第一篇：質(zhì)粒DNA提取定量酶切與PCR鑒定實(shí)驗(yàn)報(bào)告

粒 質(zhì)粒 DNA 的提取、定量、酶切與 PCR 判定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.學(xué)習(xí)并掌握用堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA 的要領(lǐng)； 2.學(xué)習(xí)并掌握了解質(zhì)粒酶切判定的要領(lǐng)； 3.學(xué)習(xí)并掌握紫外吸收檢測 DNA 濃度和純度的原理和要領(lǐng)； 4.學(xué)習(xí)并掌握 PCR 基因擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)原理和操縱要領(lǐng)； 5.學(xué)習(xí)并掌握水平式瓊脂糖凝膠電泳的原理和使用要領(lǐng)。

二、實(shí)驗(yàn)原理 1.PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒错?

在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，以 dNTP 為原料，通過變性、退火、延伸等步調(diào)，在體外（緩沖液中）復(fù)制 DNA，使目的 DNA 按 2 n 方法呈指數(shù)形式擴(kuò)增。

PCR 一次循環(huán)的具體反響步調(diào)為：

A.變性：加熱反響系統(tǒng)至 95℃，使模板 DNA 在高溫下完全變性，雙鏈解鏈。

B.退火：逐漸低落溶液溫度，使合成引物在低溫（35－70℃,一般低于模板 Tm 值的 5℃左右），與模板 DNA 互補(bǔ)退火形成部分雙鏈。

C.延伸：溶液反響溫度升至中溫 72℃，在 Taq 酶作用下，以 dNTP 為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板 DNA 的一條單鏈在解鏈和退火之后延伸為一條雙鏈。

2.質(zhì)粒 DNA 的提取與制備(1).堿裂解法：

染色體 DNA 與質(zhì)粒 DNA 的變性與復(fù)性存在差別：

A.高堿性條件下，染色體 DNA 和質(zhì)粒 DNA 均變性；

B.當(dāng)以高鹽緩沖液調(diào)治其 pH 值至中性時，變性的質(zhì)粒 DNA 復(fù)性并生存在溶液中，染色體 DNA 不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可通過離心形成沉沉淀去除。

(2).離心層析柱：

A.硅基質(zhì)膜在高鹽、低 pH 值狀態(tài)下可選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒 DNA，而不吸附溶液中的卵白質(zhì)和多糖等物質(zhì)； B.通已往卵白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌身分去除； C.低鹽，高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。

3.質(zhì)粒 DNA 的定量闡發(fā)（紫外分光光度法）：

A.物質(zhì)在光的照射下會產(chǎn)生對光的吸收效應(yīng)，且其對光的吸收是具有選擇性； B.種種差別的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜: DNA 分對波長 260nm 的紫外光有特異的吸收峰 卵白質(zhì)對波長 280nm 的紫外光有特異的吸收峰 碳水化合物對 230nm 的紫外光有特異的吸收峰 C.A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反響 DNA 的純度； A260/A280=1.8

DNA 純凈 A260/A280<1.8

體現(xiàn)樣品中含卵白質(zhì)（芳香族）或酚類物質(zhì)

A260/A280>1.8

含 RNA 雜質(zhì)，用 RNA 酶去除。

4.質(zhì)粒 DNA 的酶切判定：

限制性內(nèi)切酶是 DNA 重組操縱歷程中所使用的根本東西。限制性內(nèi)切酶能特異性地與一段被稱為限制酶識別序列的特殊 DNA 序列結(jié)合，或是與其四周的特異位點(diǎn)結(jié)合，并在結(jié)合位點(diǎn)切割雙鏈 DNA。

5.瓊脂糖凝膠電泳：

瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的巨細(xì)決定于瓊脂糖的濃度。

DNA 分子在堿性情況中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。

DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)：差別的 DNA，分子量巨細(xì)及構(gòu)型差別，電泳時的泳動率就差別，從而分出差別的區(qū)帶(遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比干系).三、質(zhì)料與要領(lǐng)：

：

（一）實(shí)驗(yàn)質(zhì)料：

：

1.PCR 儀器：PCR 儀、臺式離心機(jī)、微量加樣槍、滅菌的薄壁離心管 質(zhì)料：菌液【大腸桿菌 DH5a 菌株(pMD19-T 質(zhì)粒,含目的片段-綠色熒光卵白 GFP)】、無菌去離子水、2×Premix Taq、引物 2.質(zhì)粒 DNA 的提取與制備 儀器：恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機(jī)、離心層析柱、Eppendorf 管、微量加樣槍、離心管 質(zhì)料：溶液 P1（S1）、溶液 P2(S2）、溶液 P3（S3）、去卵白液 PE（W1）漂洗液WB（W2）、洗脫液 EB（Eluent)、含 pMD19-T 質(zhì)粒的大腸桿菌 DH5α 3.質(zhì)粒 DNA 的定量（紫外分光光度法）

儀器：比色杯、紫外分光光度計(jì)、微量加樣槍 質(zhì)料：蒸餾水、質(zhì)粒ＤＮＡ 4.質(zhì)粒 DNA 的酶切判定 儀器：1.5ml 的 EP 管、微量加樣槍 質(zhì)料：無菌水、10×M 酶切緩沖液 Buf R、質(zhì)粒 DNA、Hind III(15U/ul)、EcoR I(12U/ul)5.瓊脂糖凝膠電泳

儀器：凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng) 質(zhì)料：電泳指示劑、Gelview、TBE、瓊脂糖、DNA Marker 5000、電泳緩沖液（二）實(shí)驗(yàn)要領(lǐng)

1..PCR..質(zhì)粒 DNA 的提取與制備

準(zhǔn)備目的 DNA：菌液煮沸 10min，冷凍，室溫解凍后離心取上清液 取 0.2 ml PCR 反響管一只，用微量加樣槍按下述順序分別參加：滅菌去離子水5.5μl、2*Premix Taq12.5μl、引物 1(10 mol/L)1μl、引物 2(10 mol/L)1μl、菌液 5μl 將裝有 PCR 反響體系的 PCR 反響管放入 PCR 儀上進(jìn)行如下操縱：

①94℃預(yù)變性5分鐘后開始以下循環(huán) ②循環(huán)為94℃——30 秒，50℃——30 秒，72℃ ——1 分鐘。循環(huán)為 30 次 ③72℃ 5 分鐘 ④4 ℃

保溫 取 1.5ml 培養(yǎng)物參加 Eppendorf 管中 將擴(kuò)增后的基因用微量加樣槍加到電泳儀的凝膠孔中

13000rpm x 1min，棄上清

將 PCR 反響管置臺式離心機(jī)中瞬時離心

3.質(zhì)粒 DNA 的定量（紫外分光光度法）

參加 250μl 溶液 S1，吹打，使細(xì)菌沉淀疏散，徹底懸浮

參加 250μl 溶液 S2，顛倒 4～6 次混勻（不要劇烈振蕩），直到溶液變得清亮

參加 350μl 溶液 S3，立即溫和混勻 6~8 次。13000rpm 離心 10min，小心取上清液（500-800μl）

將吸附柱放于收集管中，將上一步所得上清液參加吸附柱中，13000rpm 離心 3min，棄濾液

參加 500μl 去卵白液(W1)，13000rpm 離心 1min，棄濾液

向吸附柱中參加 700μl 漂洗液 W2，13000rpm 離心 1min，棄濾液；重復(fù)一遍 空柱 13000rpm 離心 1min，然后室溫安排 3min，使殘留乙醇揮發(fā) 取出吸附柱，放入一個潔凈的離心管中，在吸附膜的中間加 50μl 洗脫緩沖液(Eluent)，室溫安排 1min，13000rpm 離心 1min 洗脫質(zhì)粒 DNA，-20℃生存?zhèn)溆?清洗比色皿：用微量加樣槍向比色皿參加適量的蒸餾水刷洗，2~3 次。并用濾紙擦拭潔凈 空白比較比色測定 向比色皿參加 98ul 蒸餾水，進(jìn)行 Blank 調(diào)零 再向比色皿參加 2ul 的質(zhì)粒 DNA，于紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行‘sample’測定，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)

4..質(zhì)粒 DNA 的酶切判定

5.瓊脂糖凝膠電泳

四、結(jié)果與討論 ：

（一）實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象 1.參加溶液 P1，出現(xiàn)懸表現(xiàn)象； 2.參加溶液 P2,溫和混勻，溶液會變得清亮； 在一個潔凈的 1.5mlEP 管中按順序依次參加下述試劑

無菌水 9.0μl、10×M 酶切緩沖液 2.0μl、質(zhì)粒 DNA 7.0μl、Hind III(15U/ul)1.0μl、EcoR I(12U/ul)

1.0μl 小心混勻試劑，將 EP 管置于恒溫水浴箱中 37℃1.5 小時。

取質(zhì)粒 DNA、經(jīng)酶切反響后的 DNA 片段和 PCR擴(kuò)增的 DNA 各 6μl 于三個 EP 管中并做好標(biāo)記 往每個 EP 管中參加 1μlGelview 染料，室溫安排一分鐘 用微量加樣槍分別各吸取 10ul，按序號參加到電泳儀的凝膠孔中 電泳 30 分鐘

取出凝膠 紫外光下視察，拍照

3.參加溶液 P3,有白色絮狀沉淀生成； 4.電泳時，可視察到在電流作用下，點(diǎn)樣的溶液出現(xiàn)電泳現(xiàn)象，電泳速度差別。

在紫外檢測儀條件下，可以視察到差別的物質(zhì)出現(xiàn)差別的電泳帶。

（二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 丈量次數(shù)

質(zhì)粒 DNA 濃度（ug/ml）

Ratio 比值(A260/A280)

148

1.46

1.52

115

1.45平均值

123

1.47

電泳后的圖片

A:PCR 目的條帶

B:酶切片段

C:質(zhì)粒 DNA

（四）實(shí)驗(yàn)闡發(fā) 1.由上數(shù)據(jù)可知，Ratio=1.47

A260/A280<1.8

表明樣品中含有較多的卵白質(zhì)（芳香族）

2.在圖片中，其他三類 DNA 與 Maker 相比力，可知質(zhì)粒 DNA 的分子巨細(xì)在 2500bp-3500bp，酶切反響的質(zhì)粒 DNA 片段分子巨細(xì)在 2800-3000bp 和 400-500 左右，PCR 的 DNA 分子巨細(xì)在 400-500bp。根本切合預(yù)期。

（四）實(shí)驗(yàn)討論 1.質(zhì)粒 DNA 中出現(xiàn)三條帶，分別對應(yīng)超螺旋質(zhì)粒 DNA、線性 DNA 和開環(huán)狀質(zhì)粒 DNA。這三種差別構(gòu)型的分子有差別的遷移率，在一般情況下，遷移速度最快的為超螺旋型，其次為線性分子，最慢的為開環(huán)狀分子，所以條帶從上到下分別為：超螺旋型 DNA、線性分子、開環(huán)狀分子。, 2.對付實(shí)驗(yàn)結(jié)果中：A260/A280<1.8 的可能原因?yàn)椋?/p>

A.在質(zhì)粒 DNA 的提取實(shí)驗(yàn)的“取上清液”步調(diào)中吸入沉淀導(dǎo)致引入較多的卵白雜質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)中因卵白質(zhì)量較多而難以去除。

B.可能為試劑污染引起雜質(zhì)卵白的引入。

3.實(shí)驗(yàn)中需注意的事項(xiàng)：

用微量加樣槍加試劑時，同種試劑可以不消換吸頭，每次換差別試劑時要記得換一個新吸頭。

在 PCR 中，如果配好的反響液較多沾到管壁上，要將 PCR 反響管置臺式離心機(jī)中瞬時離心，使反響液會合于管底，然后才將反響管放到基因擴(kuò)增儀上。

在質(zhì)粒 DNA 提取的實(shí)驗(yàn)中，參加溶液 S2 時，時間不能太久，行動要溫柔，輕輕顛倒頻頻。

在電泳實(shí)驗(yàn)中，點(diǎn)樣時槍頭下伸，點(diǎn)樣孔內(nèi)不能有氣泡。

在電泳中，Geldview 有毒，切勿用手打仗。

思考題：

（1）堿裂解法提取質(zhì)粒時，溶液 I、II、III 的作用分別為？ 答：

溶液 I：螯合金屬離子，抑制脫氧核酸酶對 DNA 的降解作用；有利于溶酶體的作用。

溶液 II：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和卵白質(zhì)變性。

溶液 III：酸性條件下質(zhì)粒 DNA 復(fù)性，變性卵白-SDS+線性 DNA 沉淀，Na+可中和 DNA。

（2）結(jié)合實(shí)驗(yàn)情況，如何提高限制性酶切的反響效率？ 答：

①盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。

②酶量的選擇任何時候 2 種酶的總量不能凌駕反響體系的 1/10 體積，并且最大反響體系最好不要小于 20 ul，且酶切反響中甘油濃度應(yīng)低于 5%。

③底物 DNA 的純度：主要污染 DNA 的某些物質(zhì)，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反響應(yīng)盡量純化底物。

④反響系統(tǒng)：主要是反響緩沖液中的離子強(qiáng)度,如 NaCl 和 Mg2+, 符合離子強(qiáng)度可以引發(fā)酶切反響。

第二篇：質(zhì)粒DNA的提取、定量與酶切鑒定實(shí)驗(yàn)報(bào)告-2015級預(yù)防醫(yī)學(xué)-第2實(shí)驗(yàn)室

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

姓 名：

學(xué) 號：

專業(yè)年級： 2015級預(yù)防

組 別： 第二實(shí)驗(yàn)室

生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心

實(shí)驗(yàn)名稱 質(zhì)粒DNA的提取、定量與酶切鑒定

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn) 指導(dǎo)老師

教師簽名

第二實(shí)驗(yàn)室 實(shí)驗(yàn)日期 2016-12-1 合作者 評分

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

批改日期

1.掌握PCR基因擴(kuò)增的原理和操作方法 2.掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法

3.了解紫外吸收法檢測DNA濃度與純度的原理、方法 4.學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳操作

二、實(shí)驗(yàn)原理

1.PCR反應(yīng)：加熱使模板DNA在高溫下90℃-95變性，雙鏈解鏈；降低溶液溫度使合成引物在低溫（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），與模板DNA互補(bǔ)退火形成部分雙鏈；溶液反應(yīng)溫度升至中溫72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板DNA的一條單鏈在解鏈和退火之后延伸為一條雙鏈。

2.堿裂解法：基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，細(xì)菌線性染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，而質(zhì)粒DNA大部分氫鍵也斷裂，當(dāng)pH調(diào)至4.8的時候線狀染色體DNA片段難以復(fù)性而成纏連網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性蛋白質(zhì)與細(xì)胞碎片纏繞在一起而沉淀，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，并溶解于液相中。

3.離心層析柱：硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，不吸附蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)；通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除；低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

4.紫外光吸收法：物質(zhì)在光的照射下會產(chǎn)生對光的吸收效應(yīng)，而且物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的，各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜。因?yàn)榻M成核酸的堿基(G,A,T,C）在260nm處具有強(qiáng)吸收峰，所以通過測定260nm的吸收峰即可對DNA進(jìn)行定量。

5.瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度；DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動；DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶(遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系)。

三、材料與方法：

材料與儀器：

PCR反應(yīng)：PCR儀、加樣槍、菌液（大腸桿菌DH5a菌株）、引物、2×Premix Taq、滅菌去離子水；

質(zhì)粒DNA的提取與鑒定：臺式離心機(jī)、含pMD19-T質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α、AXYGEN試劑盒質(zhì)粒提取試劑盒、溶液 P1（S1，50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)、10 mmol/L EDTA(pH8.0))、溶液 P2(S2，0.2 mol/ L NaOH、1% SDS）、溶液 P3（S3，5mol/L 乙酸鈉 60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5ml）、去蛋白液 PE（W1)、漂洗液 WB(W2）、洗脫液 EB（Eluent)；

紫外光吸收法：比色杯、紫外分光光度計(jì)；

酶切鑒定：無菌水、10×M酶切緩沖液、質(zhì)粒DNA（來自質(zhì)粒DNA提取步驟）、Hind III(15U/ul)、EcoR I(12U/ul)瓊脂糖凝膠電泳：電泳指示劑、Gelview、TBE、瓊脂糖、DNA Marker 5000

實(shí)驗(yàn)方法：

煮菌，PCR（PCR程序最后設(shè)4℃保溫）

↓約2小時收集PCR產(chǎn)物

質(zhì)粒DNA提?。s1小時）

↓ 紫外檢測定量

↓ 酶切步驟 ↓ 酶切約1~2小時

↓

電泳（樣品：質(zhì)粒DNA，PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物，Marker）

↓約30分鐘 觀察電泳結(jié)果、記錄、拍照、保存

1.PCR反應(yīng)：

菌液煮沸10min, 冷凍，室溫解凍后離心取上清

↓

取0.2 ml PCR反應(yīng)管一只，用微量加樣槍分別加入各試劑

↓

在PCR儀中94℃預(yù)變性5分鐘后開始循環(huán)（94℃30 秒，50℃30 秒，72℃↓(循環(huán)30次)72℃ 5 分鐘，4 ℃ 保溫

2.質(zhì)粒DNA提取與定量）1min

取1.5ml培養(yǎng)物加入Eppendorf管中

↓

9000rpm×30 s，棄上清

↓

加入250μl 溶液S1，吹打，使細(xì)菌沉淀分散，徹底懸浮

↓

加入250μl 溶液S2，顛倒6～10次混勻（不要劇烈振蕩），直到溶液變得清亮

↓

加入400μl 溶液S3，立即溫和混勻，室溫放置3-5min。13000rpm離心10min，小心取上清液（700-800μl）

↓

將吸附柱放于收集管中，將上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm離心3min，棄濾液

↓

加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm離心1min，棄濾液

↓

向吸附柱中加入700μl 漂洗液W2，13000rpm離心1min，棄濾液

↓ 重復(fù)步驟8一次

↓

空柱13000rpm離心2min，然后室溫放置3min，使殘留乙醇揮發(fā)

