第一篇：基于質譜蛋白質鑒定，第1節(jié)：蛋白質鑒定技術簡介

基于質譜的蛋白質鑒定，第 1 節(jié)：蛋白質鑒定技術簡介

蛋白質組學（Proteomics）的分析一般可分為四類分析方法：（i）快速而簡單的分析方法，用于從復雜混合物中純化少量蛋白質；（ii）快速而靈敏的方法，可從目標蛋白質中獲取少量但足夠的結構信息（iii）獲取拓展的蛋白質或 DNA 序列數(shù)據(jù)庫，以及（iv）能夠通過計算機算法將DNA 序列信息與各種類型的蛋白質結構信息結合起來，例如 N 末端蛋白質或內部肽序列，氨基酸組成，肽質量指紋圖，MS 片段圖譜或所選肽的序列標簽。

高分辨率凝膠電泳（2-D 凝膠電泳是目前最有效的蛋白質分離方法），自 70 年代后期就已經(jīng)被用作分析工具。但一直到蛋白質樣品制備方法和測序工具得到了相當大的改進之后，二維凝膠電泳才發(fā)展成為制備性的蛋白質純化程序。蛋白質能夠通過電印跡法轉到化學惰性的膜上，可能是蛋白質微量樣品制備中最重要的步驟之一，因為它將高分辨率凝膠電泳（純化步驟）和氣體色譜（分析步驟）直接聯(lián)系在了一起。電印跡法又可以結合基于膜的埃德曼化學法形成 N 末端或內部肽序列。這種組合技術現(xiàn)在通常稱為微測序，因為與早期技術相比，它使樣品制備的靈敏度提高了至少 100 倍，從而可以分析低至 pmole 或 μg 級別的蛋白質。這項技術在 80 年代后期開始流行，當時聚二氟乙烯（PVDF）印跡膜已經(jīng)成功商業(yè)化。同一時期，第一個 2-D 凝膠蛋白序列數(shù)據(jù)庫（實際蛋白質組學的祖先）也誕生了。但是，由于當時已知的蛋白質或 DNA序列數(shù)量很少，這些數(shù)據(jù)庫中的信息非常有限。因此，微測序法更常被用作 cDNA 克隆的起始點，而不是用于通過同源性進行蛋白質鑒定。

隨著蛋白質，DNA 和表達序列標簽（EST）等數(shù)據(jù)庫信息在 90 年代以來的迅速增長。從頭測序變得不再那么常見，而重測序或通過比較法進行測序變得更加重要。這是生物質譜（MS）技術進入測序領域的正確時機。質譜 MS 是非?？焖凫`敏的技術方法，即使到了現(xiàn)在，MS 技術的分析速度和靈敏度仍未達到其極限。MS 技術的兩大主要領域是：基質輔助激光解吸電離/飛行時間（MALDI-TOF）質譜和電噴霧電離（ESI）質譜，這兩種方法的區(qū)別在于其電離分析物的方法，相關的樣品制備程序也不同。因此 ESI 主要與液相色譜儀器相結合，而 MALDI-TOF更適合于高通量檢測，更適合于大規(guī)模的蛋白質組學分析。隨著快速蛋白質鑒定技術的發(fā)展，對高度可重復的，可比較的，大規(guī)模二維凝膠電泳方法的需求穩(wěn)步增長，也通過引入可固定的pH 梯度法得以實現(xiàn)。

最后，還需要將所有的數(shù)據(jù)結合起來。氨基酸序列，肽質量指紋或肽 MS 片段數(shù)據(jù)需要被翻譯為帶注釋或無注釋基因組序列數(shù)據(jù)庫中的 DNA 序列。每個 DNA 序列可以從兩端和三個不同的開放閱讀框進行讀取。在某些表達序列標簽（EST）中，經(jīng)常會出現(xiàn)錯誤，使得搜索變得困難。而計算機算法可以成功地解決遇到的這些挑戰(zhàn)，可以匹配到最接近MS 分析獲取的結構信息對應的蛋白質或 DNA 序列片段。

基于質譜的蛋白質鑒定系列總結，將主要集中在兩個部分：（i）如何從凝膠純化的蛋白質樣品中獲得必要的結構信息，（ii）以及如何使用此類信息鑒定蛋白質。第 2 節(jié)簡要介紹了基于常規(guī)Edman 的 N 末端或內部肽測序的方法。

在第二部分中，我們重點介紹基于 MALDI-TOF 的蛋白質分析方法，并簡要回顧將 MS 生成的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中存儲的序列進行匹配的算法。

本文由百泰派克生物科技整理編輯。未經(jīng)許可，不得轉載。

北京百泰派克公司采用高分辨率質譜平臺技術，包括 Thermo Fisher 的 Q Exactive 質譜儀，LTQ Orbitrap Velos 質譜儀，以及 AB SCIEX 的 6500 Q TRAP 質譜儀，結合 Nano-LC 高通量液相色譜技術，能夠對 SDS-PAGE 蛋白條帶、2D 蛋白膠點等樣品中的蛋白質進行高效精準鑒定。膠條、膠點蛋白質譜鑒定服務可保證 100%的鑒定率，否則不收任何費用。

文獻參考：Protein identification methods in proteomics.Electrophoresis, 2000.

第二篇：可溶性還原糖脂肪蛋白質的鑒定

學案六實驗一可溶性還原糖脂肪蛋白質的鑒定

一、解讀兩綱

1.識記鑒定實驗所用的材料，懂得選材的要求。

2.掌握實驗原理、步驟，理解實驗目的、方法。

3.學會制備生物組織樣液，正確選用鑒定試劑，并能按規(guī)范的要求操作，獨立完成鑒定工作。

4.明確觀察對象，正確說出鑒定過程中樣液的顏色變化，并能用準確的語言解釋實驗現(xiàn)象，作出實驗結論。

5.能熟練制作徒手切片，臨時裝片和使用低倍顯微鏡，了解高倍顯微鏡的使用方法。

6.具備驗證相關生物學事實的能力，并能對實驗現(xiàn)象和結果進行解釋、分析和處理；能對一些生物學問題進行初步的探究性研究。

二、高考熱線

1.題型以選擇題為主，也可能以簡答題出現(xiàn)，重點是以對比的方式考查相關實驗的異同點。

2.以教材實驗為依據(jù)，設置實驗設計題是今后考查的重點，如“設計實驗證明淀粉酶是蛋白質”，就是依據(jù)教材中的實驗3的原理和步驟。

三、學法指點

1.運用對比的方法認識三種物質的鑒定原理、過程及注意事項。

2.對比三種物質鑒定過程中的相同點和不同點，重點掌握試劑使用上的區(qū)別。

3.根據(jù)所學的原理鑒定類似物質，設計相應的實驗程序。

四、教材梳理

（一）實驗原理

生物組織中含有可溶性還原糖（如_______、_______、________）、脂肪、蛋白質等化學成分，可分別與某些化學試劑作用產(chǎn)生特定的_____________。

(1)可溶性還原糖+__________試劑—→磚紅色沉淀

可溶性還原糖+班氏糖定性試劑—→__________

(2)脂肪+__________________染液—→染成橘黃色

脂肪+蘇丹Ⅳ染液———————→染成______

(3)蛋白質+________________試劑—→溶液呈紫色

(二)實驗目的1.初步掌握鑒定可溶性還原糖、脂肪、蛋白質的基本方法。

(三)實驗材料

(四)方法步驟

1.可溶性還原糖的鑒定

(1)制備組織樣液：蘋果切塊、研磨、________。

(2)鑒定組織樣液：1 支試管+2mL_____________+2mL________________，振蕩試管，（溶液_______色?），________2min左右，觀察溶液顏色變化。（________色→棕色→_________色）。

2.脂肪的鑒定

(1)切片制作：用花生子葉作徒手切片。

(2)染色：1塊載玻片+切片+ 3滴________染液，3min后吸去染液+ 2滴50%________溶液去浮色，吸去后+ 2滴__________，蓋蓋玻片。

(3)鏡檢鑒定：先用低倍鏡觀察，找到子葉最薄處，再用高倍鏡觀察。（圓形的脂肪顆粒為_____色）。

3.蛋白質的鑒定

(1)制備樣液：大豆切片、________、_______。

(2)鑒定：1 支試管+2mL黃豆組織樣液+2mL________________，振蕩試管（溶液_____色），+4滴______________，________試管，觀察溶液顏色變化。（______色→______色→_______色）。

（五）結論與討論

1.結論：從斐林試劑與蘋果樣液作用、蘇丹III染液與花生種子作用、雙縮脲試劑與大豆樣液作用

1的顏色變化可以得出：___________________________________________________________。

2.討論鑒定依據(jù)。因為某些化學試劑與生物組織中的有關_________發(fā)生一定的化學反應，產(chǎn)生有固定顏色的新化合物。故可根據(jù)待檢物與某些化學試劑反應的____________,如橘黃色、_________色、______色等，鑒定生物組織中含有_______、可溶還原糖和___________。

五、疑難精析

1．生物組織中的還原糖是指分子結構中含有還原性基團(如游離醛基或酮基)的糖，如葡萄糖、麥芽糖、果糖，淀粉、蔗糖不具有還原性，斐林試劑只能檢驗可溶性還原糖的存在，而不能鑒定可溶性非還原糖或不溶性糖。

2．可溶性還原糖鑒定實驗的選材原則。選用可溶性還原糖含量較高的生物組織，而且組織的顏色較淺，或近于白色。常用的植物組織是：蘋果、梨、白色甘藍葉、白蘿卜。雙子葉植物光合作用的主要產(chǎn)物為淀粉，其葉不理想。有些單子葉植物，如韭菜、鳶尾等，其葉內含有大量的可溶性單糖，但由于葉片中葉綠素顏色較深，影響鑒定時實驗現(xiàn)象的觀察，也不宜作實驗材料。

3．可溶性還原糖鑒定實驗的關鍵性的步驟在于斐林試劑現(xiàn)用現(xiàn)配及用量。很不穩(wěn)定，故應將組成斐林試劑的甲液(0.1g／mL的NaOH溶液)和乙液(0.05g／mL的CuS04溶液)分別配制、儲存；使用時，再臨時配制，將4～5滴乙液滴入2mL甲液中，配完混合均勻后[得到淡藍色的Cu(OH)2沉淀的懸濁液]立即使用。如果過早混合會產(chǎn)生Cu(OH)2沉淀，加入到組織樣液中并加熱時會產(chǎn)生黑色CuO沉淀。而臨時混合所得斐林試劑立即用于實驗，即可使新制的Cu(OH)2作氧化劑與可溶性還原糖發(fā)生氧化-還原反應，生成磚紅色的Cu2O沉淀。溶液的變化過程：淡藍色→棕色→磚紅色沉淀。

4．在可溶性還原糖的鑒定中，在對盛有組織樣液與斐林試劑混合物的試管直接用酒精燈加熱易破，因為試管受熱不均勻，若要避免此現(xiàn)象產(chǎn)生應改用水浴加熱。此時試管底部不要觸及燒杯底部，試管口不要朝向實驗者，以免溶液沸騰時沖出試管造成燙傷。

5．雙縮脲試劑并不是雙縮脲分子。所謂雙縮脲是由兩分子尿素經(jīng)脫氨縮合而成的化合物。該化合物在堿性溶液中能與CuSO4反應產(chǎn)生紫色絡合物，此反應稱雙縮脲反應。蛋白質分子中含有許多與雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應。特別要提醒學生的是實驗桌上兩瓶不同濃度的CuS04溶液，避免拿錯。

6．蛋白質鑒定實驗中，最好選用富含蛋白質的生物組織，植物材料常用的是大豆，動物材料常用的是雞蛋。其關鍵性步驟在于先加雙縮脲試劑A(0.1g/mLNaOH溶液)再加雙縮脲試劑B(0.01g/mLCuSO4溶液)。如果用雞蛋白稀釋液，則濃度不宜過大，以免實驗后粘住試管壁，不易洗凈。

7.脂肪的鑒定實驗中，實驗材料最好選用富含脂肪的種子，其關鍵性步驟在于子葉要削成理想薄片。為了作好徒手切片，種子浸泡的時間不宜過長。也可改成刮取種子子葉泥制作臨時裝片，易做，效果又好。

8.填表比較實驗1和3：

9.本實驗為驗證性實驗，也用注意對照。如在鑒定可溶性還原糖和蛋白質時，鑒定之前需留一部分樣液，以便與鑒定后樣液顏色變化作對比。

例1 用下列實驗材料做特定實驗，從理論上講能否成功?說明依據(jù)的道理。

(1)用韭菜葉片做可溶性還原糖的鑒定實驗；

(2)用蓖麻種子做脂肪鑒定實驗；

(3)用卵白做蛋白質鑒定實驗。

[解析] 此題是要求根據(jù)課本實驗原理進行拓展和應用，這也是近幾年高考的一個趨勢。韭菜在進行光合作用時并不能將光合作用的產(chǎn)物葡萄糖轉變成淀粉，因此葉內含有大量的可溶性還原糖，但是，由于葉片中葉綠素含量較多，綠色較深，對于鑒定時的顏色反應起著掩蓋作用，導致實驗現(xiàn)象不明顯，因此不宜用這些單子葉植物作此實驗材料；后兩個實驗材料從理論上說是可行的。

答案：(1)用韭菜葉片做還原糖實驗不能成功，因為葉片內雖然含有大量可溶性還原糖，但葉片中葉綠素含量較多，顏色較深，對鑒定時的顏色反應起著遮蓋作用；(2)若用蓖麻種子做脂肪鑒定實驗，從理論上說可以成功，因為該種子含較多的脂肪，種子也比較大，便于進行徒手切片；(3)由于卵白中含有大量的蛋白質，從理論上講做蛋白質鑒定實驗是會成功的。

六、趁熱打鐵

（一）選擇題

1．將面團包在紗布中在清水中搓洗，鑒定黏留在紗布上的黏稠物質和洗出的白漿用的試劑分別是

()

A.碘液、蘇丹Ⅲ溶液B．雙縮脲試劑、碘液

C.亞甲基藍溶液、蘇丹ⅢD．碘液、斐林試劑

2．蛋白質的鑒定時，事先留出一些黃豆組織樣液的目的是()

A.與反應后混合液的顏色做對比B．失敗后重做一遍

C.鑒定可溶性還原糖用D.留下次實驗用

3．用斐林試劑鑒定可溶性還原糖時，溶液的顏色變化過程為()

A.淺藍色→棕色→磚紅色B．無色→淺藍色→棕色

C.磚紅色→淺藍色→棕色D.棕色→綠色→無色

4．在鑒定可溶性糖的實驗中，對試管中的溶液進行加熱時，操作不正確的是()

A.將這支試管放進盛開水的大燒杯中B．試管底部不要觸及燒杯底部

C.試管口不要朝向實驗者D.試管底部緊貼燒杯底部

5．現(xiàn)有如下實驗材料：①西瓜汁②菜籽③豆?jié){④草莓果實⑤花生仁 ⑥雞蛋清，它們與斐林試劑作用呈磚紅色、與蘇丹Ⅲ試劑作用呈橘黃色、與雙縮脲試劑作用呈紫色的實驗材料分別為()

A.①④、②⑤、⑤⑥B．①④、②⑤、③⑥

C.①④、②③、⑤⑥D．②④、③⑤、③⑥

6.青蘋果汁遇碘液顯蘭色，熟蘋果汁能與斐林試劑作用產(chǎn)生磚紅色沉淀，這說明()

A.青蘋果汁含有淀粉，不含有糖類B．熟蘋果汁含有糖類，不含有淀粉

C．蘋果成熟時，淀粉水解成單糖D.蘋果成熟時，單糖合成淀粉

7.下列關于生物組織中三大有機物的鑒定操作步驟，正確的是()

A.用于鑒定可溶性還原糖的斐林試劑，可直接用于蛋白質的鑒定

B．脂肪的鑒定需要用顯微鏡才能看到被染成橘黃色脂肪滴

C.鑒定可溶性還原糖時，要加入斐林試劑甲液搖均后再加入乙液

D.用于鑒定蛋白質的雙縮脲試劑A液與B液要混合均勻后，再加入含樣品的試管中，且必須現(xiàn)配現(xiàn)用

8．某同學在顯微鏡下觀察被蘇丹Ⅲ染液染色后的花生種子子葉切片，當轉動細準焦螺旋調焦距時，有一部分細胞看得很清楚，另一部分細胞較模糊，這是由于（）

A.反光鏡沒調好B．標本切得厚薄不均勻

C.顯微鏡物鏡損壞D．細準焦螺旋未調好

9．可溶性還原糖的鑒定中，制備生物組織樣液時加入少許石英砂，其目的是()

A.研磨充分B.防止糖被破壞C．防止反應D.無作用

10.在過氧化氫酶溶液中加入雙縮脲試劑，其結果應是（）

A.產(chǎn)生氣泡B.溶液呈紫色C.溶液呈藍色D.產(chǎn)生磚紅色沉淀

11.雙縮脲試劑可以鑒定蛋白質是因為（）

A.蛋白質都有肽鍵B.蛋白質都有氨基酸

C.蛋白質都有羧基D.蛋白質都有氨基

12.(多選)下列物質用斐林試劑檢測時可能出現(xiàn)磚紅色沉淀的是()

A.葡萄糖B．果糖C．麥芽糖D．淀粉

13.(多選)下列各組中前項為所鑒定的物質，中項為所使用試劑，后項為所產(chǎn)生的顏色。正確的是

()

A.葡萄糖、斐林試劑、橘黃色B.脂肪、蘇丹Ⅲ染液、磚紅色

C.蛋白質、雙縮脲試劑、紫色D.淀粉、碘液、藍色

二、非選擇題

14．做“生物組織中可溶性還原糖、脂肪、蛋白質的鑒定”實驗時，需根據(jù)實驗需要選擇不同的實驗材料。請根據(jù)下表所列各種材料回答問題：

(1)其中適合于鑒定糖的是_______，理由是_____________________________________________。

(2)小麥種子不如花生種子更適合用來鑒定脂肪，這是因為________________________________。但小麥種子中糖類化合物___________含量很高，卻不適合用來鑒定________，這是因為__________ __________________________________。

15．在做“可溶性還原糖的鑒定”實驗時:

(1)所用斐林試劑甲液的質量濃度為____g／mL，乙液的質量濃度為____g/mL，如何用這兩種溶液配制斐林試劑(簡要步驟)__________________________________________________。

