第一篇：芝麻素減輕自發(fā)性高血壓大鼠腎臟纖維化作用及其機(jī)制討論論文

原發(fā)性高血壓是發(fā)病率較高的常見疾病。發(fā)病率呈逐年上升趨勢，若不及時(shí)治療，可發(fā)展為慢性腎衰竭或尿毒癥而危及生命。目前，高血壓腎病機(jī)制尚不十分清楚，其主要的病理改變?yōu)槟I間質(zhì)纖維化與腎小球硬化。其中腎間質(zhì)纖維化是決定腎臟疾病發(fā)展和預(yù)后的重要因素，是所有原發(fā)或繼發(fā)慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰竭的共同途徑。芝麻素(sesamin，Ses)是從芝麻中提取出來的有效活性成分，具有調(diào)節(jié)血壓、血脂，保護(hù)與改善肝腎功能及抗腫瘤等藥理作用。本課題組前期研究已證實(shí)，Ses 具有減輕自發(fā)性高血壓大鼠腎損傷的保護(hù)作用，但深入的機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)為研究對象，探討Ses 減輕大鼠腎臟纖維化的作用及其可能存在的機(jī)制。材料與方法

1.1 藥品和試劑

芝麻素(分子式C20H15O6，相對分子質(zhì)量354.34，純度≥98%)，購自上海純優(yōu)生物科技有限公司;卡托普利片(批號:13030711)，購自常州制藥廠有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、BCA(bicinchoninicacid)蛋白濃度檢測試劑盒、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA，批號: AA132)抗體均購自碧云天生物技術(shù)研究所;轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1，批號:BA0290)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9，批號:BA2202)、基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑-1(TIMP-1，批號: BA3727)抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器

ALC-NIBP 無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測定分析系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司);DYCP-34A 型電泳槽、DYY-Ⅲ-8B 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳(北京六一儀器廠);Mini PROTEAN 轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、MiniPROTEAN 電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司);CS-15臺(tái)式離心機(jī)(Beckman Coulter);SIEMENS RXLMAX全自動(dòng)生化儀(上海西門子有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物及分組10 周齡雄性SHR 大鼠28 只，WKY 大鼠7 只，體質(zhì)量180 ～ 200 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號為SCXK(滬)2012-0002，合格證號為2007000552035。大鼠每4 只1 籠進(jìn)行飼養(yǎng)，自然光照，室溫(23 ± 2)℃，相對濕度60% ～ 65%，動(dòng)物可自由進(jìn)食飲水。SHR 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3周后，隨機(jī)分為4 組: 模型(SHR)組、芝麻素低、高(80、160 mg /kg)劑量組及卡托普利(30 mg /kg)組，以同周齡WKY 大鼠作為對照組。按上述設(shè)定劑量灌胃給藥，每日一次，連續(xù)12 周。

1.4 測量

血壓采用尾動(dòng)脈無創(chuàng)測壓法。在干燥、安靜的環(huán)境中，將清醒狀態(tài)下的大鼠放置于37 ℃ 恒溫袋內(nèi)預(yù)熱15 min，用ALC-NIBP 無創(chuàng)血壓計(jì)測量尾動(dòng)脈舒張壓，在大鼠安靜狀態(tài)下連續(xù)測定3 次，每次間隔1 ～ 2 min，取其平均值。

1.5 生化指標(biāo)檢測

全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測定各組大鼠血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)和尿微量白蛋白(U-mAlb)含量;黃嘌呤氧化酶法測定SOD;硫代巴比妥酸法測定MDA。具體方法、操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 腎臟病理學(xué)變化

觀察給藥12 周后，10%水合氯醛(0.33 g /kg，i.p.)麻醉各組大鼠，取腎臟組織，置入4%多聚甲醛溶液中固定48 h 后，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化等，進(jìn)行HE 和Masson染色，光鏡下觀察腎臟病理學(xué)變化。