↓

取出吸附柱，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間加60μl-100μl洗脫緩沖液(Eluent)，室溫放置1min，13000rpm離心1min洗脫質(zhì)粒DNA，-20℃保存?zhèn)溆?/p>

酶切鑒定：

在一個潔凈的1.5mlEP管中按順序依次加入試劑

↓

移液槍輕輕混勻,37℃水浴1.5h 瓊脂糖凝膠電泳：

將PCR、酶切及提取的質(zhì)粒DNA分別點(diǎn)樣入凝膠電泳槽中

↓ 電泳 ↓ 取出觀察并拍照

四、結(jié)果與討論：

結(jié)果：在本次實(shí)驗(yàn)中，三種產(chǎn)物從左到右為酶切產(chǎn)物，質(zhì)粒，PCR,如圖1；

圖1 在質(zhì)粒DNA的提取中，經(jīng)第一次離心過后的樣品中沉淀附著于EP管壁下方；而在對提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行純度鑒定時，可根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)比值估計(jì)核酸的純度（Ratio=A260/A280），Ratio= 1.8表示DNA樣品較純,符合實(shí)驗(yàn)要求，Ratio＞1.9表示有RNA污染，而Ratio＜1.6則表示有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染，我們所測得的A260與A280的比值分別為1.82，1.79，1.75，如圖2、3、4.圖2

圖3

A280 0.026 0.022 0.017 0.022

圖4

Ratio(A260/A280)1.82 1.79 1.75 1.79

測量次數(shù) 質(zhì)粒DNA的濃度（ug/ml）A260 1 2 3平均值 119.5 100.5 73 97.67

0.048 0.040 0.029 0.039 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后制版上呈現(xiàn)顏色不同且移動路程不同的點(diǎn)，如圖。

討論：我們組的DNA純度較純，Ratio值為1.79，但未達(dá)到1.8，說明混入了蛋白質(zhì)或其他雜物，有可能是在吸取上清液的時候吸入了蛋白質(zhì)或者是在操作過程中操作不當(dāng)，引入了污染物；也有可能是，因?yàn)榍懊娴耐瑢W(xué)在進(jìn)行紫外分光光度法測DNA的濃度及Ratio時用手多次接觸比色杯的光滑面，造成了后來我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有錯誤。每組質(zhì)粒DNA的濃度都大于55ug/ml，說明DNA濃度較純。

從瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看我們組做的PCR反應(yīng)及酶切鑒定都很成功，美中不足之處是質(zhì)粒DNA的濃度不夠，現(xiàn)象不是很明顯，說明我們沒有盡可能的吸取上清液，導(dǎo)致DNA含量不足。思考題：

（1）在堿裂解法提取質(zhì)粒DNA時，溶液1的作用是：葡萄糖懸浮細(xì)胞，EDTA鰲合金屬離子使DNase失活；溶液2的作用是：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，使核酸和蛋白質(zhì)變性；溶液3的作用是在酸性條件下使質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白-SDS＋線性DNA沉淀，而Na則可中和DNA。

（2）為了提高限制性酶切的反應(yīng)效率，應(yīng)保證DNA的純度，DNA樣品中應(yīng)不含有蛋白質(zhì)、金屬離子等雜質(zhì)，選擇合適的反應(yīng)容器，并應(yīng)在合適的pH、溫度下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及保證適當(dāng)?shù)拿笣舛?。?/p>

第三篇：質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定

質(zhì)粒DNA的酶切及瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定

一 目的學(xué)習(xí)質(zhì)粒的酶切及電泳分析。二 原理

限制性內(nèi)切酶可以識別雙鏈DNA特定位點(diǎn)，并產(chǎn)生特異的切割，形成粘性末端或平末端，這樣有利于DNA片段再連接。

限制性內(nèi)切酶對環(huán)狀質(zhì)粒DNA有多少切點(diǎn)，酶切后就能產(chǎn)生多少個片段。因此，鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷切點(diǎn)的數(shù)目；從片段遷移率的大小可以判斷酶切片段大小的差別。用已知相對分子量DNA為對照，通過電泳遷移率的比較，可以粗略地測出分子形狀相同的未知DNA的相對分子質(zhì)量。

