)此仍不很清楚，但是基于預(yù)實(shí)驗(yàn)的判斷，蛋白微芯片在高通量蛋白測(cè)定方面很有應(yīng)用潛力。

蛋白微芯片也被用作研究蛋白－蛋白相互作用的特異性(Newman and Keating,2003)。bZIP轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中DNA結(jié)合蛋白的重要一類(lèi)，其中無(wú)規(guī)線團(tuán)的二聚化作用在結(jié)合特異性方面起著重要的作用。人基因組中編碼了大量的bZIP無(wú)規(guī)線團(tuán)，我們使用蛋白芯片分析了這些模塊的組合結(jié)合特異性。這些實(shí)驗(yàn)通過(guò)表達(dá)和純化每個(gè)結(jié)構(gòu)域以及連接蛋白到一個(gè)醛包被的玻璃平板上，構(gòu)造出由49個(gè)人bZIP無(wú)規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu)域組成的亮氨酸拉鏈芯片（Newman and Keating,2003）。然后49個(gè)蛋白中的每一個(gè)都用熒光標(biāo)記，每一個(gè)都單獨(dú)用作探針結(jié)合到芯片上去。用這種方法，總共有492個(gè)反應(yīng)能迅速評(píng)估出來(lái)。這些實(shí)驗(yàn)的重要特點(diǎn)就是交互實(shí)驗(yàn)>90%的一致性，也就是說(shuō)，一個(gè)結(jié)構(gòu)域固定化或作為溶液探針結(jié)合了相同的一套結(jié)構(gòu)域（Newman and Keating,2003）。這項(xiàng)結(jié)果預(yù)示了因?yàn)榈鞍讜?huì)在固757 758 759 760 761 762 763 764 765 766 767 768 769 770 771 772 773 774 775 776 777 778 779 780 781 782 783 784 785 體支持物和其他表面化學(xué)人工合成物上去折疊，而這樣的人工合成物不會(huì)成為此法的主要限制因素。這個(gè)方法也適用于檢驗(yàn)其他蛋白家族中二元交互作用組。蛋白芯片在蛋白質(zhì)組尺度范圍內(nèi)的應(yīng)用，由構(gòu)建的含有代表93.5%的酵母蛋白質(zhì)組的5,800種不同酵母蛋白芯片所展現(xiàn)（Zhu et al.,2001）。該研究中5,800個(gè)酵母ORF被克隆到一個(gè)酵母高拷貝表達(dá)載體，融合了谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和多組氨酸（polyhistidine）（GST-HisX6）（Zhu et al.,2001）。蛋白在酵母中表達(dá)以促進(jìn)適當(dāng)?shù)恼郫B和整合一些修飾作用。依照96孔板規(guī)格，一次純化了1,152個(gè)樣品，所有5,800個(gè)蛋白純化以后，樣品以高密度分散點(diǎn)在鎳包被的玻片上（Zhu el al.,2001）。蛋白微芯片通過(guò)用生物素化的鈣調(diào)蛋白（鈣離子存在的條件下）探測(cè)玻片，來(lái)測(cè)試蛋白－蛋白交互作用。鈣調(diào)蛋白是一種高度保守的鈣結(jié)合蛋白，這種蛋白涉及到很多鈣調(diào)控的細(xì)胞過(guò)程，同時(shí)也有很多已知的配合物（Hook and Means,2001）。這些實(shí)驗(yàn)分辨出六種已知鈣調(diào)蛋白的靶蛋白還有另外33個(gè)潛在的結(jié)合伙伴（Zhu et al.,2001）。因?yàn)榕c鈣調(diào)蛋白的相互作用需要精確的三級(jí)結(jié)構(gòu)，研究表明玻片上大部分的蛋白質(zhì)折疊呈功能狀態(tài)。

酵母蛋白組微芯片也被用來(lái)測(cè)試不能被體內(nèi)方式檢測(cè)的相互作用。特別是，蛋白質(zhì)－脂質(zhì)相互作用也能用磷酸肌醇(PI)結(jié)合蛋白篩選法檢測(cè)（Zhu et al.,2001）。PI是重要的細(xì)胞膜組成成分，也作為第二信使廣泛地調(diào)控細(xì)胞過(guò)程。蛋白芯片用脂質(zhì)體探測(cè)，這些脂質(zhì)體包括了5種不同類(lèi)型的PI，還有含脂質(zhì)體的卵磷脂(PC)。每個(gè)脂質(zhì)體也含有一個(gè)生物素化的脂，這種脂用來(lái)探測(cè)連接到微芯片上蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體（Zhu et al.,2001）。這六種脂質(zhì)體辨識(shí)出總共150種不同蛋白靶體，該靶體產(chǎn)生的信號(hào)遠(yuǎn)高于背景（Zhu et al.,2001）。這些蛋白中52個(gè)為非特性蛋白質(zhì)。剩下蛋白中，45個(gè)與膜有關(guān)，包括整合膜蛋白和脂修飾蛋白（Zhu et al.,2001）。另外，很多激酶連接到脂分子上。為了確認(rèn)芯片上的相互作用，幾個(gè)蛋白以不同的濃度固定到硝化纖維素濾膜上，顯示出對(duì)脂的結(jié)合具有濃度依賴性（Zhu et al.,2001）。

酵母蛋白組芯片研究表明蛋白芯片比其他鑒別蛋白－脂相互作用的方法方面有一定的優(yōu)勢(shì)。例如，采用酵母雙雜交方法，核內(nèi)能檢測(cè)到的相互作用數(shù)目有限。反過(guò)來(lái)，因?yàn)榈鞍仔酒Y(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)茉隗w外做，蛋白的本地化限制就不是一個(gè)問(wèn)題了。體外檢測(cè)相互作用的另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以檢測(cè)很多不同類(lèi)型的配體。因786 787 788 789 790 791 792 793 794 795 796 797 798 799 800 801 802 803 804 805 806 807 808 809 810 811 812 813 814 此，諸如蛋白-脂、蛋白-小分子、或者蛋白-核酸酸性相互作用能被檢測(cè)出來(lái)。小分子芯片 遺傳學(xué)對(duì)生物學(xué)的進(jìn)步貢獻(xiàn)很大。它借助突變等位基因來(lái)增加對(duì)有興趣的途徑的認(rèn)識(shí)。在化學(xué)遺傳學(xué)方面，小分子而不是遺傳變異，被用作有條件地或臨時(shí)地調(diào)控蛋白質(zhì)的功能，因此許多生物學(xué)過(guò)程才得以發(fā)現(xiàn)（Mitchison,1994）。這些方法有使用秋水仙堿發(fā)現(xiàn)了微管蛋白（Borisy and Taylor,1967）；河豚毒素的發(fā)現(xiàn)，使得動(dòng)作電位的解剖成為可能（Narahashi et al.,1964）；過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ拮抗劑的辨識(shí)，增進(jìn)了對(duì)脂肪生成調(diào)節(jié)的理解（Lehmann et al.,1995）。發(fā)展化學(xué)遺傳學(xué)作為一項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)就是高效的合成大量的多樣的小分子和簡(jiǎn)單地篩選大量的小分子的方法。合成多樣化小分子的重要過(guò)程可通過(guò)以下方法：多樣性定向合成（Schreiber,2000）、固相純化（Merrifield,1963）和分離池合成策略（Furka et al.,1991）。近來(lái)，描繪了一個(gè)具有分離池和以高容量微球?yàn)閱蝹€(gè)反應(yīng)器的多樣化定向合成的技術(shù)平臺(tái)（Blackwell et al.,2001）。每個(gè)微球傳送大約5mM合成儲(chǔ)液到測(cè)定板做化合物解離和重懸浮（Blackwell et al.,2001）。這個(gè)產(chǎn)物量足以做大量生物學(xué)檢驗(yàn)?；瘜W(xué)遺傳學(xué)的另一重要方法就是有效的篩選影響感興趣的過(guò)程的分子。表型的和蛋白質(zhì)結(jié)合的測(cè)試被成功的利用。例如，基于雙表型篩選的組合，有一個(gè)是基于特定轉(zhuǎn)錄后修飾，另一個(gè)是可視的微管和染色質(zhì)，被用來(lái)篩選影響有絲分裂的化合物（Mayer et al.,1999）。其中一個(gè)化合物monastrol通過(guò)與有絲分裂的驅(qū)動(dòng)蛋白Eg5相互作用，阻止了哺乳動(dòng)物的有絲分裂。Monastrol是第一個(gè)被識(shí)別的不通過(guò)結(jié)合微管蛋白而影響有絲分裂的化合物。

