第一篇：PCR實驗室認證體會

一、申請臨床基因擴增實驗實驗收的目的

臨床基因擴增實驗室近年來在我國發(fā)展很快，基因診斷技術在疾病的預防、診斷、治療方面起到了積極的作用。由于、基因擴增檢測技術的應用對、實驗室的環(huán)境條件、儀器設備、試劑耗材、人員技術能力和質量控制等方面要求嚴格，而一些實驗人員對此不甚了解，加之利益的驅使，曾經在20世紀80年代，某些沿海省份的實驗室未按要求規(guī)范設置，出現(xiàn)氣溶膠污染，導致大規(guī)模假陽性結果報出，為臨床診斷造成了極大的困難。臨床基因擴增實驗室為了規(guī)范實驗室，保證基因擴增技術有效應用，防止假陰性、假陽性結果的報出，為臨床出具合格而可靠的報告，申請臨床基因擴增實驗室的驗收是必然而且也是必要的。

二、開展臨床基因擴增實驗的必備條件

根據(jù)衛(wèi)生部2002年1月14日發(fā)布了衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（以下簡稱《辦法》）及其附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》，及同年2月20日衛(wèi)生部臨床檢驗中心發(fā)布《臨床基因擴增實驗室工作規(guī)范》，明確規(guī)定臨床基因擴增檢驗實驗室開展PCR技術必需具備的條件：

（1）二級以上醫(yī)院實驗室，經衛(wèi)生部臨床檢驗中心驗收合格；（2）從事基因擴增實驗操作的人員必須經過培訓并取得上崗證；

（3）使用經國家藥品監(jiān)督管理局批準的允許進入市場銷售的商品試劑盒；

（4）開展衛(wèi)生部允許開展的項目。具備了以上幾條后，我們從事臨床基因檢測任務才是符合要求和規(guī)定并對臨床出具的報告有保障的。

三、臨床基因擴增實驗室驗收準備工作 1.硬件準備

（1）實驗室整體布局：

根據(jù)《辦法》要求，臨床基因擴增檢驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)，標本制備區(qū)，擴增產物分析區(qū)。由于我實驗室使用的是羅氏公司的Lightcycler實時熒光定量擴增儀，擴贈后產物不需開蓋處理直接檢測，所以擴增區(qū)和擴增產物分析區(qū)合為一室，此區(qū)為負壓。實驗室設計時按照《辦法》規(guī)定，三個區(qū)域相互獨立，并有各自的緩沖區(qū)域（見圖1）（2）各工作區(qū)域儀器設備

各工作區(qū)域的儀器設備及物品，包括椅子、辦公用品、清潔用品等均不能拿出本區(qū)域，所有可移動物品均應有本區(qū)域的標示。

各區(qū)域應具備的設備配置為：屋頂紫外燈、近臺紫外燈、一次性手套、一次性鞋套、工作服、廢液缸、掃帚、拖把、廢紙褸簍、微量加樣器（覆蓋1-1000μl），經高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）、筆、紙等。各工作區(qū)域的特殊配置包括：

（1）試劑貯存和準備區(qū)：2～8oC冰箱、漩渦震蕩器、超凈工作臺。

（2）標本制備：2～8oC冰箱、-20oC冰箱、高速臺式冷凍離心機、漩渦震蕩器、金屬加熱模塊、超凈工作臺。

（3）擴增及產物分析區(qū)：羅氏Lightcycler熒光定量核酸擴增儀、電腦、打印機。

同時：進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一流向，并用明顯的箭頭表示，個區(qū)域用不同的顏色以示區(qū)別。即試劑貯存和設備區(qū)（藍色）→標本制備區(qū)（白色）→擴增及產物分析區(qū)（粉色）。2.軟件準備：

（1）臨床基因擴增實驗室文件編寫： 本實驗診斷中心正在進行ISO15189實驗室的認可工作，故質量手冊同中心統(tǒng)一，其它文件包括：程序文件、標準操作程序（SOP）、相關圖表等由本實驗自己制定。制定的原則根據(jù)衛(wèi)生部下發(fā)的兩個文件，并結合本實際情況編寫適合本實驗實際情況編寫適合本實驗室的切實可行的文件，做到“寫你所做的，做你所寫的，記錄你已做的”。具體編寫內容如下：

