第一篇：細胞骨架組分的熒光染色觀察

細胞生物學實驗報告

細胞骨架組分的熒光染色觀察

姓名：

學號：

班級：

專業(yè)：

同組成員：

一、實驗原理

鬼筆環(huán)肽(phalloidin)是從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿，它同細胞松弛素的作用相反, 只與聚合的微絲結(jié)合, 而不與肌動蛋白單體分子結(jié)合。它同聚合的微絲結(jié)合后, 抑制了微絲的解體, 因而破壞了微絲的聚合和解聚的動態(tài)平衡。

由于鬼筆環(huán)肽非常特異地結(jié)合并穩(wěn)定聚合態(tài)肌動蛋白,因而對肌動蛋白的動態(tài)平衡造成嚴重影響.此外, 較高濃度的鬼筆環(huán)肽對細胞有毒害作用。因此,用鬼筆環(huán)肽標記微絲并不是用于研究活體細胞的理想方法。

二、實驗目的

1．掌握細胞骨架的顯示方法 2.掌握熒光顯微鏡的使用方法

3.了解熒光顯微鏡下細胞骨架的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)

三、實驗器材 1.材料：

CHO（中國倉鼠卵巢細胞）、雞胚成纖維細胞 2.試劑：

PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 0.5% Triton X-100溶于PEM緩沖液。4%多聚甲醛溶于PEM緩沖液。3.儀 器

超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡 4.其它用品：

蓋玻片（無菌）、35mm細胞培養(yǎng)皿、試管、移液管，滴管，酒精燈、75％酒精棉球、廢液缸。

四、方法與步驟

由于上節(jié)課雞胚成纖維細胞被污染，本次實驗所用細胞為CHO細胞（1）準備好實驗器材。（本次實驗無需在超凈臺中進行）

（2）將上節(jié)課進行細胞爬片的培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，取出蓋片，于小平皿中。（3）37℃預溫 PEM洗3次(每次 1mL)（4）Triton X-100處理約10min(1mL)（5）37℃預溫 PEM洗3次(每次 1mL)（6）37℃預溫 4%多聚甲醛固定細胞15min(1mL)（7）37℃預溫 PEM洗3次

（8）55nM Alex-phalloidin 10μL濕盒中室溫染色30min。（避光）（9）在parafilm 膜上加PEM，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片。（10）37℃預溫 PEM洗數(shù)3次，滴加10μL Ho.33342復染色。（11）熒光顯微鏡下觀察并拍照。

五、注意事項

1.蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕。2.注意不要弄碎蓋片，分清細胞所在面； 3.各步洗細胞要輕，勿使細胞脫落； 4.熒光觀察注意避光操作，防止熒光淬滅。5.節(jié)約試劑。

六、實驗結(jié)果

本次實驗我們對CHO細胞爬片結(jié)果進行了熒光染色，在熒光顯鏡下用不同波長的激發(fā)光對細胞骨架微絲結(jié)構(gòu)及細胞核進行了觀察、拍攝照片并將結(jié)果疊加。得到以下的實驗現(xiàn)象：

圖1.CHO細胞微絲熒光染色圖

圖2.CHO細胞核熒光染色圖

圖3.CHO細胞微絲及細胞核熒光染色合成圖

從拍攝的照片可以較為清晰的看到CHO細胞骨架的微絲被染成了綠色，細胞核被染成藍色；微絲的形狀為長條的紡錘狀細絲，遍布整個細胞，在細胞中起到了類似骨架般的支撐作用；細胞核為橢圓形，之后再將兩圖合成，可觀察到細胞核被遍布的微絲結(jié)構(gòu)包圍。實驗較為成功。在實驗時要注意熒光染料均存在淬滅問題，所以要盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。每步洗滌要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀釋下一步的抗體或試劑，這樣才能得到清晰的熒光圖像。

【參考文獻】

[1] 桑建利, 譚信.細胞生物學實驗指導.北京:科學出版社, 2010.[2] 北京師范大學生命科學學院.細胞生物學實驗.北京:北京師范大學生命科學學院,2015.9.