基于蛋白質(zhì)結(jié)合分析的小分子篩選是有意義的，因?yàn)樗锌赡馨l(fā)展成高通量篩選。蛋白質(zhì)結(jié)合分析能從不同的蛋白質(zhì)篩選大量的小分子，從而有效地識(shí)別有用的小分子。已有報(bào)道用硫醇捕獲反應(yīng)建立由含硫醇的小分子組成的芯片（MacBeath et al.,1999），和通過(guò)亞硫酰二氯活化的玻璃載玻片表面制作含乙醇的小分子微芯片（Hergenrother et al.,2000）。這個(gè)方法被用來(lái)制作一種高密度的微芯片，此芯片有3,780結(jié)構(gòu)復(fù)雜的產(chǎn)生自多樣化定向的合成的1,3-二氧六環(huán)小分子（Kuruvilla el al.,2002）。此類(lèi)微芯片的應(yīng)用包括用熒光標(biāo)記的酵母蛋白Ure2p作為芯片的探針。這個(gè)蛋白是酵母氮代謝系列基因的中心抑制物。一個(gè)結(jié)合到Ure2p的化合物uretupamine，被識(shí)別出來(lái)用做干擾葡萄糖敏感轉(zhuǎn)錄過(guò)815 816 817 818 819 820 821 822 823 824 825 826 827 828 829 830 831 832 833 834 835 836 837 838 839 840 841 842 843 程，這個(gè)過(guò)程在Ure2p形成的下游過(guò)程出現(xiàn)（Kuruvilla et al.,2002）。新信息表明，因?yàn)閡retupamine只調(diào)控部分Ure2p功能，因此它的功效比單純URE2基因的敲除更專(zhuān)一。研究表明小分子微芯片提供了一種系統(tǒng)化的方法，獲得能調(diào)控不同方面蛋白功能的小分子探針，由此使破壞特定蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程更容易。

以上描述的SPOT合成方法，往往用在合成某種芯片模式的膜結(jié)合肽鏈。然而，此方法廣泛運(yùn)用于高效合成膜表面的小型有機(jī)分子的芯片（Scharn et al.,2000）。Trisamino-和amino-oxy-1,3,5-triazine需要通過(guò)應(yīng)用SPOT技術(shù)平行連接到纖維素膜和聚丙烯膜。完成這個(gè)過(guò)程需要用氨基酸和酚鹽離子作為結(jié)構(gòu)單元，還需一個(gè)以三氟乙酸蒸汽裂解的連接系統(tǒng)（Scharn et al.,2000）。為了識(shí)別抗原決定簇類(lèi)似物，總共合成了8,000個(gè)纖維素結(jié)合的1,3,5-三嗪，連接到抗變形生長(zhǎng)因子-α單克隆抗體Tab2，做成平行探針（Scharn et al.,2000）。這些研究預(yù)示了SPOT合成也是一種創(chuàng)建小分子芯片的有效方法。因此，小分子芯片很可能成為將來(lái)蛋白組學(xué)研究的重要工具，用來(lái)探測(cè)生物學(xué)過(guò)程的蛋白質(zhì)功能。蛋白芯片和質(zhì)譜 MALDI-TOF質(zhì)譜結(jié)合蛋白質(zhì)芯片的方法曾用在分析組織培養(yǎng)細(xì)胞分泌的淀粉樣蛋白β肽鏈變體（Davis et al.,1999）。在Alzheimer癥病人的腦組織中常見(jiàn)的老年斑中具有4-kDa淀粉樣β肽鏈的聚集態(tài)（Selkoe,1998）。臨床藥品中識(shí)別出大量肽鏈的變體，因此很需要有效識(shí)別變體的方法。為此，以在芯片表面封固淀粉樣β肽鏈的抗體的方法構(gòu)建了蛋白芯片（Davies et al.,1999）。芯片表面上放1μl介質(zhì)來(lái)捕獲培養(yǎng)細(xì)胞分泌的淀粉樣β肽鏈變體，然后清洗芯片，結(jié)合肽鏈被抽提出來(lái)用于MALDI-TOF質(zhì)譜分析（Davies et al.,1999）。質(zhì)譜的高敏感性和高精確度使數(shù)種淀粉樣β肽鏈蛋白可以被精確識(shí)別。此外，一種對(duì)照的牛IgG固定到芯片上不同位置，結(jié)果顯示淀粉樣肽鏈的抗體有捕獲介質(zhì)中的變體的能力（Davies et al.,1999）。這項(xiàng)研究證明了結(jié)合蛋白質(zhì)芯片與質(zhì)譜是識(shí)別組成上細(xì)微差別的肽鏈的有效方法。

蛋白芯片－質(zhì)譜方法已被擴(kuò)大到很多感興趣的分子的固定化平臺(tái)。因此，分子能為親和方法所捕獲，例如抗體或其他有陰離子交換、陽(yáng)離子交換、金屬親和和反相色譜等色譜特性的芯片表面（Fung et al.,2001）。這類(lèi)芯片能被用來(lái)將蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物純化成具有共同特性的一組蛋白，然后用于質(zhì)譜分析。從概念上講，這個(gè)方法與液相色譜（LC）和第九章介紹的串聯(lián)質(zhì)譜方法相似（Link et 844 845 846 847 848 849 850 851 852 853 854 855 856 857 858 859 860 861 862 863 864 865 866 867 868 869 870 871 872 al.,1999）。兩個(gè)方法的目的都是為了降低蛋白質(zhì)的復(fù)雜度，變成一些能準(zhǔn)確檢測(cè)的蛋白。給定色譜分離方法所給出的蛋白譜，代表了蛋白抽提出來(lái)時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的指紋印記。舉例來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)芯片方法被用來(lái)研究正常狀態(tài)下和癌癥前期的樣品的蛋白質(zhì)表達(dá)的概貌，通過(guò)該方法可以發(fā)現(xiàn)疾病狀態(tài)的蛋白質(zhì)標(biāo)記特征（Wright et al.,2000）。商業(yè)化蛋白質(zhì)芯片－質(zhì)譜平臺(tái)業(yè)已開(kāi)發(fā)出來(lái)，也發(fā)表了一些應(yīng)用（Fung et al.,2001的評(píng)論）。

使用DNA芯片研究蛋白質(zhì)功能 DNA芯片通過(guò)測(cè)量mRNA的水平廣泛用于研究基因表達(dá)（Brown and Botstein,1999）。一個(gè)有趣的額外功能是用這些芯片研究轉(zhuǎn)錄因子蛋白的DNA結(jié)合特異性。已發(fā)展了基于DNA芯片對(duì)特征化DNA序列專(zhuān)一性的鋅指蛋白識(shí)別的方法（Bulyk et al.,2001）。說(shuō)到序列特異性DNA結(jié)合，鋅指轉(zhuǎn)錄因子是最好理解的家族之一。小鼠Zif268轉(zhuǎn)錄因子被用做這些研究的模型系統(tǒng)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)需要在M13線性噬菌體表面上展示Zif268蛋白，通過(guò)誘變和噬菌體展示篩選技術(shù)，利用不同的結(jié)合特異性分離一些變體。野生型和變異型Zif268蛋白的結(jié)合特異性就這樣運(yùn)用DNA微芯片確定下來(lái)。

Zif268蛋白包含三種鋅指（F1,F2,F3），每種鋅指與三堿基對(duì)序列相互作用（Pavletich和Pabo，1991）。F2指中的氨基酸通過(guò)噬菌體展示技術(shù)誘變和篩選，來(lái)分離結(jié)合的變體。有人建立起了一個(gè)包含所有64種可能的F2鋅指3堿基對(duì)結(jié)合區(qū)的組合并在側(cè)翼具有野生型F1和F3識(shí)別序列的DNA芯片（Bulyk et al.,2001）(圖10.13)。讓噬菌體展示的野生型或者變異型Zif268蛋白去與芯片上的DNA序列結(jié)合；非結(jié)合物質(zhì)都給沖洗走了，結(jié)合的噬菌體能用包含熒光標(biāo)記抗M13抗體探測(cè)到(Bulyk et al.2001)。結(jié)合測(cè)定是高度平行的，因此，一個(gè)芯片試驗(yàn)就有可能全面描述每個(gè)突變體的結(jié)合特異性。