①程序性文件：PCR實驗室管理制度，PCR實驗室人員管理制度，儀器設備的管理程序，PCR實驗室儀器設備操作程序，PCR實驗室儀器設備校準程序，PCR檢驗實驗操作程序，實驗室消耗品購買、驗收及儲存程序，PCR試劑購買、驗收及儲存程序，PCR檢測標本的管理程序，PCR實驗室記錄控制程序，PCR檢驗結果報告的控制程序，PCR實驗室室內質量控制程序，抱怨處理程序，實驗室生物防護錯施，實驗室的清潔程序，實驗室廢棄物處理程序等。

②標準操作程序（SOP）：試劑準備區(qū)工作制度，樣本準備區(qū)工作制度，PCR擴增區(qū)工作制度，半自動型蒸汽壓力滅菌器標準操作程序，高速離心機的標準操作程序，恒溫金屬浴使用規(guī)程，漩渦震蕩器標準操作程序，潔凈工作臺的標準操作程序，可調式加樣器標準操作程序，恒溫金屬浴的校準程序，標本采集、運送、接收、保存的標準操作程序試劑準備的標準操作程序，核酸提取的標準操作程序，Lightcycler使用的標準操作程序，統(tǒng)計學者質量控制的標準操作程序，消耗品驗收質檢的標準操作程序。試劑質檢的標準操作程序等。

③相關圖表：PCR實驗室工作人員一覽表，實驗室主要負責人簡歷表，PCR實驗室工作人員檔案，PCR實驗室人員培訓計劃，儀器設備一覽表，儀器設備損壞、故障、修理記錄，儀器設備的報表申請表，儀器維護保養(yǎng)記錄，Lightcycler熒光定量擴增儀維護保養(yǎng)記錄，恒溫金屬校準記錄，采購申請單，試劑領取驗收記錄，試劑質檢記錄，消耗品質檢記錄，消耗性材料領取驗收記錄，標本接收等記表，不合格標本記錄，報告單發(fā)放接收登記表，特殊報告要求登記表，抱怨情況登記表，抱怨處理登記表，PCR實驗室日常工作核查表，Lightcycler儀器使用記錄，試劑使用記錄，PCR實驗室室內質量控制失控原因及糾正錯施記錄，樣本處理記錄，冰箱溫度記錄-試劑準備區(qū)，冰箱溫度記錄-樣本準備區(qū)，環(huán)境溫度記錄-試劑準備區(qū)，環(huán)境溫濕度記錄-樣本準備區(qū)，環(huán)境溫度記錄-PCR擴增區(qū)，PCR實驗室日常工作核查表，紫外燈使用登記表，溫度計校準記錄，PCR實驗室平面圖等。（2）人員管理：

文件要在臨床基因擴增實驗室工作的實驗人員必須經過培訓并取得上崗證，所以在申請實驗室驗收前，要至少一名人員參加衛(wèi)生部檢驗中心舉辦的臨床基因擴贈實驗室上崗培訓班并取得上崗證。同時實驗室還應該制定自己的年度培訓計劃，保證實驗室人員能不斷得到培訓。（3）實驗方面：

使用經國家藥品監(jiān)督管理批準的允許開展的項目。

四、臨床基因擴增實驗室驗收申請

如果以上方面準備就緒后，就可以進行臨床基因擴增實驗室驗收申請了，但以本人的經驗，建議在實驗室設計好后，先請驗收專家進入實地看一下，并提出他們的寶貴意見，以免在驗收時因離要求有差距而成耽誤了驗收，同時編寫好的程序性文件和SOP文件也應請才、專家過目，得到認可后再提交申請，內容包括： 1.基因擴增檢驗實驗室基本情況：

（1）實驗室所屬法人單位名稱、地址、電話、聯(lián)系人等。（2）實驗室人呀情況和職稱比例。2.應提供的資料

（1）《醫(yī)療機構職業(yè)許可證》復印件；

（2）擬設置基因擴增檢驗實驗室醫(yī)院的醫(yī)療衛(wèi)生資源狀況，對臨床基因擴增檢驗的需求情況以及實驗室運行的預測分析；

（3）擬設基因擴增檢驗實驗室的設置平面圖；（4）實驗室主要負責人簡歷表；（5）實驗室工作人員一覽表；（6）主要儀器設備表；

（7）擬開展的臨床基因診斷項目；

（8）實驗室相關程序文件和標準操作程序（SOP）；（9）檢驗報告樣單； 3.希望驗收時間 4.聲明

本實驗室自愿申請衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織的技術驗收，并愿意承擔下列義務：遵守《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》和《臨床基因診斷實驗室工作規(guī)范》及與關規(guī)定；不論能否獲得通過驗收，預付驗收階段的全部費用。