質(zhì)粒DNA在細(xì)胞內(nèi)有三種構(gòu)象：①共價閉環(huán)DNA，常以超螺旋形式存在；②如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成開環(huán)DNA；③線狀DNA，雙鏈DNA斷開成線狀。電泳時，三種構(gòu)象中，共價閉環(huán)DNA遷移率最大，其次是線狀DNA和開環(huán)DNA。因此在本實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒在電泳中呈現(xiàn)2~3條區(qū)帶。

三 試劑與主要儀器

（一）試劑

1．EcoRⅠ酶 2．λ DNA

3．TBE緩沖液（5×）：用時需稀釋10倍 4．點(diǎn)樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油

5．溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶 注意：該試劑具致癌作用，用時要小心。6．瓊脂糖

（二）儀器

1．電泳儀系統(tǒng)2．紫外燈3．恒溫水浴箱

四 操作步驟

（一）質(zhì)粒DNA酶切

1．按下表將各種試劑分別加入每個Eppendorf管中，要注意管號。

管 號

質(zhì)粒DNA EcoRⅠ/ μl

酶切Buffer（10×）/ μl ddH2O/ μl RNA酶

① 102 8

② 10 1 2 7

③ 10 1 2 6 1

2．加樣后混勻，置于37℃水浴中，保溫2小時。然后每個管中加入4 μl Loading buffer。

（二）瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠的制備稱取0.4g瓊脂糖加入40ml 0.5×TBE緩沖液中，加熱熔解。冷卻至65℃時加入2 μl EB，混勻。膠板制備將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，并在一端插好梳子。然后倒入熔好的瓊脂糖，待凝膠完全凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽（槽中已加入0.5× TBE緩沖液），拔掉梳子。注意：緩沖液要高出膠面2毫米。加樣每個樣品中加入1/10體積點(diǎn)樣緩沖液，混勻后小心地加入樣品槽中，要避免相互污染。1-2㎝處時，停止電泳。觀察及照相將膠板拿出，用自來水小心地沖洗一下。在紫外燈下觀察結(jié)果，如果有條件也可用凝膠成像系統(tǒng)照相。

第四篇：dna的粗提取與鑒定

dna的粗提取與鑒定

實(shí)驗(yàn)十一 DNA的粗提取與鑒定

教學(xué)目的1、初步掌握DNA的粗提取和鑒定的方法

2、觀察提取出來的DNA物質(zhì)

實(shí)驗(yàn)原理

1、DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaCl的濃度的變化而改變的，dna的粗提取與鑒定。當(dāng)NaCl的物質(zhì)的量濃度為0.14mOl/L時,DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。

2、DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。

3、DNA遇二苯胺(沸水浴)會染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。

注意事項(xiàng)

1、步驟3析出含DNA的黏稠物中，蒸餾水要沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入，不能一次快速倒入。

2、實(shí)驗(yàn)中有多個步驟都要用玻璃棒進(jìn)行攪拌，但是在不同的步驟中玻璃棒的用法不同。

實(shí)驗(yàn)用具

雞血細(xì)胞液(5～10mL);體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精，蒸餾水，質(zhì)量濃度為0.1g/mL的檸檬酸鈉溶液，物質(zhì)的量濃度分別為2mol/L和0.015mol/L的NaCl溶液，二苯胺試劑;燒杯(100mL，1個，50mL，500mL，各2個)，漏斗，試管(20mL，2個)，玻璃棒，滴管，量筒(100mL，1個)，紗布，鑷子，濾紙，鐵架臺，鐵環(huán)，三角架，酒精燈，石棉網(wǎng)，載玻片，試管夾。

課時安排

一課時

課前準(zhǔn)備

制備雞血細(xì)胞液，方法是：將質(zhì)量濃度為0.1g/mL的檸檬酸鈉溶液100mL，置于500mL燒懷中，注入新鮮的雞血(約180mL)，用玻璃棒攪拌，使其充分混合，以免凝血。靜置于冰箱內(nèi)一天，使血細(xì)胞自行沉淀。也可以用離心機(jī)離心2 min(轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn)/分)。用吸管吸去上清液。

板書

實(shí)驗(yàn)十一 DNA的粗提取與鑒定

實(shí)驗(yàn)原理

1、析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2、用冷酒精提取出含雜質(zhì)較少的DNA。

3、DNA在沸水浴時被二苯胺染成藍(lán)色。

方法步驟：

1、提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)：順時針方向攪拌，稍快，稍重。5 min2、溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA3、析出含DNA的黏稠物：蒸餾水300mL，逆時針方向攪拌，緩慢

4、過濾：取黏稠物

5、再溶解：順時針方向攪拌，較慢。3 min6、過濾：取濾液。

7、提取出含雜質(zhì)較少的DNA，逆時針方向攪拌，稍慢。5 min8、DNA的鑒定：沸水浴5min((1)無變化(2)藍(lán)色)