如果改進(jìn)DNA芯片結(jié)合實(shí)驗(yàn)，就可以用來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的整個(gè)基因組分析。Bulyk和其同事們用12,000個(gè) 1-kb序列的可以包容Saccharomyces cerevisiae 基因組的芯片來(lái)描述S.cerevisiae 轉(zhuǎn)錄因子的序列特異性（Bulyk et al.,2001）。這些芯片也可以預(yù)測(cè)從未描述過(guò)的轉(zhuǎn)錄因子的功能和發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Bulyk et al.,2001）。

10.8 表面胞質(zhì)基因組共振生物傳感器分析

表面胞質(zhì)基因組共振（SPR）生物傳感器已確定為測(cè)定分子間相互作用的方法。873 874 875 876 877 878 879 880 881 882 883 884 885 886 887 888 889 890 891 892 893 894 895 896 897 898 899 900 901 SPR生物傳感器實(shí)驗(yàn)包括在表面固定一個(gè)反應(yīng)物并監(jiān)測(cè)它與溶液中的其它分子的相互作用。SPR描述的是復(fù)雜的合成與分解過(guò)程導(dǎo)致表面附近的溶液光折射系數(shù)發(fā)生改變時(shí)測(cè)到的光現(xiàn)象（Jonsson et al.,1991）(圖 10.14)。SPR信號(hào)表達(dá)為共振單位（RU），它與溶液中和固定配體相互作用的分子質(zhì)量成比例。所以標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)包括固定低分子量的配體和探測(cè)配對(duì)分子不停地流過(guò)固相表面時(shí)信號(hào)的改變（Schuck,1997）。SPR的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)合反應(yīng)，而不需要標(biāo)記配體。因此，SPR可以用來(lái)研究蛋白、碳水化合物、核酸、脂肪和小分子之間的相互作用。

10.8.1用SPR探測(cè)生物分子的相互作用

關(guān)于用SPR生物感應(yīng)大分子之間相互作用的數(shù)百篇論文已在不同的領(lǐng)域發(fā)表（Rich 和Myszka,2000）。許多研究關(guān)注于探測(cè)和定量蛋白-蛋白相互作用。典型的實(shí)驗(yàn)是將一種蛋白共價(jià)結(jié)合到傳感器表面。已有許多表面材料在市場(chǎng)上供應(yīng)，如羧甲基葡聚糖，羧甲基葡聚糖衍生后給出許多功能基團(tuán)可用于固定化（Schuck,1997）。其他表面還有捕獲生物素化的streptavidin分子和捕獲組氨酸標(biāo)記蛋白的鎳鰲合物表面等（Rich and Myszka,2000）?？扇苄缘鞍捉Y(jié)合到固相蛋白給出的SPR信號(hào)是實(shí)時(shí)的，可以用來(lái)監(jiān)測(cè)結(jié)合動(dòng)力學(xué)。無(wú)蛋白的緩沖液流過(guò)結(jié)合體可以探測(cè)分解動(dòng)力學(xué)。通過(guò)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)（Ka,Kd）得到平衡常數(shù)（KD）(Morton and Myszka,1998)。近年來(lái)SPR儀器的發(fā)展已有可能實(shí)現(xiàn)蛋白間相互作用的高通量分析。例如，BIACORE已發(fā)展了分析96孔板上的樣品的儀器。所以，SPR可能對(duì)基因組水平的蛋白-蛋白相互作用的描述作出重大貢獻(xiàn)。

固相表面的發(fā)展使SPR傳感器可用于監(jiān)測(cè)蛋白與脂質(zhì)表面及膜相關(guān)蛋白之間的作用。商業(yè)化（BIACORE）的疏水親脂的傳感器表面已可構(gòu)建穩(wěn)定的膜表面。已有顯示這種疏水傳感器表面可以用來(lái)形成脂質(zhì)單層（Evans and MacKenzie,1999）。這個(gè)單層表面又可以用來(lái)檢測(cè)蛋白-脂質(zhì)相互作用。例如，有一生物傳感器被用來(lái)檢測(cè)Src同源域與磷脂雙層上的磷脂肌醇的結(jié)合（Surdo et al.,1999）。另外，親脂的傳感器表面被用來(lái)捕獲脂質(zhì)體和形成像生物膜一樣的脂質(zhì)雙層。

疏水傳感器表面上脂質(zhì)單層的一個(gè)有意思的應(yīng)用是主要組織相容性復(fù)合物（MHC）以特定的方向結(jié)合到表面（Celia et al.,1999）。這是因?yàn)橹|(zhì)體在極性902 903 904 905 906 907 908 909 910 911 912 913 914 915 916 917 918 919 920 921 922 923 924 925 926 927 928 929 930 一端連接了一個(gè)經(jīng)化學(xué)修飾的帶有鎳鹽的脂質(zhì)的作用（Celia et al.,1999）。含有鎳脂質(zhì)的脂質(zhì)體包被疏水傳感器表面形成單脂層。實(shí)驗(yàn)用的重組MHC分子在跨膜區(qū)域含多組氨酸標(biāo)記。電子顯微鏡顯示組氨酸標(biāo)記的MHC分子結(jié)合到脂質(zhì)體的表面。SPR度量顯示組氨酸標(biāo)記的MHC分子特異性結(jié)合到脂質(zhì)雙層的表面（Celia et al.,1999）。更進(jìn)一步，SPR實(shí)驗(yàn)表明MHC蛋白與單脂層在特定的方向上相互作用。觀察到MHC分子與抗微球 抗體結(jié)合卻不與抗組氨酸標(biāo)記抗體結(jié)合的現(xiàn)象可以推斷上述結(jié)論（Celia et al.,1999）。抗組氨酸標(biāo)記抗體不與MHC分子結(jié)合可能因?yàn)榭臻g位阻，因?yàn)榻M氨酸標(biāo)記在單脂層表面上結(jié)合了鎳脂質(zhì)。最后，Celia和同事們通過(guò)將熒光標(biāo)記的脂質(zhì)結(jié)合到單脂層，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)在單脂層里橫向流動(dòng)（Celia et al.,1999）。這樣，精密的SPR應(yīng)用發(fā)展起來(lái)用于模擬體外膜蛋白的相互作用。膜及傳感器表面膜蛋白構(gòu)建技術(shù)的進(jìn)步對(duì)蛋白組學(xué)的研究將會(huì)做出重大貢獻(xiàn)?；蚪M中將近三分之一的開(kāi)放閱讀框被認(rèn)為是編碼膜相關(guān)蛋白的。所以，測(cè)定和定量膜內(nèi)蛋白之間相互作用的能力對(duì)在基因組水平研究蛋白-蛋白相互作用的蛋白組學(xué)起關(guān)鍵性作用。10.8.2 SPR生物傳感器與質(zhì)譜的聯(lián)合

正如上面講到的，SPR生物傳感器被用來(lái)監(jiān)測(cè)和定量蛋白-蛋白相互作用而不需要標(biāo)記任何一方結(jié)合物。此方法還用于探測(cè)來(lái)自包括細(xì)胞溶解物和條件媒介物在內(nèi)的復(fù)雜混合物的蛋白作用。稱(chēng)為配基釣魚(yú)的方法是將已知蛋白固定作為功能魚(yú)餌，釣出復(fù)雜混合物中的未知的結(jié)合伙伴（Lackman et al.,1996;Nelson et al.,2000）。困難在于當(dāng)潛在的結(jié)合物從復(fù)雜混合物中釣出來(lái)后，在氨基酸測(cè)序以確定身份之前必須用標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)方法將該蛋白純化（Lackman et al.,1996）。生物傳感器聯(lián)合質(zhì)譜能更直接地鑒定結(jié)合伙伴。生物傳感器為質(zhì)譜和蛋白鑒定提供了微量純化的平臺(tái)（Williams and Addona,2000）。從SPR生物傳感器表面回收的蛋白量非常少（毫微摩爾），但用靈敏的MALDI-TOF或隨機(jī)質(zhì)譜方法鑒定已足夠了（Nelson et al.,2000;Williams and Addona,2000）。