五、現(xiàn)場技術驗收

當提交臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收申請表后，大約兩周時間內（視具體情況而定）衛(wèi)生部臨床檢驗中心會將臨床基因擴增檢驗實驗室收通知傳真或郵寄至你處，告知驗收工作的具體時間、專家組成員、驗收程序及驗收費用等。

在驗收當天，專家組成員將對實驗室布局、實驗室設置及儀器設備配備情況、實驗室表示、程序文件標準操作文件的編寫、試驗記錄等情況進行驗收，同時還會現(xiàn)場讓實驗室技術人員進行臨床標本的操作，實驗結果的正確與否也是實驗室驗收合格的依據(jù)之一?，F(xiàn)場提問時專家會對你所編寫的文件進行提問，主要涉及實驗室污染、是內質控、標本的收集及保存等。驗收結束后，專家會填寫臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收報告，對驗收結果進行總結，提出整改要求和意見。

六、臨床基因擴增檢驗實驗室收體會 1.認真學習和領會衛(wèi)生部頒發(fā)的《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》及其附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》，及衛(wèi)生部臨床檢驗中心發(fā)布《臨床基因擴增實驗室工作規(guī)范》的內容，并將以上兩個文件的內容落室到自己所編寫的程序文件和標準操作程序中。

2.實驗室布局設計好后一定要請專家實地進行一下檢查，如果條件不具備，也可以將實驗室設計平面圖寄給專家，因為每個實驗室都有自己的具體情況，如果是新建的實驗室可以按照衛(wèi)生部臨檢中心提供的標準實驗設計圖來設計，如果是在老的實驗室基礎上改造，就應該多聽一些專家的意見，以免在驗收的時候因實驗室設計不合理而耽誤驗收以至延誤臨床工作的開展。

3.程序性文件和標準操作程序編寫時，最主要的是可操作性要強，尤其是SOP文件，使用頻率很高，與實驗室的日常工作密切相關，寫的要具體一些，格式并不是很重要，主要是讓第依次接觸該SOP的人也能夠按其完成相關操作。同時還要集注，該文件不是用來驗收的。而是給自己實驗室人員用的，要認識到文件對保證檢驗質量的重要性，這樣在編寫時就能更細化，更具體，更實用。文件的編寫是整個實驗室驗收工作任務重要的一個環(huán)節(jié)，也是驗收工作時檢查的重點，所以在編寫文件時要讓每一個實驗室的人員都參與進來，對所寫的內容、程序和要求都要知道，并能遵守執(zhí)行。在驗收的時候，專家會對你所寫的文件內容進行提問，如果一個實驗室操作人員對其應該遵循的管理制度和SOP一無所知之甚少，這樣對日常檢驗的質量控制也是沒有好出的。文件編寫好后，建議也請專家過目，得到首背后再提交認可申請。

4.文件編寫好后，應該按其執(zhí)行，做到“記錄你所做的”簡單的說就是將常規(guī)工作中所做的記錄下來，一般說，需要記錄的有臨床標本接收中的餓患者個人資料、標本接收日期、標本狀態(tài)、唯一編號等；檢測前實驗室的清潔；檢測中實驗記錄，試劑廠家、批號、檢測日期、檢測結果、質控記錄及分析、檢測人（簽字）、儀器運轉情況等；檢測后實驗臺面、儀器設備等的消毒和清潔、紫外線照射等。依次兩次的記錄并不難，難的是持之以恒。所以許多記錄我們多記錄我們可以把做到成表格的形式，記錄時在相應的條款上打“√”就行了。

5.實驗過程嚴把質量關。我們編寫的質量手冊的木的的是規(guī)格實驗操作整個過程，做到實驗過程有章可循，實驗記錄有據(jù)可查，保證實驗結果的可靠性和準則性。由于基因擴增技術特殊性，即使嚴格按質量手冊進行操作，也難免出現(xiàn)錯誤結果，因此包括試劑空白對照，陰性標本對照、臨界值陽性標本對照等，分別監(jiān)測試劑配制與加樣過程中是否存在污染，標本核酸模板提取過程紅是否存在污染，標本檢測過程中是否在假陰性結果和結果是否準確等。