(2)斐林試劑甲液與乙液混合后產(chǎn)生_________色沉淀，它與葡萄糖在加熱條件下發(fā)生化學反應，產(chǎn)生_________色沉淀。

(3)請解釋為什么斐林試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，不能放置太久____________________________________。

(4)做此實驗時，試管直接用酒精燈加熱易破，其原因是____________，若要避免此現(xiàn)象產(chǎn)生應改用_________________。

16．用蘋果和黃豆做實驗材料時，都需將其研磨碎，在研磨時加入少量石英砂的作用是___________；在研磨后二者都需要對研磨液進行過濾，過濾的目的是除去_________________，在過濾中為什么只用一層紗布，不用濾紙?______________________________________________________________________。

17．（設計實驗，論證結論）請根據(jù)下列材料和實驗原理，設計一個證明淀粉酶是蛋白質的實驗。

(1)實驗器材：雞蛋、人的唾液、清水、0.1g/mLNaOH溶液、0.01g/mLCuSO4溶液、小燒杯、玻璃棒、試管和滴瓶。

(2)實驗原理：雞蛋的蛋清主要成分是蛋白質，在堿性條件下，蛋白質與CuSO4反應產(chǎn)生紫色物質，即雙縮脲反應。如通過實驗再證明淀粉酶能發(fā)生雙縮脲反應，即可證明淀粉酶是蛋白質。

(3)實驗步驟：

第一步：制備蛋清液。取雞蛋一個，打破蛋殼（不破壞蛋黃），取少許蛋清注入小燒杯中，加入30mL清水，用玻璃棒攪拌均勻備用。

第二步：_____________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________。

第三步：_____________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________。

(4)實驗結果：_______________________________________________________________________。

(5)結果分析：_______________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________。

第三篇：蛋白質-配基相互作用的鑒定

10.蛋白質－配基相互作用的鑒定

Timothy Palzkill 張曉君、毛躍建、李旻、張晶、趙琴麗、徐靈筠譯；申劍初校；張曉君修校

10.1 前言

基因組測序計劃已鑒定了大量的以前未知的基因。然而，甚至對于已被深入研究的模式生物，如大腸桿菌和釀酒酵母，大約三分之一的基因的功能仍未知。了解基因組中所有基因的功能的挑戰(zhàn)促進了高通量實驗技術的發(fā)展，并因此推動了大規(guī)模描繪蛋白質－蛋白質以及蛋白質－配基的相互作用。

蛋白質－蛋白質相互作用在功能性細胞內扮演著重要的角色。在基因組規(guī)模上確定蛋白質的相互作用可建立蛋白質相互作用網(wǎng)絡，這種網(wǎng)絡可為基因產(chǎn)物的功能提供重要的線索。例如，如果一個未知功能的蛋白可與已知功能的一族蛋白相互作用，說明這個蛋白與它們具有相同的功能（Schwikowski等，2000）。蛋白質－蛋白質相互作用的鑒定可以通過提供它們與復合體的結合模式為生物學過程的機制的了解提供新觀點。例如，即使知道一類蛋白參與某個生物學過程，我們也不知道這些蛋白是否或怎樣與復合體相互作用以實現(xiàn)它們的功能。蛋白質－蛋白質作用譜圖提供了蛋白質相互作用的詳細信息因此提供復合體組織的精確信息。

本章綜述了在基因組規(guī)模上蛋白質相互作用的研究方法。包括如酵母雙雜交系統(tǒng)的在體方法和一些體外方法，如質譜、噬菌體展示和蛋白芯片等。10.2 開放閱讀框的高通量克隆

測定基因組規(guī)模的蛋白功能的功能基因組研究依賴于開放閱讀框的高效克隆。開放閱讀框必須被克隆到可以大規(guī)模表達或便利地對編碼蛋白進行功能性分析的質粒載體。由于所有蛋白不可能在一個系統(tǒng)中得到一樣好的表達，對所感興趣的基因應構建到多個蛋白表達系統(tǒng)。例如，用各種細菌的啟動子測定可以確定哪個系統(tǒng)最適合表達。此外，對于功能分析，將感興趣的基因插入載體用于噬菌體展示、雙雜交分析或谷胱苷肽S轉移酶（GST）融合。如果我們使用傳統(tǒng)的采用限制性內切酶和DNA連接酶的克隆技術，構建這樣一套載體所用的時間和費用將是不可想象的。但是，替代的新方法已可以便利地快速克隆PCR產(chǎn)物。10.2.1 λ噬菌體att重組克隆 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 λ噬菌體位點專一重組系統(tǒng)已被用于創(chuàng)建有效的克隆系統(tǒng)。λ噬菌體具有裂解和溶源循環(huán)。在溶源循環(huán)，噬菌體不復制而將DNA整合到宿主的染色體上（Ptashne，1992）。一旦λ噬菌體感染后，溶源過程馬上開始，λDNA環(huán)化、Int蛋白啟動環(huán)狀DNA整合入染色體。Int蛋白催化λ噬菌體結合位點（aatP）和E.coli結合位點(aatB)的位點專一的重組。一個稱為整合宿主因子（IHF）的E.coli宿主蛋白對λDNA的整合也是必需的（Landy,1989）。整合反應具有高度的序列專一性，沒有任何核苷酸的冗余與缺少。這個位點專一的重組并非同源重組，因為attB和attP有很大差異。這個位點有15個堿基對的核心序列5＇-GCTTTTTTATACTAA。由于同源的區(qū)域很小，在沒有Int蛋白時重組無法進行。attB和attP 重組后的位點稱為attL和attR（圖10.1）(Landy,1989).λ噬菌體DNA 保持為前噬菌體狀態(tài)直到宿主細胞被損壞（Ptashne，1992）。DNA損傷引發(fā)λint和xis基因的表達。Int和Xis表達產(chǎn)物催化細菌染色體上λDNA的剪切。在aatL和aatR位點的剪切產(chǎn)生aatB和aatP位點。剪切反應并非整合反應的簡單的逆向反應，除了Int和IHF蛋白還需要Xis蛋白（Landy，1989）。所以，利用適當?shù)闹亟M蛋白可以控制重組反應的方向。

λ重組克隆系統(tǒng)方法就是將兩端帶有att重組位點的DNA和載體與整合蛋白一起保溫使DNA片段插入載體（Hartley等，2000）。這個系統(tǒng)被稱為重組克隆(RC)（Hartley等，2000）。此系統(tǒng)可被用于直接將PCR片段克隆到載體而無需DNA連接酶。插入PCR片段的反應是attB＋attP>attL＋attR，與λ噬菌體插入相似也是被另加的Int和IHF蛋白催化。反應底物是帶有attB位點的PCR片段和兩端帶有attP的選擇性標記的質粒（圖10.1）。與λ噬菌體插入不同的是，此反應用了兩個attB 和兩個attP，此外，att位點被突變使attB1只能與attP1而非attP2重組。att位點的改造使得PCR片段可以直接克隆到載體（圖10.1）(Hartley等，2000)。

以RC法克隆PCR片段的最后結果是載體帶有兩端含attL位點的標記基因。此質粒被稱為起始克隆(Entry clone)，因為它可以通過重組反應來產(chǎn)生各種功能載體（Hartley等，2000）。用于載體轉換的反應是attL+attR>attB+attP, 類似于λ噬菌體被Int、Xis和IHF蛋白剪切（Landy，1989）。通過對兩種載體和Int、Xis及IHF蛋白的共同溫育，起始克隆的基因被轉到帶轉錄啟動子和蛋白標簽的60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 目的載體。該反應不同于λDNA從染色體的切除，因為起始克隆帶兩個attL位點且目的載體帶兩個attR位點（Hartley等，2000）。att位點被突變以保證只在attL1和attR1 及attL2與attR2之間發(fā)生重組。重組反應通過形成一個復合體來進行，而且最終將形成一個帶有感興趣的基因及啟動子和標簽序列的目的載體圖10.1)。

RC 系統(tǒng)最近被用于幾個大規(guī)?？寺」こ?。例如，從Caenorhabditis elegans中克隆基因以酵母雙雜交系統(tǒng)構建用于蛋白質表達和分析蛋白質相互作用的載體（walhout等，2000）。到最近為止已用此系統(tǒng)克隆了超過12000個C.elegans的基因（Reboul等，2003）。此外，大于100個人cDNA已用此法克隆創(chuàng)建了一套起始克隆。這些克隆以適合的載體轉為GFP融合載體，測定了這些cDNA表達的蛋白的細胞定位（Simpson等，2000）。10.2.2 拓撲異構酶法克隆

痘病毒拓撲異構酶I載體

另一條避免DNA連接酶的克隆途徑是拓撲異構酶介導的克隆。此法利用痘病毒DNA拓撲異構酶I以很高的序列專一性切斷和連接DNA鏈（Shuman，1992a,b）。反應時，酶識別5’-CCCTT序列并在末尾的T切開，在斷開鏈的3’磷酸基團與酶分子的酪氨酸殘基之間形成共價鍵（圖10.2）。共價復合物可以與帶5’羧基并與復合物的尾部互補的異源受體DNA形成重組分子（Shuman，1994）。

拓撲異構酶I克隆利用上述的反應將DNA片段連接到帶5’羧基并可與拓撲異構酶共價結合的受體質粒。反應只在有自由的5’羧基的DNA存在時才會發(fā)生，這很有利于克隆PCR產(chǎn)物，因為當用不帶5’磷酸的引物擴增的產(chǎn)物都不帶5’磷酸基團（Shuman，1994）。最近這個方法被用于從釀酒酵母克隆了6035個開放讀碼框到一個酵母蛋白表達質粒和一個哺乳動物表達載體（Heyman等，1999）。原始的拓撲異構酶克隆方法的缺點是PCR產(chǎn)物可以任意方向插入?？寺∠到y(tǒng)最近被改進可以對PCR產(chǎn)物進行定向克?。▓D10.2）。該系統(tǒng)僅需要在設計引物時在引物的5’末端加入5’CACC。5’CACC序列與質粒－拓撲異構酶復合體的5’端互補，由此控制PCR產(chǎn)物的插入方向（圖10.2）。此系統(tǒng)被用于從梅毒病源Treponema pallidum的基因組克隆了99％的開放讀碼框（McKevitt等，2003）。拓撲異構酶I克隆方法提高了克隆的效率，可以將大量的開放讀碼框插入到質粒89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 載體。

10.2.3 酵母的在體重組克隆

通過轉化克隆

上述的λ重組克隆系統(tǒng)利用體外重組然后轉化到E.coli細胞。替代的體內方法利用酵母高效的同源重組機制克隆了大于99％的釀酒酵母基因（～6000）（Uetz等，2000）。這用兩步PCR完成，首先，一套大約6000個引物對從釀酒酵母中擴增它的開放讀碼框,每個正向引物有特定開放讀碼框的序列和5’端22堿基的所有引物相同的序列，反向引物有特定開放讀碼框序列和20堿基的共有序列（圖10.3）。6000個開放讀碼框隨后被分別擴增得到一套PCR產(chǎn)物。第二套PCR反應引物以第一套PCR所用引物中的共有序列為基礎。正向引物取22堿基共有序列，反向引物取20堿基共有序列，另外還帶有50堿基與作為受體質粒的酵母載體克隆位點兩側的序列同源的序列（Hudson等，1997；Uetz等，2000）。PCR產(chǎn)物將在兩端各帶有70堿基的序列，它們與受體載體的克隆位點兩側的70堿基同源。

每個PCR產(chǎn)物與被限制性內切酶在克隆位點切開而線性化的受體載體一起轉化到酵母（圖10.3）。在PCR產(chǎn)物的兩端70堿基的同源序列足以使酵母的同源重組系統(tǒng)將PCR插入到載體中（Hudson等，1997；Ma等1987）。10.2.4 重組克隆系統(tǒng)的優(yōu)缺點

每個重組克隆方法都是將PCR產(chǎn)物克隆入期望的載體序列的有效手段。拓撲異構酶克隆的主要優(yōu)點是對擴增每個ORF所用的引物的5’端所需要的額外序列最小。只需要在正向引物5’端加四個堿基即可有效地進行定向克隆，而不需在反向引物添加額外核苷酸。但以λ重組克隆系統(tǒng)克隆PCR產(chǎn)物卻需要在正向和反向引物都加25個額外的核苷酸（Hartley等，2000）。

以酵母重組克隆PCR產(chǎn)物的主要優(yōu)點是簡單易行。但是由于需要在PCR產(chǎn)物的兩端帶有至少50bp的與載體的序列同源的序列，因此需要進行兩輪的PCR反應。多輪PCR反應會增加PCR產(chǎn)物的序列發(fā)生突變的可能性。此外，第一輪PCR反應的引物在每個ORF之外又額外增加了20到22個堿基序列，這將會增加引物合成的成本。

總之，重組的克隆方法極大地便利了大量的開放讀碼框的高通量克隆。而這又使下面討論的功能基因組實驗變得可行。118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 10.3 酵母雙雜交選擇系統(tǒng)

酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質相互作用的有力工具。它是基于位點專一的轉錄激活子的模塊特性（Fields和Song，1989）。雜交蛋白由蛋白X 與DNA結合域的融合及蛋白Y與轉錄激活域的融合組成。如果蛋白X和蛋白Y發(fā)生相互作用，將會重建轉錄因子并導致報告基因的表達（圖10.4）。DNA結合域常被稱為“誘餌”，而激活域被稱為“陷阱”。

數(shù)個不同版本的雙雜交系統(tǒng)被廣泛地使用。大多使用DNA結合域與Gal4轉錄因子的融合。另一個版本利用將E.coli LexA的DNA結合域融合到感興趣的蛋白的氨基端來創(chuàng)建‘陷阱’。這個系統(tǒng)需要在報告基因的上游設置一個LexA結合位點。陷阱由Gal4激活域或另外的酸性激活域組成，如E.coli序列的B42。這個陷阱可以與Gal4或LexA的DNA結合域“誘餌”搭配（Brent和Finley，1997）。各種誘餌的常用的報告基因是E.coli的lacZ基因，它編碼半乳糖苷酶。Gal4或LexA的結合位點設置于lacZ基因的上游。蛋白的相互作用以激活域與DNA結合域共同激活lacZ基因的轉錄進行檢測（Fields和Song，1989）?；蚣せ羁赏ㄟ^β半乳糖苷酶的產(chǎn)物使克隆在X－Gal平板上顯藍色來檢測。

使用雙雜交系統(tǒng)的難點在于消除假陽性。假陽性克隆來自于誘餌和陷阱蛋白的非專一的結合所導致的報告基因的轉錄的激活。例如，任何誘餌蛋白的自我激活轉錄就會導致假陽性。但自我激活轉錄可以通過用構建的誘餌克隆篩選報告基因的激活而消除。某些報告系統(tǒng)具有很高的假陽性背景（James等，1996）。為克服這些問題，新版的雙雜交系統(tǒng)使用多個表型的報告基因檢測基因的激活。在一個新的版本中，使用了HIS3、ADE2和lacZ為報告基因（James等，1996）。此外，此系統(tǒng)利用不同的Gal4啟動子，使HIS3處于Gal1的啟動子的控制之下，ADE2處于Gal2啟動子控制，LacZ處于Gal7啟動子控制。蛋白質相互作用以酵母在缺乏組氨酸的平板上的生長來鑒定。假陽性通過用克隆顏色篩選來評定腺嘌呤和lacZ標記來消除（James等，1996）。使用受不同啟動子控制的多報告基因可以提供高靈敏度和低假陽性背景值（Brent和Finley，1997;James等，1996）。雙雜交法最流行的用途就是從與LexA和Gal4的融合誘餌作用的激活域文庫中分離新蛋白。激活域文庫可由從插在激活域C末端的cDNA或基因組DNA片段組成。新的相互作用蛋白通過將激活域文庫引入含有融合到DNA結合域的感興147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 趣的蛋白的酵母株中并以上述的報告系統(tǒng)分離克隆來進行鑒定（Bai和Elledge，1997）。許多實驗室使用了此方法并鑒定了很多新的相互作用蛋白（Schwikowski等，2000）。

10.3.1 酵母中基因組范圍的蛋白質相互作用分析

高通量酵母雙雜交篩選

釀酒酵母全基因組序列的公布推動了在基因組范圍用雙雜交方法和從所有酵母ORF擴增克隆的基因來繪制蛋白質相互作用譜（Hudson等，1997;Uetz等，2000）。已大規(guī)模實施了兩類雙雜交實驗。用芯片法，融合到Gal4的DNA結合域或激活域的每個ORF被排列到芯片上，與其作用的反向融合分別以芯片進行篩選以鑒定相互作用克隆。而復雜的文庫篩選方法用一套克隆的ORF創(chuàng)建融合文庫，每個ORF融合與文庫雜交來鑒定相互作用克隆。

在第一個大規(guī)模芯片實驗中，一套大約6000個基因分別被克隆融合到GAL4激活域（Hudson等，1997）并轉化入雙雜交報告株。每個菌株分別接入384孔板的一個孔內，16個這種板裝有大約6000株克隆并組成了一個活的蛋白矩陣（Uetz等，2000）。一套192個酵母基因分別被融合到Gal4 DNA結合域并轉化到相反雜交型的報告株，以此作為激活域克隆系列。192個誘餌株的每一個與約6000個陷阱株分別在芯片上進行交配以系統(tǒng)地篩選蛋白質相互作用（Uetz等，2000）（圖10.5）。發(fā)現(xiàn)192個DNA結合域融合中有87個參與了蛋白質相互作用，一共有281個作用對。

最早實施的復雜文庫篩選將6000個克隆的Gal4激活域融合分別地收集入單個的池（pool）（Uetz等，2000）。然后6000個酵母基因分別融合入Gal4 DNA 結合域。成組的激活域融合與6000個Gal4 DNA 結合蛋白融合分別進行雜交（圖10.5）。可能的相互作用以報告基因鑒定，12個產(chǎn)生相互作用的克隆測定了序列以對激活域融合進行鑒定。在692個蛋白質相互作用對中共發(fā)現(xiàn)817個ORF參與（Uetz等，2000）。有趣的是，192個蛋白中的45％在蛋白芯片實驗中發(fā)生相互作用，而5345個可能的ORF中只有8％在用6000個陷阱高通量篩選時發(fā)現(xiàn)了相互作用。因此，盡管芯片篩選為低通量，它可產(chǎn)生相對更多的相互作用子。這可能是由于在高通量實驗當中，把所有的激活域克隆都用于篩選相互作用時，其中也包括了生長遲緩和交配能力降低的細胞（Uetz等，2000）。結果表明，兩176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 種方法篩選鑒定得到的相互作用系列有所不同，具有方法上的差異性。Ito和他的同事（2001）提出一個高通量復雜文庫篩選方法。構建了酵母6000個ORF的DNA結合域融合和激活域融合（圖10.6）。DNA結合域和激活域融合轉化到相反交配型的酵母受體株并組成62套每套96個ORF的融合。為測定可能的相互作用，在DNA激活域和結合域間實施了3844個（62×62）交配反應。交配后，包含相互作用的蛋白的二倍體以多個報告基因進行篩選。PCR擴增DNA結合域與激活域融合的插入片段，測序后鑒定相互作用的克隆。結果總共發(fā)現(xiàn)了3268個酵母蛋白參與了4549對相互作用（Ito等，2001）。當作者只考慮那些至少出現(xiàn)三次的相互作用時，構成一個由797個蛋白和806對相互作用對的核心群組（Ito等，2001）。