1.7 免疫組織化學(xué)法測

TGF-β1、α-SMA 陽性細(xì)胞的表達(dá)按照厚度約為5 μm/片的標(biāo)準(zhǔn)將各組大鼠腎臟石蠟橫斷面連續(xù)切5 ～ 6 片，切片常規(guī)脫蠟至水。嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說明書操作。將免疫組化染色的切片在光鏡下統(tǒng)一放大10 ×40 倍，采用Image-pro plus 圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，將每只大鼠腎組織染色切片各取5 個(gè)相同單位面積的區(qū)域，棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，測定TGF-β1及α-SMA 陽性細(xì)胞的積分光密度值(IOD)，計(jì)算其平均積分光密度值(AIOD)。

1.8 Western blot 測TGF-β1、α-SMA、MMP-9、TIMP-1 蛋白的表達(dá)

RIPA 裂解液裂解腎組織，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測蛋白濃度，每孔上樣50 μg 蛋白，SDS-PAGE(12%)電泳分離樣品。電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫下封閉液封閉1 h，一抗孵育(4 ℃)過夜。然后用洗滌液洗膜10 min × 3 次，再將膜浸入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H + L)(1∶ 2 000)中，室溫下孵育60 min，洗膜10 min × 3 次，ECL 發(fā)光顯色，曝光、顯影及定影，采用Image J 1.43 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，條帶強(qiáng)度用集成光密度值表示。(目的蛋白集成密度值/β-actin 集成密度值)為目的蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(x ± s)表示，2 組間比較，方差不齊用t' 檢驗(yàn)，方差齊用非配對t 檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析(ANOVA)分析。P < 0.05 為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果

2.1 芝麻素對SHR 大鼠舒張壓的影響給藥前，各組SHR 大鼠舒張壓均明顯高于正常組(P< 0.01)。當(dāng)模型組大鼠給藥治療后，在12 周內(nèi)其舒張壓隨時(shí)間的延長逐漸下降，尤其在給藥第8 周后，與模型組比較，芝麻素各劑量組與卡托普利組大鼠舒張壓明顯下降(P < 0.01)。提示芝麻素具有一定降低SHR 大鼠血壓的作用。

2.2 芝麻素對SHR 大鼠生化指標(biāo)的影響與正常組比較，模型組大鼠Scr、BUN、U-mAlb 及MDA含量明顯升高，SOD 水平顯著降低(P < 0.01)。與模型組相比，芝麻素低、高劑量組及卡托普利組Scr、BUN、U-mAlb、MDA 含量均顯著下降，SOD水平明顯提高(P < 0.05，P < 0.01)，其中芝麻素高劑量組與卡托普利組效果更明顯。提示芝麻素具有減輕SHR 大鼠腎損傷的作用，可能與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

2.3 芝麻素對SHR 大鼠腎臟形態(tài)學(xué)的影響正常組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)均正常。與正常組比較，HE 結(jié)果顯示模型組大鼠腎小球系膜區(qū)基質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)顆粒變性伴萎縮，腎間質(zhì)發(fā)生纖維化伴淋巴-單核細(xì)胞浸潤;Masson 染色結(jié)果顯示腎小球系膜區(qū)與腎小管周圍出現(xiàn)大量藍(lán)染膠原沉積，纖維增生和間質(zhì)纖維化。與模型組相比較，用藥組HE、Masson 染色均顯示腎小球系膜基質(zhì)增生和腎小管上皮細(xì)胞變性明顯減少，膠原沉積和腎間質(zhì)纖維化程度顯著減輕。提示芝麻素具有一定改善SHR 大鼠腎臟纖維化的作用。

2.4 芝麻素對SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細(xì)胞表達(dá)的影響正常組大鼠腎小管上皮細(xì)胞、基膜和腎間質(zhì)中，極少表達(dá)TGF-β1、α-SMA，僅見很少量的棕黃色顆粒沉積;模型組TGF-β1陽性細(xì)胞表達(dá)主要在腎小管上皮細(xì)胞，可見大量棕黃色顆粒沉積，α-SMA 陽性細(xì)胞表達(dá)主要在腎小管基膜及腎間質(zhì)中，出現(xiàn)大量棕黃色顆粒沉積;而用藥組腎小管基膜、上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)中棕黃色顆粒沉積明顯減少。半定量分析結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增強(qiáng)(P < 0.01);而與模型組相比，芝麻素、卡托普利能不同程度地減弱大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細(xì)胞表達(dá)(P<0.05，P < 0.01)。提示芝麻素具有下調(diào)SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細(xì)胞表達(dá)的作用。

