第一篇：質(zhì)粒提取簡(jiǎn)介及問(wèn)題分析

質(zhì)粒提取簡(jiǎn)介及問(wèn)題分析

一、導(dǎo)論

(一)質(zhì)粒提取的原理：

為了方便理解，這里羅列一下堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液：

溶液I，50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，pH 8.0；

溶液II，0.2 N NaOH，1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸鉀，2 M 醋酸。

讓我們先來(lái)看看溶液I的作用。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-HCl溶液，是再自然不過(guò)的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)對(duì)質(zhì)粒的抽提本身而言幾乎沒(méi)有任何影響，所以說(shuō)溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長(zhǎng)。在溶液I中加入高達(dá) 10 mM 的EDTA，就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實(shí)也沒(méi)什么大不了的，只要是在不太長(zhǎng)的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會(huì)迅速被降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽質(zhì)粒呢？只要用等體積的水或LB培養(yǎng)基來(lái)懸浮菌體就可以了。有一點(diