第一篇：MEF小鼠胚胎成纖維細(xì)胞知識總結(jié)（精選）

MEF小鼠胚胎成纖維細(xì)胞知識總結(jié)

2008-06-19 00:00 來源：丁香園

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知識總結(jié)

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1517 關(guān)鍵詞： MEF小鼠 胚胎成纖維細(xì)胞

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的富集

1、給13-14天的孕鼠注射大約0.5ml阿佛丁。當(dāng)鼠麻醉后，實施斷頸法處死小鼠。

2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮膚向后拉，暴露出腹膜。用消毒過的工具，剪開腹壁以暴露出子宮角。將子宮角移到10cm的皿里。用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍。

3、用剪刀剪開每一測的胚囊,并將胚胎移到培養(yǎng)皿中。

4、用兩副鐘表鑷子將胎盤和膜與胚胎分離開，分離后切除內(nèi)臟（所有深色的東西）。將胚胎轉(zhuǎn)移到(有蓋)培養(yǎng)皿中，用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍。

5、用帶有彎鉤的眼科剪將組織剪碎，當(dāng)你剪的很累以致于不能再剪的時候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA繼續(xù)剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大約20分鐘。此時，返回至第一步，對下一只鼠進(jìn)行操作。

6、執(zhí)行1－4步，到將胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中這一步。

7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的組織物殘留。將皿放回培養(yǎng)箱再孵育10分鐘。

8、用20ml培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶/EDTA的消化，將皿中的物質(zhì)轉(zhuǎn)移至50ml錐形管中。

9、混勻管內(nèi)的物質(zhì)，加入到含有20ml培養(yǎng)基的T75培養(yǎng)瓶中。每個培養(yǎng)瓶中裝大約3個胚胎。

10、將這些培養(yǎng)瓶放在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。

11、將胚胎置于PBS中，并重復(fù)第5步。

12、第二天更換培養(yǎng)基，以去除碎片和中毒的細(xì)胞及其分泌的物質(zhì)。

13、當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞長到80-90%匯合時并仍處于指數(shù)生長期時，是凍存細(xì)胞的最佳時期。一般說來，這發(fā)生在準(zhǔn)備胚胎的第二天。這可能或早或晚發(fā)生，所以請注意觀察你的培養(yǎng)瓶。

注釋：

我們已用CF－1品系的鼠制備了成纖維細(xì)胞。

培養(yǎng)基成分：

88％ DMEM 10％ FBS 1％ NEAA 1% 雙抗

對于新建立的細(xì)胞系，要對樣本進(jìn)行支原體檢測。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的消化/傳代

1、移去MEF培養(yǎng)基

2、用5ml不含鈣鎂離子的PBS洗滌細(xì)胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。

3、每個培養(yǎng)瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。

4、為了使細(xì)胞分散開，輕輕吹打細(xì)胞。

5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶的消化。

6、將細(xì)胞懸液加入到15ml的錐形管中，吹打幾次，使細(xì)胞分散為單個的。

7、在新的T75培養(yǎng)瓶中加入10mlMEF培養(yǎng)基。

8、將細(xì)胞懸液分裝到新的T75培養(yǎng)瓶中，放在37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

注釋：

MEF培養(yǎng)基成分：

89% DMEM(Gibco # 12100-046)10% FBS(Gibco # 16000-044)1% NEAA(Gibco # 11140-050)MEF每傳一代就會生長得更慢些。你第一次傳代的比例可以是1:5，但是最后一次的傳代（第4代或第5代）比例應(yīng)該是1:2。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的凍存

重懸培養(yǎng)基：

80% DMEM 20% FBS 1% NEAA 凍存培養(yǎng)基：

60％ DMEM 30％ FBS 20％ DMSO

1、用不含鈣鎂離子的PBS洗一次細(xì)胞。

2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大約5min。

3、將細(xì)胞吹打下來。

4、加入與胰蛋白酶/EDTA等體積的培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶的消化。

5、吹散大塊組織。如果還有大塊組織存在，可將懸液加入到50ml的管中使其沉淀。

6、取上清液，將其分裝到錐形管中，1000rpm離心5min。

7、每個凍存瓶中加入0.5ml（凍存液的一半體積）的重懸培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