2.5 芝麻素對SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達(dá)的影響模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達(dá)水平與正常組比較，顯著增加(P < 0.01);而與模型組相比，芝麻素與卡托普利能不同程度地降低SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達(dá)水平，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05，P < 0.01，圖4)。提示芝麻素可下調(diào)SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白的表達(dá)水平。

2.6 芝麻素對SHR 大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)水平的影響與正常組比較，模型組大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)，尤其是TIMP-1 表達(dá)顯著增強(qiáng)，MMP-9 /TIMP-1 比值明顯降低(P < 0.01);與模型組比較，芝麻素高劑量組及卡托普利組大鼠腎臟MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)水平降低，且TIMP-1 表達(dá)水平下降更顯著，MMP-9 /TIMP-1 比值明顯增大(P < 0.05，P<0.01)。提示芝麻素能下調(diào)SHR 大鼠腎組織MMP-9 和TIMP-1 蛋白的過度表達(dá)，尤其下調(diào)TIMP-1 表達(dá)更為顯著，增大MMP-9 /TIMP-1 比值。討論

腎纖維化是高血壓的常見并發(fā)癥之一，是反映腎功能損傷程度的最主要指標(biāo)。腎纖維化形成的主要機(jī)制包括膠原過量聚集、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在腎間質(zhì)過度積聚與沉積、α-SMA 不斷活化、成纖維細(xì)胞大量增生等。腎纖維化若不積極治療最終可發(fā)展為腎衰竭而危及生命。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑卡托普利已廣泛應(yīng)用于心衰、高血壓及腎臟疾病等治療。它不僅具有抗脂質(zhì)過氧化、降低血壓等作用，而且能有效降低血肌酐、尿蛋白排泄，改善腎小球血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，延緩腎小球硬化等。因此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用卡托普利作為陽性對照藥。

實(shí)驗(yàn)中，HE 和Masson 染色結(jié)果顯示，模型組大鼠腎小球系膜區(qū)基質(zhì)伴有增生和膠原纖維沉積，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生顆粒變性伴萎縮，腎間質(zhì)出現(xiàn)大量藍(lán)染膠原纖維增生，提示高血壓時(shí)腎臟發(fā)生纖維化。用藥后，芝麻素明顯改善腎小管及腎間質(zhì)病變，表明芝麻素可減輕SHR 大鼠腎損傷，該結(jié)果與前人報(bào)道基本一致。研究還發(fā)現(xiàn)給予芝麻素處理后，在12 周內(nèi)，模型組大鼠舒張壓隨著治療時(shí)間的延長而降低，尤其在治療后第8 周下降明顯，且以芝麻素高劑量組效果顯著，提示芝麻素具有降低SHR 大鼠血壓的作用，呈劑量依賴性，其結(jié)果與本課題組前人報(bào)道一致。UmAlb是高血壓早期腎功能損害的檢測指標(biāo)，BUN、Scr 是反映中晚期腎功能改變的常用指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠U-mAlb、BUN、Scr 含量均顯著升高，而芝麻素能明顯降低以上指標(biāo)，尤其是高劑量組效果顯著。