第二篇：細胞實驗細胞骨架組分的熒光染色觀察

細胞生物學實驗

細胞骨架組分的熒光染色觀察

一、實驗目的

1、掌握細胞骨架的顯示方法

2、掌握熒光顯微鏡的使用方法

3、了解熒光顯微鏡下細胞骨架的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)

4、了解熒光探針Hoechst 33342（Ho.33324）與細胞成分的結(jié)合特性和光譜特性

二、實驗原理

1、微絲股價是一種高度動態(tài)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與細胞的多種生理活動如細胞運動、胞質(zhì)分離、細胞器的定位、細胞內(nèi)物質(zhì)的運輸、吞噬作用、細胞極性生長等密切相關(guān)。

2、鬼筆環(huán)肽(phalloidin)是從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿，它同細胞松弛素的作用相反, 只與聚合的微絲結(jié)合, 而不與肌動蛋白單體分子結(jié)合。它同聚合的微絲結(jié)合后, 抑制了微絲的解體, 因而破壞了微絲的聚合和解聚的動態(tài)平衡。

3、由于鬼筆環(huán)肽非常特異地結(jié)合并穩(wěn)定聚合態(tài)肌動蛋白, 因而對肌動蛋白的動態(tài)平衡造成嚴重影響.此外, 較高濃度的鬼筆環(huán)肽對細胞有毒害作用.因此, 用鬼筆環(huán)肽標記微絲并不是用于研究活體細胞的理想方法。

三、實驗材料

1、材料：CHO（中國倉鼠卵巢細胞）

2、試劑：

（1）PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM

EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇

（2）0.5% Triton X-100溶于PEM緩沖液中。

（3）4%多聚甲醛溶于PEM緩沖液中。

四、實驗步驟

1、取出上次實驗爬片于小蓋玻片上的CHO細胞；

2、取出培養(yǎng)有CHO細胞的蓋片，于小平皿中37℃預溫 PEM洗3次(每次 1mL)； 3、37℃預溫 4%多聚甲醛固定細胞15min(1mL)4、37℃預溫 PEM洗3次

5、加入0.5%Triton X-100處理約10min(1mL)；

6、取一潔凈的載玻片，按照其的大小在其上放置一條封口膜，在封口膜上滴加20μL 60nM Alex-phalloidin 10L濕盒中室溫染色30min；

7、在parafilm 膜上加PEM，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片； 8、37℃預溫 PEM洗數(shù)3次；

9、滴加10L Ho.33342復染色；

10、熒光鏡下觀察?！咀⒁馐马棥?/p>

1、注意不要弄碎蓋片，分清細胞所在面；

2、各步洗細胞要輕，勿使細胞脫落；

3、熒光觀察注意避光操作

4、節(jié)約試劑。

五、實驗結(jié)果

圖一：CHO細胞微絲熒光染色圖

圖二：CHO細胞細胞核熒光染色圖

圖三：CHO細胞微絲與細胞核熒光染色疊加圖

六、實驗結(jié)果分析

染色后微絲呈綠色，細胞核為藍色，染色較為清晰。但細胞數(shù)量較多，導致有些染色結(jié)果重疊。

七、思考題

1、PEM緩沖液的作用是什么？

細胞內(nèi)的微絲在含有ATP和Ca2+及低濃度的Na+，K+等陽離子溶液中，趨于解聚成G-actin；而在Mg2+和高濃度的Na+，K+等陽離子溶液中，G-actin則裝配為F-actin。PEM緩沖液提供高Mg環(huán)境，讓單體肌動蛋白（G-actin）聚合成絲狀肌動蛋白（F-actin）。同時，EGTA能螯合Ca2+，使G-actin裝配成F-actin，微絲骨架保持聚合狀態(tài)且較為舒張。用PEM緩沖液處理細胞，能夠模擬體內(nèi)環(huán)境并提高細胞骨架的穩(wěn)定性。2、0.5%Triton X-100處理細胞的作用是什么？

0.5%Triton X-100處理細胞的作用是溶解細胞膜上的脂類和蛋白質(zhì)，增加細胞膜的通透性，使熒光染料能夠更容易地透過細胞膜與F-actin特異性結(jié)合。

3、鬼筆環(huán)肽用于細胞骨架研究的優(yōu)缺點是什么？

（1）鬼筆環(huán)肽用于細胞骨架研究的優(yōu)點：鬼筆環(huán)肽的分子量小，很容易通過細胞，不需要對細胞進行冷丙酮和TRITON X-100處理。鬼筆環(huán)肽可以與聚合的微絲結(jié)合，通過讓這種毒素吸附于熒光染料上面，可以研究細胞的內(nèi)部工作機制，窺視細胞如何分裂。（2）鬼筆環(huán)肽用于細胞骨架研究的缺點：對細胞有毒性，價格昂貴。

參考文獻：細胞生物學實驗(桑建利, 譚信)

