第一篇：植物細(xì)胞骨架的顯示及光鏡觀察

植物細(xì)胞骨架的顯示及光鏡觀察

———試劑配制及注意事項

1.M緩沖液：M緩沖液是使細(xì)胞骨架中的微絲保持穩(wěn)定的溶液。在M緩沖液中，其中咪唑是緩沖劑EGTA 和EDTA螯合 Ca離子，溶液并提供Mg離子，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張，便于觀察。

配制： 試劑

相對分子質(zhì)量

所需濃度

每升加量

備注

咪唑

68.08

50mmol/L

3.40g

穩(wěn)定PH值，緩沖作用。

KCl

74.55

50mmol/L

3.73g

提供離子，對骨架起聚合作用

MgCl2。6H2O 203.30 0.5mmol/L

0.1g

提供離子，對骨架起聚合作用。

EGTA

380.40 1.0mmol/L 0.38g

螯合Ca離子 Ca離子對聚合不利

EDTA。2H2O 372.24 0.1mmol/L

0.04g

螯合Ca離子 Ca離子對聚合不利。

B-巰基乙醇

78.13

1.0 mmol/L

70ul

起還原作用，穩(wěn)定骨架結(jié)構(gòu)。

甘油

92.09

4.0mmol/L

294.8ul

加水定容至1L，PH調(diào)至7.2 注意：B-巰基乙醇

危險品！經(jīng)皮膚、吞咽吸收有致命危險；刺激眼睛、呼吸道 粘膜，引起慢性咽炎！用藥品時應(yīng)適當(dāng)穿戴防護(hù)服，手套。取用時及時塞好瓶塞。

2.60mM磷酸緩沖液：維持細(xì)胞生理平衡使其保持正?；钚浴?/p>

配制：KH2PO4, 0.37g

Na2HPO4.12H2O,1.2 g

加水到500ML

注意：

3.Triton X-100(曲拉通 X-100)化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基:可以處理掉一部分蛋白質(zhì)，使骨架成分更清晰。

配制方法：用M緩沖液稀釋已有濃度的藥品。

注意：對人體有危害，皮膚粘上后用大量清水沖洗，不慎入眼時應(yīng)提起眼瞼，用流動清水沖洗并就醫(yī)，不慎食入后，應(yīng)大量飲用清水催吐并就醫(yī)。4.3％戊二醛：室溫下較好地保存細(xì)胞骨架成分。

配制：25％戊二醛 12ml,6mM磷酸緩沖液 88ml 注意： ①2%酸性戊二醛對金屬有腐蝕性；2%中性戊二醛對手術(shù)刀片等碳鋼制品有腐

蝕性，使用前應(yīng)先加入0.5%亞硝酸鈉防銹。②戊二醛殺菌效果受pH影響大，用酸性或強(qiáng)化酸性戊二醛浸泡醫(yī)療器械時，應(yīng)先用0.3%碳酸氫鈉調(diào)pH7.5-8.8。pH超過9.0時，戊二醛迅速聚合則失去殺菌能力。

③2%堿性戊二醛室溫只可保存2周，其余劑型可保存4周。

④戊二醛對皮膚粘膜有刺激性，接觸溶液時應(yīng)戴手套，防止濺入眼內(nèi)或吸入體內(nèi)。⑤配制戊二醛要用蒸餾水，盛放戊二醛溶液的容器要干凈。

⑥用戊二醛消毒或滅菌后的器械一定要用滅菌蒸餾水充分沖洗后再使用

5.考馬斯亮藍(lán)R-250

配制：考馬斯亮藍(lán)R-250 0.2g 冰醋酸7ml

甲醇46.5ml 蒸餾水46.5ml 注意：考馬斯亮藍(lán)和皮膚中蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，反應(yīng)快速，并且穩(wěn)定，無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細(xì)胞自然衰老脫落即可無礙。甲醇對人體有害，誤食后可導(dǎo)致失明，肝病，甚至死亡。皮膚粘上后用大量清水沖洗，不慎入眼時應(yīng)提起眼瞼，用流動清水沖洗并就醫(yī)，不慎食入后，應(yīng)大量飲用清水催吐洗胃并就醫(yī)。甲醇易燃，使用時應(yīng)避免明火，做好防火處理。

冰醋酸有腐蝕性，其蒸汽對眼與鼻有刺激作用，應(yīng)做好通風(fēng)與防護(hù)。

所有藥品使用后統(tǒng)一回收處理

第二篇：植物細(xì)胞骨架的觀察

實(shí)驗六 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

一、實(shí)驗?zāi)康模赫莆罩参锛?xì)胞骨架處理及染色方法。

二、實(shí)驗原理：用適當(dāng)濃度的TritonX-100處理時，可將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)破壞，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)卻被保存，后者用考馬斯亮蘭R250染色，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