對上述的高通量文庫篩選法鑒定的相互作用的比較顯示驚人的少的重復。只有大約20％的相互作用是相同的（Ito等，2001；Uetz等，2000）。缺乏重復說明文庫的篩選實驗方法還不成熟。所選擇的克隆組不能發(fā)現(xiàn)高比例的潛在的相互作用，這并不奇怪。要篩選所有可能的ORF間的相互作用需要測試6000×6000=36×107對組合。即使我們已知很多蛋白具有多個相互作用，實際的相互作用的數(shù)目可能還要遠大于此。

計算機輔助的雙雜交篩選

僅通過鑒定盤繞的蛋白線團介導的相互作用的計算機輔助篩選進一步證明酵母基因組雙雜交篩選低估了總的相互作用（Newman等，2000）。盤繞的線團是一種由兩個或更多α螺旋相互盤繞組成的蛋白質相互作用（Cohen和Parry，1994）。可以形成無規(guī)線團的序列以簡單的重復模式為特征，由此設計了可以通過蛋白序列的一級結構鑒定無規(guī)線團的電腦程序（Berger等，1995；Wolf等，1997）。以這些程序在酵母ORF中鑒定無規(guī)線團，發(fā)現(xiàn)基因組編碼的大約300個蛋白為兩條鏈的無規(guī)線團，另250個蛋白有三條鏈的無規(guī)線團（Newman等，2000）。也即大約每11個酵母蛋白中有一個就有無規(guī)線團。Newman和他同事（2000）用雙雜交系統(tǒng)檢查了162個預測的無規(guī)線團區(qū)之間的相互作用?？偣?6×16＝26244對測試鑒定出來自77個不同蛋白的213對相互作用，其中100對為無規(guī)線團。

奇怪的是用無規(guī)線團方法鑒定的相互作用無一可用前述的雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)。此結果說明雙雜交篩選存在很高的假陽性。這個結果與前述的結果相似，當用激活域205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 文庫克隆進行配對雙雜交篩選實驗時發(fā)現(xiàn)相互作用的頻率很高（Uetz等，2000）。除配對篩選外，由于只有酵母蛋白的無規(guī)線團區(qū)被用于篩選，無規(guī)線團實驗可能也鑒定出更多的相互作用子。雙雜交實驗使用全長蛋白可能掩蓋一些只有用蛋白質片段才能發(fā)現(xiàn)的相互作用子。例如，全長蛋白可能包含被遮蔽的相互作用位點，只有當發(fā)生構象變化時才可以暴露出來（Hu，2000）?？傊?，實驗表明只用雙雜交測定的酵母相互作用子是被低估了的。而計算機輔助篩選，如無規(guī)線團篩選可能提供文庫篩選得不到的信息。

酵母蛋白質相互作用網(wǎng)絡

將雙雜交方法在基因組規(guī)模測定的酵母蛋白質相互作用的分析結果與生物化學方法測定的相互作用結合起來可顯示出整個蛋白組的更復雜的相互作用譜。Schwikowki及其同事（2000）分析了2709個已發(fā)表且可在公共數(shù)據(jù)庫和大規(guī)模雙雜交實驗中獲得的相互作用，其中包括2039個酵母蛋白。他們發(fā)現(xiàn)了一個包括1548個蛋白構成的2358對相互作用的大網(wǎng)絡及幾個小網(wǎng)絡（Schwikowki等，2000）。

相互作用蛋白網(wǎng)絡有很多有趣的特性。首先，相似功能的蛋白在網(wǎng)絡內趨于聚為簇。例如，89％的已注釋為染色質相關的蛋白都定位在染色質相關的蛋白簇內（Schwikowki等，2000）?？傆?3％的相互作用發(fā)生在一般常用功能蛋白之間。其次，一般亞細胞定位的蛋白在網(wǎng)絡內趨于聚為簇（Schwikowki等，2000）。第三，相互作用網(wǎng)絡揭示一些相互作用與細胞過程關聯(lián)，這揭示了細胞組件之間的互作。例如，細胞周期控制蛋白展示了大部分的細胞過程之間的相互連接。測定了細胞周期控制簇的蛋白、有絲分裂相關蛋白、蛋白降解、交配反應、DNA合成、轉錄、信號轉導及其它過程相關的蛋白的相互作用（Schwikowki等，2000）。這些相互聯(lián)系反應了細胞周期控制蛋白在調節(jié)細胞其它過程中的作用。最后，網(wǎng)絡還提供了一些未知功能的蛋白質的信息。網(wǎng)絡方法進行功能預測，如鑒定未知蛋白的相互作用伙伴的最一般功能、假定感興趣的蛋白具有相同或相關的功能（Mayer和Hieter，2000;Schwikowki等，2000）。確定相互作用伙伴的蛋白功能的限制性因素是缺少基因組內蛋白功能的知識。例如，Schwikowki及其同事（2000）發(fā)現(xiàn)的大網(wǎng)絡中未知功能的554個蛋白中只有69個有2或多個已知功能的伙伴。當對某機體的蛋白質功能的認識提高后，可以從相互作用網(wǎng)絡分析得到的蛋白功能將會隨之增加。234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 蛋白質網(wǎng)絡的組織

酵母蛋白質相互作用的大網(wǎng)絡的組織已有詳細的研究(Jeong等,2001;Maslov and Sneppen,2002)。已分析的網(wǎng)絡由大于1500個蛋白組成并由大于2000個相互作用聯(lián)結在一起。這些研究的一個目的是測定網(wǎng)絡的結構是否可由一致指數(shù)拓撲學(Uniform exponential topology)(即所有蛋白都與其它蛋白具有相同數(shù)目的連接)或異質無標度拓撲學(蛋白質連接顯示出極大的差異)來描述。相互作用的可能性的分析表明了一個高度異源的無極網(wǎng)絡，少數(shù)高度連接的蛋白在介導大量的低連接蛋白間的相互作用中發(fā)揮重要的作用（Jeong等，2001）。這種網(wǎng)絡結構正如其它復雜的系統(tǒng)（如互聯(lián)網(wǎng)和代謝網(wǎng)絡）一樣，都遵循能量分布規(guī)律（Barabasi和Albert，1999；Jeong等，2000）。蛋白網(wǎng)絡的另一個特性是高度連接的蛋白主要都與低連接性的蛋白連接在一起（Maslov和Sneppen，2002）。這種組織方式降低了細胞不同功能模塊間的相互對話的可能性，而通過定位有害突變的效應增加了網(wǎng)絡的穩(wěn)固性（Maslov和Sneppen，2002）。

網(wǎng)絡的結構表明它們可以允許隨機的突變，因為大部分的傷害可以發(fā)生在與其它蛋白沒有太多聯(lián)系的蛋白上（Jeong等，2001）。然而，位于節(jié)點的高連接蛋白一旦突變這個網(wǎng)絡將異常脆弱。此想法通過用根據(jù)所有相互作用蛋白所具有的連接數(shù)確定的級別，并將它們的級別與從基因組刪除相應基因的表型效應進行關聯(lián)（Jeong等，2001）。從系統(tǒng)的酵母基因刪除實驗獲得的大規(guī)模數(shù)據(jù)表明了它們的相關性（Ross-Macdonald 等，1999；Winzeler等，1999）。實驗表明蛋白質去除對細胞的致死的可能性是與該蛋白具有的連接數(shù)相關的（Jeong等，2001）。例如，93％的酵母蛋白是具有5個或更少相互作用的蛋白質，我們有它們的基因去除數(shù)據(jù)，只有21％的蛋白是必需的。相反，只有0.7%的酵母蛋白具有15個以上的連接，但其中62％的蛋白的去除對細胞是致死的（Jeong等，2001）。因此，在網(wǎng)絡結構中高連接的蛋白比連接較少的蛋白更為關鍵。10.3.2 對其他生物基因組范圍的酵母雙雜交分析

病毒系統(tǒng)中蛋白質－蛋白質相互作用的雙雜交分析

已經(jīng)利用病毒、細菌和動物基因組的ORFs（開放閱讀框）對雙雜交實驗進行了全面、廣泛的演示（Bartel et al.，1996；McCraith et al.，2000；Rain et al.，2001；Walhout et al.，2000）。在病毒系統(tǒng)中，T7噬菌體和牛痘病毒的基因組已經(jīng)被檢測過了。使用病毒基因組263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 的好處是可以系統(tǒng)的檢測所有可能的兩兩相互作用。例如，一組266個來自牛痘病毒的潛在ORFs與Gal4的激活區(qū)域及DNA結合區(qū)域分別融合后進行了克?。∕cCraith et al.，2000）。利用每個與DNA結合區(qū)域的相連的融合子與由266個與激活區(qū)域相連的融合子芯片進行配對，來檢驗蛋白間70756種兩兩結合的所有可能?？偣仓粰z測到37個蛋白質－蛋白質的相互作用，其中有28個是以前所未知的（McCraith et al.，2000）。正如McCraith及他的同事所指出的那樣，這些作用可能只是病毒感染過程中的一小部分。這種低數(shù)量的相互作用的一個理由可能是大量的牛痘蛋白都是膜相關蛋白。這些蛋白質都是以全長的ORFs表達的，因此不可能到達酵母的核中來參與雙雜交作用（McCraith et al.，2000）。全長ORFs的表達可能也屏蔽了某些特定的作用，導致了高幾率的假陰性反應（Hu，2000）。從這些實驗中獲得的重要信息是即使一個膜上所有的蛋白質－蛋白質兩兩相互結合已經(jīng)飽和，僅使用雙雜交篩選很難把其中很大比例的相互作用檢測出來。細菌中蛋白質－蛋白質相互作用的雙雜交分析

幽門螺桿菌的基因組的大小為2Mb，它編碼了1742個ORFs。用這些ORFs進行雙雜交獲得的文庫和上面所說的酵母實驗不同，在那個實驗中所使用的GAL4激活區(qū)域文庫包含超過1千萬個隨機的基因組片斷（Rain et al.,2001）。因此，降低了全長的ORFs屏蔽蛋白質－蛋白質作用的潛在問題?？偣灿昧?61個ORFs來和GAL4的DNA結合區(qū)域進行融合來作為餌。這些ORFs的選擇都避開那些無法進入酵母核內的疏水性蛋白（Rain et al.,2001）。261個含DNA結合區(qū)域的融合子激活結構域的文庫進行配對來檢測蛋白間的相互作用?？偣茶b定了1200個相互作用，將近是基因組的50％。這個方法似乎可以非常有效的防止ORF配對篩選中出現(xiàn)的問題。另外，從激活結構域文庫中檢測到的反應子中的片斷序列的數(shù)據(jù)積累起來了。片斷的配對使得我們可以定位蛋白質的作用區(qū)域（Rain et al.,2001）。

線蟲中蛋白質－蛋白質相互作用的雙雜交分析

相對于病毒和細菌系統(tǒng)，線蟲的基因組比較大，大概編碼了20000個預測的ORFs。這些所有的ORFs的兩兩配對需要4×108次匹配，這在目前的技術條件下是不可行的。然而，已做過一個直接的檢測，使用了27個已知的參與vulval發(fā)展過程的蛋白質與GAL4的DNA結合域融合，線蟲的cDNA文庫與GAL4 的292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 激活域融合（Walhout et al.,2000）。這個雙雜交鑒定了包含124個不同蛋白的148個相互作用。為了測定已鑒定的相互作用的生物學關系，作者從其他生物中搜尋同源蛋白中的保守相互作用。這樣的保守相互作用用interlogs標記，這代表了一種增加相互作用有效性和可信度的新方法。另外，Walhout和他的同事還用了一個系統(tǒng)的聚類分析來搜尋形成閉合環(huán)的網(wǎng)狀的相互作用，說明在這個環(huán)中的ORFs在生物學重要相互作用中有更高的相似性（Walhout et al.,2000）。

從來自幾個生物的大量的數(shù)據(jù)可以明顯的看出雙雜交是一種高效自動的、也是高通量的在基因組范圍內檢測蛋白質－蛋白質相互作用的有效的方法。然而，高比例的假陽性和假陰性也始終難以避免。事實上，以功能無關的蛋白和來自細胞不同部分的蛋白的關聯(lián)頻率來評估，估計目前所有的高通量的相互作用預測方法的預測結果都有超過一半是假的（von Mering et al.,2002）。因此，其他鑒定蛋白質－蛋白質相互作用的方法都要求同時做雙雜交數(shù)據(jù)的有效性分析和新的相互作用的鑒定。

10.4 使用噬菌體展示來檢測蛋白質－配體的相互作用 10.4.1 在M13纖維狀噬菌體中展示蛋白

噬菌體展示已成為一種強大的蛋白質－蛋白質相互作用和蛋白質－配體相互作用研究的工具（reviewed in Smith and Petrenko,1997）。這個方法最基本的操作是把肽鏈或蛋白質融合到纖維狀噬菌體的外殼蛋白上。肽鏈和蛋白質一般都是融合到噬菌體的III或VIII蛋白的N末端的（Smith,1985）。III蛋白是一個低拷貝的外殼蛋白（大約3～5個拷貝），它位于噬菌體的頂部，負責噬菌體感染細菌的過程中使噬菌體吸附到F菌毛上（Riechmann and Holliger,1997）。VIII蛋白是一種主要外殼蛋白，每個噬菌體微粒大概有2700個拷貝(Rasched and Oberer,1986)。因為基因編碼的融合蛋白是包裝在同一個噬菌體微粒上的，所以各種表現(xiàn)型（也就是展示蛋白和這個展示蛋白的基因序列的配體結合特征）之間具有直接的聯(lián)系。這就允許隨機氨基酸序列的多肽的大文庫能夠快速篩選特定的配體結合特征（Fig.10.7）（Smith,1985）。另外，也可以從大量展示蛋白的突變體中篩選配體結合特征發(fā)生改變的突變體（Katz,1997）。

噬菌體展示的一個重要應用是繪制蛋白質－蛋白質相互作用的位點。例如，隨機的多肽文庫用來鑒定單克隆抗體的抗原決定簇和多克隆抗體（Felici et 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 al.,1993;Folgori et al.,1994;Yao et al.,1995）。根據(jù)他們結合抗體的能力，從隨機序列的噬菌體展示多肽中進行選擇，選擇的多肽通過DNA測序進行鑒定。經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)一些序列和一些感興趣的抗原區(qū)域結合。這種方法的一個變種是利用DNAseI對感興趣的蛋白的基因隨機酶切后構建多肽的文庫，然后用霰彈法(shotgun)把這些小片段基因克隆到噬菌體展示載體上（Petersen et al.,1995）。這個方法的優(yōu)點是如果結合的多肽是已知的，它們就會結合到我們感興趣的蛋白區(qū)域。這個方法已經(jīng)用來繪制除了抗體－抗原以外其他的一些相互作用了。例如，用來定位β內酰胺酶抑制蛋白的結合決定區(qū)，這個區(qū)域對結合到β內酰胺酶上非常重要（Rudgers and Palzkill,2001）。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在某些時候這個方法可以以構象特征鑒定結合域（Williamson et al.,1998）。

用Shotgun克隆打斷的基因到噬菌體展示載體中已經(jīng)擴展到了細菌的全基因組（Jacobsson and Frykberg,1995,1996;Jacobsson et al.,1997）。在檢測實驗中，Staphylococcus aureus的全基因組DNA用超聲波破碎后克隆到了基因III和基因VIII的噬菌體展示載體上。這個方法的潛力在實驗中得到了驗證，通過固定的IgG蛋白的結合富集噬菌體從Staphylococcus aureus基因組文庫中選擇編碼蛋白A的基因片段（Jacobsson and Frykberg,1995,1996）。這個系統(tǒng)也已經(jīng)被用來從Staphylococcus epidermidis中克隆纖維蛋白結合蛋白（Nilsson et al.,1998），還有來自結合α巨球蛋白、血清蛋白和IgG的C群鏈球菌的表面蛋白（Jacobsson et al.,1997）。這個方法的一個局限性是DNA的隨機片斷必須在信號序列和基因III編碼的蛋白（g3p）或基因VIII編碼的蛋白（g8p）間克隆。因此，只有1/18的克隆將含有一個有正確方向的融合子及同時含有信號序列和噬菌體外殼蛋白。標準的噬菌體展示系統(tǒng)也不合適用來構建真核生物cDNA文庫，因為在cDNA中基因編碼末端的終止子的存在排除了它與外殼蛋白的結合的可能。這個問題利用在裂解噬菌體的外殼蛋白上展示蛋白或片段就可以避免。10.4.2 T7噬菌體的蛋白展示

使用裂解噬菌體載體，如λ（Maruyama et al.,1994;Santini et al.,1998），T4（Ren et al.,1996），T7（Rosenberg et al.,1996）的噬菌體展示系統(tǒng)的發(fā)展已經(jīng)提供了一種不依賴E.coli分泌機制的替代法。所有這些系統(tǒng)的額外的優(yōu)點是克隆的蛋白是融合在噬菌體外殼蛋白的C端的，這樣方便了基因組和cDNA文庫的350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 構建。在T7 上展示cDNA文庫最近已經(jīng)被用來鑒定信號蛋白在EFG－受體信號通路中的作用了（Zozulya et al.,1999）。另外，利用cDNA文庫，T7系統(tǒng)已經(jīng)被用來鑒定蛋白質和小分子間的相互作用。這些研究說明噬菌體展示可以用作高通量的蛋白質－蛋白質相互作用的研究。