第三篇：細胞骨架的觀察

細胞生物學實驗

細胞骨架的觀察

姓名：鄧燕玲 學號：201011202912 專業(yè)：生命科學生物科學 實驗時間：20121030 指導老師：張偉 同組同學：張麗華

細胞生物學實驗

實驗目的

1.了解細胞骨架的組成、結(jié)構(gòu)和功能。2.學習細胞骨架標記的原理和方法。3.學習用鬼筆環(huán)肽標記微絲的方法步驟。

4.觀察小鼠胚胎成纖維細胞和中國倉鼠卵巢細胞的細胞微絲骨架。5.討論細胞骨架在中學中教學的重點與難點。

實驗原理

1.細胞骨架一般是指真核細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)架系統(tǒng)。廣義大的細胞骨架包括細胞膜骨架、細胞核骨架和細胞質(zhì)骨架。直至1963年，科學家用戊二醛在室溫下固定成功后，人們才廣泛地觀察到各類細胞骨架纖維的存在。細胞骨架包括微管、微絲和中間纖維。不同成分有不同的結(jié)構(gòu)和功能。細胞骨架處于不斷地動態(tài)平衡中，并且有極性。2.微絲的標記方法可分為在固定細胞中標記和在活體中標記。本實驗采用的是固定細胞標記，主要運用帶熒光探針的抗體或鬼筆環(huán)肽標記，這需要對樣品進行化學固定和膜的通透。

3.熒光探針是一種標記物，其中包含的熒光物質(zhì)在從外界吸收能量后變成激發(fā)態(tài)，在回到基態(tài)時以電磁波的形式釋放能量，從而產(chǎn)生熒光。熒光物質(zhì)在受到長時間的照射后會淬滅。

4.鬼筆環(huán)肽（phalloidin）是一種劇毒生物堿，能結(jié)合F-actin，而不與G-actin結(jié)合，并且在結(jié)合后可以抑制微絲的解聚，破壞微絲聚合和解聚的動態(tài)平衡。鬼筆環(huán)肽對細胞有毒害作用，因此不利于活體細胞的研究。

5.熒光顯微鏡是用于觀察和分析樣品中產(chǎn)生的熒光物質(zhì)的成分和定位的一種光學顯微鏡，熒光物質(zhì)在受到激發(fā)光的激發(fā)下，會發(fā)出比激發(fā)光波長更長的光，從而在顯微鏡下觀察。

實驗器材

1.材料：小鼠胚胎成纖維細胞、CHO中國倉鼠卵巢細胞

2.試劑：PEM緩沖液（50 mM pipes,5 mM EGTA, 5 mM MgSO4, 0.225M 山梨醇），0.5 % Triton X-100（溶于PEM緩沖液），4%多聚甲醛（溶于PEM緩沖液），55nM Alex-phalloidin 3.器械：熒光顯微鏡 實驗步驟

1.將小培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液用移液槍吸掉，加入預熱的1mlPEM清洗，注意不要打在蓋玻片

細胞生物學實驗

上，洗三次。

2.加入1ml37°C預熱的0.5 % Triton X-100，放置10min。3.加入預熱的1mlPEM清洗，洗三次。4.加入預熱的4%多聚甲醛1ml，放置15min。5.加入預熱的1mlPEM清洗，洗三次。

6.剪下一段與載玻片寬度一樣的封口膜，將封口膜包在在玻片上，在玻片上的封口膜上加10?L的 55nM Alex –phalloidin，將載玻片有細胞的一面朝下蓋片，在暗盒中靜置25min。7.用37°預熱的PEM洗三次，將載玻片有細胞的一面朝上轉(zhuǎn)移到一個新的載玻片中，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

實驗結(jié)果 思考題

1.PEM緩沖液的作用是什么？

答：促進微管中肌動蛋白的聚合，抑制其解聚，使微管形態(tài)固定，便于觀察。2.1％Triton X-100處理細胞的作用是什么？

答：能溶解膜上的脂類和蛋白質(zhì)，使細胞膜穿孔，便于標記物質(zhì)進入細胞。3.如何在中學教學中推進細胞骨架的教學？

第四篇：2014 細胞生物學實驗課內(nèi)容(細胞形態(tài)觀察、細胞器活體染色、細胞骨架觀察)

實驗三 細胞形態(tài)的觀察

【實驗目的】

1.認識光學顯微鏡下細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)； 2.掌握臨時制片和顯微繪圖的方法。