三、實(shí)驗試劑：

1、M-緩沖液；

2、pH6.8磷酸緩沖液； 3、1% TritonX-100，用M-緩沖液配制； 4、0.2%考馬斯亮蘭R250； 5、3%戊二醛，用pH6.8磷酸緩沖液；

四、實(shí)驗步驟：

1、撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞（約1cm2大小若干片）置于裝有pH6.8磷酸緩沖液的50ml燒杯中，使其下沉；

2、吸去pH6.8磷酸緩沖液，用1% TritonX-100處理20min；

3、吸去1% TritonX-100，用M-緩沖液洗三次，每次8min；

4、3%戊二醛固定30min；

5、pH6.8磷酸緩沖液洗三次，每次8min；

6、0.2%考馬斯亮蘭R250染色20min；

7、用蒸餾水洗1-2次，將內(nèi)表皮細(xì)胞平鋪?zhàn)虞d玻片上，加蓋玻片，于顯微鏡下觀察。

五、實(shí)驗作業(yè)：

1、繪制你所觀察到的植物細(xì)胞骨架圖象；

2、戊二醛、考馬斯亮蘭R250、TritonX-100是什么？在本實(shí)驗中各起什么作用？

第三篇：實(shí)驗二、植物細(xì)胞骨架的觀察

實(shí)驗

二、植物細(xì)胞骨架的觀察

一、實(shí)驗?zāi)康?/p>

觀察植物細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)狀的骨架結(jié)構(gòu)。

二、實(shí)驗原理

在真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，存在著由蛋白質(zhì)纖維構(gòu)成的網(wǎng)狀骨架系統(tǒng)。Triton X-100是非離子去垢劑，用適當(dāng)濃度的Triton X-100處理細(xì)胞，可將細(xì)胞的膜成分抽提掉，由于失去膜的保護(hù)和維系作用，細(xì)胞內(nèi)其他可溶性成分也隨之流失，這樣一來水不溶性的細(xì)胞骨架系統(tǒng)蛋白質(zhì)卻被保留下來，而這被保留下來的蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍(lán)R250染色，便可在光學(xué)顯微鏡下觀察它們——細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。為了更好地觀察微絲束的結(jié)構(gòu)，采用了戊二醛對細(xì)胞進(jìn)行固定。戊二醛是一種雙交聯(lián)劑，滲透快，交聯(lián)能力強(qiáng)，對蛋白質(zhì)的固定效果好，且不破壞細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)。M-緩沖液洗滌細(xì)胞,可以提高細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性。M－緩沖液和磷酸緩沖液作用都是維持細(xì)胞的滲透壓

三、實(shí)驗用品

顯微鏡、50ml燒杯、蓋玻片、載玻片、濾紙、M-緩沖液、磷酸緩沖液（PBS）、1% Triton X-100、0.2%考馬斯亮藍(lán)R250、3%戊二醛、洋蔥鱗莖。

四、實(shí)驗方法與步驟

1、撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮若干片，大小約1平方厘米，置于裝有PH6.8的磷酸緩沖液（PBS）的50ml燒杯中，使其下沉。

2、用濾紙吸去磷酸緩沖液（PBS），用1% Triton X-100處理20-30分鐘。

3、吸去Triton X-100，用M-緩沖液洗3次，每次10分鐘。

4、用3%戊二醛固定10-15分鐘。

5、用磷酸緩沖液（PBS）洗3次，用濾紙吸干。

6、用0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色20-30分鐘。

7、用蒸餾水洗1-2次，將洋蔥細(xì)胞置于載玻片上，加上蓋片。

8、在光學(xué)顯微鏡下鏡檢。

五、作業(yè)

寫出你的實(shí)驗結(jié)果并繪成圖。

附：藥品配置

1、M—緩沖液（10×原液）

咪唑（50m mol）34.04g MgCl.6H2O 1.02g EGTA（1m mol）3.80g EDTA（0.1m mol）0.29g 巰基乙醇 0.78（0.7ml）蒸餾水 加至1000ml 用時稀釋，取50ml（10×原液）加450ml蒸餾水。

2、磷酸緩沖液（PBS）

配方①：

NaCl 8.0g Na2HPO4.2H2O 1.42g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g MgCl2.6H2O 0.10g CaCl2（無水）0.10g 0.5%酚紅 4ml 雙蒸水 加至100ml 用 5%NaHCO3調(diào)PH值至6.8。也可先配成10被濃縮液，使用時再稀釋。配方②：