8、逐滴加入等體積的（0.5ml/瓶）凍存培養(yǎng)基，混勻?，F(xiàn)在DMSO的濃度是10％。

9、每個凍存瓶中加入1ml的細(xì)胞。

10、迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到凍存的容器中，-70℃凍存過夜。（細(xì)胞不能長時間放置在室溫而含有DMSO的情況下）

11、第二天將細(xì)胞放于液氮中長期保存。注釋：

提前標(biāo)注好凍存細(xì)胞的以下信息：

細(xì)胞系名稱

傳代的代數(shù)

凍存細(xì)胞的數(shù)目

日期

Initials 注明凍存/解凍形式

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的解凍/復(fù)蘇

1、將凍存瓶從液氮中取出。

2、放在37℃水浴中快速解凍，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.3、當(dāng)僅還有一點(diǎn)冰晶殘留時，用95％的乙醇消毒凍存瓶的外面，并將其置于hood中。（為什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）

4、輕輕地上下翻轉(zhuǎn)細(xì)胞一次，將它們放入15ml錐形管中。

5、想管中逐滴加入10ml培養(yǎng)基。這一步操作不能少于兩分鐘。做快了對細(xì)胞將是一種打擊，你將得到比其他方法具有更低生活能力的細(xì)胞。6、1000rpm離心5min。

7、將細(xì)胞重懸于10ml培養(yǎng)基中，然后放入T75培養(yǎng)瓶中。

8、放入37℃培養(yǎng)箱。

9、注明凍存/解凍的形式，以更新數(shù)據(jù)。

1、關(guān)于如何確底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能夠介紹一下自己所采用的方法，集思廣益。我所采用的方法是選擇同一天出生的三對小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合籠，（每周合籠一對），然后待最早合籠的小鼠產(chǎn)崽后，再取另兩個雌鼠的胚胎。不知道這樣行不行，也沒注意別人是怎樣做的。另外問了幾個外科的同學(xué)也沒找到可以查出小鼠孕期的儀器。

2、關(guān)于提取MEF的比較好的protocol

3、關(guān)于MEF轉(zhuǎn)染時起耐受性如何？這個我以后主要做這些，可能會積累一定的經(jīng)驗，但現(xiàn)在肯定有各位朋友已經(jīng)從事或正在從事著方面的工作，希望能夠分享經(jīng)驗。

4、關(guān)于其分泌細(xì)胞因子能力？我從一些文獻(xiàn)上發(fā)現(xiàn)，MEF除了作為胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)層以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本東京大學(xué)的AKIRA的實驗室，大板大學(xué)的takashi fujita實驗室就發(fā)了相當(dāng)多的文章。從這些文獻(xiàn)可以看出，MEF分泌細(xì)胞因子能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于HEK293等工程細(xì)胞，相當(dāng)于肝實質(zhì)細(xì)胞，略低于幾種免疫細(xì)胞。但較免疫細(xì)胞，我認(rèn)為有其不可替代的優(yōu)勢：

（1）其并不是主要發(fā)揮免疫功能的細(xì)胞，只有在受到外界刺激時才會應(yīng)答，分泌細(xì)胞因子，免疫細(xì)胞在不受刺激時也會為了維持穩(wěn)態(tài)而不斷產(chǎn)生細(xì)胞因子，即使有嚴(yán)格的control 組，但專門的免疫細(xì)胞即使是同一種細(xì)胞（DC，NK，T）但不同的細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力也是參差不齊的。會造成control 相對不一致。

（2）另一方面，由于這些免疫細(xì)胞大部分都是懸浮的，不太容易轉(zhuǎn)染，結(jié)果陽性率也會較低。（3）現(xiàn)在的分離MEF的方法很便宜，不復(fù)雜，而分離純的免疫細(xì)胞（如NK，DC），需要MACS，F(xiàn)ACS等，這對目前國內(nèi)的實驗室經(jīng)費(fèi)相對緊張的情況來說，不是很劃算。因此除非是需要研究某一種免疫細(xì)胞，如果是為了研究天然免疫或者adaptive immune過程中某中基因，或者蛋白，或者某一信號通路等的作用，MEF 細(xì)胞不失為一種選擇。

網(wǎng)友crepi 的觀點(diǎn)：

1、我每次取的是16~18天的胚鼠 個人覺得無礙 我倒更喜歡大一點(diǎn)的胚胎 更好操作一點(diǎn)

2、我取的是皮膚 然后胰酶4度消化過夜 第二天終止消化 撕掉表皮 留下真皮 減碎 用的100目濾網(wǎng)過濾 這個胰酶消化的時間是個關(guān)鍵 時間長了 細(xì)胞容易死 時間少了，表皮不容易揭下來 我有此就是這樣 消化了15個小時 結(jié)果接種下來的細(xì)胞不能貼壁 全死了

3、我用的培養(yǎng)液是DMEM+10%小牛血清 培養(yǎng)液也是關(guān)鍵 因為雖然都是成纖維細(xì)胞比較潑辣 但總歸是原代 可能還是比較嬌嫩 我前幾天就是這樣 后來發(fā)現(xiàn)是培養(yǎng)液出的問題 測的PH值都8.3了 細(xì)胞不死才怪 畢竟細(xì)胞耐酸不耐堿

4、原代培養(yǎng)的最大天敵還是污染

網(wǎng)友baichangming的觀點(diǎn)：

MEF對培養(yǎng)基和血清的要求不高，一般的都行我用過高糖DMEM和D/F-12，生長情況都行，而且看不出什么差別。血清也是以前用幾百塊錢的國產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清也長得也不錯，因為要養(yǎng)干細(xì)胞，所以現(xiàn)在換成進(jìn)口Gibco胎牛的血清（兩千多/500ml），感覺細(xì)胞的狀態(tài)確實好了一些。我的血清濃度一般是16.66666%。

網(wǎng)友北羽迦樓的觀點(diǎn)： 細(xì)胞沒別的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3傳代，3代之后細(xì)胞就出現(xiàn)衰老了，我感覺年輕增殖能力強(qiáng)的MEF應(yīng)該有著清晰的細(xì)胞輪廓，細(xì)胞立體效果不錯，在相差顯微鏡下，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞纖長，正在分裂或是剛剛分裂的細(xì)胞沒有伸出偽足，但是同樣有著更加明亮的輪廓，與細(xì)胞邊緣相比，細(xì)胞呈深色（我覺得是透光效果不好）。一般在4×下觀察最能看出細(xì)胞的狀態(tài)，此時能看到細(xì)胞呈梭形或是三角形。細(xì)胞鋪展很厲害，細(xì)胞的透光效果增加，說明開始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做轉(zhuǎn)染或是感染的話，出現(xiàn)衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以內(nèi)做。

我們用的就是WiCell的protocal養(yǎng)，和前面那位戰(zhàn)友發(fā)的差不多。只是我們用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我覺得最重要的就是種盤后的換液。原代2小時不管還有多少米貼都不要，傳代復(fù)蘇后一小時就換。消化的時候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下來的也統(tǒng)統(tǒng)不要。因為健康的MEF就是易消化易貼壁。老化以及混雜的其他細(xì)胞（神經(jīng)、上皮）就沒那么快了。

附帶一句，易消化易貼壁是fibroblast的共性。

第二篇：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)

一、實驗材料 1．主要儀器設(shè)備

倒置顯微鏡、培養(yǎng)箱、離心機(jī)、25ml玻璃培養(yǎng)瓶、吸管；10ml尖底離心管、Ф80mm玻璃培養(yǎng)皿、青霉素小瓶、小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科鑷）2．試劑

RPMI 1640培養(yǎng)液、平衡緩沖生理鹽水(PBS, pH7.2-7.4)、0.25%胰蛋白酶 3．實驗動物

孕14～15天(E14～16)昆白母鼠，領(lǐng)自福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