【材料、器材和試劑】

材料：人體口腔黏膜上皮細胞、洋蔥鱗莖；

器材：顯微鏡、剪刀、鑷子、載玻片、蓋玻片、牙簽、濾紙； 試劑：1%碘液。

【方法和步驟】

1.口腔黏膜上皮細胞的制片與觀察

口腔黏膜細胞涂片標本的制備：吸取一滴碘液滴在一張潔凈的載玻片中央，用一根事先滅菌的牙簽伸入自己的口腔內(nèi)壁輕輕刮取黏膜上皮細胞，然后，將其放入載玻片上的染液中并來回攪動使細胞散開，染色1 min左右后小心加蓋玻片（盡量避免產(chǎn)生氣泡），用濾紙吸去蓋玻片周圍的液體。

觀察：將自制的口腔黏膜上皮細胞標本裝片置于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡觀察較分散的、輪廓清晰的黏膜上皮細胞。由于該細胞體積較小、著色較淡，觀察時應稍降低視野亮度以便于較快找到目標（在低倍鏡下，用碘液染色的細胞呈黃色，成群或分散分布，形態(tài)大小多呈扁平橢圓形）。選擇輪廓清晰的細胞移至視野中央，轉(zhuǎn)換至高倍鏡下觀察。在高倍鏡下，可見口腔黏膜上皮細胞外圍有一層薄薄的細胞膜，扁圓形的細胞核呈深黃色，細胞質(zhì)呈淺黃色或淺藍色，核中央致密的結(jié)構(gòu)為核仁。

2.洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞的制片與觀察

表皮細胞裝片標本的制備：取一干凈載玻片，在其中央滴一滴碘液，將洋蔥鱗莖用小刀分為幾塊，取一塊肉質(zhì)鱗葉，用剪刀在內(nèi)表皮劃“田”字形小方格，每一小方格邊長3-4mm，然后用鑷子輕輕撕下一小方格的膜質(zhì)表皮，置于載玻片的碘液滴中鋪平，取一干凈的蓋玻片，將其一側(cè)先接觸標本旁的碘液，再緩緩地蓋上蓋玻片，盡量避免產(chǎn)生氣泡，用濾紙吸去蓋玻片周圍的液體。

觀察：將制備好的裝片標本放到顯微鏡下，先用低倍鏡觀察，可見許多長柱狀、排列整齊、彼此相連的細胞，選擇其中一個典型的細胞移至視野中央，再轉(zhuǎn)換至高倍鏡下仔細觀察細胞壁、細胞核、細胞質(zhì)和液泡等結(jié)構(gòu)。

【實驗結(jié)果】

繪圖并進行適當標注：人口腔黏膜上皮細胞和洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞。【討論】

簡述觀察細胞形態(tài)時，制作臨時裝片和顯微鏡鏡檢時的注意事項。

實驗四 線粒體和液泡系的活體染色

【實驗目的】

1.掌握一些細胞器的超活性染色技術(shù)和原理。

2.觀察動物、植物細胞內(nèi)線粒體和液泡系的形態(tài)、數(shù)量和分布。

【材料、器材和試劑】

材料：人體口腔黏膜上皮細胞、洋蔥；

器材：顯微鏡、牙簽、鑷子、剪刀、載玻片、蓋玻片；

試劑：Ringer溶液；1/5000詹納斯綠B溶液；1/3000中性紅溶液。

【方法和步驟】

1.線粒體的超活染色與觀察

（1）人體口腔黏膜上皮細胞線粒體的超活染色和觀察

① 取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴2滴1/5000詹納斯綠B染液； ② 用一根預先滅菌的牙簽伸入自己的口腔內(nèi)壁輕輕刮取黏膜上皮細胞，將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10-15min（注意不可使染液干燥，必要時可再加一滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置于顯微鏡下觀察；

③ 在低倍鏡下，選擇平展的口腔黏膜上皮細胞，轉(zhuǎn)換高倍鏡進行觀察?？梢姳馄綘钌掀ぜ毎暮酥車|(zhì)中，分布著一些被染成藍綠色的顆粒狀或棍棒狀的線粒體。（2）洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞線粒體的超活染色和觀察

① 用吸管吸取1/5000詹納斯綠B染液，滴一滴在干凈的載玻片上，然后用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊，置于染液中，染色10-15min；

② 吸去染液，加一滴Ringer液，注意使內(nèi)表皮展平，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察。在高倍鏡下，可見表皮細胞中央被一大液泡所占據(jù)，細胞核被擠至旁邊，線粒體染成藍綠色，呈顆粒狀或線條狀。

2.液泡系的超活染色和觀察

① 洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊，置于1/3000中性紅溶液中，染色5-10min；

② 吸去染液，加一滴Ringer液，注意使內(nèi)表皮展平，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察，可見被染成磚紅色的中央大液泡。