基因組或cDNA噬菌體展示文庫的一個優(yōu)勢是同一個文庫可以用來分離很多不同配體的結合蛋白。另外，用來掃描的配體并不局限于其它蛋白，任何可以被固定的分子都可能作為一個測試的目標。這使得文庫能用來搜索那些可以結合DNA、RNA、蛋白質、糖、氨基酸或其他小分子物質的蛋白質。多肽噬菌體展示文庫甚至已經(jīng)被用來探索活的動物的脈管系統(tǒng)（Pasqualini and Ruoslahti,1996）。這就是把噬菌體庫注射到小鼠的循環(huán)系統(tǒng)中，等一段時間后收集感興趣的器官和組織，利用勻漿混合物感染E.coli來擴增結合在這些組織上的噬菌體（Pasqualini and Ruoslahti,1996）。這個方法已經(jīng)被用來鑒定對不同組織和腫瘤的脈管系統(tǒng)特異性的多肽（Arap et al.,2002;Pasqualini and Ruoslahti,1996;Rajotte et al.,1998）。結果表明大部分組織的脈管系統(tǒng)表現(xiàn)出組織特有的標記。利用來自病原微生物的基因組或cDNA文庫來做這個體內噬菌體展示實驗，以檢查由微生物的ORFs介導的目標組織將是非常有意思的。

鑒定很多種配體的結合蛋白的能力將使噬菌體展示成為蛋白質組學的一個有用的工具。基因組測序已經(jīng)鑒定很多沒有功能的開放閱讀框。基因組噬菌體展示文庫可以被用來利用結合功能對ORFs進行分類。例如，基因組DNA可以被固定到小珠上，就可以從基因組噬菌體展示文庫中篩選出一組DNA結合蛋白。使用不同類型的配體就可能根據(jù)結合能力把大量的ORFs進行分門別類。10.4.3 酵母雙雜交和噬菌體展示相結合

酵母雙雜交和噬菌體展示系統(tǒng)都共同具有的一個缺點是都產(chǎn)生高比例的假陽性數(shù)據(jù)。因為這兩個技術相當不同，即酵母雙雜交系統(tǒng)是一個體內的分析，而噬菌體展示是體外的，因此結合這兩種方法可能會產(chǎn)生更有用的生物學數(shù)據(jù)。該途徑的強大能力最近已經(jīng)被含有SH3結構域的酵母蛋白的研究很好的闡明了（Tone et al.,2003）。SH3結構域是蛋白質識別分子，它介導很多參與特殊生物學功能的蛋白質－蛋白質的相互作用（Pawson and Scott,1997）。為了鑒定和酵母中發(fā)現(xiàn)的SH3結構域發(fā)生作用的蛋白質，總共在E.coli中表達了24個和谷胱甘肽硫轉移379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 407 酶融合并以可溶狀態(tài)出現(xiàn)的SH3結構域（Tone et al.,2002）。這些蛋白被用作噬菌體展示的目標來從隨機氨基酸序列的九肽文庫中選擇SH3結構域的配體。在多方面富集多肽配體之后，對陽性克隆進行測序，分析了20個不同的SH3結構域的結合配體的一致序列（Tone et al.,2002）。這些相同的序列就被用來搜尋酵母蛋白組中潛在的天然SH3配體。發(fā)現(xiàn)含有天然SH3 結合位點的蛋白質形成了一個網(wǎng)狀的相互作用。為了證明這個發(fā)現(xiàn)，以18個不同的SH3結構域和幾個富含脯氨酸的目標為餌進行一系列的雙雜交后建立了第二個蛋白質－蛋白質作用網(wǎng)絡（Tone et al.,2002）。最后，利用噬菌體展示和酵母雙雜交相互作用網(wǎng)絡中的交叉點找到了它們的共有組分。總共有59個噬菌體展示網(wǎng)絡中的相互作用在酵母雙雜交相互作用網(wǎng)也得到印證（Tone et al.,2002）。其中的一些作用已經(jīng)用免疫共沉淀在體內進行了證明。利用來自多種試驗方法得到的多組試驗數(shù)據(jù)是一種評估一種特定辦法的產(chǎn)生偏差的有用的辦法。10.5 在蛋白片段互補實驗中檢驗相互作用 10.5.1 簡介

蛋白片段互補實驗是以酶的重裝配策略為基礎的：蛋白質－蛋白質的相互作用能促進有效的再折疊和酶片段互補來恢復成為活性酶。這個方法起初是用復原的泛素作為蛋白質－蛋白質相互作用傳感器。泛素是一種由76個氨基酸組成的蛋白質，獨立或與其它蛋白共價連接存在于細胞中（Johnsson and Varshavsky,1994）。泛素與其他蛋白的融合蛋白會很快的被泛素特異性蛋白酶降解，這個酶識別泛素的折疊構象。如果泛素和一個報告蛋白一起融合表達，那么降解反應后就能在體內釋放報告子（Johnsson and Varshavsky,1994）。然而，泛素的C末端片段與報告子的融合蛋白和泛素的N末端片段在同一個細胞中分別表達，這種降解將不會發(fā)生。如果兩個相互作用的蛋白質分別與泛素的C端片段和N端片段融合，并在同一細胞表達，則完整的泛素將會被復原，降解效應將發(fā)生（Fig.10.8）。因此蛋白質的相互作用可以在體內把他們分別融合到泛素的C端片段和N端片段并測定報告蛋白的釋放來檢測。就像下面討論的那樣，這個方法已經(jīng)被擴展到了其他系統(tǒng)，現(xiàn)在已經(jīng)成為酵母雙雜交和噬菌體展示的可行的替代方法在體內檢測蛋白質－蛋白質的相互作用。

10.5.2 利用二氫葉酸還原酶的蛋白片段的互補 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 二氫葉酸還原酶參與了一碳化合物的代謝，是原核細胞和真核細胞生存所必須的。這個酶催化從二氫葉酸到四氫葉酸還原反應，這個過程是絲氨酸、蛋氨酸、嘌呤、胸苷酸生物合成所必須的。老鼠的二氫葉酸還原酶（mDHFR）是一個較小的（21KD）單體酶，它和E.coli中的酶同源性很高（29％的序列一致性）（Pelletier et al.,1998）。DHFR的三位結構說明它由F[1]、F[2]、F[3]三個結構片段組成（Gegg et al.,1997）。

E.coli的DHFR被抗生素甲氧芐氨嘧啶選擇性抑止。mDHFR和甲氧芐氨嘧啶的親和系數(shù)要比細菌的DHFR小12000倍。因此表達mDHFR的E.coli能在存在甲氧芐氨嘧啶時生長。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mDHFR的F[1,2]、F[3]三個結構域與寡聚亮氨酸拉鏈融合后分別表達，在體內的重組導致了甲氧芐氨嘧啶抗性的E.coli細胞的產(chǎn)生（Pelletier et al.,1998）。該重組是由于亮氨酸拉鏈序列的相互作用拉近了mDHFR的F[1,2]、F[3]的片段使它們能夠折疊成單個有功能的酶。潛在蛋白質－蛋白質的相互作用可以用下述方法來檢測：把一個蛋白與F[1,2]域融合并讓該蛋白的已知結合伙伴與F[3]融合，然后測試包含融合結構的E.coli細胞的甲氧芐氨嘧啶抗性。這個系統(tǒng)與上面所描述的泛素系統(tǒng)比較類似。

mDHFR蛋白片段互補實驗的使用已經(jīng)擴展到了哺乳動物細胞中。哺乳動物細胞培養(yǎng)中的mDHFR活性的恢復用缺少DHFR的細胞在缺失核苷酸中的生長來檢測（Remy and Michnick,1999）。這些細胞的生長必須要有一個有活性的mDHFR酶，因為DHFR的活性是合成嘌呤和嘧啶所必須的（Remy and Michnick,1999）。第二種在細胞培養(yǎng)中檢測mDHFR重組的方法是以熒光實驗為基礎的，檢測在體內熒光標記的甲氨蝶呤（fMTX）結合到重組的mDHFR上。這個實驗的基礎是當mDHFR在細胞內發(fā)生重組，它就會以高親和力與fMTX結合生成1：1的復合物。結合了的fMTX會停留在細胞中，未結合的則排出細胞外。因此重組的mDHFR存在與否可以利用熒光顯微鏡、FACS或光譜進行檢測（Remy and Michnick,1999）。

mDHFR蛋白互補實驗已經(jīng)被用來繪制原核生物翻譯起始的信號傳導網(wǎng)絡（Remy and Michnick,2001）?？偣卜治隽?5對全長的蛋白質，利用細胞在缺少核苷酸時存活的選擇性鑒定了14個相互作用。另外，利用fMTX試劑結合熒光顯微鏡來定位蛋白復合物在細胞中的位置（Remy and Michnick,2001）。mDHFR437 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460 461 462 463 464 465 蛋白互補系統(tǒng)相對于酵母雙雜交系統(tǒng)在檢測蛋白質－蛋白質相互作用中有潛在的優(yōu)勢。例如，mDHFR系統(tǒng)可以在E.coli或哺乳動物細胞中使用（Pelletier et al.,1998;Remy and Michnick,1999）。當試驗哺乳動物蛋白相互作用時，可能使用陰性系統(tǒng)更為有利。另外利用MTX試劑結合熒光顯微鏡在細胞中定位相互作用的能力提供了酵母雙雜交系統(tǒng)所無法提供的重要信息。因此，這種技術可能會在未來的蛋白組學研究中有很廣泛的應用。

10.5.3 用β－半乳糖苷酶互補來檢測蛋白質的相互作用

β－半乳糖苷酶廣泛的被用作基因表達的報告子，因為它降解產(chǎn)色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）來產(chǎn)生藍色產(chǎn)物的能力。以經(jīng)典的內部順反子互補的細菌基因表型為基礎，發(fā)展出了蛋白質－蛋白質相互作用實驗（Mohler and Blau,1996）。在E.coli中去掉lacZ的N端或C端會產(chǎn)生一個沒有活性的酶，但是缺少不同末端的無活性酶共表達后互補。利用把缺失片段裝配到一個穩(wěn)定的八聚蛋白中產(chǎn)生互補，這個蛋白含有野生型所有的必須的結構域（Mohler and Blau,1996）。參與互補的存在于突變體中的N端和C端結構域就是我們所知的а和ω區(qū)域。相互作用的實驗是基于這樣一個基礎上的，即當缺少а結構域（△а）和ω結構域（△ω）的β-半乳糖苷酶共表達時互補產(chǎn)生有活性酶的效率是很高的（Mohler and Blau,1996）。當△а和△ω的β-半乳糖苷酶突變體分別和相互作用的蛋白質融合時，有利于△а和△ω片段的靠近，這樣就能產(chǎn)生高效的互補作用。因此，潛在的蛋白質－蛋白質相互作用可以利用把感興趣的蛋白質分別融合到△а和△ω的β-半乳糖苷酶突變體上，然后檢測酶利用X-Gal的活性（Mohler and Blau,1996;Rossi et al.,2000）。

β－半乳糖苷酶互補作用實驗已經(jīng)被應用到了哺乳動物細胞（Rossi et al.,1997）。熒光標記的β－半乳糖苷酶的底物使得能夠用熒光顯微鏡和FACS來分析表達感興趣的融合蛋白的哺乳動物細胞。因此，類似于mDHFR系統(tǒng)，β-半乳糖苷酶互補實驗可能會發(fā)展成為在基因組范圍內研究哺乳動物細胞中蛋白質－蛋白質相互作用的有用的工具。

10.6利用質譜儀研究蛋白質－蛋白相互作用的圖譜 10.6.1概論

蛋白質的快速鑒定可以通過直接搜索蛋白質和核酸數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)來獲得，466 467 468 469 470 471 472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 493 494 這些數(shù)據(jù)庫是由質譜儀所產(chǎn)生的多肽質量數(shù)據(jù)構成的。鑒定蛋白復合物的組成是質譜在蛋白－蛋白相互作用圖譜中最普遍的應用。這些實驗可以通過應用親和方法來分離完整的蛋白復合體來實現(xiàn)（圖.10.9）。而這通常需要了解蛋白質復合物中至少一個蛋白的特性。這個蛋白可以通過親和處理來標記，比如谷胱甘肽S－轉移酶、多聚組氨酸重復或者抗體的抗原決定簇如Flag 標記。標記蛋白可以在細胞中過量表達，在非變性條件下進行親和純化過程中與標記蛋白相互作用的蛋白也一同被純化。復合物進行洗提，蛋白組分用SDS－PAGE分離，條帶從凝膠中切割下來并進行蛋白酶解，肽的精確的質量可由質譜儀來確定。搜索肽質量數(shù)據(jù)庫，進行比對可以鑒定復合物中的蛋白。這種常規(guī)的方法文獻中已有很多例子，包括研究核孔復合體、酵母Arp2/3復合體、TATA－結合蛋白關聯(lián)因子、酵母紡錘體復合物、剪切體組份以及結合到分子伴侶 GroEL的蛋白等。10.6.2 鑒定E.coli 的GroEL作用底物

分子伴侶 GroEL和它的輔因子GroES是E.coli生長所必須的。GroEL的作用是通過限制聚合作用來促進折疊。GroEL是一個由14個亞單位構成的有2個大空穴的圓柱形的同源低聚體，底物蛋白通過GroEL復合物疏水表面結合在圓柱體空穴中間。GroES隨后結合在圓柱體的頂點表面上使底物被捕獲在阻止聚合作用的空穴內。細胞中大概10％的新的翻譯的蛋白可以與GroEL相互作用，這一點是明確的，但是這些底物蛋白的身份知之甚少。

GroEL首選底物可通過脈沖－追蹤標記生長的E.coli細胞來鑒定的。在不同的追蹤時間，GroEL-底物復合物可以用 anti-GroEL 抗體免疫沉淀反應分離出。沉淀下來的蛋白可通過雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，通過胰酶對斑點進行消化，隨后用MALLDA－TOF質譜儀分析肽－質量指紋就可以實現(xiàn)對蛋白的鑒定。利用這種方法，總共鑒定出了52個不同的GroEL的底物蛋白。分析這些蛋白與GroEL的相互作用為基礎的共同結構模塊。發(fā)現(xiàn)GroEL底物比其它E.coli蛋白多具有幾個αβ域。這些試驗說明質譜方法可以來確定蛋白－蛋白的相互作用。10.6.3啤酒酵母蛋白復合物的鑒定

質譜儀最近用來系統(tǒng)分析酵母中蛋白－蛋白相互作用。這些研究與上述的雙雜交實驗類似，很重要的不同在于質譜儀是研究蛋白復合物，而雙雜交方法是來檢測兩者間的相互作用。在一個實驗中，TAP用來純化589個蛋白復合物。TAP495 496 497 498 499 500 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 511 512 513 514 515 516 517 518 519 520 521 522 523 方法利用兩個親和標記的結合來純化蛋白復合物。復合物在單向SDS－PAGE中分離，單個蛋白用MALDI－TOF質譜儀來鑒定。589個純化的TAP標記蛋白中，78％存在與之相結合的蛋白，表明這種方法可以有效純化復合物?？偣?45個純化復合物與酵母中98個已知的蛋白復合物是一致的，這證明了此方法的可靠性。另外242個純化復合物中鑒定出了134新的復合物。這些數(shù)據(jù)表明兩種不同的純化方法檢測到相同蛋白的可能性大概為70％。因此30% 的結果可能是有問題的。.酵母中的蛋白復合物第二個系統(tǒng)研究是在餌蛋白上應用單親和標記來純化感興趣的復合物。在這些實驗中，752種蛋白標記為餌，相關的復合物被純化。復合物中的蛋白在SDS－PAGE中分離，從凝膠中挖出，用胰蛋白酶消化，然后利用串聯(lián)質譜儀來鑒定。研究鑒定了1578個不同相互作用的蛋白，它們代表了25％的酵母蛋白質組。

一個重要的問題是數(shù)據(jù)的獲得是否是從高通量質譜儀實驗和利用雙雜交試驗相交合的數(shù)據(jù)中獲得的。研究利用TAP標記產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，只有7％是與雙雜交是重疊的。用兩種試驗來檢測相互作用的類型表明是互補的。雙雜交方法不適用于檢測蛋白的復合物，它僅鑒定二元的作用。然而雙雜交試驗對于鑒定兩者間的作用以及低親和力很有用。

10.7蛋白表達譜以及相互作用中的蛋白質芯片

蛋白質芯片分析是另外一個新出現(xiàn)的熱點，針對檢測蛋白表達及相互作用的高通量技術?？梢跃哂胁煌姆绞降牡鞍踪|芯片，如一套抗體可以排列于濾光器或者載玻片上，用來檢測蛋白表達的水平。另外一種方法包括來源于組織的蛋白直接放于玻璃載片、尼龍濾網(wǎng)或者微量滴定孔。這個方法可以用來定位蛋白－蛋白相互作用或者蛋白催化作用。

蛋白質芯片試驗的難點在于蛋白不如核酸那樣的均一。蛋白功能依賴于精確的脆弱的三維結構，這在試驗中很難保持。另外相互作用的強度和穩(wěn)定性不如核酸那樣標準。每個蛋白－蛋白相互反應是專一的可以呈現(xiàn)一個寬范圍的親和力。目前蛋白表達的分析幾乎完全依賴雙向電泳以及質譜儀。然而蛋白試驗的發(fā)展，需要另外有力方法以便在更廣的基因范圍內研究蛋白表達和蛋白－蛋白相互作用。524 525 526 527 528 529 530 531 532 533 534 535 536 537 538 539 540 541 542 543 544 545 546 547 548 549 550 551 552 10.7.1蛋白表達圖譜抗體試驗

蛋白組學的一個目標是檢測組織之內或者之間蛋白表達水平。長期以來抗體被用來檢測蛋白，如western雜交和ELISA等方法。然而檢測成千上萬的蛋白用這種方法就很麻煩。一個替代的方法是抗體的芯片，待測組織中每種蛋白的專一抗體被置于濾膜或者玻片上。蛋白表達測定首先通過在目的組織中獲得天然蛋白裂解物并將蛋白用熒光標記。蛋白混合物結合抗體芯片，目的組織中表達的蛋白在芯片上結合他們的同類抗體。將非特異的蛋白洗掉，通過測定結合蛋白熒光來檢測結合蛋白類型。這個方法本質上是高通量 ELISA試驗。這個試驗的優(yōu)點在于芯片結合之前不需要天然蛋白的分餾。另外可以實現(xiàn)應用自動化程序對多種樣品進行平行檢測。顯然這種方法的限制是需要對每一個蛋白專一抗體的研究。