二、實驗步驟

1.獲取小鼠胚胎

(1)取孕14～15天的母鼠，斷頸處死，置于蠟盤上

(2)75％酒精消毒后，用剪刀和鑷子剪開下腹皮膚，用兩把彎頭止血鉗夾住切口處的皮膚向頭尾兩側(cè)牽拉即剝皮，用眼科彎鑷和眼科彎剪打開腹腔，暴露出子宮。(3)用眼科彎鑷夾住一側(cè)子宮，分離子宮系膜，眼科彎剪剪斷子宮角和子宮頸，將整個子宮分離下來（注意勿使子宮滑落到腹腔外，避免污染）。將子宮置于無菌濾紙上去除血跡。

(4)在超凈臺內(nèi)將子宮移入預(yù)先盛有PBS的培養(yǎng)皿中，洗滌數(shù)次。

(5)將子宮移入另一盛有PBS的培養(yǎng)皿中，用眼科彎剪沿子宮系膜打開子宮，取出帶有胎膜的胎鼠，并用兩把眼科鑷子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。

(6)將胎鼠移入另一盛有PBS的培養(yǎng)皿中，用眼科剪和眼科鑷去除胎鼠的頭、四肢和內(nèi)臟，得鼠胚軀干。

(7)將鼠胚軀干移至另一盛有PBS的培養(yǎng)皿中，用PBS洗滌兩次至無肉眼可見的血色。

2.小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)（組織塊半消化法）

(1)將干凈的鼠胚軀干移至青霉素小瓶內(nèi)（每6個鼠胚軀干裝1瓶），用眼科直剪剪成約1 mm3以下的碎塊。

(2)用5ml的刻度吸管每瓶加入約3ml的PBS，混勻后連同鼠胚碎塊一起移至一尖底離心管中。

(3)室溫下靜置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚組織碎塊。

(4)向裝有鼠胚碎塊的離心管內(nèi)加入1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，輕輕吹吸30秒（可見組織塊變得較為粘稠）。

(5)加入1 ml 1640培養(yǎng)液終止消化，室溫下靜置5min，吸去上清液，留下鼠胚組織碎塊沉淀。

(6)每個離心管內(nèi)加入5ml 1640培養(yǎng)液懸浮鼠胚組織塊，并接種到25ml的螺口的培養(yǎng)瓶中（接種時應(yīng)用滴管將組織塊混勻）。(7)做好標(biāo)記（如培養(yǎng)日期，細(xì)胞名稱，編號），將裝有鼠胚組織碎塊的培養(yǎng)瓶放入37℃，5％CO2，100％相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(8)培養(yǎng)的頭兩天不要晃動培養(yǎng)瓶，第三天可以觀察，可見組織碎塊附著于培養(yǎng)瓶底，周圍細(xì)胞呈放射狀生長，此時有多種細(xì)胞類型，有的是呈梭形的成纖維細(xì)胞，有的是呈圓形的上皮細(xì)胞。

第三篇：小鼠MCAO總結(jié)

小鼠MCAO模型

一、實驗器材：

1.手術(shù)器械：眼科剪

1、顯微剪

1、鉤鑷

1、直鑷

1、顯微鑷

2、止血鉗

1、持針器

1、縫合線（2-0/5-0）、縫合針、麻醉劑：10%水合氯醛（350mg/kg）2.栓線：0.18mm（20~25g）、0.20mm(25~30g)；在栓線10mm的位置用黑色記號筆標(biāo)記；75%酒精清潔后置1: 2500單位肝素化生理鹽水中備用。

3.其他用品：酒精棉球、75%酒精、生理鹽水、注射器（1ml、2ml）、黑色記號筆、固定鼠用粗線繩、鼠板

二、步驟：Zea Longa 線栓法

1.麻醉：10％水合氯醛腹腔注射（350mg/kg）2.術(shù)前準(zhǔn)備：仰臥位固定大鼠，備皮消毒 3.分離血管及掛線：

1)自胸骨柄到下頜骨間取長約1cm 正中切口。見下頜下腺，將其分離至兩側(cè)；

2)見右側(cè)肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌、二腹肌形成的三角區(qū)，鏡下分離此三角區(qū)內(nèi)，暴露右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA）； 3)首先分離CCA于其上掛線1；