SPR與質(zhì)譜聯(lián)用的潛力曾被谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和抗-GST抗體模型系統(tǒng)證實(shí)（Nelson et al.,1997）。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，抗-GST抗體聯(lián)結(jié)到羧甲基葡聚糖芯片，GST注入芯片與抗體結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，芯片從儀器上移開(kāi)，以基質(zhì)材料包被含有結(jié)合蛋白的芯片區(qū)域并用于MALDI分析（Nelson et al.,1997）。接931 932 933 934 935 936 937 938 939 940 941 942 943 944 945 946 947 948 949 950 951 952 953 954 955 956 957 958 959 著用MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析此芯片，質(zhì)譜圖顯示結(jié)果與GST蛋白質(zhì)量相一致。這個(gè)方法又經(jīng)改進(jìn)，包括了以單個(gè)芯片上多流細(xì)胞的方法進(jìn)行樣品的蛋白水解消化。如抗人白細(xì)胞介素α（anti-IL-1α）抗體固定在傳感器芯片上的流動(dòng)池1中，胃蛋白酶固定在流動(dòng)池2（Nelson et al.,2000）。含IL-1α的溶液進(jìn)入到流動(dòng)池1，在那里，SPR測(cè)量?jī)x顯示IL-1α結(jié)合到抗IL-1α抗體的情況。洗去非特異性結(jié)合的蛋白，然后從表面洗脫IL-1α，IL-1α再?gòu)牧鲃?dòng)池1進(jìn)入流動(dòng)池2。經(jīng)足夠時(shí)間的固定化胃蛋白酶的蛋白水解消化后，MALDI-TOF質(zhì)譜分析儀分析流動(dòng)池2的表面。結(jié)果肽質(zhì)量譜清楚地反映IL-1α的存在（Nelson et al.,2000）。

上述試驗(yàn)表明聯(lián)結(jié)SPR和質(zhì)譜的技術(shù)是可行的。這些方法對(duì)蛋白相互作用的描述是有用的。例如，固定蛋白被用作餌，在活體條件下釣出復(fù)雜蛋白混合物中的相應(yīng)的蛋白結(jié)合物。復(fù)合技術(shù)的使用不僅能快速鑒別蛋白相互作用，而且提供了作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)信息。此方法可以作為體內(nèi)技術(shù)比如酵母雙雜交系統(tǒng)的絕佳的輔助手段。10.9總結(jié)

有效的高通量的蛋白-蛋白和蛋白-配體相互作用的檢測(cè)對(duì)蛋白組研究起著越來(lái)越重要的作用。鑒別結(jié)合伙伴的最常用的方法是酵母雙雜交系統(tǒng)。這是依賴于通過(guò)由蛋白質(zhì)的相互作用以DNA結(jié)合域回收轉(zhuǎn)錄激活域，而使其功能重構(gòu)的體內(nèi)探測(cè)方法。雙雜交法已被用于研究酵母蛋白的相互作用及數(shù)以千計(jì)的蛋白構(gòu)成的精細(xì)網(wǎng)絡(luò)的鑒定。分析表明在這些高度異源的無(wú)級(jí)網(wǎng)絡(luò)中少數(shù)緊密聯(lián)系的蛋白介導(dǎo)著大量的鏈接較少的蛋白間的相互作用。這種類(lèi)型的網(wǎng)絡(luò)框架在很多復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)中非常普遍，如英特網(wǎng)絡(luò)、代謝網(wǎng)絡(luò)等。以雙雜交法還發(fā)現(xiàn)在其它類(lèi)型的生物中也存在復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，如病毒、細(xì)菌、動(dòng)物系統(tǒng)等。噬菌體展示也為發(fā)現(xiàn)很多蛋白－配基相互作用做出了貢獻(xiàn)。特別有用的是噬菌體展示和雙雜交數(shù)據(jù)的結(jié)合可以減少假陽(yáng)性相互作用的數(shù)量。蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)研究的相互作用數(shù)據(jù)的使用很可能增強(qiáng)蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)，在蛋白組規(guī)模提供更為精確的相互作用譜。

以蛋白質(zhì)芯片鑒定蛋白－配基相互作用很具有挑戰(zhàn)性，蛋白質(zhì)固定到固體支持物時(shí)需要保持三維結(jié)構(gòu)的完整。蛋白間的相互作用用肽和蛋白芯片來(lái)檢測(cè)和解析。SPOT合成已大量用于合成肽芯片，這種芯片主要用于鑒定抗體抗原決定部位和解析蛋白相互作用的結(jié)合部位。蛋白質(zhì)芯片也被用于研究蛋白間和蛋白－配960 961 962 963 964 965 966 967 968 969 970 971 972 973 974 975 976 977 978 979 980 981 982 983 984 985 986 987 988 989 990 991 992 993 基間相互作用。最近，構(gòu)建了一個(gè)含90％酵母蛋白組（5800個(gè)蛋白）的蛋白質(zhì)芯片，用它鑒定了鈣調(diào)素結(jié)合蛋白和脂結(jié)合蛋白。這些使用表明，蛋白質(zhì)可以在芯片上保持它的高級(jí)結(jié)構(gòu)，這預(yù)示著蛋白質(zhì)芯片的廣闊未來(lái)。研制了小分子芯片用于在化學(xué)遺傳學(xué)中快速鑒定小分子探針。小分子在解析復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程中具體的蛋白的作用是一個(gè)非常有用的工具。蛋白和小分子芯片可以用熒光標(biāo)記分子檢測(cè)芯片表面的相互作用。一個(gè)比熒光檢測(cè)方法更細(xì)致和定量化的方法是表面胞質(zhì)基因組共振，該法原理是當(dāng)配體結(jié)合到固定在芯片表面的靶體蛋白時(shí)引起的折射系數(shù)的變化。此法的優(yōu)勢(shì)在于可以測(cè)定相互作用分子對(duì)的結(jié)合率、解離率和平衡常數(shù)，因此該法在高通量的蛋白－配基相互作用的檢測(cè)中發(fā)展快速而且很可能將廣泛應(yīng)用（Protomics，T.Palzkill, 2002）。