6.工作量少影響質量保證系實施。嚴格按臨床基因擴增檢驗實驗室技術要求通過驗收的實驗室，存在一定運行成本，需要有一定臨床標本量的支持；如果某一醫(yī)院醫(yī)療資源不足，標本來源不足以支持運行成本時，就會想方設法去減少運行成本（包括試劑成本和勞務成本），導致檢驗質量難以得到保證。因此建立了臨床基因擴增檢驗實驗室后，應根據(jù)本醫(yī)院的情況，制定可行的試驗方案（如實驗周期、合理接受外來標本等），做到既保證臨床標本結果的質量又不浪費成本。以上只是本人對臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收及日常工作的一點體會，望和大家多多交流。參考文獻

1.申子瑜，李金明.《臨床基因擴增檢驗技術》，人民衛(wèi)生出版社。

第二篇：PCR實驗室

高端PCR實驗室控制設計說明

PCR實驗室即分子生物學實驗室，在醫(yī)療、科研、生物技術方面得到廣泛的應用。因其在不同行業(yè)的應用各有區(qū)別，在具體設計時也有不同之處，就醫(yī)療機構的應用而言，主要使用三區(qū)或四區(qū)設計，即試劑準備區(qū)、樣品提取區(qū)、擴增分析區(qū)；此類三區(qū)設計時候應用于類似熒光定量型或同類PCR分析設備，及擴增與分析過程在設備內一次完成。而四區(qū)設計在三區(qū)的基礎上講擴增分析區(qū)拆分為擴增區(qū)與分析區(qū)適用于其他類型的pcr設備及手工處理。

在PCR實驗的設計上，經過多年的經驗累積，已經在一些關鍵技術上達成了共識。因為PCR實驗中所產生的DNA與RNA片段過于微小，以至于可以穿透高效過濾器，所以在實驗室設計上已經不在強制要求設計高效凈化系統(tǒng)，但是為了提高實驗環(huán)境水平及保護實驗室內的敖貴設備方面，如果在具備條件的情況下可考慮追加高效空氣凈化系統(tǒng)；建議凈化級別萬級。在PCR實驗中所產生的DNA與RNA片段污染是一直以來PCR實驗的重點問題。此類污染主要至上次試驗中所產生的基因片段對下次試驗產生的污染，而且一旦試驗環(huán)境中的污染形成后很難處理。因為消毒等傳統(tǒng)方式對于基因污染沒有很良好的效果。所以在PCR實驗室設計中一般將整套實驗室設計為全新風型實驗室，這樣而已通過有效的換氣次數(shù)來達到凈化室內污染的作用。而在控制方面也有很多不同之處，因為各單位對PCR實驗的重視程度各有不同，所以在設計上也有不同，主要的控制設計有定送定排式壓力控制系統(tǒng)、變送定排式壓力控制系統(tǒng)變送變排式壓力控制系統(tǒng)。在控制設備方面也有很多區(qū)分如壓力無關型控制系統(tǒng)、壓力有關型控制系統(tǒng)。

根據(jù)業(yè)主要求，本PCR實驗室為三區(qū)設計，各區(qū)可獨立使用，不設置高效過濾系統(tǒng)等相關要求，根據(jù)業(yè)主以上要求，我方給出的設計方案為壓力無關型變送變排壓力控制系統(tǒng)。本系統(tǒng)的特點是，設備啟動后可根據(jù)實驗室內使用節(jié)點調節(jié)送風量及排風量來控制各房間狀態(tài)，系統(tǒng)說明見下圖

? 每個房間可分別控制，使用時通過房間開關輸出啟動信號，當設備接到啟動信號時設備運行，運行中根據(jù)管道壓力反饋決定變頻器大小，房間內送排風量由壓力無關型風量調節(jié)閥控制。? 當有多個房間開啟或關閉時，設備更加管道壓力反饋，調節(jié)設備變頻器增加或減少送排風量來穩(wěn)定管道壓力。各房間內壓力又房間內的壓力無關型定風量閥進行控制。