4)隨后向頭側(cè)分離ECA血管及其分支，于ECA上頭尾側(cè)分別掛線2、3；

5)然后清除CCA分叉部脂肪，觀察ECA分支與ICA關(guān)系，分離ICA及ECA分支，于其上掛線4；

6)注意操作輕柔避免迷走神經(jīng)、舌咽神經(jīng)、氣管損傷，避免過度牽拉血管使其嚴(yán)重移位或斷裂。

5.結(jié)扎：死結(jié)：線1、2；活結(jié)：線4；不系結(jié)：線3 6.剪口插入：

1)將鼠臺逆時針旋轉(zhuǎn)90°，在ECA上距分叉1~1.5mm用顯微剪剪一切口； 2)將標(biāo)記好的線栓由此切口插入CCA 中；

3)將鼠臺轉(zhuǎn)回，將線栓從CCA拔出至分叉稍尾側(cè)，右手將線栓轉(zhuǎn)向滑入ICA，右手拉開線4活結(jié)，后繼續(xù)插入ICA，待有阻力時再進(jìn)入少許，深度1cm+，到達(dá)大腦中動脈與前交通之間；

4)順利插入后將絲線4扎緊，抽出線3減去多余線頭。6.縫皮

7.術(shù)后：小鼠俯臥位，頭略抬高，至于溫濕度適宜環(huán)境。

三、注意事項：

1.雌性鼠對于牽拉等操作的反應(yīng)更強(qiáng)烈，故建議選擇雄性大鼠作為實驗對象。

2.大鼠解剖學(xué)變異：一般而言，F(xiàn)isher-344大鼠MCA解剖變異較小，閉塞后形成的梗死體積一致性好；Wistar-Kyoto 大鼠變異相對最大； 而Sprague-Dawley大鼠介于兩者之間。3.麻醉：10%水合氯醛腹腔注射（30ml/kg），一般可持續(xù)1~1.5h。如按標(biāo)準(zhǔn)體重計算的麻醉劑量效果欠佳，可使用總量的10%進(jìn)行追加。需注意反復(fù)多次或過量追加易造成動物死亡，或?qū)е虑逍淹七t而影響再灌注前評分，從而使再灌注時間不能統(tǒng)一界定在2h。水合氯醛可使動物呼吸頻率下降50%左右,但一般不會導(dǎo)致動物窒息而死亡。術(shù)中嚴(yán)密觀察動物呼吸頻率、深度及有無痰鳴音等。

4.分離氣管前肌肉時注意保護(hù)好甲狀腺和甲狀旁腺。甲狀腺呈鮮紅色，緊密貼在氣管前壁上，甲狀旁腺位于甲狀腺外上方，顏色略淡。血管分離要到位，使用電凝器可明顯減少小血管的出血，從而保證手術(shù)野清晰，尤其是肌肉內(nèi)部的血管和 ECA 的一些細(xì)小分

支，未明確時不可隨意離斷。結(jié)扎血管時要注意力度和方向，由于血管被膜被分離后血管表面相當(dāng)光滑，結(jié)扎不牢可能導(dǎo)致難以控制的出血；術(shù)中還要注意保護(hù)與血管緊密相依的神經(jīng)，注意觀察神經(jīng)的顏色、反光性和輕觸時的感覺，切勿損傷或離斷。牽拉迷走神經(jīng)時可見動物呼吸明顯減慢甚至血液呈深紫色，出現(xiàn)肢體末端紫紺。在無法給予輔助通氣時，應(yīng)暫停操作。一般來說，動物呼吸可恢復(fù)到麻醉后的平穩(wěn)狀態(tài)，血液顏色也可恢復(fù)到正常，這時再繼續(xù)手術(shù)較為安全。