研究已證實(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)是高血壓腎損傷進(jìn)展的重要因素之一，持續(xù)高血壓狀態(tài)可使氧化應(yīng)激水平增加，抗氧化活性降低，使活性氧簇的生成顯著超過機(jī)體清除能力，從而導(dǎo)致機(jī)體腎組織結(jié)構(gòu)損傷。MDA 水平反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度和含量，間接反映細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度，SOD 屬于機(jī)體內(nèi)氧自由基清除酶體系重要成員之一。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎臟MDA含量顯著升高，SOD 活性明顯降低。與模型組相比，芝麻素組及卡托普利組MDA 含量明顯減少，SOD 活性顯著升高。提示芝麻素可通過提高腎臟SOD 活性，降低MDA 含量來抑制高血壓腎臟過度激活的氧化應(yīng)激反應(yīng)。TGF-β1是最重要的促纖維化因子，參與誘導(dǎo)腎臟纖維化過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)。大量研究證實(shí)，持續(xù)高血壓狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體抗氧化活性下降，氧化應(yīng)激水平增加，促使腎臟細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致活性氧簇生成增多，從而上調(diào)一些細(xì)胞因子的表達(dá)，如TGF-β1、結(jié)締組織生長因子(CTGF)等，進(jìn)而促使腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成為肌成纖維細(xì)胞，而肌成纖維細(xì)胞是合成ECM 的主要細(xì)胞。α-SMA 是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物，在TGF-β1刺激下，α-SMA 會(huì)明顯活化，表達(dá)顯著上升;TGF-β1等細(xì)胞因子還可促使基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMPs)及其特異性抑制劑組織金屬蛋白酶抑制物(tissueinhibitors of metalloproteinases，TIMPs)過度表達(dá)，引起ECM 過度沉積，抑制蛋白酶生成，減少基質(zhì)降解等，從而最終導(dǎo)致腎臟纖維化。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細(xì)胞和蛋白表達(dá)均顯著增加，表明持續(xù)高血壓狀態(tài)過度激活TGF-β1、α-SMA 的活性。而給予芝麻素處理后，兩者陽性細(xì)胞和蛋白表達(dá)均明顯減少，提示芝麻素可下調(diào)SHR 大鼠腎臟過度激活的TGF-β1，進(jìn)而進(jìn)一步阻滯α-SMA 活化，從而抑制腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，有效遏制腎臟纖維化的進(jìn)程。

MMPs /TIMPs 是參與腎臟細(xì)胞外基質(zhì)降解的重要酶系統(tǒng)，其活性變化對于維持腎臟ECM 生成與降解的動(dòng)態(tài)平衡十分重要。文獻(xiàn)報(bào)道，在持續(xù)高血壓狀態(tài)下，過度激活的TGF-β1可與腎小球高壓相互作用，促使腎組織ECM 降解系統(tǒng)尤其是MMPs /TIMPs 功能紊亂，引起兩者過度表達(dá)或平衡失調(diào)，抑制ECM 降解，促進(jìn)其生成，從而最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。MMPs 能水解ECM 中的各種蛋白成分，其活化被認(rèn)為是ECM 降解的限速關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中MMP-9 主要降解膠原與明膠等，從而緩解腎間質(zhì)纖維化。TIMP-1 是MMP-9 特異性抑制劑，正常情況下MMP-9 與TIMP-1 按1∶ 1比例釋放，兩者共同維持ECM 生成與降解的平衡。有研究表明，腎硬化等ECM 增多的疾病中均有TIMP-1 過度表達(dá)或MMP-9 /TIMP-1 比值降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1 表達(dá)均增強(qiáng)，且TIMP-1 表達(dá)增強(qiáng)較MMP-9 更為顯著，MMP-9 /TIMP-1 比值明顯降低，與前人文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。而給予芝麻素處理后，MMP-9、TIMP-1 表達(dá)均減弱，但TIMP-1表達(dá)減弱較MMP-9 更明顯，MMP-9 /TIMP-1 比值顯著升高。提示持續(xù)高血壓狀態(tài)下，腎臟TGF-β1表達(dá)增多，促使MMP-9 與TIMP-1 過度表達(dá)或失衡，尤其是TIMP-1 表達(dá)顯著增強(qiáng)，從而進(jìn)一步加重腎組織腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。而芝麻素能有效下調(diào)MMP-9 及TIMP-1 在腎組織的過度表達(dá)，尤其下調(diào)TIMP-1 表達(dá)更顯著，上調(diào)MMP-9 /TIMP-1，恢復(fù)MMP-9 與TIMP-1 間的平衡，減少細(xì)胞外基質(zhì)積聚與沉積，從而減輕腎臟纖維化。綜上所述，本課題組推測芝麻素可能是通過其降壓和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制TGF-β1過度激活，進(jìn)而阻滯α-SMA 活化，下調(diào)TIMP-1 過度表達(dá)，上調(diào)MMP-9 /TIMP-1，恢復(fù)MMP-9 與TIMP-1間平衡，從而減少膠原過量聚集、ECM 在腎間質(zhì)過度積聚及成纖維細(xì)胞大量增生等，發(fā)揮減輕自發(fā)性高血壓大鼠腎臟纖維化作用。但其深入而全面的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。