上節(jié)課我們通過幾個驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，證明了DNA是主要的遺傳物質(zhì)，自我鑒定《dna的粗提取與鑒定》。那么DNA是什么樣的物質(zhì)呢?今天我們就通過實(shí)驗(yàn)將它提取出來，進(jìn)行觀察和鑒定。

通過預(yù)習(xí)，我們知道選用雞血細(xì)胞液作為實(shí)驗(yàn)材料。在制備雞血細(xì)胞液時，所用的檸檬酸鈉有防止血液凝固的作用。

制備過程中，一定要用剛宰殺的雞的新鮮血，并且要與抗凝劑充分混合，防止凝血。我們采用靜置一天的方法，獲得雞血細(xì)胞液。

大家在動手做實(shí)驗(yàn)之前先要明確幾個需要注意的問題。

1、要嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的方法步驟去操作。

2、實(shí)驗(yàn)中有多個步驟都要用玻璃棒進(jìn)行攪拌，使用時玻璃棒不要碰到燒杯底，在不同的步驟中玻璃棒的用法不同，每一步的用法參照黑板上的指導(dǎo)去操作。

3、在DNA的鑒定中，所用的二苯胺是一種有毒性的試劑，大家在使用時注意不要讓藥液接觸到皮膚或身體的其他部位，也不要近距離觀察。

下面在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中，要思考每一操作步驟要達(dá)到什么目的。

在進(jìn)行步驟1時，利用攪拌的5分鐘，做如下提問：

為什么要加蒸餾水?加入蒸餾水后細(xì)胞將會怎樣?

(讓細(xì)胞內(nèi)溶液的濃度大于周圍溶液的濃度，細(xì)胞會吸水以至脹破)

為什么要用力攪拌?

(可以加速血細(xì)胞和細(xì)胞核的破裂)

所以下一步驟過濾將濾去的是細(xì)胞膜和核膜等物質(zhì)。

在進(jìn)行步驟3時，要向全班明確：這一步驟是這個實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，注意加蒸餾水的方法和使用玻璃棒的方法，千萬不能太快太猛，防止打碎DNA。

觀察濾取出來的黏稠物的顏色。

有的同學(xué)提取的黏稠物較少，原因可能是在溶解DNA時不充分，也可能是析出黏稠物時攪拌的快了。

將黏稠物再溶解時一定要充分，多攪拌。以免有DNA損失。

加入冷酒精時動作要慢。

當(dāng)玻璃棒上出現(xiàn)絲狀物纏繞時，繼續(xù)慢慢攪拌。至不再增加時，取出吸干上面的水分。仔細(xì)觀察絲狀物呈什么顏色?(黃色)

這些絲狀物要用二苯胺鑒定。使用二苯胺時要注意不要接觸到藥液。進(jìn)行沸水浴時，在實(shí)驗(yàn)室較為通風(fēng)的地方集體進(jìn)行。

利用沸水浴的5 min。

步驟3中加入蒸餾水的目的?與步驟1有什么區(qū)別?

(步驟3中加蒸餾水是使NaCl溶液的濃度逐漸降至0.14mol/L，使DNA的黏稠物析出。而步驟1加蒸餾水是為了讓細(xì)胞吸水脹破)

步驟7為什么要加50mL的冷酒精?

(因?yàn)镈NA不溶于冷酒精，而其他物質(zhì)可以溶解在酒精中，使含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物可以析出。懸浮于溶液中)

現(xiàn)在大家從水浴鍋中拿出試管，比較兩個試管中溶液的顏色有什么不同?

(有絲狀物的試管變成藍(lán)色，另一試管還是原來顏色)

這一鑒定結(jié)果說明什么問題?

(提取出的絲狀物是DNA)

那么你看到的絲狀物的粗細(xì)是不是DNA分子的直徑呢?

(不是。DNA分子直徑只有2nm。絲狀物是多個DNA分子聚在一起形成的)

下面請同學(xué)們將實(shí)驗(yàn)用具，按原樣擺放整齊，實(shí)驗(yàn)桌要保持清潔。

今天我們通過實(shí)驗(yàn)將DNA提取出來進(jìn)行了觀察和鑒定，那么DNA的化學(xué)組成，分子結(jié)構(gòu)和復(fù)制是怎樣的?我們下節(jié)課再繼續(xù)研究。