5.關(guān)于是否結(jié)扎 PPA 文獻(xiàn)報道尚不一致?？裳豂CA一直分離至看到其入顱分支與PPA分叉處，觀察線栓走行狀況，若順利將長度約1cm的線栓插入，則可固定線栓而無需對 PPA進(jìn)行操作； 如只進(jìn)入5mm左右即遇到明顯阻力，則線栓進(jìn)入PPA的可能性很大，此時可將線栓撤離至ECA/ICA處，提起PPA，以幫助線栓沿ICA進(jìn)入顱內(nèi)而最終阻塞MCA。

6.Koizumi等1986年首次報道不開顱經(jīng)CCA插入尼龍線栓致MCA閉塞；之后，Longa等進(jìn)行了改良，將栓線從ECA插入，再灌注時將栓線抽回ECA內(nèi)，通過CCA實現(xiàn)再灌注。Koizumi使用的絲線末段均勻包被硅膠，直徑增加近30~40%，插入后不僅可伸入大腦前動脈ACA）近端，肯定阻塞ACA及前交通動脈，而且阻塞MCA及后交通動脈開口處，徹底阻塞MCA及其所有側(cè)枝供應(yīng)血管，形成供應(yīng)區(qū)域完全缺血，因此局部梗死面積大，均勻一致，各動物間差異較小。Longa使用的4-0尼龍線末端球形擴(kuò)大，但并非直接閉塞MCA，而是依靠結(jié)扎同側(cè)ICA和其球形擴(kuò)大的末端伸入ACA腔內(nèi)、阻斷經(jīng)前交通動脈來自對側(cè)ACA的血流形成局灶性腦缺血，但不能阻斷來自后交動脈的側(cè)枝供應(yīng)，且絲線末端伸入ACA腔內(nèi)位置不同，所起作用差異很大，因此形成的梗死面積很小，各動物之間差異較大。宋紅松等建議采用Koizumi方法。丁香園：

1.注意盡量不要損傷在頸內(nèi)頸外分叉下的交感神經(jīng)節(jié)。2.栓線進(jìn)入后頸內(nèi)動脈后即可逐漸插入了，有時候很順利一插到底，但有時候在中間就怎么也進(jìn)不去了，這是因為在血管入顱穿過顱骨時有一個狹窄或者角度。因此，碰上這種明顯阻力時，一定不能盲目向前使力插，越插栓線前端變形越進(jìn)不去且容易損傷血管。這時候正確的作法是往外抽出較多栓線，也許會有一定的動脈血流出，不必慌，只要順著血管走行調(diào)整一下進(jìn)線角度輕柔的使勁，一般都能進(jìn)去，反復(fù)試幾次還不行最好換根栓線，很可能前端也經(jīng)變形角度變了！頸內(nèi)動脈的走向為內(nèi)上方,可以用眼科鑷夾住魚線插,但進(jìn)去后要注意,別太用力,要不血管就要破了

3.栓線不能在血管里反復(fù)進(jìn)退，否則及容易造成蛛網(wǎng)膜下腔出血，而且很容易誤解為模型成功，因為這時的神經(jīng)功能改變也很明顯，但并不是由于栓塞引起的

4.大鼠仰臥時，ICA從CCA分出后下行（向背側(cè)）約5mm又分為兩支A，即走向乳突泡（Mastoid bulla）的 翼腭A和進(jìn)入顱內(nèi)的ICA的延伸部分。因為翼腭A的走向幾乎和分

支前的ICA走向相同，而ICA的延伸部分則是改向頭側(cè)走行，所以插線時會很自然的進(jìn)入翼腭A。進(jìn)線時，用鑷子將ICA輕輕往頭側(cè)推一下，使ICA和其延長的分支成一直線，同時順勢插線，可很容易的進(jìn)入顱內(nèi)?；蚴顾ň€有一定程度的彎曲，且只要保證栓線向屋頂方向彎曲，一般都能將線插如顱內(nèi)，決不會進(jìn)入翼腭A。