? 當BSC（生物安全柜，B2全排）開啟時BSC專用供風機組運行，BSC-供風機-排風機連鎖運轉。

? 當BSC做變風量調節(jié)時，根據(jù)房間內壓力變化，BSC專用供風機組前安裝的壓力無關型變風量調節(jié)閥根據(jù)壓力變化增減送風量，確保房間壓力執(zhí)行在可控范圍內。

? 當房間不適用時，房間與緩沖間均關閉電動密閉閥，確保房間處在密閉狀態(tài)避免布朗運動造成的可能污染風險。

? 房間換氣次數(shù)均按照一定凈化標準設計，當室內污染發(fā)生時，通過一定時間的換氣處理后，污染問題可以基本解決。? 本系統(tǒng)如果業(yè)主需要，可在室內送風口末端加裝高效過濾設備，房間可升級為凈化型實驗室。

? 壓力無關型風閥簡介：壓力無關型風閥的特點是不會根據(jù)管道壓力的變化而影響風閥內部的送風量，在一定管道壓力區(qū)間內能夠自行調節(jié)閥體阻力，來穩(wěn)定送風量，是高端實驗室必備的關鍵部件，目前此類閥體技術均有國外生產廠家控制，目前國內主用使用的產品有妥思、文丘里、西門子等品牌。

第三篇：PCR實驗室

簡介

Pcr實驗室又叫基因擴增實驗室。PCR是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內存在的數(shù)量、是否復制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據(jù)

條件

1、必須擁有標準的的PCR熒光實驗室;實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出 由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它 有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣 泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹

2、檢測設備必須符合標準PCR熒光實驗室設置要求;熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統(tǒng)。

3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證;

4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務培訓并取得合格證書;PCR實驗室內工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班，并持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛(wèi)生部的要求，確保檢測結果準確、確保實驗室衛(wèi)生安全，確保實驗室長期穩(wěn)定運行

5、必須在無菌無塵環(huán)境下進行操作

功能

能夠對患者病情進行科學、準確、實時的掌控，并結合抗HBV與T細胞免疫來打破免疫耐受，阻斷肝病病毒復制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒復制模板難以治療，人體免疫耐受狀態(tài)不易打破等醫(yī)學難題，能迅速消除臨床癥狀，而且有效抑制乙肝病毒復制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉換速度，殺滅血液及肝細胞內的病毒，為防止再感染提供了長期保護，有效阻斷和逆轉肝纖維化、肝硬化進程。

建立方法

1、建立樣品準備區(qū)

這個區(qū)域專門用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采取預防措施：⑴PCR產物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。⑵組織培養(yǎng)物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據(jù)應用的需要提取DNA或RNA。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生，而且管子不能用力崩開，這樣會產生氣溶膠。⑺任何時候都應該穿實驗服和帶手套，手套要經常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間，經常清洗。

2、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉錄一步可以在樣品準備區(qū)進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。

3、建立前PCR區(qū)。

該去專門用于準備各種反應，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。

4、PCR實驗室試劑的操作。

⑴所用的所有溶液都應該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。⑷所用試劑都應該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。⑸所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。⑺樣品準備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。

5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。⑵如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。⑶作為一個規(guī)則，應該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產物的污染，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。⑸當做陽性對照時，有兩個理由決定了應該使用最少數(shù)量的核酸。⑹由于必須有對照反應，對照模板的特點應該予以考慮。

6、控制污染的方法。

已設計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術能有效地消除由PCR產物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數(shù)量級。

7、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應該留出一個專門用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動

第四篇：PCR實驗室說明

PCR實驗室設計

PCR實驗室分為四個區(qū)域，進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一方向進行，不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出，四區(qū)域分別為： 1.試劑配制區(qū)n 2.樣品處理區(qū)n 3.核酸擴增區(qū)n 4.產物分析區(qū)n 如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當合并,三四區(qū)可合并為擴增產物分析。

各區(qū)的功能是： 1.1.1 試劑準備區(qū)：擴增試劑的配制、分裝和保存。1.1.2 樣品處理區(qū)：樣品登記、分裝；核酸提取、保存和加樣。1.1.3 擴增產物分析區(qū)：擴增產物的測定、結果分析、登記及報告。1.2 擴增前區(qū)與擴增后區(qū)應嚴格分開，須使用不同的房間，兩區(qū)之間最好有一定的間隔。1.3 使用商品化試劑盒可在樣品處理區(qū)進行少量試劑配制。1.4 在滿足下列操作和清潔處理要求的前提下樣品處理區(qū)和試劑準備區(qū)可設在同一房間內： 1.4.1 在生物安全柜內操作。1.4.2 每個實驗人員、實驗組分別使用各自的試劑及耗材。1.4.3 盛放污染材料的器皿密封并一次性使用。1.4.4 用有效的方法對操作區(qū)域和共享器具在實驗前后進行清潔及消毒。設計要求：