圖例

圖10.1 重組克隆.(a)以attB＋attP>attL+attR反應(yīng)克隆PCR產(chǎn)物受Int 和IHF蛋白催化。結(jié)果展示了可以構(gòu)建功能載體的起始克隆。（b）以Int、Xis和IHF蛋白催化通過(guò)attB＋attP>attL+attR反應(yīng)將起始克隆轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ茌d體。利用編碼適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和標(biāo)簽的目的載體可以構(gòu)建多樣的功能載體。（引自Protomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.2 PCR產(chǎn)物的定向克隆策略。定向拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的對(duì)PCR產(chǎn)物的克隆在其5’末端需要5’-CACC序列。本例中CACC序列緊靠在插入基因的起始密碼子ATG之前。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.3 酵母的重組克隆。進(jìn)行兩個(gè)連續(xù)的PCR反應(yīng)。每套引物的5’端都含有額外序列，這些序列最終使PCR產(chǎn)物可與線性化載體進(jìn)行同源重組。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.4 酵母雙雜交系統(tǒng)。報(bào)告基因上游的蛋白X和Y的相互作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活。蛋白X做為融合蛋白通過(guò)DNA結(jié)合域（DBD）結(jié)合在報(bào)告基因的上游位點(diǎn)，蛋白Y是帶有轉(zhuǎn)錄激活域（Act）的融合蛋白。蛋白X和Y的相互作用使激活域置于994 995 996 997 998 999 1000 1001 1002 1003 1004 1005 1006 1007 1008 1009 1010 1011 1012 1013 1014 1015 1016 1017 1018 1019 1020 1021 1022 1023 1024 1025 1026 1027 1028 1029 1030 1031 1032 1033 1034 1035 1036 1037 報(bào)告基因的附近并刺激它的轉(zhuǎn)錄。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.5 雙雜交蛋白相互作用的高通量配型測(cè)定。含有‘餌’和‘阱’的酵母菌株放在多孔板的孔內(nèi)雜交。以轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因篩選二倍體并用以測(cè)定蛋白－蛋白相互作用。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.6 酵母雙雜交‘餌’和‘阱’的系統(tǒng)雜交.酵母的每ORF分別被克隆為DNA結(jié)合域融合（餌）和DNA激活域融合（阱）.DNA結(jié)合域融合導(dǎo)入到MATa株，DNA激活域融合導(dǎo)入到MATa株.它們分別構(gòu)成62套每套96克隆的組；組間進(jìn)行系統(tǒng)的雜交（62×62共3844個(gè)組合）.選擇相互作用的克隆，PCR擴(kuò)增插入片段并切測(cè)序鑒定。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.7 絲狀噬菌體展示。隨機(jī)序列的多態(tài)或者是不同的蛋白質(zhì)被融合到噬菌體M13的衣殼蛋白的基因III上。目標(biāo)配體被固定在固相上。噬菌體所展示的蛋白利用與目標(biāo)之間的親和力被富集并純化，這個(gè)過(guò)程叫做Panning。經(jīng)過(guò)多輪的Panning后，噬菌體被用來(lái)感染E.coli，然后這個(gè)被選擇出來(lái)的插入片斷的成分通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)鑒定。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.8 開(kāi)裂的泛素作為蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的傳感器。蛋白A被融合到了泛素N末端區(qū)域，蛋白B則融合到了它的C末端。蛋白A與蛋白B的相互作用會(huì)重新組成一個(gè)完整的，折疊了的泛素。折疊了的蛋白質(zhì)能夠被一種特別的蛋白酶識(shí)別，酶切后釋放一種報(bào)告蛋白。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.9 鑒定復(fù)合物內(nèi)蛋白相互作用的一般方法。利用一個(gè)與復(fù)合物種一個(gè)已知蛋白相互作用的標(biāo)簽序列把復(fù)合物從細(xì)胞中分離出來(lái)?；蛘呃冕槍?duì)這個(gè)復(fù)合物中的某個(gè)蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀來(lái)分離復(fù)合物。這些蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺電泳，水解來(lái)分析，水解產(chǎn)生的碎片可以通過(guò)質(zhì)譜來(lái)鑒定。或者是蛋白質(zhì)水解后用液相色譜處理。然后，多肽片斷用質(zhì)譜鑒定，然后通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)來(lái)鑒定蛋白的成分。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.10 利用抗體芯片來(lái)繪制蛋白表達(dá)圖譜。這個(gè)抗體芯片是由針對(duì)一組感興趣的生物體內(nèi)蛋白的特異性的單克隆抗體固定到膜上而成的。為了鑒定一種蛋白在測(cè)試條件下是否有表達(dá)，先要獲得粗裂解物，然后對(duì)裂解物內(nèi)的蛋白要進(jìn)行熒光標(biāo)記。裂解液加到膜上，使蛋白質(zhì)與相應(yīng)的抗體結(jié)合。結(jié)合了的蛋白可以通過(guò)熒光標(biāo)記看到。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.11 利用點(diǎn)合成法構(gòu)建多肽芯片。β丙氨酸被共價(jià)連接到作為平面支持的纖維膜上。然后以β丙氨酸為起點(diǎn)通過(guò)Fmoc化學(xué)法合成多肽。多肽通過(guò)羧基末端與膜相連。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.12 從成組的酵母菌株中純化蛋白質(zhì)。每個(gè)酵母的ORF都被以蛋白表達(dá)載體中與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合而克隆并構(gòu)建了6144個(gè)酵母株。所有酵母株被分成64組，每組96株。每組培養(yǎng)后批量純化96個(gè)融合蛋白。然后測(cè)定每組的生1038 1039 1040 1041 1042 1043 1044 1045 1046 1047 1048 1049 1050 1051 1052 1053 化功能（Martzen等，1999）。將功能陽(yáng)性的菌株歸并為新的組。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.13 用DNA微芯片確定轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)合位點(diǎn)。（A）含有Zif168-結(jié)合位點(diǎn)的DNA片斷的 固定。F2指針的結(jié)合位點(diǎn)表示為圖中NNN,N指任一核苷酸。(B)構(gòu)建了一個(gè)64孔微芯片，每孔由圖A顯示的含有3堿基對(duì)的F2結(jié)合位點(diǎn)的序列組成，然后噬菌體展示的各種不同的Zif268蛋白結(jié)合到這個(gè)芯片上。（C）被結(jié)合的噬菌體用抗M13抗體檢測(cè)。噬菌體的結(jié)合位點(diǎn)決定了不同Zif268蛋白的底物特異性（Bulyk et al.2001）。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.14 表面胞質(zhì)基因組共振生物傳感器的示意圖.一種結(jié)合伙伴固定在感應(yīng)器表面.使用BIACORE儀器，可溶性分子可以流過(guò)固定的分子．可溶性分子的結(jié)合導(dǎo)致傳感芯片表面的溶液的折光系數(shù)發(fā)生改變.折光系數(shù)改變的大小與可溶性分子被結(jié)合的數(shù)量存在相關(guān)性.（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

第四篇：體內(nèi)化學(xué)交聯(lián)和質(zhì)譜分析法證實(shí)蛋白質(zhì)相互作用

體內(nèi)化學(xué)交聯(lián)和質(zhì)譜分析法證實(shí)蛋白質(zhì)相互作用

蛋白復(fù)合體的分離可用不同的親和色譜法。在經(jīng)典的免疫親和實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞裂解液中的蛋白復(fù)合體能被固定化了的抗體獲取，該抗體識(shí)別復(fù)合體中已知成分的抗原決定簇。經(jīng)過(guò)多次洗滌以去除非特異性結(jié)合蛋白，該復(fù)合體由質(zhì)譜法分析（MS）。短暫性結(jié)合復(fù)合體，其解離常數(shù)高，不適合這種方法。本文通過(guò)一種新的方法，用體內(nèi)化學(xué)交聯(lián)和基于鑒定蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析法來(lái)鑒定瞬時(shí)作用的蛋白復(fù)合體?；罴?xì)胞用甲醛處理，其快速蔓延到細(xì)胞膜，形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)化學(xué)交聯(lián)。互作蛋白質(zhì)交聯(lián)到一個(gè)含有Myc標(biāo)簽的蛋白質(zhì)上，通過(guò)免疫親和層析共同純化出來(lái)，再把分離下來(lái)。通過(guò)SDS-PAGE分離后，再用串聯(lián)的質(zhì)譜分析鑒定。利用這種方式我們證實(shí)了大量的與M-Ras組成激活形式共同被純化下的蛋白質(zhì)。在這些蛋白中，我們證實(shí)了RasGAP相關(guān)蛋白IQGAP1，它是與M-Ras相互作用的一個(gè)新的蛋白質(zhì)。這種方法適合多種蛋白，對(duì)研究蛋白質(zhì)相互作用十分有益。簡(jiǎn)介

蛋白質(zhì)互作幾乎是細(xì)胞內(nèi)每個(gè)功能水平都出現(xiàn)的，包括亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，各種細(xì)胞膜的機(jī)械轉(zhuǎn)運(yùn)，染色體包裝，基因表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。蛋白質(zhì)互作異常將導(dǎo)致很多種疾病，所以對(duì)蛋白質(zhì)互作的研究成為生命科學(xué)領(lǐng)域極為緊迫的一件事。蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化可以應(yīng)用多種方法，包括經(jīng)典的分子篩和凝膠過(guò)濾，以及這個(gè)不同的親和色譜法分離。免疫親和的方法是目前最具說(shuō)服力的純化方法，通常用于證明體內(nèi)蛋白質(zhì)互作和復(fù)合體中相互作用的物。一個(gè)經(jīng)典的免疫親和實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞裂解液中的蛋白復(fù)合體能被固定化了的抗體獲取，該抗體識(shí)別復(fù)合體中已知成分的抗原決定簇。經(jīng)過(guò)多次洗滌以去除非特異性結(jié)合蛋白，該復(fù)合體由質(zhì)譜法分析。