對于大量的蛋白利用免疫處理動物并純化蛋白來獲得抗體可能會比較困難且費用昂貴。一個替代的方法是利用噬菌體展示庫分離專一的抗體?？贵w的噬菌體展示庫已經(jīng)廣泛的運用于篩選單克隆抗體而不需要傳統(tǒng)的雜交技術。從單個噬菌體展示庫中眾多蛋白中分離專一抗體的技術已可以自動化，因此在更廣的基因組范圍的項目中有很大的潛力來提供抗體。10.7.2 運用肽、蛋白質和小分子芯片進行功能分析

蛋白質芯片技術的目的之一是將基因組翻譯的所有蛋白排成芯片用于功能研究。對于蛋白質功能的全局分析，過去已經(jīng)通過文庫篩選方法有所研究了。對于cDNA表達文庫等文庫篩選，可以成批地對某一種期望的生物學特性進行檢測。例如，從λ噬菌體的噬菌斑中篩選出表達蛋白已經(jīng)被運用了很多年了（Young and Davis，1983）。在這些實驗中，一個cDNA文庫插入到一個λ噬菌體載體中，這樣編碼的蛋白以一個與E.coli β－半乳糖苷酶融合蛋白的形式表達出來。噬菌體文庫感染E.coli后，在瓊脂平板上形成λ噬菌斑。每一個λ噬菌斑表達一種不同的融合蛋白，然后運用這些蛋白質特異抗體探查出這些噬菌斑中特異蛋白的存在（Young and Davis，1983）。挑出確定的陽性噬菌斑，檢測插入片段的DNA序列從而確定相關的基因。通過這種方法，基于抗體－抗原的相互作用篩選并克隆基因成為可能。

蛋白質芯片比文庫方法可能會有更多的優(yōu)點。芯片方式提供了一種精確的，空間定向的格子，允許芯片上的所有蛋白質能夠并行的對比從而篩選出來。這種553 554 555 556 557 558 559 560 561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576 577 578 579 580 581 空間結構也能夠確定出芯片中的一個克隆，該克隆是根據(jù)芯片中其所在的位點測試出為陽性的。因此，這種方法確定蛋白質相互作用中的一個蛋白質比文庫篩選要省力。但是，蛋白質芯片也有一個缺點，即與文庫（～109）相比，所能排列和篩選的蛋白質較少（～104）。同樣，純化所要排列的成千上百個單個蛋白質種類也是一個技術上的挑戰(zhàn)。因此，可以有效測定的蛋白數(shù)目限制了蛋白質芯片的應用。

肽芯片

最早應用芯片形式的是肽芯片。例如，合成肽的大頭針式方法就是在一個96微孔板內平行合成肽。運用Fluoenylmethoxycarbonyl（Fmoc）標記氨基酸保護機制，肽在直徑為4mm的經(jīng)氨活化的聚乙烯大頭針上合成（Geysen et al，1984，1986）。每一個合成循環(huán)中，這些大頭針被浸入一種氨基酸溶液中。因為肽是在固體支持相上合成的，因此在循環(huán)之間未反應的多余氨基酸可以被完全洗脫下來，增加最后結果的純度。這種方法起初被用于檢測口蹄疫病毒VP1衣殼蛋白的抗原決定簇的結構圖譜。存在于有218個氨基酸的VP1序列中的所有208種可能的重復的六肽通過與抗體的相互作用被合成并制成芯片。該方法中檢測出一個免疫結構域，進而通過將單核苷酸依次替代肽所在的區(qū)域產(chǎn)生較好的圖譜。這是第一個使用高通量方法確定蛋白與蛋白之間的關系。

SPOT合成方法是另一種同時的、平行的在固相支持上合成肽的方法。這種方法運用Fmoc化學保護法，但使用在纖維素膜上的羥基作為合成的固相支持（Frank，1992）。當一小滴液體滲入多孔膜時，液體就會被吸收，形成一個圓點。通過使用一種包含合適反應物的低揮發(fā)的溶劑，那么在逐步添加活性氨基酸至固定在支持膜上的化學基團時每一個點就會形成一個開放的反應器（Frank，1992）。通過一個αN-Fmoc保護的氨基酸與纖維素膜上的羥基之間的酯化作用及隨后的Fmoc切除來為完成肽的組裝提供錨點（Frank and Overwin，1996）。Fmoc-β-丙氨酸是最常用的膜上的反應物。去保護之后，β－丙氨酸游離的氨基部分可以作為肽芯片合成的模板（Frank，1992；Gausepohl et al，1992）。這種方法已經(jīng)被廣泛應用于描繪抗體－抗原的相互作用，同時也用于蛋白-DNA，蛋白-金屬，其他蛋白-蛋白之間的相互關系（Reineke et al，2001）。582 583 584 585 586 587 588 589 590 591 592 593 594 595 596 597 598 599 600 601 602 603 604 605 606 607 608 609 610

SPOT合成法最多的應用是為確定線性B細胞抗原決定簇而制備肽芯片。如果抗原蛋白已知，那么包含整個序列的一系列重復的肽就可以很容易的合成并通過結合抗體進行測定（Reineke et al，1999a）。對于結合起關鍵作用的單個殘基可以通過肽的SPOT合成法及氨基酸替代而被確定。該方法曾用于檢測抗李斯特菌細胞溶解素（listeriolysin）產(chǎn)生的六個單克隆抗體（MAbs）的抗原決定簇結合位點，李斯特菌細胞溶解素是由病原菌Listeria monocytogenes產(chǎn)生的一種毒素（Darji et al，1996）。MAbs的結合位點通過SPOT合成法產(chǎn)生重復的肽而確定，這些肽可以覆蓋李斯特菌細胞溶解素分子的整個氨基酸序列。一共有166個肽，每個肽含12個氨基酸及一條含3個氨基酸的支鏈，在芯片中以點的形式合成（Darji et al，1996）。通過將一個MAb與固定化的肽孵育并用過氧化物酶連接的二抗檢測抗體的方法來檢測肽的結合。纖維素膜在洗脫掉結合抗體后可以重復使用數(shù)次。通過這種方法，六個MAb中的每一個含6～8個氨基酸的結合位點就可以被定位了（Darji et al，1996）。除此之外，有報道通過將抗體與每個MAb上已確定的結合位點相關的可溶的肽進行預培養(yǎng)的方法，可以阻斷MAbs與膜的結合。

SPOT合成法也用于為繪制抗原決定簇圖譜，建立組合的肽文庫。例如，可以通過組合文庫確定被鼠抗p24的HIV-1單克隆IgG2a抗體CB4－1識別的肽抗原決定簇（Kramer et al，1997）。對于這些實驗，需要合成一個由68590個肽的混合物組成的復雜組合肽文庫XXXX[B1,B2,B3,B3,X1,X2,X3]XXXX。這個庫由10個含有不同六肽核心的亞庫組成，六肽核心分別為[XXB1B2B3XX],[XB1XB2B3X],[XB1B2XB3X],[XB1XXB2B3],[XB1XB2XB3], [XB1B2XXB3],[B1XXXB2B3],[B1XXB2XB3],[B1XB2XXB3],[B1B2XXXB3]，這些核心對應于三個確定位點所有可能的距離模式(Kramer et al，1997）。根據(jù)與CB4－1的結合篩選纖維素結合位點篩選組合文庫，結果從68590個點上檢測到225個肽的混合物。將篩選出來的肽混合物去掉其隨機化的位點，確定了一條與p24有關的序列的肽段，同時還確定了三條完全不同的肽段(Kramer et al，1997）。肽結合的親和力及競爭力實驗顯示所有的肽可以結合到單克隆抗體的同一位點，但是親和力各有不同。另外，每一個肽段的替代分析清楚的顯示抗體識別的分子基礎對每一個確定的肽段是特異且唯一的（Kramer et al，1997）。這種替代分析611 612 613 614 615 616 617 618 619 620 621 622 623 624 625 626 627 628 629 630 631 632 633 634 635 636 637 638 639 也被用于確定supertope序列，該方法建立在氨基酸替代的基礎上，替代的氨基酸與p24單克隆抗體的結合位點相一致。例如，其中一條肽段的序列是GATPEDLNQKLAGN, 但是使用SPOT合成法進行系統(tǒng)的氨基酸替代得到的的supertope序列為XXXXX[DE]L[HKNR]XX[IL]XXX, X為任意氨基酸（Kramer et al，1997）。與supertope一致的序列與SWISSPROT蛋白質數(shù)據(jù)庫比對后，發(fā)現(xiàn)5517個配對的蛋白質。其中一些已確定的蛋白質純化后可與p24 單克隆抗體結合。這些實驗證實了P24MAb的多特異性，表明SPOT合成法也可以用于產(chǎn)生及尋找無偏的組合隨機序列文庫。

繪制非連續(xù)的抗原決定簇的結構圖更要困難，因為抗體結合到來自抗原蛋白的不同區(qū)域的肽的親和力較低。SPOT合成法的一個有趣的應用是繪制與IL－10結合的中性抗IL－10抗體即CB/RS/1結合位點的圖譜（Reineke et al，1999b）。IL－10序列上一段重復的肽段通過將一段15mer的肽段上的一個氨基酸替換掉而得到。肽芯片通過使用CB/RS/1抗體進行探測，而結合抗體可以通過使用鼠IgG過氧化物酶標記抗體而檢測到。發(fā)現(xiàn)CB/RS/1抗體與代表著蛋白質兩個不同區(qū)域的肽段結合，這兩個區(qū)域在一級結構中是分開的，而在高級結構中是連續(xù)的（Reineke et al，1999b）。那些結合在抗體上的肽段上的氨基酸殘基位點隨后被系統(tǒng)的一一替換，并通過點合成而排成芯片。對于與CB/RS/1抗體的結合很重要的肽段上的各個位點又可以通過檢測而確定。大量的替代可以增加抗體的結合。展示抗體結合能力的兩個區(qū)域位于同一條肽鏈，并且這條單個肽鏈與替代增加結合能力相適應。然后用半胱氨酸替換這條單個肽鏈上的氨基酸形成二硫鍵，二硫鍵可能通過降低肽鏈的空間構象而增加結合能力。這些多點合成實驗的最終結果是得到一個在IL-10與CB/RS/1抗體之間的非連續(xù)結合位點上的緊密結合的32氨基酸的虛擬肽段（Reineke et al，1999b）。這個研究也證明了SPOT合成法對于快速構建及測試肽芯片的巨大作用。

SPOT合成法還用于其他很多研究蛋白質與蛋白質的相互作用上。這些相互作用包括與信號傳導有關的蛋白質之間的作用，如PDZ結構域（Schultz等，1998）、SH3域（Cestra等，1999）和腫瘤壞死因子受體相關因子（TRAFs）（Pullen等，1999）。此外，該法被用于確定細菌伴侶蛋白SecB的底物專一性（Knoblauch等，1999）。此研究極其有趣，因為伴侶蛋白具有寬松的底物結合專一性，因此640 641 642 643 644 645 646 647 648 649 650 651 652 653 654 655 656 657 658 659 660 661 662 663 664 665 666 667 668 與大量的蛋白結合。SecB通過在翻譯中或翻譯后與新合成的前體蛋白聯(lián)系，協(xié)助前體蛋白穿過細菌細胞質膜，因而使這些前體蛋白保持一種可以轉移的狀態(tài)。但是SecB的底物特異性的決定因子還未確定（Knoblauch et al，1999）。為了解決這個問題，合成并篩選出與SecB結合的來自23種不同蛋白質的總數(shù)為2688條肽鏈（Knoblauch et al，1999）。這一系列蛋白質包括已知的SecB的底物以及很多未知的蛋白。這個大的數(shù)據(jù)庫可以對被SecB識別的底物模體進行可靠的統(tǒng)計分析。所有被篩選出來的肽鏈根據(jù)它們與SecB的親和力（高、中度、低、無親和力）被分為四組。親和力由合成的點的強度來決定（Knoblauch et al，1999）。與SecB結合和不與SecB結合的肽鏈其氨基酸分布存在著很大的差異。高親和力SecB結合肽富含基本氨基酸殘基（Arg和Lys）以及芳香族殘基（Phe，Tyr，Trp），而酸性殘基（Asp，Glu）卻非常少（Knoblauch et al，1999）。該結果可用于鑒定識別模塊，它又能夠準確的預測SecB結合肽。這些實驗代表了SPOT合成法的應用向蛋白組范圍上篩選結合特異性邁進了一步。包含一個細菌的蛋白組所有重復的肽的SPOT芯片很快也將產(chǎn)生。這種芯片將會成為在蛋白組學水平上研究抗體－抗原及蛋白質－蛋白質相互作用的強有力的工具。

最近，SPOT法被推廣到產(chǎn)生一個包含837個不同的hYAP WW蛋白功能域的肽芯片（Toepert et al，2001）。之所以選擇WW結構域作為模型，是因為它只有大約40個氨基酸長度。WW結構域在很多具有不同功能的蛋白質中發(fā)現(xiàn)，例如酵母、線蟲、哺乳動物的結構蛋白、調節(jié)蛋白及信號蛋白中（Chen et al，1997a）。WW結構域與富含脯氨酸序列的短片段結合來介導蛋白質與蛋白質之間的相互作用。WW結構域的結構是已知的，一些定點突變實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實了對其結構和功能重要的殘基（Chen et al，1997）。WW結構域的44個殘基的每一個逐一被19個L－氨基酸所替代（Toepert et al，2001）。結果與早先的突變實驗結果相一致，該結果是建立在結構域的結構基礎上，應該是合理的。固相合成44個氨基酸的肽鏈有一個值得擔憂的是，一個點內合成的肽鏈中有很大部分是不完全的產(chǎn)物?？梢允褂觅|譜來確認已合成的肽段的大?。═oepert et al，2001）。另外，所有可能的單個氨基酸的缺失都被合成在芯片中，與含有各種不同的全長的肽段的突變體芯片不同，幾乎所有的缺失都是無活性的。這些結果提示在一個點里合成的大部分肽鏈都是全長的（Toepert et al，2001）。該研究結合蛋白質化學669 670 671 672 673 674 675 676 677 678 679 680 681 682 683 684 685 686 687 688 689 690 691 692 693 694 695 696 697 698 合成的快速發(fā)展，提示著SPOT法將會成為使用固相合成產(chǎn)生蛋白質芯片的一種方法。

盡管SPOT合成法具有很大的實用性，但是濾膜上點的密度與DNA芯片或玻璃板上列的順序不同（Brown and Botstein，1999）。但是，有結果表明影印照相術可大大增加芯片上肽的密度（Fodor，1991）。這種方法與構建高密度寡核苷酸芯片方法相似。光敏保護基團被用于肽的合成。通過使用只允許光照射那些只加某種氨基酸的肽鏈的過濾罩，這樣肽鏈可以被選擇性的去保護。通過這種技術，肽的密度可達到250000/cm2（Fodor，1991）。上述所說的芯片可以通過直接在固體支持相上合成肽鏈而構建。目前，由于產(chǎn)物純化以及連接效率的困難，使得SPOT法局限于合成30～40個氨基酸的肽鏈（Molina et al，1996）。因此，通過直接合成構建蛋白質芯片是不可能的。相反，蛋白質必須在芯片中表達、純化隨后使用。重組蛋白能夠在E.coli或S.cerevisiae 等一些有機體內表達，或者通過組織培養(yǎng)得到。蛋白質也可以選擇在體外轉錄、翻譯產(chǎn)生。這些方法的困難是獲得用于芯片上的穩(wěn)定高級結構的蛋白質。不正確的折疊及聚合是重組蛋白在異源系統(tǒng)內表達存在的普遍問題。另外，蛋白質體外表達缺乏特異的伴侶蛋白，也會導致一些不正確的折疊結構的形成。這個問題是蛋白質芯片不同于DNA或寡核苷酸芯片的一個主要因素。所以，蛋白質芯片發(fā)展的進程一直以來都比DNA芯片慢。但無論如何，近年來的發(fā)展提示蛋白質芯片還是可行的。

歸組的重組蛋白芯片

蛋白芯片發(fā)展中的第一個難題就是由生物體開放閱讀框編碼的蛋白質的大規(guī)模表達和純化。關于S.cerevisiae(Martzen et al., 1999)的工作表明了這種方法的可行性。在這些實驗中，建立起一個由6,144個酵母菌株組成的芯片，每個菌株都包含一個質粒，該質粒在Pcup1啟動子的轉錄控制下表達不同的GST-ORF融合。因為純化6,144單個蛋白相當困難，所以菌株被集中在64個組（pool），每個組有96個不同的GST融合菌株。每個組的GST融合蛋白用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂為分離介質進行分批親和層析純化(Martzen et al., 1999)。然后這些組用作蛋白質功能的生化測定。舉例來說，GST融合組的測試證明了酵母中兩個預先知道的tRNA剪接反應中的每一個只會基于ORF數(shù)量在預期組中出現(xiàn)。當某組監(jiān)測出具有某種生化功能時，這個單獨的導致反應的菌株需要進行測定，699 700 701 702 703 704 705 706 707 708 709 710 711 712 713 714 715 716 717 718 719 720 721 722 723 724 725 726 727 由適當?shù)?6孔板中制備和測定GST融合蛋白(Martzen et al., 1999)。運用此法，生化檢驗定出三個先前未知基因編碼的蛋白質的假定功能，包括兩種涉及tRNA處理的環(huán)磷酸二酯酶和一個可修飾細胞色素c的轉甲基酶(Martzen et al., 1999)。原則上，如果我們假定融合蛋白是可溶的、折疊的和功能性的，成組的GST融合蛋白能用來識別任何生化反應相關的蛋白。這個方法有個獨到的優(yōu)勢，那就是一旦GST融合克隆建立起來，這就是一項快速的技術。Martzen和同事宣稱只要兩周就能純化64個組，同時檢驗工作一天就能完成(Martzen et al., 1999)。此外，這個方法也是很靈敏的，因為一次只有96個重組蛋白被測定而相比之下，用細胞溶解產(chǎn)物的話，溶液中會有成千上萬的蛋白質。這個方法使得每個蛋白有更高的濃度，因此大大地促進生化反應的檢測(Martzen et al., 1999)。

成組GST融合蛋白方法的強大能力可以推出新生化反應劑和測定方法。生物過程的化學探針（又稱化學生物學）的開發(fā)是一個快速發(fā)展的領域。例如，化學合成一種活性位點指向的探針，可以用來識別絲氨酸水解酶家族成員，近來已經(jīng)有人描述過此過程了（Liu et al，1999）。探針的活性由絲氨酸水解酶的有效抑制和不可逆抑制決定的，抑制劑為熒光磷酸(FP)衍生物，如比二異丙基熒光磷酸。這個探針組成有一個生物素化的長鏈熒光磷酸，稱作FP-生物素（Liu et al.，1999）。FP-生物素已在來自各種大鼠器官的粗組織提取物上試驗過了。這些實驗顯示此試劑能與粗提取物中的大量絲氨酸水解物反應，也能探測飛摩爾級（10-15 mol）的酶（Liu et al.，1999）。顯然，F(xiàn)P-生物素之類試劑將能與成組GST融合物更好地反應，因為成組GST融合物的蛋白濃度高于粗提取物的蛋白濃度（Martzen et al.，1999)。此類化學探針很可能將在今后幾年內得到發(fā)展。