PCR實驗室可以是分散形式，也可以是組合形式,現(xiàn)要主要是以組合形式為主流。完成一組PCR實驗，通常應經過試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產物分析四個實驗過程，若實驗工藝需要，還應增加樣品粉碎過程。

一、分散形式PCR實驗室 所謂分散形式PCR實驗室，是指完成上述實驗過程的實驗用房彼此相距較遠，呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCR實驗室，由于各個實驗之間不易相互干擾，因此無需特殊條件要求。

二、組合形式PCR實驗室 所謂組合形式PCR實驗室, 是指完成PCR四個實驗過程的實驗用房相鄰布置，組成獨立實驗區(qū)域的形式。對于組合形式PCR實驗室，由于各個實驗間集中布置，容易造成相互干擾，因此，對總體布局以及屏障系統(tǒng)具有一定的要求。各室在入口處設緩沖間，以減少室內外空氣交換。

試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染,可以通過控制進風風量大于排風風量達到正壓效果。

核酸擴增室及產物分析室應呈微負壓，以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品，可以通過控制排風風量大于進風風量達到負壓效果。

在理想情況下，PCR實驗室緩沖間內，可設置正壓，使室內空氣不流向室外，室外空氣不流向室內。

PCR實驗室進風由原有中央空調控制，要求將中央空調風口安裝到指定定點，且高度為地面鋪裝好后2600mm處。

如果使用熒光PCR儀，擴增室和產物分析室可以合并。

若房間進深允許，可設PCR內部專用走廊。需要指出的是在減少室內外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。各個區(qū)域之間應具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產生假性結果。實驗室的墻體，包括頂棚，應結構牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕的要求。

如果使用熒光PCR儀，擴增室和產物分析室可以合并。

若房間進深允許，可設PCR內部專用走廊。需要指出的是在減少室內外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。各個區(qū)域之間應具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產生假性結果。實驗室的墻體，包括頂棚，應結構牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕的要求。主要設備試劑準備區(qū) 儀器設備主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平和離心機等，加樣器、天平除了要專用外，還應有定期校準。試劑分裝應在超凈臺中進行 擴增反應混合液應使用分子生物學級的，試劑制備好后應有質檢：一是否有污染、二是檢測試劑的擴增效果。標本制備區(qū) 儀器設備主要有生物安全柜、加樣器、離心機、溫育儀、混勻器等

擴增區(qū) 擴增區(qū)的主要儀器是核酸擴增儀、超凈臺、微量加樣器、離心機、可移動紫外燈。擴增儀需進行校準。并配備UPS電源，以防止由于電壓的波動，停電對擴增效果的影響。分析區(qū) 本區(qū)所使用的儀器設備有酶標儀、洗板機、加樣器和水浴箱等

潔凈實驗區(qū)的緩沖間部分面積不能超過主實驗室的八分之一,這是有規(guī)定的.1、主體結構： 主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內所有陰角、陽角均采用鋁合金50內圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結構牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。

2、標準的四區(qū)分隔和氣壓調節(jié)： 將PCR過程分成試劑準備、標本制備和PCR擴增，產物分析四個獨立的實驗區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區(qū)設置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產物對人員和環(huán)境的污染?？纱蜷_緩沖區(qū)Ⅰ，緩沖區(qū)Ⅱ和 PCR 擴增區(qū)的排風扇往外排氣，在實驗區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調的回風口，空氣通過回風口向室內換氣。

3、消毒： 在三個實驗區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準備區(qū)和標本制備區(qū) 還設置移動紫外線燈，對實驗桌進行局部消毒。

4、不銹鋼傳遞窗： 試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。

5、地面 地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進行清掃，耐腐蝕。

6、照明 燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點。在建設的過程中應注意： ●規(guī)范的安裝流程和全面的服務流程?！駠栏癜凑找?guī)范科學設計的安裝流程。●安裝前需要確定以下安裝條件，如：電源電壓，電源進線位置，電話網絡線進線位置，進水水壓，最小安裝空間，地面平整度，通風孔、進水管和下水管的位置等，理想狀態(tài)的空間尺寸 樣本處理區(qū)