【實驗結(jié)果】

1.根據(jù)實驗觀察，繪制洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞和人體口腔黏膜上皮細胞線粒體分布圖。2.根據(jù)實驗觀察，繪制洋蔥鱗莖表皮細胞指示液泡系的形態(tài)和分布。

【討論】

1.簡述線粒體詹納斯綠B活體染色和液泡系中性紅活體染色的原理； 2.分析線粒體和液泡系活體染色時需要注意的事項。3.細胞內(nèi)線粒體的形態(tài)和分布有何特點？

實驗五 植物細胞骨架的光學顯微鏡觀察

【實驗目的】

了解細胞骨架的結(jié)構(gòu)特征及其樣品制備技術(shù)。

【材料、器材和試劑】

材料：洋蔥鱗莖；

器材：普通光學顯微鏡、5Oml燒杯、玻璃滴管、容量瓶、試劑瓶、載玻片、蓋玻片、鑷子、小剪刀、吸水紙、擦鏡紙；

試劑：M 緩沖液；6mmol/L（pH 6.8）磷酸緩沖液；1% Triton X-100；0.2%考馬斯亮藍R250；3%戊二醛。

【方法和步驟】

1.撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮（約lcm大小若干片）置于裝有pH 6.8磷酸緩沖液的50ml燒杯中，使其下沉；

2.吸去磷酸緩沖液，用l% Triton X-100處理20-30min； 3.吸去Triton X-100，用M緩沖液洗3次，每次10min； 4.3%戊二醛固定O.5-lh；

5.pH 6.8磷酸緩沖液洗3次，每次10min； 6.0.2%考馬斯亮藍R250染色20-30min；

7.用蒸餾水洗1或2次，細胞置于載玻片上，加蓋玻片，于普通光學顯微鏡下觀察。

2【實驗結(jié)果】

繪制洋蔥鱗莖表皮細胞微絲束的分布圖。

【討論】

1.闡述采用考馬斯亮藍R250染色法顯示微絲的原理； 2.分析和論述在光學顯微鏡下觀察到的細胞骨架的形態(tài)特征。

第五篇：細胞骨架觀察實驗設(shè)計

細胞骨架觀察實驗設(shè)計

I、實驗內(nèi)容

一、正常細胞

二、秋水仙素處理 三、VP16處理 四、低溫處理 II、實驗流程

一、細胞傳代

二、細胞爬片

1~2d

三、細胞處理

6h

四、細胞固定、免染、觀察

1d III、實驗過程

一、細胞傳代

1、實驗材料

VEC

2、實驗器材

超凈臺、CO2培養(yǎng)箱、普通冰箱、倒置顯微鏡、離心機、離心管、微量加液器、吸管、細胞培養(yǎng)瓶（皿）、鑷子、酒精燈、消毒酒精、廢液缸

3、試劑

胰酶、PBS、培養(yǎng)液（牛血清、雙抗）

二、細胞爬片

已處理蓋片

三、細胞處理

細胞爬片、秋水仙素、VP16、普通冰箱

四、細胞固定、免染、觀察

1、實驗材料

已處理的爬片

2、實驗器材

離心機、離心管、玻璃培養(yǎng)皿、載玻片、濾紙、封口膜、溫箱、熒光顯微鏡、微量加液器、鑷子

3、試劑

PBS、BSA封閉液、一抗、二抗、蒸餾水、DAPI

4、步驟

固定

爬片置于玻璃培養(yǎng)皿中，PBS（500uL）洗3次，每次2min 吸棄PBS，加-20℃預冷甲醇，固定5min 吸棄甲醇，PBS洗3次，每次2min 免染

吸棄PBS，加100uL 2﹪BSA封閉液，蓋上培養(yǎng)皿蓋，室溫固定15min 濾紙吸去片子上封閉液，加30uL（1:500）稀釋一抗，蓋上封口膜（勿大于蓋片），37℃孵育30min ,邊上滴一滴PBS PBS洗3次，每次5min 在邊緣吸棄PBS（濾紙），滴加30uL（1:200）稀釋二抗，避光，蓋封口膜，37℃,30min 揭去封口膜，PBS洗3次，每次5min 吸棄PBS，蒸餾水清涮，迅速，片子正面朝上，晾干

干凈載玻片上，滴加3uLDAPI，將爬片鑷子夾上，反蓋于防淬滅劑上 熒光鏡觀察

IV、注意事項

1、區(qū)分蓋片正反面

2、保持樣品濕潤

3、一抗二抗孵育后，封口膜輕輕沖起

4、二抗孵育后，避光操作，以免熒光淬滅

5、標本染色后立即觀察，不看時4℃保存