這種方法的缺點(diǎn)是，對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)需要一種特異的抗體（Ab），許多時(shí)候這種親和導(dǎo)致純化效率很低。Ab除了和靶蛋白外的其他蛋白交聯(lián)是另一個(gè)缺點(diǎn)。這時(shí)，與靶蛋白不相關(guān)的蛋白或蛋白復(fù)合體被純化下了，導(dǎo)致假陽(yáng)性。通過(guò)抗原決定簇標(biāo)簽把抗原結(jié)合到特異的抗體上，形成普通的抗體。為此，需要一個(gè)帶有抗原決定簇標(biāo)簽的抗體和一個(gè)高親和力的抗原。通用的標(biāo)簽有Myc，F(xiàn)lag，相應(yīng)抗體已經(jīng)被商品化。操作說(shuō)明被標(biāo)準(zhǔn)，不要求每一部都在最適合的條件。雖然抗原決定簇標(biāo)簽適用于大范圍的純化實(shí)驗(yàn)，但是其局限于穩(wěn)定的復(fù)合體。結(jié)合較弱的或者瞬間結(jié)合的復(fù)合物會(huì)被忽視，進(jìn)而不能被分析出來(lái)。短暫性結(jié)合復(fù)合體，其解離常數(shù)高，在洗脫非特異結(jié)合條帶時(shí)被洗脫下來(lái)。這些步驟不要嚴(yán)謹(jǐn)操作，在高鹽或洗滌劑濃度時(shí)效率高。在溫和條件下，重復(fù)洗滌也將洗脫掉結(jié)合不緊密的成分。

通過(guò)化學(xué)交聯(lián)可以阻止蛋白質(zhì)復(fù)合體特異組分的丟失。有效地化學(xué)交聯(lián)劑是甲醛。甲醛的幾個(gè)特點(diǎn)應(yīng)用于蛋白質(zhì)互作的研究。1，交聯(lián)發(fā)生在近距離（2A），被交聯(lián)的蛋白位置很近。2，甲醛可以擴(kuò)散到細(xì)胞膜且是非特異的，有益于廣譜的蛋白互作研究。3，甲醛幾乎在添加到細(xì)胞內(nèi)后阻止酶反應(yīng)，可以提供添加時(shí)瞬間的互作情形。4，一旦交聯(lián)反應(yīng)完成，反應(yīng)物可用于非生理?xiàng)l件下操作，并保持結(jié)構(gòu)完整性。另外，交聯(lián)是可逆的，可以隨后分析復(fù)合體組分。

甲醛溫和處理和免疫沉淀在分析轉(zhuǎn)錄因子，與染色體結(jié)合的多聚配合物，核小體位置的確定，核小體動(dòng)力學(xué)和核小體再構(gòu)建方面。最近，甲醛交聯(lián)與免疫沉淀和Western雜交結(jié)合，成功分析了，在酵母里是否TATA結(jié)合蛋白，TF IIB，SAGA組氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶是否直接與轉(zhuǎn)錄結(jié)合蛋白結(jié)合。最近，作者在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，采用了新的分析蛋白質(zhì)互作方法，即甲醛交聯(lián)結(jié)合免疫親和層析，基于質(zhì)譜分析的蛋白鑒定。利用這種方式我們證實(shí)了大量的與M-Ras組成激活形式共同被純化下的蛋白質(zhì)。共免疫沉淀和Western雜交證實(shí)很多蛋白互作。在這些蛋白質(zhì)，我們證實(shí)了RasGAP相關(guān)蛋白IQGAP1，它是與M-Ras相互作用的一個(gè)新的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步研究去解釋其互作的生物學(xué)功能。2材料與方法 2.1 抗體與試劑

抗Myc的小鼠抗體mAB（clone 9E10）來(lái)自于H.Ziltener博士?？笽QGAP1和抗Rac的小鼠抗體是購(gòu)買(mǎi)于BD生物科學(xué)公司。抗Rap1的兔多克隆抗體購(gòu)買(mǎi)于Santa Cruz生物技術(shù)公司。羊抗鼠和羊抗兔的二抗來(lái)自DAKO公司。羊抗鼠Alexa Fluor 680二抗來(lái)自分子探針公司。另外的試劑來(lái)自Fisher Scientific。2.2 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

R6X細(xì)胞（依賴于白介素3雙點(diǎn)位的鼠肥大細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系）感染雙順?lè)醋幽孓D(zhuǎn)錄病毒載體基于pMXpie，其穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白和天然的M-Ras和突變的組成型激活M-Ras，它們都帶有氨基端的Myc標(biāo)簽。R6X細(xì)胞在37℃,5%CO2，RPMI1640培養(yǎng)基中加2mm的l谷氨酸鹽，100單位/ml的青霉素，50ug/ml的鏈霉素，10%胎牛血清，2%的10倍的培養(yǎng)基，在WEHI-3B沒(méi)有的作為白介素3的來(lái)源。2.3甲醛交聯(lián)？？？

收集R6X細(xì)胞，用PBS洗，每5*106個(gè)細(xì)胞在1ml的PBS（含0.125-1.0%多聚甲醛質(zhì)量體積比）中孵育。甲醛交聯(lián)在37℃,5-60分鐘。反應(yīng)終止是加入起始濃度為1.25M的甘氨酸，抑制濃度為125mM，室溫，5分鐘。細(xì)胞收集，PBS洗兩次，在裂解緩沖液（50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% 甘油, 1% NP-40, 5 mM EDTA）中打散沉淀物，裂解液中加入蛋白酶抑制劑。細(xì)胞裂解物在14000rpm，15min成為細(xì)胞顆粒碎片。收集上清用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量檢測(cè)蛋白質(zhì)量。

3.4 Western雜交和免疫沉淀反應(yīng)

蛋白在10% SDS-PAGE中被分離，并轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，膜在4℃，3%的BSA過(guò)夜封閉，室溫一抗孵育1小時(shí)，PBS中加入0.1%的吐溫洗滌四次，室溫二抗孵育1小時(shí)。在一輪洗滌后，條帶在化學(xué)發(fā)光劑和X射線膠卷或奧德賽紅外成像系統(tǒng)中被看到。免疫沉淀反應(yīng)，2mg抗Myc的抗體用鄰苯二甲酸二甲酯偶聯(lián)到1ml的蛋白G瓊脂糖珠子上，細(xì)胞裂解液用25-50ml蛋白G瓊脂糖珠預(yù)處理，4℃,10min，含有1mg的處理裂解液在25-50ul的含抗Myc的抗體瓊脂珠，4℃，2h。裂解液用buffer洗滌三次，結(jié)合材料再用1m甘氨酸（pH2.5）37℃,15min。用飽和Tris溶液再次洗滌。洗滌樣品中加入5倍的樣品buffer（2%SDS, 10%甘油, 40%mMTris pH 6.8, 715 mM b-巰基乙醇稀釋成1倍），65℃煮10民，以備SDS-PAGE。2.5 免疫親和層析

9多聚甲醛處理的細(xì)胞裂解液約需10R6X細(xì)胞，含有標(biāo)準(zhǔn)化保證豈有相同的蛋白數(shù)量。免疫親和層析實(shí)驗(yàn)中，0.864 cm Poly-Prep柱子中1ml抗Myc抗體的柱子。在純化之前，細(xì)胞裂解液用1ml的蛋白G瓊脂珠預(yù)處理，4℃,10min。預(yù)處理的裂解液加入免疫親和層析柱子中，4℃，2小時(shí)。柱子用10ml平衡buffer（20 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mMEDTA）洗脫，第2次用10ml含1%吐溫20平衡buffer洗脫，第3次用10ml含500mM NaCl平衡buffer洗滌。結(jié)合材料用1m甘氨酸（pH2.5）37℃,15min。用飽和Tris溶液再次洗滌。把三次的純化也收集在一起，用Amicon Ultra-4 10 000 MWCO過(guò)濾器離心。在濃縮的樣品中加入5倍的上樣buffer，95℃煮20min。蛋白質(zhì)在10%SDS-PAGE中分離，用考馬斯亮藍(lán)染色法觀察。2.6多維液相層析/串聯(lián)式質(zhì)譜法分析