蛋白微芯片 成組GST融合蛋白的運用使得生化反應的測試成為可能，但也不僅限于蛋白－蛋白或蛋白－小分子交互作用的識別。因為此目的，有必要固定蛋白于固體支撐基質上，使得非結合蛋白能夠被洗去。同時也有必要讓蛋白連接到固體支撐基質上后仍能保留它的折疊構象。

已經(jīng)有一種方法可以高空間密度連接蛋白到玻片上(MacBeath and Schreiber,2000）。這樣的微芯片制做系統(tǒng)使用高精準自動機械臂來傳遞納升體積的樣品到玻片上，密度達到每平方厘米1,600個點。用含醛硅烷試劑預處理玻728 729 730 731 732 733 734 735 736 737 738 739 740 741 742 743 744 745 746 747 748 749 750 751 752 753 754 755 756 片蛋白質才能共價連接其上(MacBeath and Schreiber,2000）。醛很容易與賴氨酸殘基以及蛋白質N端的a氨基酸等主鏈胺反應。因為賴氨酸通常會出現(xiàn)在蛋白質表面的多個位點，所以該蛋白能以多個方位連接。

高密度蛋白芯片是用來檢驗蛋白－蛋白交互作用，三個已知會相互反應的蛋白作用對被使用：蛋白G和IgG；p50和IkBa；以及FKBP12雷帕霉素結合域（FRB）和FKBP12(MacBeath and Schreiber,2000)。每一個此類實驗，兩結合蛋白中的一個被固定了，而另一個蛋白則用熒光標記，可以結合到玻片上。清洗以后，被結合的蛋白可以通過滯留的熒光標記檢測出(MacBeath and Schreiber,2000)。這些實驗證實微芯片能用來有效地檢測極小樣品量的蛋白－蛋白交互作用。固化的蛋白以每毫升100ug的濃度分布。因為結合反應在納升體積中發(fā)生，所以需要檢測結合的溶液相蛋白的數(shù)量是很小的。例如，特定的結合能用pg量的FKBP12檢測FRB-FKBP12的相互作用(MacBeath and Schreiber,2000)。MacBeath和Schreiber（2000）提到，因為結合所必要的溶液相蛋白的濃度相當?shù)?，所以有可能在細胞溶解產(chǎn)物中用熒光標簽標記蛋白，也可以用芯片來定量溶解物中特定蛋白的總量。因此，蛋白芯片能夠用作蛋白表達作圖和檢測蛋白－蛋白相互作用(MacBeath and Schreiber,2000)。通過相似的方法，研究顯示微芯片上小分子與蛋白的結合能被有效的檢測出。但是固定化的蛋白組分有多少還保留折疊結構，對此仍不很清楚，但是基于預實驗的判斷，蛋白微芯片在高通量蛋白測定方面很有應用潛力。

蛋白微芯片也被用作研究蛋白－蛋白相互作用的特異性(Newman and Keating,2003)。bZIP轉錄因子是真核生物中DNA結合蛋白的重要一類，其中無規(guī)線團的二聚化作用在結合特異性方面起著重要的作用。人基因組中編碼了大量的bZIP無規(guī)線團，我們使用蛋白芯片分析了這些模塊的組合結合特異性。這些實驗通過表達和純化每個結構域以及連接蛋白到一個醛包被的玻璃平板上，構造出由49個人bZIP無規(guī)線團結構域組成的亮氨酸拉鏈芯片（Newman and Keating,2003）。然后49個蛋白中的每一個都用熒光標記，每一個都單獨用作探針結合到芯片上去。用這種方法，總共有492個反應能迅速評估出來。這些實驗的重要特點就是交互實驗>90%的一致性，也就是說，一個結構域固定化或作為溶液探針結合了相同的一套結構域（Newman and Keating,2003）。這項結果預示了因為蛋白會在固757 758 759 760 761 762 763 764 765 766 767 768 769 770 771 772 773 774 775 776 777 778 779 780 781 782 783 784 785 體支持物和其他表面化學人工合成物上去折疊，而這樣的人工合成物不會成為此法的主要限制因素。這個方法也適用于檢驗其他蛋白家族中二元交互作用組。蛋白芯片在蛋白質組尺度范圍內的應用，由構建的含有代表93.5%的酵母蛋白質組的5,800種不同酵母蛋白芯片所展現(xiàn)（Zhu et al.,2001）。該研究中5,800個酵母ORF被克隆到一個酵母高拷貝表達載體，融合了谷胱甘肽S轉移酶和多組氨酸（polyhistidine）（GST-HisX6）（Zhu et al.,2001）。蛋白在酵母中表達以促進適當?shù)恼郫B和整合一些修飾作用。依照96孔板規(guī)格，一次純化了1,152個樣品，所有5,800個蛋白純化以后，樣品以高密度分散點在鎳包被的玻片上（Zhu el al.,2001）。蛋白微芯片通過用生物素化的鈣調蛋白（鈣離子存在的條件下）探測玻片，來測試蛋白－蛋白交互作用。鈣調蛋白是一種高度保守的鈣結合蛋白，這種蛋白涉及到很多鈣調控的細胞過程，同時也有很多已知的配合物（Hook and Means,2001）。這些實驗分辨出六種已知鈣調蛋白的靶蛋白還有另外33個潛在的結合伙伴（Zhu et al.,2001）。因為與鈣調蛋白的相互作用需要精確的三級結構，研究表明玻片上大部分的蛋白質折疊呈功能狀態(tài)。

酵母蛋白組微芯片也被用來測試不能被體內方式檢測的相互作用。特別是，蛋白質－脂質相互作用也能用磷酸肌醇(PI)結合蛋白篩選法檢測（Zhu et al.,2001）。PI是重要的細胞膜組成成分，也作為第二信使廣泛地調控細胞過程。蛋白芯片用脂質體探測，這些脂質體包括了5種不同類型的PI，還有含脂質體的卵磷脂(PC)。每個脂質體也含有一個生物素化的脂，這種脂用來探測連接到微芯片上蛋白質的脂質體（Zhu et al.,2001）。這六種脂質體辨識出總共150種不同蛋白靶體，該靶體產(chǎn)生的信號遠高于背景（Zhu et al.,2001）。這些蛋白中52個為非特性蛋白質。剩下蛋白中，45個與膜有關，包括整合膜蛋白和脂修飾蛋白（Zhu et al.,2001）。另外，很多激酶連接到脂分子上。為了確認芯片上的相互作用，幾個蛋白以不同的濃度固定到硝化纖維素濾膜上，顯示出對脂的結合具有濃度依賴性（Zhu et al.,2001）。

酵母蛋白組芯片研究表明蛋白芯片比其他鑒別蛋白－脂相互作用的方法方面有一定的優(yōu)勢。例如，采用酵母雙雜交方法，核內能檢測到的相互作用數(shù)目有限。反過來，因為蛋白芯片結合實驗能在體外做，蛋白的本地化限制就不是一個問題了。體外檢測相互作用的另外一個優(yōu)勢是可以檢測很多不同類型的配體。因786 787 788 789 790 791 792 793 794 795 796 797 798 799 800 801 802 803 804 805 806 807 808 809 810 811 812 813 814 此，諸如蛋白-脂、蛋白-小分子、或者蛋白-核酸酸性相互作用能被檢測出來。小分子芯片 遺傳學對生物學的進步貢獻很大。它借助突變等位基因來增加對有興趣的途徑的認識。在化學遺傳學方面，小分子而不是遺傳變異，被用作有條件地或臨時地調控蛋白質的功能，因此許多生物學過程才得以發(fā)現(xiàn)（Mitchison,1994）。這些方法有使用秋水仙堿發(fā)現(xiàn)了微管蛋白（Borisy and Taylor,1967）；河豚毒素的發(fā)現(xiàn)，使得動作電位的解剖成為可能（Narahashi et al.,1964）；過氧化物酶體增殖活化受體γ拮抗劑的辨識，增進了對脂肪生成調節(jié)的理解（Lehmann et al.,1995）。發(fā)展化學遺傳學作為一項技術的關鍵點就是高效的合成大量的多樣的小分子和簡單地篩選大量的小分子的方法。合成多樣化小分子的重要過程可通過以下方法：多樣性定向合成（Schreiber,2000）、固相純化（Merrifield,1963）和分離池合成策略（Furka et al.,1991）。近來，描繪了一個具有分離池和以高容量微球為單個反應器的多樣化定向合成的技術平臺（Blackwell et al.,2001）。每個微球傳送大約5mM合成儲液到測定板做化合物解離和重懸?。˙lackwell et al.,2001）。這個產(chǎn)物量足以做大量生物學檢驗。化學遺傳學的另一重要方法就是有效的篩選影響感興趣的過程的分子。表型的和蛋白質結合的測試被成功的利用。例如，基于雙表型篩選的組合，有一個是基于特定轉錄后修飾，另一個是可視的微管和染色質，被用來篩選影響有絲分裂的化合物（Mayer et al.,1999）。其中一個化合物monastrol通過與有絲分裂的驅動蛋白Eg5相互作用，阻止了哺乳動物的有絲分裂。Monastrol是第一個被識別的不通過結合微管蛋白而影響有絲分裂的化合物。

基于蛋白質結合分析的小分子篩選是有意義的，因為它有可能發(fā)展成高通量篩選。蛋白質結合分析能從不同的蛋白質篩選大量的小分子，從而有效地識別有用的小分子。已有報道用硫醇捕獲反應建立由含硫醇的小分子組成的芯片（MacBeath et al.,1999），和通過亞硫酰二氯活化的玻璃載玻片表面制作含乙醇的小分子微芯片（Hergenrother et al.,2000）。這個方法被用來制作一種高密度的微芯片，此芯片有3,780結構復雜的產(chǎn)生自多樣化定向的合成的1,3-二氧六環(huán)小分子（Kuruvilla el al.,2002）。此類微芯片的應用包括用熒光標記的酵母蛋白Ure2p作為芯片的探針。這個蛋白是酵母氮代謝系列基因的中心抑制物。一個結合到Ure2p的化合物uretupamine，被識別出來用做干擾葡萄糖敏感轉錄過815 816 817 818 819 820 821 822 823 824 825 826 827 828 829 830 831 832 833 834 835 836 837 838 839 840 841 842 843 程，這個過程在Ure2p形成的下游過程出現(xiàn)（Kuruvilla et al.,2002）。新信息表明，因為uretupamine只調控部分Ure2p功能，因此它的功效比單純URE2基因的敲除更專一。研究表明小分子微芯片提供了一種系統(tǒng)化的方法，獲得能調控不同方面蛋白功能的小分子探針，由此使破壞特定蛋白參與的生物學過程更容易。

以上描述的SPOT合成方法，往往用在合成某種芯片模式的膜結合肽鏈。然而，此方法廣泛運用于高效合成膜表面的小型有機分子的芯片（Scharn et al.,2000）。Trisamino-和amino-oxy-1,3,5-triazine需要通過應用SPOT技術平行連接到纖維素膜和聚丙烯膜。完成這個過程需要用氨基酸和酚鹽離子作為結構單元，還需一個以三氟乙酸蒸汽裂解的連接系統(tǒng)（Scharn et al.,2000）。為了識別抗原決定簇類似物，總共合成了8,000個纖維素結合的1,3,5-三嗪，連接到抗變形生長因子-α單克隆抗體Tab2，做成平行探針（Scharn et al.,2000）。這些研究預示了SPOT合成也是一種創(chuàng)建小分子芯片的有效方法。因此，小分子芯片很可能成為將來蛋白組學研究的重要工具，用來探測生物學過程的蛋白質功能。蛋白芯片和質譜 MALDI-TOF質譜結合蛋白質芯片的方法曾用在分析組織培養(yǎng)細胞分泌的淀粉樣蛋白β肽鏈變體（Davis et al.,1999）。在Alzheimer癥病人的腦組織中常見的老年斑中具有4-kDa淀粉樣β肽鏈的聚集態(tài)（Selkoe,1998）。臨床藥品中識別出大量肽鏈的變體，因此很需要有效識別變體的方法。為此，以在芯片表面封固淀粉樣β肽鏈的抗體的方法構建了蛋白芯片（Davies et al.,1999）。芯片表面上放1μl介質來捕獲培養(yǎng)細胞分泌的淀粉樣β肽鏈變體，然后清洗芯片，結合肽鏈被抽提出來用于MALDI-TOF質譜分析（Davies et al.,1999）。質譜的高敏感性和高精確度使數(shù)種淀粉樣β肽鏈蛋白可以被精確識別。此外，一種對照的牛IgG固定到芯片上不同位置，結果顯示淀粉樣肽鏈的抗體有捕獲介質中的變體的能力（Davies et al.,1999）。這項研究證明了結合蛋白質芯片與質譜是識別組成上細微差別的肽鏈的有效方法。

蛋白芯片－質譜方法已被擴大到很多感興趣的分子的固定化平臺。因此，分子能為親和方法所捕獲，例如抗體或其他有陰離子交換、陽離子交換、金屬親和和反相色譜等色譜特性的芯片表面（Fung et al.,2001）。這類芯片能被用來將蛋白質的復雜混合物純化成具有共同特性的一組蛋白，然后用于質譜分析。從概念上講，這個方法與液相色譜（LC）和第九章介紹的串聯(lián)質譜方法相似（Link et 844 845 846 847 848 849 850 851 852 853 854 855 856 857 858 859 860 861 862 863 864 865 866 867 868 869 870 871 872 al.,1999）。兩個方法的目的都是為了降低蛋白質的復雜度，變成一些能準確檢測的蛋白。給定色譜分離方法所給出的蛋白譜，代表了蛋白抽提出來時細胞狀態(tài)的指紋印記。舉例來說，蛋白質芯片方法被用來研究正常狀態(tài)下和癌癥前期的樣品的蛋白質表達的概貌，通過該方法可以發(fā)現(xiàn)疾病狀態(tài)的蛋白質標記特征（Wright et al.,2000）。商業(yè)化蛋白質芯片－質譜平臺業(yè)已開發(fā)出來，也發(fā)表了一些應用（Fung et al.,2001的評論）。

使用DNA芯片研究蛋白質功能 DNA芯片通過測量mRNA的水平廣泛用于研究基因表達（Brown and Botstein,1999）。一個有趣的額外功能是用這些芯片研究轉錄因子蛋白的DNA結合特異性。已發(fā)展了基于DNA芯片對特征化DNA序列專一性的鋅指蛋白識別的方法（Bulyk et al.,2001）。說到序列特異性DNA結合，鋅指轉錄因子是最好理解的家族之一。小鼠Zif268轉錄因子被用做這些研究的模型系統(tǒng)。這個實驗需要在M13線性噬菌體表面上展示Zif268蛋白，通過誘變和噬菌體展示篩選技術，利用不同的結合特異性分離一些變體。野生型和變異型Zif268蛋白的結合特異性就這樣運用DNA微芯片確定下來。

Zif268蛋白包含三種鋅指（F1,F2,F3），每種鋅指與三堿基對序列相互作用（Pavletich和Pabo，1991）。F2指中的氨基酸通過噬菌體展示技術誘變和篩選，來分離結合的變體。有人建立起了一個包含所有64種可能的F2鋅指3堿基對結合區(qū)的組合并在側翼具有野生型F1和F3識別序列的DNA芯片（Bulyk et al.,2001）(圖10.13)。讓噬菌體展示的野生型或者變異型Zif268蛋白去與芯片上的DNA序列結合；非結合物質都給沖洗走了，結合的噬菌體能用包含熒光標記抗M13抗體探測到(Bulyk et al.2001)。結合測定是高度平行的，因此，一個芯片試驗就有可能全面描述每個突變體的結合特異性。

如果改進DNA芯片結合實驗，就可以用來進行轉錄因子結合位點的整個基因組分析。Bulyk和其同事們用12,000個 1-kb序列的可以包容Saccharomyces cerevisiae 基因組的芯片來描述S.cerevisiae 轉錄因子的序列特異性（Bulyk et al.,2001）。這些芯片也可以預測從未描述過的轉錄因子的功能和發(fā)現(xiàn)新的調控網(wǎng)絡（Bulyk et al.,2001）。

10.8 表面胞質基因組共振生物傳感器分析

表面胞質基因組共振（SPR）生物傳感器已確定為測定分子間相互作用的方法。873 874 875 876 877 878 879 880 881 882 883 884 885 886 887 888 889 890 891 892 893 894 895 896 897 898 899 900 901 SPR生物傳感器實驗包括在表面固定一個反應物并監(jiān)測它與溶液中的其它分子的相互作用。SPR描述的是復雜的合成與分解過程導致表面附近的溶液光折射系數(shù)發(fā)生改變時測到的光現(xiàn)象（Jonsson et al.,1991）(圖 10.14)。SPR信號表達為共振單位（RU），它與溶液中和固定配體相互作用的分子質量成比例。所以標準的實驗包括固定低分子量的配體和探測配對分子不停地流過固相表面時信號的改變（Schuck,1997）。SPR的一個優(yōu)勢是可以實時監(jiān)測結合反應，而不需要標記配體。因此，SPR可以用來研究蛋白、碳水化合物、核酸、脂肪和小分子之間的相互作用。

10.8.1用SPR探測生物分子的相互作用

關于用SPR生物感應大分子之間相互作用的數(shù)百篇論文已在不同的領域發(fā)表（Rich 和Myszka,2000）。許多研究關注于探測和定量蛋白-蛋白相互作用。典型的實驗是將一種蛋白共價結合到傳感器表面。已有許多表面材料在市場上供應，如羧甲基葡聚糖，羧甲基葡聚糖衍生后給出許多功能基團可用于固定化（Schuck,1997）。其他表面還有捕獲生物素化的streptavidin分子和捕獲組氨酸標記蛋白的鎳鰲合物表面等（Rich and Myszka,2000）。可溶性蛋白結合到固相蛋白給出的SPR信號是實時的，可以用來監(jiān)測結合動力學。無蛋白的緩沖液流過結合體可以探測分解動力學。通過動力學數(shù)據(jù)（Ka,Kd）得到平衡常數(shù)（KD）(Morton and Myszka,1998)。近年來SPR儀器的發(fā)展已有可能實現(xiàn)蛋白間相互作用的高通量分析。例如，BIACORE已發(fā)展了分析96孔板上的樣品的儀器。所以，SPR可能對基因組水平的蛋白-蛋白相互作用的描述作出重大貢獻。