6m mol/L PH6.5磷酸鹽緩沖液

A液：NaH2PO4.2H2O 938mg/1000ml B液：Na2HPO4.12H2O 2150mg/1000ml 取A液68.5ml，B液31.5ml，加蒸餾水100ml即為工作液。加入0.5%酚紅4ml。3、1% Triton X-100 用M-緩沖液配制。

取1mlTriton X-100液加M-緩沖液至100ml。4、0.2%考馬斯亮藍(lán)R250配制

考馬斯亮藍(lán)R250 0.2g 甲醇 46.5ml 冰醋酸 7ml 蒸餾水 46.5ml 5、3%戊二醛的配制

用磷酸緩沖液（PBS）配制。取3ml戊二醛加PH7.0、（1/15）磷酸鹽緩沖液至100ml。

第四篇：細(xì)胞骨架的觀察

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗

細(xì)胞骨架的觀察

姓名：鄧燕玲 學(xué)號：201011202912 專業(yè)：生命科學(xué)生物科學(xué) 實(shí)驗時間：20121030 指導(dǎo)老師：張偉 同組同學(xué)：張麗華

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗

實(shí)驗?zāi)康?/p>

1.了解細(xì)胞骨架的組成、結(jié)構(gòu)和功能。2.學(xué)習(xí)細(xì)胞骨架標(biāo)記的原理和方法。3.學(xué)習(xí)用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲的方法步驟。

4.觀察小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞的細(xì)胞微絲骨架。5.討論細(xì)胞骨架在中學(xué)中教學(xué)的重點(diǎn)與難點(diǎn)。

實(shí)驗原理

1.細(xì)胞骨架一般是指真核細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)架系統(tǒng)。廣義大的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞膜骨架、細(xì)胞核骨架和細(xì)胞質(zhì)骨架。直至1963年，科學(xué)家用戊二醛在室溫下固定成功后，人們才廣泛地觀察到各類細(xì)胞骨架纖維的存在。細(xì)胞骨架包括微管、微絲和中間纖維。不同成分有不同的結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞骨架處于不斷地動態(tài)平衡中，并且有極性。2.微絲的標(biāo)記方法可分為在固定細(xì)胞中標(biāo)記和在活體中標(biāo)記。本實(shí)驗采用的是固定細(xì)胞標(biāo)記，主要運(yùn)用帶熒光探針的抗體或鬼筆環(huán)肽標(biāo)記，這需要對樣品進(jìn)行化學(xué)固定和膜的通透。

3.熒光探針是一種標(biāo)記物，其中包含的熒光物質(zhì)在從外界吸收能量后變成激發(fā)態(tài)，在回到基態(tài)時以電磁波的形式釋放能量，從而產(chǎn)生熒光。熒光物質(zhì)在受到長時間的照射后會淬滅。

4.鬼筆環(huán)肽（phalloidin）是一種劇毒生物堿，能結(jié)合F-actin，而不與G-actin結(jié)合，并且在結(jié)合后可以抑制微絲的解聚，破壞微絲聚合和解聚的動態(tài)平衡。鬼筆環(huán)肽對細(xì)胞有毒害作用，因此不利于活體細(xì)胞的研究。

5.熒光顯微鏡是用于觀察和分析樣品中產(chǎn)生的熒光物質(zhì)的成分和定位的一種光學(xué)顯微鏡，熒光物質(zhì)在受到激發(fā)光的激發(fā)下，會發(fā)出比激發(fā)光波長更長的光，從而在顯微鏡下觀察。

實(shí)驗器材

1.材料：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、CHO中國倉鼠卵巢細(xì)胞

2.試劑：PEM緩沖液（50 mM pipes,5 mM EGTA, 5 mM MgSO4, 0.225M 山梨醇），0.5 % Triton X-100（溶于PEM緩沖液），4%多聚甲醛（溶于PEM緩沖液），55nM Alex-phalloidin 3.器械：熒光顯微鏡 實(shí)驗步驟

1.將小培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液用移液槍吸掉，加入預(yù)熱的1mlPEM清洗，注意不要打在蓋玻片

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗

上，洗三次。

2.加入1ml37°C預(yù)熱的0.5 % Triton X-100，放置10min。3.加入預(yù)熱的1mlPEM清洗，洗三次。4.加入預(yù)熱的4%多聚甲醛1ml，放置15min。5.加入預(yù)熱的1mlPEM清洗，洗三次。

6.剪下一段與載玻片寬度一樣的封口膜，將封口膜包在在玻片上，在玻片上的封口膜上加10?L的 55nM Alex –phalloidin，將載玻片有細(xì)胞的一面朝下蓋片，在暗盒中靜置25min。7.用37°預(yù)熱的PEM洗三次，將載玻片有細(xì)胞的一面朝上轉(zhuǎn)移到一個新的載玻片中，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