5.注意手的感覺，輕緩?fù)七M(jìn)，直至感覺到阻力為

止（當(dāng)遇到阻力后，再插線會見到線彎曲）。可能有人會說，把血管插破了也未感覺到阻力或線遇阻后的彎曲。一個原因是線太硬，另一主要原因是當(dāng)栓線從血管切口插入后為防止血液從此處流出，需要結(jié)扎一條細(xì)線，這條線結(jié)扎的松緊程度很關(guān)鍵，應(yīng)在不流血的情況下盡可能的松，這樣你會發(fā)現(xiàn)進(jìn)線時很輕松，一旦遇到阻力，就會感覺到。后者至關(guān)重要，請體會。

6.栓線一旦進(jìn)入ACA，就要把上面提到的那根細(xì)線適度扎緊（“適度”很重要，會影響到再灌流時大鼠的生死存亡），此時的關(guān)鍵是動作輕柔，不要使ICA有任何的牽拉，否則栓線會脫出ACA，可能會造成缺血失敗。血管外的栓線不要留得過長，更不要縫在皮外，大鼠醒來后會自己拔出。

7.如果你用的是中長效麻醉劑，插線成功后，固定絲線，然后讓其俯臥位，而且稍稍抬高其頸部，才能確保模型成功。8.術(shù)后一定要注意保暖。

9.插入線拴要輕柔熟練，速度盡可能快，以避免時間長了血管內(nèi)血栓形成。

10.手術(shù)后評分的主觀因素很大，有用5分制和11分制的，我個人認(rèn)為用5分制比較準(zhǔn)些。11.大鼠大腦中動脈永久性閉塞性腦缺血模型，梗死體積出現(xiàn)的最小時間點(diǎn)可能為2h，體積隨時間進(jìn)行性增大，至12h基本趨于穩(wěn)定

12.整個試驗是很費(fèi)動物的，存在15-30％的淘汰率（如果你做的好），但注意嚴(yán)格控制自己淘汰的動物（紀(jì)錄具體情況）。

13.除了剛才說的蛛網(wǎng)膜下腔出血外，還有一些老鼠肺出血明顯，整個肺暗紅，我也想不出原因，不知道是不是醫(yī)學(xué)臨床所說的腦肺綜合癥.14.術(shù)后處理：由于術(shù)后動物尚未清醒,因此護(hù)理也很重要。但為保證栓線成功,達(dá)到預(yù)期的阻塞時間,防止栓線脫落暫時把動物留在手術(shù)臺上,保證動物不會因掙扎而把栓線過早脫落,但仍需監(jiān)測體溫,并注意保暖。再灌注后動物可放入籠中。另外籠中應(yīng)保持干燥,沒有積水及粉塵,防止動物誤吸而窒息。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)一些模型癥狀不典型甚至沒有癥狀,都是由于動物蘇醒后極力掙扎使栓線過早脫落所致。手術(shù)后大鼠存活期可以滿足通常的實驗需求,一般來講,隨著栓塞和再灌注損傷時間的延長,死亡率會上升。大鼠在術(shù)后24～48小時最容易死亡,這種死亡是嚴(yán)重腦缺血損傷造成的,較直接的因素是腦水腫。用線栓制作持續(xù)性局灶性腦缺血模型時,術(shù)后要肌注慶大霉素預(yù)防感染;如果動物模型要生存1周以上,必要肌注速尿,防止因腦水腫動物在短期內(nèi)死亡。術(shù)后飲水中加入葡萄糖,保證動物術(shù)后有充足的能量生存到實驗要求的時間。

舍去標(biāo)準(zhǔn)：

⑴栓線插入深度不足18 mm,且無明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)或癥狀很輕的大鼠 ⑵ 蛛網(wǎng)膜下腔出血、MCA起始部或其附近的willis環(huán)動脈有凝血塊的大鼠，因為這是出血性腦損傷或永久性腦缺血損傷，而非MCAO/Reperfusion損傷。3）手術(shù)時出血較多，癥狀很重的動物。死亡原因分析：