固相表面的發(fā)展使SPR傳感器可用于監(jiān)測蛋白與脂質表面及膜相關蛋白之間的作用。商業(yè)化（BIACORE）的疏水親脂的傳感器表面已可構建穩(wěn)定的膜表面。已有顯示這種疏水傳感器表面可以用來形成脂質單層（Evans and MacKenzie,1999）。這個單層表面又可以用來檢測蛋白-脂質相互作用。例如，有一生物傳感器被用來檢測Src同源域與磷脂雙層上的磷脂肌醇的結合（Surdo et al.,1999）。另外，親脂的傳感器表面被用來捕獲脂質體和形成像生物膜一樣的脂質雙層。

疏水傳感器表面上脂質單層的一個有意思的應用是主要組織相容性復合物（MHC）以特定的方向結合到表面（Celia et al.,1999）。這是因為脂質體在極性902 903 904 905 906 907 908 909 910 911 912 913 914 915 916 917 918 919 920 921 922 923 924 925 926 927 928 929 930 一端連接了一個經(jīng)化學修飾的帶有鎳鹽的脂質的作用（Celia et al.,1999）。含有鎳脂質的脂質體包被疏水傳感器表面形成單脂層。實驗用的重組MHC分子在跨膜區(qū)域含多組氨酸標記。電子顯微鏡顯示組氨酸標記的MHC分子結合到脂質體的表面。SPR度量顯示組氨酸標記的MHC分子特異性結合到脂質雙層的表面（Celia et al.,1999）。更進一步，SPR實驗表明MHC蛋白與單脂層在特定的方向上相互作用。觀察到MHC分子與抗微球 抗體結合卻不與抗組氨酸標記抗體結合的現(xiàn)象可以推斷上述結論（Celia et al.,1999）?？菇M氨酸標記抗體不與MHC分子結合可能因為空間位阻，因為組氨酸標記在單脂層表面上結合了鎳脂質。最后，Celia和同事們通過將熒光標記的脂質結合到單脂層，發(fā)現(xiàn)脂質在單脂層里橫向流動（Celia et al.,1999）。這樣，精密的SPR應用發(fā)展起來用于模擬體外膜蛋白的相互作用。膜及傳感器表面膜蛋白構建技術的進步對蛋白組學的研究將會做出重大貢獻?；蚪M中將近三分之一的開放閱讀框被認為是編碼膜相關蛋白的。所以，測定和定量膜內蛋白之間相互作用的能力對在基因組水平研究蛋白-蛋白相互作用的蛋白組學起關鍵性作用。10.8.2 SPR生物傳感器與質譜的聯(lián)合

正如上面講到的，SPR生物傳感器被用來監(jiān)測和定量蛋白-蛋白相互作用而不需要標記任何一方結合物。此方法還用于探測來自包括細胞溶解物和條件媒介物在內的復雜混合物的蛋白作用。稱為配基釣魚的方法是將已知蛋白固定作為功能魚餌，釣出復雜混合物中的未知的結合伙伴（Lackman et al.,1996;Nelson et al.,2000）。困難在于當潛在的結合物從復雜混合物中釣出來后，在氨基酸測序以確定身份之前必須用標準的生物化學方法將該蛋白純化（Lackman et al.,1996）。生物傳感器聯(lián)合質譜能更直接地鑒定結合伙伴。生物傳感器為質譜和蛋白鑒定提供了微量純化的平臺（Williams and Addona,2000）。從SPR生物傳感器表面回收的蛋白量非常少（毫微摩爾），但用靈敏的MALDI-TOF或隨機質譜方法鑒定已足夠了（Nelson et al.,2000;Williams and Addona,2000）。

SPR與質譜聯(lián)用的潛力曾被谷胱甘肽S-轉移酶（GST）和抗-GST抗體模型系統(tǒng)證實（Nelson et al.,1997）。在這個實驗中，抗-GST抗體聯(lián)結到羧甲基葡聚糖芯片，GST注入芯片與抗體結合。反應結束后，芯片從儀器上移開，以基質材料包被含有結合蛋白的芯片區(qū)域并用于MALDI分析（Nelson et al.,1997）。接931 932 933 934 935 936 937 938 939 940 941 942 943 944 945 946 947 948 949 950 951 952 953 954 955 956 957 958 959 著用MALDI-TOF質譜儀分析此芯片，質譜圖顯示結果與GST蛋白質量相一致。這個方法又經(jīng)改進，包括了以單個芯片上多流細胞的方法進行樣品的蛋白水解消化。如抗人白細胞介素α（anti-IL-1α）抗體固定在傳感器芯片上的流動池1中，胃蛋白酶固定在流動池2（Nelson et al.,2000）。含IL-1α的溶液進入到流動池1，在那里，SPR測量儀顯示IL-1α結合到抗IL-1α抗體的情況。洗去非特異性結合的蛋白，然后從表面洗脫IL-1α，IL-1α再從流動池1進入流動池2。經(jīng)足夠時間的固定化胃蛋白酶的蛋白水解消化后，MALDI-TOF質譜分析儀分析流動池2的表面。結果肽質量譜清楚地反映IL-1α的存在（Nelson et al.,2000）。

上述試驗表明聯(lián)結SPR和質譜的技術是可行的。這些方法對蛋白相互作用的描述是有用的。例如，固定蛋白被用作餌，在活體條件下釣出復雜蛋白混合物中的相應的蛋白結合物。復合技術的使用不僅能快速鑒別蛋白相互作用，而且提供了作用的動力學參數(shù)信息。此方法可以作為體內技術比如酵母雙雜交系統(tǒng)的絕佳的輔助手段。10.9總結

有效的高通量的蛋白-蛋白和蛋白-配體相互作用的檢測對蛋白組研究起著越來越重要的作用。鑒別結合伙伴的最常用的方法是酵母雙雜交系統(tǒng)。這是依賴于通過由蛋白質的相互作用以DNA結合域回收轉錄激活域，而使其功能重構的體內探測方法。雙雜交法已被用于研究酵母蛋白的相互作用及數(shù)以千計的蛋白構成的精細網(wǎng)絡的鑒定。分析表明在這些高度異源的無級網(wǎng)絡中少數(shù)緊密聯(lián)系的蛋白介導著大量的鏈接較少的蛋白間的相互作用。這種類型的網(wǎng)絡框架在很多復雜的網(wǎng)絡中非常普遍，如英特網(wǎng)絡、代謝網(wǎng)絡等。以雙雜交法還發(fā)現(xiàn)在其它類型的生物中也存在復雜網(wǎng)絡，如病毒、細菌、動物系統(tǒng)等。噬菌體展示也為發(fā)現(xiàn)很多蛋白－配基相互作用做出了貢獻。特別有用的是噬菌體展示和雙雜交數(shù)據(jù)的結合可以減少假陽性相互作用的數(shù)量。蛋白質片段互補研究的相互作用數(shù)據(jù)的使用很可能增強蛋白質相互作用數(shù)據(jù)庫，在蛋白組規(guī)模提供更為精確的相互作用譜。

以蛋白質芯片鑒定蛋白－配基相互作用很具有挑戰(zhàn)性，蛋白質固定到固體支持物時需要保持三維結構的完整。蛋白間的相互作用用肽和蛋白芯片來檢測和解析。SPOT合成已大量用于合成肽芯片，這種芯片主要用于鑒定抗體抗原決定部位和解析蛋白相互作用的結合部位。蛋白質芯片也被用于研究蛋白間和蛋白－配960 961 962 963 964 965 966 967 968 969 970 971 972 973 974 975 976 977 978 979 980 981 982 983 984 985 986 987 988 989 990 991 992 993 基間相互作用。最近，構建了一個含90％酵母蛋白組（5800個蛋白）的蛋白質芯片，用它鑒定了鈣調素結合蛋白和脂結合蛋白。這些使用表明，蛋白質可以在芯片上保持它的高級結構，這預示著蛋白質芯片的廣闊未來。研制了小分子芯片用于在化學遺傳學中快速鑒定小分子探針。小分子在解析復雜生物學過程中具體的蛋白的作用是一個非常有用的工具。蛋白和小分子芯片可以用熒光標記分子檢測芯片表面的相互作用。一個比熒光檢測方法更細致和定量化的方法是表面胞質基因組共振，該法原理是當配體結合到固定在芯片表面的靶體蛋白時引起的折射系數(shù)的變化。此法的優(yōu)勢在于可以測定相互作用分子對的結合率、解離率和平衡常數(shù)，因此該法在高通量的蛋白－配基相互作用的檢測中發(fā)展快速而且很可能將廣泛應用（Protomics，T.Palzkill, 2002）。

圖例

圖10.1 重組克隆.(a)以attB＋attP>attL+attR反應克隆PCR產(chǎn)物受Int 和IHF蛋白催化。結果展示了可以構建功能載體的起始克隆。（b）以Int、Xis和IHF蛋白催化通過attB＋attP>attL+attR反應將起始克隆轉變?yōu)楣δ茌d體。利用編碼適當?shù)膯幼雍蜆撕灥哪康妮d體可以構建多樣的功能載體。（引自Protomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.2 PCR產(chǎn)物的定向克隆策略。定向拓撲異構酶介導的對PCR產(chǎn)物的克隆在其5’末端需要5’-CACC序列。本例中CACC序列緊靠在插入基因的起始密碼子ATG之前。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.3 酵母的重組克隆。進行兩個連續(xù)的PCR反應。每套引物的5’端都含有額外序列，這些序列最終使PCR產(chǎn)物可與線性化載體進行同源重組。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.4 酵母雙雜交系統(tǒng)。報告基因上游的蛋白X和Y的相互作用導致轉錄激活。蛋白X做為融合蛋白通過DNA結合域（DBD）結合在報告基因的上游位點，蛋白Y是帶有轉錄激活域（Act）的融合蛋白。蛋白X和Y的相互作用使激活域置于994 995 996 997 998 999 1000 1001 1002 1003 1004 1005 1006 1007 1008 1009 1010 1011 1012 1013 1014 1015 1016 1017 1018 1019 1020 1021 1022 1023 1024 1025 1026 1027 1028 1029 1030 1031 1032 1033 1034 1035 1036 1037 報告基因的附近并刺激它的轉錄。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.5 雙雜交蛋白相互作用的高通量配型測定。含有‘餌’和‘阱’的酵母菌株放在多孔板的孔內雜交。以轉錄報告基因篩選二倍體并用以測定蛋白－蛋白相互作用。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.6 酵母雙雜交‘餌’和‘阱’的系統(tǒng)雜交.酵母的每ORF分別被克隆為DNA結合域融合（餌）和DNA激活域融合（阱）.DNA結合域融合導入到MATa株，DNA激活域融合導入到MATa株.它們分別構成62套每套96克隆的組；組間進行系統(tǒng)的雜交（62×62共3844個組合）.選擇相互作用的克隆，PCR擴增插入片段并切測序鑒定。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.7 絲狀噬菌體展示。隨機序列的多態(tài)或者是不同的蛋白質被融合到噬菌體M13的衣殼蛋白的基因III上。目標配體被固定在固相上。噬菌體所展示的蛋白利用與目標之間的親和力被富集并純化，這個過程叫做Panning。經(jīng)過多輪的Panning后，噬菌體被用來感染E.coli，然后這個被選擇出來的插入片斷的成分通過DNA測序來鑒定。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.8 開裂的泛素作為蛋白質—蛋白質相互作用的傳感器。蛋白A被融合到了泛素N末端區(qū)域，蛋白B則融合到了它的C末端。蛋白A與蛋白B的相互作用會重新組成一個完整的，折疊了的泛素。折疊了的蛋白質能夠被一種特別的蛋白酶識別，酶切后釋放一種報告蛋白。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.9 鑒定復合物內蛋白相互作用的一般方法。利用一個與復合物種一個已知蛋白相互作用的標簽序列把復合物從細胞中分離出來?；蛘呃冕槍@個復合物中的某個蛋白的抗體進行免疫沉淀來分離復合物。這些蛋白質用聚丙烯酰胺電泳，水解來分析，水解產(chǎn)生的碎片可以通過質譜來鑒定?；蛘呤堑鞍踪|水解后用液相色譜處理。然后，多肽片斷用質譜鑒定，然后通過與數(shù)據(jù)庫的比對來鑒定蛋白的成分。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.10 利用抗體芯片來繪制蛋白表達圖譜。這個抗體芯片是由針對一組感興趣的生物體內蛋白的特異性的單克隆抗體固定到膜上而成的。為了鑒定一種蛋白在測試條件下是否有表達，先要獲得粗裂解物，然后對裂解物內的蛋白要進行熒光標記。裂解液加到膜上，使蛋白質與相應的抗體結合。結合了的蛋白可以通過熒光標記看到。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.11 利用點合成法構建多肽芯片。β丙氨酸被共價連接到作為平面支持的纖維膜上。然后以β丙氨酸為起點通過Fmoc化學法合成多肽。多肽通過羧基末端與膜相連。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.12 從成組的酵母菌株中純化蛋白質。每個酵母的ORF都被以蛋白表達載體中與谷胱甘肽S轉移酶融合而克隆并構建了6144個酵母株。所有酵母株被分成64組，每組96株。每組培養(yǎng)后批量純化96個融合蛋白。然后測定每組的生1038 1039 1040 1041 1042 1043 1044 1045 1046 1047 1048 1049 1050 1051 1052 1053 化功能（Martzen等，1999）。將功能陽性的菌株歸并為新的組。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.13 用DNA微芯片確定轉錄因子的特異性結合位點。（A）含有Zif168-結合位點的DNA片斷的 固定。F2指針的結合位點表示為圖中NNN,N指任一核苷酸。(B)構建了一個64孔微芯片，每孔由圖A顯示的含有3堿基對的F2結合位點的序列組成，然后噬菌體展示的各種不同的Zif268蛋白結合到這個芯片上。（C）被結合的噬菌體用抗M13抗體檢測。噬菌體的結合位點決定了不同Zif268蛋白的底物特異性（Bulyk et al.2001）。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.14 表面胞質基因組共振生物傳感器的示意圖.一種結合伙伴固定在感應器表面.使用BIACORE儀器，可溶性分子可以流過固定的分子．可溶性分子的結合導致傳感芯片表面的溶液的折光系數(shù)發(fā)生改變.折光系數(shù)改變的大小與可溶性分子被結合的數(shù)量存在相關性.（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

第四篇：體內化學交聯(lián)和質譜分析法證實蛋白質相互作用

體內化學交聯(lián)和質譜分析法證實蛋白質相互作用

蛋白復合體的分離可用不同的親和色譜法。在經(jīng)典的免疫親和實驗中，細胞裂解液中的蛋白復合體能被固定化了的抗體獲取，該抗體識別復合體中已知成分的抗原決定簇。經(jīng)過多次洗滌以去除非特異性結合蛋白，該復合體由質譜法分析（MS）。短暫性結合復合體，其解離常數(shù)高，不適合這種方法。本文通過一種新的方法，用體內化學交聯(lián)和基于鑒定蛋白質的質譜分析法來鑒定瞬時作用的蛋白復合體?；罴毎眉兹┨幚恚淇焖俾拥郊毎?，形成蛋白質-蛋白質化學交聯(lián)?；プ鞯鞍踪|交聯(lián)到一個含有Myc標簽的蛋白質上，通過免疫親和層析共同純化出來，再把分離下來。通過SDS-PAGE分離后，再用串聯(lián)的質譜分析鑒定。利用這種方式我們證實了大量的與M-Ras組成激活形式共同被純化下的蛋白質。在這些蛋白中，我們證實了RasGAP相關蛋白IQGAP1，它是與M-Ras相互作用的一個新的蛋白質。這種方法適合多種蛋白，對研究蛋白質相互作用十分有益。簡介

蛋白質互作幾乎是細胞內每個功能水平都出現(xiàn)的，包括亞細胞結構，各種細胞膜的機械轉運，染色體包裝，基因表達調控，細胞內信號傳導。蛋白質互作異常將導致很多種疾病，所以對蛋白質互作的研究成為生命科學領域極為緊迫的一件事。蛋白質復合體的純化可以應用多種方法，包括經(jīng)典的分子篩和凝膠過濾，以及這個不同的親和色譜法分離。免疫親和的方法是目前最具說服力的純化方法，通常用于證明體內蛋白質互作和復合體中相互作用的物。一個經(jīng)典的免疫親和實驗中，細胞裂解液中的蛋白復合體能被固定化了的抗體獲取，該抗體識別復合體中已知成分的抗原決定簇。經(jīng)過多次洗滌以去除非特異性結合蛋白，該復合體由質譜法分析。

這種方法的缺點是，對感興趣的蛋白質需要一種特異的抗體（Ab），許多時候這種親和導致純化效率很低。Ab除了和靶蛋白外的其他蛋白交聯(lián)是另一個缺點。這時，與靶蛋白不相關的蛋白或蛋白復合體被純化下了，導致假陽性。通過抗原決定簇標簽把抗原結合到特異的抗體上，形成普通的抗體。為此，需要一個帶有抗原決定簇標簽的抗體和一個高親和力的抗原。通用的標簽有Myc，F(xiàn)lag，相應抗體已經(jīng)被商品化。操作說明被標準，不要求每一部都在最適合的條件。雖然抗原決定簇標簽適用于大范圍的純化實驗，但是其局限于穩(wěn)定的復合體。結合較弱的或者瞬間結合的復合物會被忽視，進而不能被分析出來。短暫性結合復合體，其解離常數(shù)高，在洗脫非特異結合條帶時被洗脫下來。這些步驟不要嚴謹操作，在高鹽或洗滌劑濃度時效率高。在溫和條件下，重復洗滌也將洗脫掉結合不緊密的成分。

通過化學交聯(lián)可以阻止蛋白質復合體特異組分的丟失。有效地化學交聯(lián)劑是甲醛。甲醛的幾個特點應用于蛋白質互作的研究。1，交聯(lián)發(fā)生在近距離（2A），被交聯(lián)的蛋白位置很近。2，甲醛可以擴散到細胞膜且是非特異的，有益于廣譜的蛋白互作研究。3，甲醛幾乎在添加到細胞內后阻止酶反應，可以提供添加時瞬間的互作情形。4，一旦交聯(lián)反應完成，反應物可用于非生理條件下操作，并保持結構完整性。另外，交聯(lián)是可逆的，可以隨后分析復合體組分。