蛋白條帶從SDS-PAGE中切割下來(lái)，膠內(nèi)進(jìn)行胰蛋白酶化。按序蛋白酶化在37℃過(guò)夜。提取多肽，到新管中，加入10ul 5%的甲酸用多維液相層析/串聯(lián)式質(zhì)譜法分析。流入的液相色譜用最終高效液相色譜系統(tǒng)，流速為200nl/min用75 mm6150 mm RP毛細(xì)管柱，用水/CAN/甲酸為梯度。液相色譜流出液電噴入QSTAR quadrupole-TOF質(zhì)譜儀的樣品孔。收集串聯(lián)質(zhì)譜儀收據(jù)。串聯(lián)質(zhì)譜儀用MASCOT搜索引擎，收據(jù)分析和對(duì)比所有的哺乳動(dòng)物序列（Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)）。3 結(jié)果與分析 3.1 體內(nèi)M-Ras化學(xué)交聯(lián)

甲醛是一種可逆的有效地蛋白交聯(lián)試劑。據(jù)此，我們研究甲醛對(duì)Ras家族（小GTP酶M-Ras）化學(xué)交聯(lián)效果。M-Ras,好家族中其他成員像類(lèi)似，以結(jié)合GDP或GTP決定分子的開(kāi)關(guān)。當(dāng)結(jié)合GTP時(shí)它可以綁定下游效應(yīng)物激活下游反應(yīng)。至今，M-Ras幾個(gè)候選效應(yīng)物已有酵母雙雜交證實(shí)，包括RPM, Nore1, AF-6, Rin1, RalGDS, Raf-1, and A-Raf。M-Ras具有很多調(diào)節(jié)物，有p21Ras蛋白特性，H-Ras，N-Ras，K-Ras。鳥(niǎo)嘌呤交換因子(GEFs)，促使GDP釋放，陰性調(diào)節(jié)劑包括GTP激活蛋白(GAPs)，是Ras與GTP結(jié)合，并增強(qiáng)GTP酶活性，導(dǎo)致失活狀態(tài)構(gòu)想變化。

已知的M-Ras的效應(yīng)物不能說(shuō)明其功能，體內(nèi)與其相互作用的物質(zhì)應(yīng)該解釋其細(xì)胞功能，包括，生長(zhǎng)，分化和瘤形成。本文的目的是尋求一種普遍的方法來(lái)鑒定蛋白質(zhì)的互作，方便我們的研究。通過(guò)甲醛處理，作者認(rèn)為可以交聯(lián)到帶有抗原決定簇標(biāo)簽的靶基因的互作蛋白。與靶基因互作的基因可以通過(guò)已知基因的抗體把互作基因共純化下來(lái)。純化的復(fù)合物通過(guò)SDS-PAGE純化出來(lái)，通過(guò)多維液相層析/串聯(lián)式質(zhì)譜法分析

R6X細(xì)胞表達(dá)帶有Myc標(biāo)簽的組成型激活M-Ras突變體，用某種濃度的多聚甲醛處理20min，包含M-Ras用Western分析（Myc抗體），M-Ras約在29kDa處，在1%多聚甲醛處理后其上方約50kDa處有兩條明顯的條帶。隨著多聚甲醛濃度從0.125%到1%增加，這兩條帶越來(lái)越明顯，表面M-Ras至少和兩條蛋白交聯(lián)，大小約20kDa。由于不溶性沉淀出現(xiàn)在細(xì)胞裂解物中，所以沒(méi)有測(cè)定更高濃度的多聚甲醛。除了上面的條帶外，約37kDa的條帶在Western（抗Myc的抗體）中一直被發(fā)現(xiàn)，為了選擇1%多聚甲醛的最適作用時(shí)間，做了一組選擇最適時(shí)間的試驗(yàn)。孵育時(shí)間在10,20min時(shí)M-Ras復(fù)合體的產(chǎn)量高。條帶彌散表明雜交時(shí)間太長(zhǎng)。因此過(guò)度的雜交，則會(huì)造成抗原決定簇位點(diǎn)的掩蓋，這是由于賴氨酸或其他由于甲醛作用的位點(diǎn)擴(kuò)大化。最后把1%多聚甲醛，20min固定作為體內(nèi)M-Ras交聯(lián)的最適條件。

Q71LWTR6X細(xì)胞中表達(dá)pMXpie空載體，M-Ras(突變)，M-Ras，通過(guò)交聯(lián)與非交聯(lián)用Western雜交觀察M-Ras表達(dá)量。多聚甲醛交聯(lián)后用紅外成像系統(tǒng)觀察到多余復(fù)合物的出現(xiàn)。這些復(fù)合物表達(dá)量較低，大小在65kDa到250kDa.只是在突變的表達(dá)載體中看到的，因?yàn)橥蛔兊妮d體處于激活狀態(tài)，其效應(yīng)物和負(fù)調(diào)控因子與其結(jié)合，增加了蛋白含量。3.2 免疫親和純化與M-Ras交聯(lián)的蛋白

Q71L為了鑒別與M-Ras(突變)結(jié)合的蛋白，需要純化出足夠的復(fù)合體以供質(zhì)譜分析。所以我們需要對(duì)地表達(dá)量的條帶進(jìn)行富集。起初，作者想用商業(yè)化的抗Myc的親和樹(shù)脂來(lái)小范圍的純化大量的SDS-PAGE中觀察到的條帶。雖然富集量很大，通過(guò)Western雜交顯示仍不夠。按比例增加反應(yīng)量，合并收集液，收益很小，且增加了非特異條帶。為此，作者采用免疫親和層析大范圍純化復(fù)合體。柱子上灌入親和樹(shù)脂，其共價(jià)結(jié)合抗Myc的抗體的蛋白G瓊脂糖珠。純化之前，細(xì)胞裂解液先于蛋白G瓊脂糖珠處理，然后，與親和樹(shù)脂孵育。經(jīng)過(guò)洗滌后，結(jié)婚有復(fù)合體的珠子用低pH的洗提也洗，然后立即從新洗滌以免蛋白質(zhì)被破壞。在進(jìn)行蛋白分離之前，甲醛交聯(lián)復(fù)合體先復(fù)興即從新解離。甲醛是與主鏈氨基上的賴氨酸殘疾反應(yīng)形成交聯(lián)，解交聯(lián)將會(huì)抑制，1)凝膠被溶解時(shí)，多肽鏈形成。胰蛋白酶消化位點(diǎn)丟失。2）殘留物中含有多個(gè)位點(diǎn)參與化學(xué)交聯(lián)3）來(lái)自不同蛋白的多肽用胰蛋白酶消化。幾種解交聯(lián)地方法，我們選擇了Hall et al，樣品在5*SDS-PAGE中煮沸20min，用Western雜交顯示煮沸法是否適用與解交聯(lián)，結(jié)果很成功。Myc變性或修飾的因素應(yīng)該被排除，因?yàn)镸-Ras條帶清晰可見(jiàn)。

3.3 質(zhì)譜分析共純化的蛋白

三次共純化的復(fù)合物收集一起，經(jīng)過(guò)解交聯(lián)反應(yīng)，再用SDS-PAGE分離。用考馬斯亮藍(lán)染色，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組顯示有多條蛋白。從膠中切下16條帶，再用胰蛋白酶消化。抽提蛋白，用液體色譜法分離，流出液電噴入QSTAR quadrupole-TOF質(zhì)譜儀的樣品孔。串聯(lián)質(zhì)譜分析以此出現(xiàn)的多肽數(shù)據(jù)，分析顯示有19中蛋白，每種至少有五個(gè)特有的肽序列。最亮的那條帶為244分（基準(zhǔn)分為37）.