實(shí)驗結(jié)果 思考題

1.PEM緩沖液的作用是什么？

答：促進(jìn)微管中肌動蛋白的聚合，抑制其解聚，使微管形態(tài)固定，便于觀察。2.1％Triton X-100處理細(xì)胞的作用是什么？

答：能溶解膜上的脂類和蛋白質(zhì)，使細(xì)胞膜穿孔，便于標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。3.如何在中學(xué)教學(xué)中推進(jìn)細(xì)胞骨架的教學(xué)？

第五篇：實(shí)驗三 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

實(shí)驗三 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

一、實(shí)驗?zāi)康?/p>

了解細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)特征及其制備技術(shù)。

二、實(shí)驗器具及試劑 1．器具

普通光學(xué)顯微鏡、50ml燒杯、玻璃滴管、容量瓶、試劑瓶、載玻片、蓋玻片、鑷子、小剪刀、吸水紙、擦鏡紙。2．試劑

M-緩沖液：咪唑、KCL、MGCL2、EGTA【乙二醇雙醚四乙酸】、EDTA、疏基乙醇或DTT(二硫蘇糖醇)；（PH6.8）磷酸緩沖液（用NaHCO3調(diào)PH值）；Triton X-100，用M-緩沖液配制；考馬斯亮藍(lán)R250,其溶劑為：甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸餾水46.5ml；戍二醛、乙醇、叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性樹膠等。3.實(shí)驗材料 洋蔥鱗莖

三、實(shí)驗內(nèi)容

細(xì)胞骨架事由蛋白質(zhì)絲組成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)其組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為微管、微絲和中間纖維。它們對細(xì)胞形態(tài)的維持，細(xì)胞的生長、運(yùn)動、分裂、分化，物質(zhì)運(yùn)輸，能量轉(zhuǎn)換，信息傳遞，基因表達(dá)等起到重要作用。當(dāng)用適當(dāng)濃度的Triton X-100處理細(xì)胞時，可經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜中和細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和全部脂質(zhì)被溶解抽提，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)不受破壞而被保存，經(jīng)用戊二醛固定，考馬斯亮藍(lán)R250染色后，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到由微絲組成的微絲束為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，就是細(xì)胞骨架。

（一）溶液配制（1）M-緩沖液配制：

M-緩沖液(10×原液)：咪唑34.04g，氯化鎂(MgCl2?6H2O)1.02g，EGTA（乙二醇雙醚四乙酸）3.8g，EDTA(乙二胺四乙酸)0.29g，巰基乙醇0.78g(0.7ml)蒸餾水加至1 000 ml。使用時，取100 ml(10×原液)加900 ml蒸餾水。（2）6mmol/L（PH6.5）磷酸緩沖液配制： 甲液：NaH2PO4?2H2O，0.938g 溶于蒸餾水中，最后稀釋至1 000ml。乙液：Na2HPO4 ?12H2O，2.15g加蒸餾水溶解，最后加水至1 000ml。取甲液685ml，乙液315ml加蒸餾水1000ml即成6mmol/LPH6.5的磷酸緩沖液。

（3）1%Triton X-100，用M-緩沖液配制： 取22ml Triton X-100液加M-緩沖液至200ml。（4）0.2%考馬斯亮藍(lán)R250：

考馬斯亮藍(lán)R250為0.2g，甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸餾水46.5ml（5）3%戍二醛，用磷酸緩沖液配制。

（二）實(shí)驗方法與步驟

（1）撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮（約1cm2大小若干片）置于裝有PH6.8磷酸緩沖液的50ml燒杯中，使其下沉。

（2）吸去磷酸緩沖液，用1% Triton X-100處理20~30min。（3）吸去Triton X-100，用M-緩沖液洗3次，每次10min。（4）3%戊二醛固定0.5~1h。

（5）PH6.5磷酸緩沖液洗三次，每次10min。（6）0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色20~30min。

（7）用蒸餾水洗1~2次，細(xì)胞置于載破片上，加蓋玻片，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

（8）如觀察效果好，可制作成永久切片。

在有樣品的50ml燒杯中，順序通過如下藥物：50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、1/2V95%乙醇+1/2V叔丁醇、叔丁醇（每級5-10min）；或正丁醇、正丁醇、二甲苯、二甲苯（每級5-10min），然后撈取樣品，平展于載玻片上，經(jīng)鏡檢，效果好的，可加一滴中性樹膠，蓋上蓋玻片，即成永久片。

四、實(shí)驗報告

1．繪出植物細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)圖。

2．分析在光學(xué)顯微鏡下觀察到的細(xì)胞骨架的形態(tài)特征。