三、工作區(qū)域及設備要求

（一）試劑儲存和準備區(qū) 1、2-8C和-15C冰箱

2、混勻器

3、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）

4、移動紫外燈（近工作臺面）

5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）

6、專用工作服和工作鞋

7、專用辦公用品

（二）標本制備區(qū) 1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱

2、高速臺式冷凍離心機

3、混允器

4、水浴箱或加熱模塊

5、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）

6、可移動紫外燈（近工作臺面）

7、生物安全柜

8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）

9、專用工作服和工作鞋

10、專用辦公用品 如需處理大分子DNA，應具有超聲波水浴儀。

（三）擴增反應混合物配制和擴增區(qū)

1、核酸擴增儀

2、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）

3、可移動紫外燈（近工作臺面）

4、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）

5、專用工作服和工作鞋

6、專用辦公用品(四)擴增產物分析區(qū) 視檢驗方法不同而定?；緝x器設備如下：

1、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）

2、可移動紫外燈（近工作臺面）

3、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）

4、專用工作服和工作鞋

5、專用辦公用品 5.人員和樣品的安全是由生物安全柜和定向氣流共同來保證。PCR實驗室設計規(guī)程中規(guī)定人員和樣品必須單向流動。即從 “試劑準備區(qū)到樣品制備區(qū)，再從樣品制備走向擴增區(qū)和產物分析區(qū)”，絕對不能反向流動，以辟免交叉污染。氣流方向只規(guī)定試劑準備區(qū)為微正壓或常壓，樣品制備區(qū)為常壓或負壓，擴增區(qū)和產物分析區(qū)為負壓，壓力梯度是從試劑準備到產物分析區(qū)，是高到低的。規(guī)程并沒有規(guī)定要做成全新風系統(tǒng)，但是為降低交叉污染的風險，建議做成全新風系統(tǒng)。概述 臨床基因擴增實驗又稱PCR實驗，是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內所含的基因進行擴增的方法，測出一些病毒含量不高的感染者體內是否含有特定的病毒。由于該檢測方法可以測出普通檢驗難以檢測出的病毒并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對樣品要求低等優(yōu)點，因此被臨床醫(yī)生廣為認可，已廣泛應用于醫(yī)院的臨床診斷和各防疫檢測部門的禽疫病診斷。但是，這種實驗需要有能保證絕對安全、配置合理的實驗室和非常規(guī)范的操作為前提。近年來對臨床基因擴增檢驗實驗室的建設越來越得到重視，因為它對檢測結果的可靠性、準確性和安全性起到至關重要的作用。本文主要從臨床基因擴增檢驗實驗室的平面布局，空調通風系統(tǒng)設計、氣流控制和污染的防制幾個方面對 實驗室設計中的主要特點進行了闡述。臨床基因擴增檢驗實驗室設計的核心問題是如何避免污染。因此，實驗室的平面布局、空調通風系統(tǒng)設計、氣流控制等都是圍繞這個核心問題進行的。下面就對這幾個方面分別進說明。2 PCR實驗室平面布局 臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應混合物配制和擴增區(qū)、擴增產物分析區(qū)。為避免交叉污染，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應混合物配制和擴增區(qū)→擴增產物分析區(qū)。各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應通過傳遞窗進行。PCR實驗室平面布置示意圖如圖1所示。圖1 PCR實驗室平面布置示意圖 3 實驗室空調通風系統(tǒng)設計及壓力控制 PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。3.1 試劑貯存和準備區(qū) 該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區(qū)，不得經過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內，并在本區(qū)內制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴格的要求。3.2 標本制備區(qū) 該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區(qū)內不必要的走動。3.3 擴增反應混合物配制和擴增區(qū) 該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應混合液等也可在本區(qū)內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內進行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區(qū)內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。3.4 擴增產物分析區(qū) 該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設。本區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。4 污染的預防與控制 PCR實驗室設計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實驗結果必須作廢，需重新進行實驗。所以發(fā)生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應是預防，而不是排除。4.1 工作區(qū)域的嚴格劃分（1）各個實驗區(qū)域設置合理；（2）各個實驗區(qū)域要有明顯的標記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實驗區(qū)域設備物品、試劑等發(fā)生混淆。4.2 合理的系統(tǒng)設置（1）合理的空調通風系統(tǒng)設置，盡量采用全送全排的空調系統(tǒng)；（2）嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區(qū)內不同的壓力要求。4.3 規(guī)范的操作（1）臨床基因擴增檢驗實驗室的技術人員必須進行上崗培訓，經培訓合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作；（2）在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施；（3）清潔工作及時、正確。實驗工作結束后，必須立即對本區(qū)進行清潔。除常規(guī)的消毒液體對表面進行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對一些實驗設備還應進行高壓消毒處理。4.4 嚴格的管理（1）嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關的人員不得隨意進出實驗室，有條件的情況下要設置獨立的通道和進出整個實驗區(qū)的門；（2）在各個實驗區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標志的工作服（如不同顏色），當工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；（3）盡量減少在實驗區(qū)內不必要的走動以減少交叉污染的可能性。（4）擴增產物分析區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應經消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；（5）擴增產物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質，應特別注意實驗人員的安全防護。4.5 完備的實驗室配套設施 完備的實驗室配套設施是保證實驗工作的必要條件，應根據(jù)各個實驗室實驗內容的不同配備相應的設備和儀器，如超凈工作臺、離心機、加樣器等。

PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。3.1 試劑貯存和準備區(qū) 該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區(qū)，不得經過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內，并在本區(qū)內制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴格的要求。3.2 標本制備區(qū) 該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區(qū)內不必要的走動。3.3 擴增反應混合物配制和擴增區(qū) 該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應混合液等也可在本區(qū)內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內進行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區(qū)內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。3.4 擴增產物分析區(qū) 該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設。本區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。4.0傳遞窗口的尺寸：

普通傳遞窗規(guī)格: SAT500 500x500x500（工作尺寸）SAT600 600x600x600（工作尺寸）潔凈傳遞窗規(guī)格: SAT600 600x600x600（工作尺寸）SAT1000 600x1000x600（工作尺寸）

第五篇：PCR實驗室管理制度

PCR實驗室管理制度

1.本實驗室進行臨床基因擴增檢測及相關檢驗工作，不得進行其他實驗操作。

2.本實驗室采用實時熒光定量PCR技術作為臨床基因診斷的主要手段，實驗室分為四個區(qū)：試劑儲存和準備區(qū)（第一區(qū)）、標本處理區(qū)（第二區(qū)）、擴增區(qū)（第三區(qū)）、擴增產物分析區(qū)(第四區(qū))。每一工作區(qū)配備專用的設備、儀器、輔助設施、耗材、清潔用品、辦公用品、專用工作服，并有明顯的區(qū)分標識，專用工作服。標本的接收則在標本接收處進行。

3.各工作區(qū)專用的儀器設備、辦公用品、工作服、實驗耗材和清潔用具等，不可混用。4.嚴格遵守從“試劑儲存和準備區(qū)→標本處理區(qū)→擴增區(qū)→擴增產物分析區(qū)”的單一流向制度，不得逆向進入前一工作區(qū)。

5.非本實驗室工作人員，未經許可不得入內；進修、實習或其他部門人員因科研活動需要。進入實驗區(qū)域（試劑儲存和準備區(qū)、標本處理區(qū)、擴增區(qū)、擴增產物分析區(qū)）需首先熟悉本程序的各項規(guī)定并嚴格遵守執(zhí)行，在本實驗室人員監(jiān)督指導下進行。

6.在各區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套、口罩、和帽子，嚴格按照操作規(guī)程。7.試劑儲存和準備區(qū)只能進行試劑的貯存及配置等相關操作。

8.標本處理區(qū)只能進行臨床標本的保存，核酸提取、保存及其加入至擴增反應管以及測定RNA時cDNA的合成。

9.擴增產物分析區(qū)只能進行DNA或cDNA的擴增，實時熒光PCR擴增產物的分析。10.進行實驗時嚴格執(zhí)行本實驗室的各項操作規(guī)程，及時做好清潔、消毒、整理及分析統(tǒng)計等工作。

11.室內儀器由專人負責，未經許可，不得隨意使用或挪用；愛護使用儀器，定期進行保養(yǎng)與維修。

12.愛護實驗室財產，注意安全；離開實驗室前應關好門窗，檢查水、電等。

北京海樂思醫(yī)學檢驗所