首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的腦，先看是否有蛛網(wǎng)膜下腔出血，如有出血，表明死因是插線太深，以后注意插線深度；如無出血，則還要再看是否有嚴(yán)重的半球水腫，如水腫嚴(yán)重，則表明死因是腦缺血時間太重，需要縮短缺血時間；如既無出血，又無明顯的腦水腫，那就要注意動物狀態(tài)或生活環(huán)境是否太差。

第四篇：小鼠游泳實驗及解剖總結(jié)

小鼠游泳實驗及解剖總結(jié)

1測試小鼠的抗疲勞能力~有時候還需要測定其恢復(fù)能力~但實驗周期長，故不作要求~

2首先抓取小鼠，在天平上放一個燒杯，去零，稱重，記錄小鼠體重，為m g 稱保險絲，保險絲體重為小鼠體重百分之十~ Ps 方法：要用到刻度尺，首先稱一定長度的保險絲的重量，如記為a cm，重量為n g，則我們要量取的保險絲長度為x=0.1m*a/n

3用細(xì)繩系上保險絲（要注意細(xì)繩的長度要適當(dāng)），怎么系呢，系在尾巴根部，用一燒杯扣住小鼠，燒杯開口處有一小嘴，所以讓小鼠的尾巴露出來即可~2個人操作，一個人用手按住燒杯，一手捏住小鼠尾巴中部，一人則將系有重物的細(xì)繩系在小鼠尾巴中部~

4一人將小鼠放入裝有溫水的超大量筒，一人開始將小鼠放入燒杯的同時，一人開始計時，等到小鼠下沉10秒，則停止計時。

5記錄時間即可啦~ 補(bǔ)充：扔進(jìn)大量筒之前可以先將小鼠打濕，為什么呢？因為小鼠的毛比較蓬松，里面充了空氣，所以當(dāng)把小鼠放進(jìn)大量筒后，可能對實驗有影響~有時甚至把小鼠毛給刮掉~ 比較嚴(yán)格的實驗還要求小鼠要空腹，不然小鼠肚子里有糞便，對小鼠體重也影響~

小鼠解剖

解剖方法類似于蟾蜍解剖~用大頭針固定~辨別雌雄，雌性有三孔：尿道，陰道，肛門。雄性少了陰道。對于雄性，有時候可以看到睪丸在外面，有時候在肚子里面~不同小鼠情況可能不同

觀察的有心臟，肺部，食道，味，盲腸，頜下腺，舌下腺，腮腺，淋巴，胰臟，脾臟，輸卵管，子宮，卵巢等等 頜下腺（2片）深紅色，前段一塊覆蓋著半透明的舌下腺，因為半透明且覆蓋在頜下腺上，所以也呈現(xiàn)深紅色，所以可以將舌下腺那一片掀開，再放回去，可能比較容易觀察，有的小鼠可能淋巴發(fā)育比較成熟，會覆蓋在舌下腺上，注意區(qū)別。

盲腸：沒有路的長，很容易辨別的吧。

對于雌性，要分清子宮（類似Y形）輸卵管，卵巢的相對位置。

第五篇：知識總結(jié)

初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：平面直角坐標(biāo)系 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：概率的簡單應(yīng)用 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：數(shù)據(jù)的代表 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：統(tǒng)計表和統(tǒng)計圖 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：坐標(biāo)方法的簡單應(yīng) 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：解直角三角形 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：銳角三角函數(shù) 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：相似三角形 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：圖形的相似 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：圖形的平移與旋轉(zhuǎn) 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：軸對稱與中心對稱 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：投影 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：視圖 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：利用基本作圖作三 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：掌握五種基本作圖 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：梯形 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：特殊的平行四邊形 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：平行四邊形 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：多邊形 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：勾股定理及其逆定 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：全等三角形 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：與三角形有關(guān)的線 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：簡單事件的概率 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：數(shù)據(jù)的波動與分布 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：推理與證明 初中數(shù)學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)：命題