第五篇：dna粗提取與鑒定

dna粗提取與鑒定

實(shí)驗(yàn)原理

DNA在氯化鈉溶液中的溶解度，是隨著氧化鈉的濃度的變化而改變的，dna粗提取與鑒定。當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 mol/L時，DNA的溶解度最大，濃度為 0.14 mol/L時，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在氯化鈉溶液中的DNA析出。

DNA不溶于95%的酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。

DNA中含有脫氧核糖，能與二苯胺(沸水浴)反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。

目的要求

1.學(xué)會DNA的粗提取和鑒定的方法。

2.觀察提取出來的DNA物質(zhì)的顏色和形狀。

材料用具

材料：活雞或鮮血雞血。

儀器：離心機(jī)、恒溫水裕鍋、載玻片，玻璃棒，濾紙，滴管，量簡(100 mL，l個)，燒杯(100 mL，l個，50 mL、500 mL各 2個)，試管(20 mL，2個)，漏斗，試管夾，紗布。

試劑：酒精的體積分?jǐn)?shù)為95%的溶液(實(shí)驗(yàn)前置于冰箱內(nèi)冷卻24 h)，蒸餾水，檸檬酸鈉的質(zhì)量濃度為 0.1g/mL的溶液，氯化鈉的物質(zhì)的量濃度分別為 2 mol/L和0.015 mol/L的溶液，二苯胺試劑。

方法步驟

實(shí)驗(yàn)前需要制備雞血細(xì)胞液(由教師完成)，制備的方法是：取檸檬酸鈉的質(zhì)量濃度為 0.1 g/mL的溶液(抗凝劑)100 mL，置于500 mL燒杯中。將宰殺活雞流出的雞血(約180 mL)注入燒杯中，同時用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合，以免凝血。然后，將血液倒入離心管內(nèi)，用 1000 r/min的離心機(jī)離，鑒定材料《dna粗提取與鑒定》。2min，此時血細(xì)胞沉淀于離心管底部。實(shí)驗(yàn)時，用吸管除去離。心管上部的澄清液，就可以得到雞血細(xì)胞液。

1.提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)

將制備好的雞血細(xì)胞液5 mL～10mL，注入到50 mL燒杯中。向燒杯中加入蒸餾水20 mL，同時用玻璃棒充分?jǐn)嚢? min，使血細(xì)胞加速破裂。然后，用放有紗布的漏斗將血細(xì)胞液過濾至500mL。取其濾液。

2.溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA

將氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 mol的溶液40mL加入到濾液中，并搖動燒杯，使其混合均勻，這時DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)。

3.析出含DNA的粘稠物

沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸餾水，同時用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時燒杯中有絲狀物出現(xiàn)，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續(xù)加入蒸餾水，溶液中出現(xiàn)的粘稠物會越來越多。當(dāng)粘稠物不再增加時停止加入蒸餾水(這時溶液中氯化鈉的物質(zhì)的量濃度相當(dāng)于0.14 mol/L)。

4.濾取含DNA的粘稠物

用放有多層紗布的漏斗，過濾步驟3中的溶液至 500mL的燒杯中，含 DNA的粘稠物被留在紗布上。

5.將DNA的粘稠物再溶解

取 1個 50 mL燒杯，向燒杯內(nèi)注入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 mol/L的溶液 20mL。用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃擇不停地?cái)嚢?，使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中。

6.過濾含有DNA的氯化鈉溶液

取1個100 mL燒杯，用放有兩層紗布的漏斗過濾步驟5中的溶液。取其濾液，DNA溶于濾液中。

7.提取含雜質(zhì)較少的DNA

在上述濾過的溶液中，加入冷卻的、酒精的體積分?jǐn)?shù)為 95%的溶液 50mL(使用冷卻的酒精，對DNA的凝集效果較佳)，并用玻璃棒攪拌，溶液中會出現(xiàn)含雜質(zhì)較少的絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA。注意觀察絲狀物是什么顏色的。

8.DNA的鑒定

取兩支20 mL的試管，各加入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為0.015 mol/L的溶液5 mL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4mlL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜诜兴屑訜?5 min，待試管冷卻后，觀察并且比較兩支試管中溶液顏色的變化。將觀察的結(jié)果填寫在《實(shí)驗(yàn)報(bào)告冊》上。

結(jié)論

步驟8的2支試管中溶液顏色的變化說明了什么?將得出的結(jié)論填寫在《實(shí)驗(yàn)報(bào)告冊》上。

討論

1.提取雞血中的DNA時，為什么要除去血液中的上清液?

2.步驟回和步驟3中都需要加入蒸餾水，兩次加入的作用相同嗎?為什么?

3.DNA的直徑約為20×10-10 m，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的絲狀物的粗細(xì)是否表示1個DNA分子直徑的大小?