甲醛溫和處理和免疫沉淀在分析轉錄因子，與染色體結合的多聚配合物，核小體位置的確定，核小體動力學和核小體再構建方面。最近，甲醛交聯(lián)與免疫沉淀和Western雜交結合，成功分析了，在酵母里是否TATA結合蛋白，TF IIB，SAGA組氨酸乙酰轉移酶是否直接與轉錄結合蛋白結合。最近，作者在哺乳動物細胞中，采用了新的分析蛋白質互作方法，即甲醛交聯(lián)結合免疫親和層析，基于質譜分析的蛋白鑒定。利用這種方式我們證實了大量的與M-Ras組成激活形式共同被純化下的蛋白質。共免疫沉淀和Western雜交證實很多蛋白互作。在這些蛋白質，我們證實了RasGAP相關蛋白IQGAP1，它是與M-Ras相互作用的一個新的蛋白質。進一步研究去解釋其互作的生物學功能。2材料與方法 2.1 抗體與試劑

抗Myc的小鼠抗體mAB（clone 9E10）來自于H.Ziltener博士?？笽QGAP1和抗Rac的小鼠抗體是購買于BD生物科學公司?？筊ap1的兔多克隆抗體購買于Santa Cruz生物技術公司。羊抗鼠和羊抗兔的二抗來自DAKO公司。羊抗鼠Alexa Fluor 680二抗來自分子探針公司。另外的試劑來自Fisher Scientific。2.2 細胞系和細胞培養(yǎng)

R6X細胞（依賴于白介素3雙點位的鼠肥大細胞/巨噬細胞系）感染雙順反子逆轉錄病毒載體基于pMXpie，其穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白和天然的M-Ras和突變的組成型激活M-Ras，它們都帶有氨基端的Myc標簽。R6X細胞在37℃,5%CO2，RPMI1640培養(yǎng)基中加2mm的l谷氨酸鹽，100單位/ml的青霉素，50ug/ml的鏈霉素，10%胎牛血清，2%的10倍的培養(yǎng)基，在WEHI-3B沒有的作為白介素3的來源。2.3甲醛交聯(lián)？？？

收集R6X細胞，用PBS洗，每5*106個細胞在1ml的PBS（含0.125-1.0%多聚甲醛質量體積比）中孵育。甲醛交聯(lián)在37℃,5-60分鐘。反應終止是加入起始濃度為1.25M的甘氨酸，抑制濃度為125mM，室溫，5分鐘。細胞收集，PBS洗兩次，在裂解緩沖液（50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% 甘油, 1% NP-40, 5 mM EDTA）中打散沉淀物，裂解液中加入蛋白酶抑制劑。細胞裂解物在14000rpm，15min成為細胞顆粒碎片。收集上清用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量檢測蛋白質量。

3.4 Western雜交和免疫沉淀反應

蛋白在10% SDS-PAGE中被分離，并轉到硝酸纖維素膜上，膜在4℃，3%的BSA過夜封閉，室溫一抗孵育1小時，PBS中加入0.1%的吐溫洗滌四次，室溫二抗孵育1小時。在一輪洗滌后，條帶在化學發(fā)光劑和X射線膠卷或奧德賽紅外成像系統(tǒng)中被看到。免疫沉淀反應，2mg抗Myc的抗體用鄰苯二甲酸二甲酯偶聯(lián)到1ml的蛋白G瓊脂糖珠子上，細胞裂解液用25-50ml蛋白G瓊脂糖珠預處理，4℃,10min，含有1mg的處理裂解液在25-50ul的含抗Myc的抗體瓊脂珠，4℃，2h。裂解液用buffer洗滌三次，結合材料再用1m甘氨酸（pH2.5）37℃,15min。用飽和Tris溶液再次洗滌。洗滌樣品中加入5倍的樣品buffer（2%SDS, 10%甘油, 40%mMTris pH 6.8, 715 mM b-巰基乙醇稀釋成1倍），65℃煮10民，以備SDS-PAGE。2.5 免疫親和層析

9多聚甲醛處理的細胞裂解液約需10R6X細胞，含有標準化保證豈有相同的蛋白數(shù)量。免疫親和層析實驗中，0.864 cm Poly-Prep柱子中1ml抗Myc抗體的柱子。在純化之前，細胞裂解液用1ml的蛋白G瓊脂珠預處理，4℃,10min。預處理的裂解液加入免疫親和層析柱子中，4℃，2小時。柱子用10ml平衡buffer（20 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mMEDTA）洗脫，第2次用10ml含1%吐溫20平衡buffer洗脫，第3次用10ml含500mM NaCl平衡buffer洗滌。結合材料用1m甘氨酸（pH2.5）37℃,15min。用飽和Tris溶液再次洗滌。把三次的純化也收集在一起，用Amicon Ultra-4 10 000 MWCO過濾器離心。在濃縮的樣品中加入5倍的上樣buffer，95℃煮20min。蛋白質在10%SDS-PAGE中分離，用考馬斯亮藍染色法觀察。2.6多維液相層析/串聯(lián)式質譜法分析

蛋白條帶從SDS-PAGE中切割下來，膠內進行胰蛋白酶化。按序蛋白酶化在37℃過夜。提取多肽，到新管中，加入10ul 5%的甲酸用多維液相層析/串聯(lián)式質譜法分析。流入的液相色譜用最終高效液相色譜系統(tǒng)，流速為200nl/min用75 mm6150 mm RP毛細管柱，用水/CAN/甲酸為梯度。液相色譜流出液電噴入QSTAR quadrupole-TOF質譜儀的樣品孔。收集串聯(lián)質譜儀收據(jù)。串聯(lián)質譜儀用MASCOT搜索引擎，收據(jù)分析和對比所有的哺乳動物序列（Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫）。3 結果與分析 3.1 體內M-Ras化學交聯(lián)

甲醛是一種可逆的有效地蛋白交聯(lián)試劑。據(jù)此，我們研究甲醛對Ras家族（小GTP酶M-Ras）化學交聯(lián)效果。M-Ras,好家族中其他成員像類似，以結合GDP或GTP決定分子的開關。當結合GTP時它可以綁定下游效應物激活下游反應。至今，M-Ras幾個候選效應物已有酵母雙雜交證實，包括RPM, Nore1, AF-6, Rin1, RalGDS, Raf-1, and A-Raf。M-Ras具有很多調節(jié)物，有p21Ras蛋白特性，H-Ras，N-Ras，K-Ras。鳥嘌呤交換因子(GEFs)，促使GDP釋放，陰性調節(jié)劑包括GTP激活蛋白(GAPs)，是Ras與GTP結合，并增強GTP酶活性，導致失活狀態(tài)構想變化。

已知的M-Ras的效應物不能說明其功能，體內與其相互作用的物質應該解釋其細胞功能，包括，生長，分化和瘤形成。本文的目的是尋求一種普遍的方法來鑒定蛋白質的互作，方便我們的研究。通過甲醛處理，作者認為可以交聯(lián)到帶有抗原決定簇標簽的靶基因的互作蛋白。與靶基因互作的基因可以通過已知基因的抗體把互作基因共純化下來。純化的復合物通過SDS-PAGE純化出來，通過多維液相層析/串聯(lián)式質譜法分析

R6X細胞表達帶有Myc標簽的組成型激活M-Ras突變體，用某種濃度的多聚甲醛處理20min，包含M-Ras用Western分析（Myc抗體），M-Ras約在29kDa處，在1%多聚甲醛處理后其上方約50kDa處有兩條明顯的條帶。隨著多聚甲醛濃度從0.125%到1%增加，這兩條帶越來越明顯，表面M-Ras至少和兩條蛋白交聯(lián)，大小約20kDa。由于不溶性沉淀出現(xiàn)在細胞裂解物中，所以沒有測定更高濃度的多聚甲醛。除了上面的條帶外，約37kDa的條帶在Western（抗Myc的抗體）中一直被發(fā)現(xiàn)，為了選擇1%多聚甲醛的最適作用時間，做了一組選擇最適時間的試驗。孵育時間在10,20min時M-Ras復合體的產(chǎn)量高。條帶彌散表明雜交時間太長。因此過度的雜交，則會造成抗原決定簇位點的掩蓋，這是由于賴氨酸或其他由于甲醛作用的位點擴大化。最后把1%多聚甲醛，20min固定作為體內M-Ras交聯(lián)的最適條件。

Q71LWTR6X細胞中表達pMXpie空載體，M-Ras(突變)，M-Ras，通過交聯(lián)與非交聯(lián)用Western雜交觀察M-Ras表達量。多聚甲醛交聯(lián)后用紅外成像系統(tǒng)觀察到多余復合物的出現(xiàn)。這些復合物表達量較低，大小在65kDa到250kDa.只是在突變的表達載體中看到的，因為突變的載體處于激活狀態(tài)，其效應物和負調控因子與其結合，增加了蛋白含量。3.2 免疫親和純化與M-Ras交聯(lián)的蛋白

Q71L為了鑒別與M-Ras(突變)結合的蛋白，需要純化出足夠的復合體以供質譜分析。所以我們需要對地表達量的條帶進行富集。起初，作者想用商業(yè)化的抗Myc的親和樹脂來小范圍的純化大量的SDS-PAGE中觀察到的條帶。雖然富集量很大，通過Western雜交顯示仍不夠。按比例增加反應量，合并收集液，收益很小，且增加了非特異條帶。為此，作者采用免疫親和層析大范圍純化復合體。柱子上灌入親和樹脂，其共價結合抗Myc的抗體的蛋白G瓊脂糖珠。純化之前，細胞裂解液先于蛋白G瓊脂糖珠處理，然后，與親和樹脂孵育。經(jīng)過洗滌后，結婚有復合體的珠子用低pH的洗提也洗，然后立即從新洗滌以免蛋白質被破壞。在進行蛋白分離之前，甲醛交聯(lián)復合體先復興即從新解離。甲醛是與主鏈氨基上的賴氨酸殘疾反應形成交聯(lián)，解交聯(lián)將會抑制，1)凝膠被溶解時，多肽鏈形成。胰蛋白酶消化位點丟失。2）殘留物中含有多個位點參與化學交聯(lián)3）來自不同蛋白的多肽用胰蛋白酶消化。幾種解交聯(lián)地方法，我們選擇了Hall et al，樣品在5*SDS-PAGE中煮沸20min，用Western雜交顯示煮沸法是否適用與解交聯(lián)，結果很成功。Myc變性或修飾的因素應該被排除，因為M-Ras條帶清晰可見。

3.3 質譜分析共純化的蛋白

三次共純化的復合物收集一起，經(jīng)過解交聯(lián)反應，再用SDS-PAGE分離。用考馬斯亮藍染色，與對照組相比，實驗組顯示有多條蛋白。從膠中切下16條帶，再用胰蛋白酶消化。抽提蛋白，用液體色譜法分離，流出液電噴入QSTAR quadrupole-TOF質譜儀的樣品孔。串聯(lián)質譜分析以此出現(xiàn)的多肽數(shù)據(jù)，分析顯示有19中蛋白，每種至少有五個特有的肽序列。最亮的那條帶為244分（基準分為37）.

第五篇：高一生物教案：蛋白質的鑒定

高一生物教案：蛋白質的鑒定

【】鑒于大家對查字典生物網(wǎng)十分關注，小編在此為大家整理了此文“高一生物教案：蛋白質的鑒定”，供大家參考!本文題目：高一生物教案：蛋白質的鑒定

【實驗一】 生物組織中還原糖、脂肪、蛋白質的鑒定

一、教學目的

初步掌握鑒定生物組織中還原糖、脂肪、蛋白質的基本方法。

二、教學建議

教材中本實驗安排為驗證性實驗，有條件的學?？梢愿臑樘剿餍詫嶒?，安排在講課之前，或與講課同步進行。本實驗難度并不大，但內容較多，實驗時間較長，因此，必須作周密安排，才能按時完成。實驗中應注意以下幾點。1.增設教師演示實驗。上課之前，教師應該準備好做演示實驗所需的實驗材料、用具、儀器和試劑等。同時，逐項完成還原糖、脂肪、蛋白質3類有機物的鑒定實驗。在實驗課上，將3個實驗的正確結果分別展示在講臺上，并作扼要的介紹，以便使學生將自己的實驗結果與教師的演示實驗作比較。2.實驗中學生應分工合作。在“還原糖的鑒定”實驗中，當每組兩個學生中的一個制備生物組織樣液時，另一個學生可以用酒精燈將水煮開，以便縮短實驗的等待時間。在“脂肪的鑒定”實驗中，一個學生制作臨時裝片時，另一個學生則可以調試顯微鏡。另外，在完成前兩個實驗時，一個學生洗刷試管、清洗玻片和整理顯微鏡，另一個學生則可以進行后一個實驗的操作。

3.關于鑒定還原糖的實驗，在加熱試管中的溶液時，應該用試管夾夾住試管上部，并放入盛開水的大燒杯中加熱。注意試管底部不要接觸燒杯底部，同時試管口不要朝向實驗者，以免試管內溶液沸騰時沖出試管，造成燙傷。如果試管內溶液過于沸騰，可以上提試管夾，使試管底部離開大燒杯中的開水。

4.做鑒定還原糖和蛋白質的實驗時，在鑒定之前，可以留出一部分樣液，以便與鑒定后的樣液的顏色變化作對比，這樣可以增強說服力。

5.斐林試劑的甲液和乙液混合均勻后方可使用，切勿將甲液和乙液分別加入組織樣液中。

三、參考資料

還原糖的鑒定原理 生物組織中普遍存在的還原糖種類較多，常見的有葡萄糖、果糖、麥芽糖。它們的分子內都含有還原性基團(游離醛基或游離酮基)，因此叫做還原糖。蔗糖的分子內沒有游離的半縮醛羥基，因此叫做非還原性糖，不具有還原性。本實驗中，用斐林試劑只能檢驗生物組織中還原糖存在與否，而不能鑒定非還原性糖。

斐林試劑由質量濃度為0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液和質量濃度為0.05 g/mL的硫酸銅溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡藍色的Cu(OH)2沉淀。Cu(OH)2與加入的葡萄糖在加熱的條件下，能夠生成磚紅色的Cu2O沉淀，而葡萄糖本身則氧化成葡萄糖酸。其反應式如下：

CH2OH—(CHOH)4—CHO+2Cu(OH)2→CH2OH—(CHOH)4—COOH+Cu2O↓+2H2O

用斐林試劑鑒定還原糖時，溶液的顏色變化過程為：淺藍色棕色磚紅色(沉淀)。

蛋白質的鑒定原理 鑒定生物組織中是否含有蛋白質時，常用雙縮脲法，使用的是雙縮脲試劑。雙縮脲試劑的成分是質量濃度為0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液和質量濃度為0.01 g/mL的硫酸銅溶液。在堿性溶液(NaOH)中，雙縮脲(H2NOC—NH—CONH2)能與Cu2+作用，形成紫色或紫紅色的絡合物，這個反應叫做雙縮脲反應。由于蛋白質分子中含有很多與雙縮脲結構相似的肽鍵，因此，蛋白質可與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應。

用于鑒定還原糖的實驗材料準備植物組織是常用的實驗材料，但必須加以選擇。在雙子葉植物中，光合作用的主要產(chǎn)物葡萄糖形成后，合成為淀粉，暫時儲藏在葉子內，因此最好不用雙子葉植物的葉子作實驗材料。有些單子葉植物，如韭菜、鳶尾，并不將光合作用的初始產(chǎn)物轉變?yōu)榈矸?，因此葉內含有大量的可溶性單糖，但是，由于葉片中葉綠素的顏色較深，對于鑒定時的顏色反應起著掩蓋作用，導致實驗現(xiàn)象不明顯，因此，也不宜用單子葉植物的葉子作實驗材料。本實驗最理想的實驗材料是還原糖含量較高的植物組織(或器官)，而且組織的顏色較淺或近于白色的，如蘋果和梨的果實。經(jīng)試驗比較，顏色反應的明顯程度依次為蘋果、梨、白色甘藍葉、白蘿卜。

用于鑒定脂肪的實驗材料 準備實驗材料最好選擇富含脂肪的種子，如花生種子(取其子葉)。供實驗用的花生種子，必須提前浸泡3～4 h。浸泡時間短了，不容易切成片;浸泡時間過長，則組織太軟，切下的薄片不易成形。

做鑒定脂肪的實驗，教師可根據(jù)本地區(qū)的情況選用蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ染液。蘇丹Ⅲ染液遇脂肪的顏色反應為橘黃色，蘇丹Ⅳ染液遇脂肪的顏色反應為紅色。因蘇丹Ⅳ染液與脂肪的親和力比較強，所以，染色的時間應比較短，一般為1 min左右。用于鑒定蛋白質的實驗材料準備 實驗材料最好選用富含蛋白質的生物組織(或器官)，植物材料常用的是大豆種子，動物材料常用的是雞蛋(卵白)。如用大豆種子，必須提前浸泡1～2 d，這樣容易研磨成漿。有條件的學校，可以直接采用現(xiàn)成的大豆磨成的豆?jié){，豆?jié){可以購買，也可用小型的研磨機制取。利用豆?jié){作實驗材料，可以節(jié)約實驗時間。如果用稀釋的卵白作實驗材料，效果會更好。斐林試劑的配制 甲液質量濃度為0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液 乙液質量濃度為0.05 g/mL的硫酸銅溶液

使用時臨時配制，將4～5滴乙液滴入2 mL甲液中，配完后立即使用。

蘇丹Ⅲ溶液的配制 稱取0.1 g蘇丹Ⅲ干粉，溶于100 mL體積分數(shù)為95%的酒精中，待全部溶解后再使用。

蘇丹Ⅳ溶液的配制 稱取0.1 g蘇丹Ⅳ干粉，溶于50 mL丙酮中，再加入體積分數(shù)為70%的酒精50 mL，充分混合后即可使用。

雙縮脲試劑的配制 取10 g氫氧化鈉放入容量瓶(或有刻度的燒杯)中，加水至100 mL，待充分溶解后倒入試劑瓶中，配成質量濃度為0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液，瓶口塞上膠塞，貼上標簽，寫上試劑A。

取1 g硫酸銅放入容量瓶(或有刻度的燒杯)中，加水至100 mL，待充分溶解后倒入試劑瓶中，配成質量濃度為0.01 g/mL的硫酸銅溶液(藍色)。瓶口塞上膠塞，貼上標簽，寫上試劑B。