第五篇：高一生物教案：蛋白質(zhì)的鑒定

高一生物教案：蛋白質(zhì)的鑒定

【】鑒于大家對(duì)查字典生物網(wǎng)十分關(guān)注，小編在此為大家整理了此文“高一生物教案：蛋白質(zhì)的鑒定”，供大家參考!本文題目：高一生物教案：蛋白質(zhì)的鑒定

【實(shí)驗(yàn)一】 生物組織中還原糖、脂肪、蛋白質(zhì)的鑒定

一、教學(xué)目的

初步掌握鑒定生物組織中還原糖、脂肪、蛋白質(zhì)的基本方法。

二、教學(xué)建議

教材中本實(shí)驗(yàn)安排為驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，有條件的學(xué)?？梢愿臑樘剿餍詫?shí)驗(yàn)，安排在講課之前，或與講課同步進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)難度并不大，但內(nèi)容較多，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，因此，必須作周密安排，才能按時(shí)完成。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。1.增設(shè)教師演示實(shí)驗(yàn)。上課之前，教師應(yīng)該準(zhǔn)備好做演示實(shí)驗(yàn)所需的實(shí)驗(yàn)材料、用具、儀器和試劑等。同時(shí)，逐項(xiàng)完成還原糖、脂肪、蛋白質(zhì)3類(lèi)有機(jī)物的鑒定實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)課上，將3個(gè)實(shí)驗(yàn)的正確結(jié)果分別展示在講臺(tái)上，并作扼要的介紹，以便使學(xué)生將自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與教師的演示實(shí)驗(yàn)作比較。2.實(shí)驗(yàn)中學(xué)生應(yīng)分工合作。在“還原糖的鑒定”實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)每組兩個(gè)學(xué)生中的一個(gè)制備生物組織樣液時(shí)，另一個(gè)學(xué)生可以用酒精燈將水煮開(kāi)，以便縮短實(shí)驗(yàn)的等待時(shí)間。在“脂肪的鑒定”實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)學(xué)生制作臨時(shí)裝片時(shí)，另一個(gè)學(xué)生則可以調(diào)試顯微鏡。另外，在完成前兩個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一個(gè)學(xué)生洗刷試管、清洗玻片和整理顯微鏡，另一個(gè)學(xué)生則可以進(jìn)行后一個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作。

3.關(guān)于鑒定還原糖的實(shí)驗(yàn)，在加熱試管中的溶液時(shí)，應(yīng)該用試管夾夾住試管上部，并放入盛開(kāi)水的大燒杯中加熱。注意試管底部不要接觸燒杯底部，同時(shí)試管口不要朝向?qū)嶒?yàn)者，以免試管內(nèi)溶液沸騰時(shí)沖出試管，造成燙傷。如果試管內(nèi)溶液過(guò)于沸騰，可以上提試管夾，使試管底部離開(kāi)大燒杯中的開(kāi)水。

4.做鑒定還原糖和蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，在鑒定之前，可以留出一部分樣液，以便與鑒定后的樣液的顏色變化作對(duì)比，這樣可以增強(qiáng)說(shuō)服力。

5.斐林試劑的甲液和乙液混合均勻后方可使用，切勿將甲液和乙液分別加入組織樣液中。

三、參考資料

還原糖的鑒定原理 生物組織中普遍存在的還原糖種類(lèi)較多，常見(jiàn)的有葡萄糖、果糖、麥芽糖。它們的分子內(nèi)都含有還原性基團(tuán)(游離醛基或游離酮基)，因此叫做還原糖。蔗糖的分子內(nèi)沒(méi)有游離的半縮醛羥基，因此叫做非還原性糖，不具有還原性。本實(shí)驗(yàn)中，用斐林試劑只能檢驗(yàn)生物組織中還原糖存在與否，而不能鑒定非還原性糖。

斐林試劑由質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液和質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的硫酸銅溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡藍(lán)色的Cu(OH)2沉淀。Cu(OH)2與加入的葡萄糖在加熱的條件下，能夠生成磚紅色的Cu2O沉淀，而葡萄糖本身則氧化成葡萄糖酸。其反應(yīng)式如下：

CH2OH—(CHOH)4—CHO+2Cu(OH)2→CH2OH—(CHOH)4—COOH+Cu2O↓+2H2O

用斐林試劑鑒定還原糖時(shí)，溶液的顏色變化過(guò)程為：淺藍(lán)色棕色磚紅色(沉淀)。

蛋白質(zhì)的鑒定原理 鑒定生物組織中是否含有蛋白質(zhì)時(shí)，常用雙縮脲法，使用的是雙縮脲試劑。雙縮脲試劑的成分是質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液和質(zhì)量濃度為0.01 g/mL的硫酸銅溶液。在堿性溶液(NaOH)中，雙縮脲(H2NOC—NH—CONH2)能與Cu2+作用，形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物，這個(gè)反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此，蛋白質(zhì)可與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)。

用于鑒定還原糖的實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備植物組織是常用的實(shí)驗(yàn)材料，但必須加以選擇。在雙子葉植物中，光合作用的主要產(chǎn)物葡萄糖形成后，合成為淀粉，暫時(shí)儲(chǔ)藏在葉子內(nèi)，因此最好不用雙子葉植物的葉子作實(shí)驗(yàn)材料。有些單子葉植物，如韭菜、鳶尾，并不將光合作用的初始產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸郏虼巳~內(nèi)含有大量的可溶性單糖，但是，由于葉片中葉綠素的顏色較深，對(duì)于鑒定時(shí)的顏色反應(yīng)起著掩蓋作用，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯，因此，也不宜用單子葉植物的葉子作實(shí)驗(yàn)材料。本實(shí)驗(yàn)最理想的實(shí)驗(yàn)材料是還原糖含量較高的植物組織(或器官)，而且組織的顏色較淺或近于白色的，如蘋(píng)果和梨的果實(shí)。經(jīng)試驗(yàn)比較，顏色反應(yīng)的明顯程度依次為蘋(píng)果、梨、白色甘藍(lán)葉、白蘿卜。

用于鑒定脂肪的實(shí)驗(yàn)材料 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料最好選擇富含脂肪的種子，如花生種子(取其子葉)。供實(shí)驗(yàn)用的花生種子，必須提前浸泡3～4 h。浸泡時(shí)間短了，不容易切成片;浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則組織太軟，切下的薄片不易成形。

做鑒定脂肪的實(shí)驗(yàn)，教師可根據(jù)本地區(qū)的情況選用蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ染液。蘇丹Ⅲ染液遇脂肪的顏色反應(yīng)為橘黃色，蘇丹Ⅳ染液遇脂肪的顏色反應(yīng)為紅色。因蘇丹Ⅳ染液與脂肪的親和力比較強(qiáng)，所以，染色的時(shí)間應(yīng)比較短，一般為1 min左右。用于鑒定蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)材料最好選用富含蛋白質(zhì)的生物組織(或器官)，植物材料常用的是大豆種子，動(dòng)物材料常用的是雞蛋(卵白)。如用大豆種子，必須提前浸泡1～2 d，這樣容易研磨成漿。有條件的學(xué)校，可以直接采用現(xiàn)成的大豆磨成的豆?jié){，豆?jié){可以購(gòu)買(mǎi)，也可用小型的研磨機(jī)制取。利用豆?jié){作實(shí)驗(yàn)材料，可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間。如果用稀釋的卵白作實(shí)驗(yàn)材料，效果會(huì)更好。斐林試劑的配制 甲液質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液 乙液質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的硫酸銅溶液

使用時(shí)臨時(shí)配制，將4～5滴乙液滴入2 mL甲液中，配完后立即使用。

蘇丹Ⅲ溶液的配制 稱(chēng)取0.1 g蘇丹Ⅲ干粉，溶于100 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精中，待全部溶解后再使用。

蘇丹Ⅳ溶液的配制 稱(chēng)取0.1 g蘇丹Ⅳ干粉，溶于50 mL丙酮中，再加入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精50 mL，充分混合后即可使用。

雙縮脲試劑的配制 取10 g氫氧化鈉放入容量瓶(或有刻度的燒杯)中，加水至100 mL，待充分溶解后倒入試劑瓶中，配成質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液，瓶口塞上膠塞，貼上標(biāo)簽，寫(xiě)上試劑A。

取1 g硫酸銅放入容量瓶(或有刻度的燒杯)中，加水至100 mL，待充分溶解后倒入試劑瓶中，配成質(zhì)量濃度為0.01 g/mL的硫酸銅溶液(藍(lán)色)。瓶口塞上膠塞，貼上標(biāo)簽，寫(xiě)上試劑B。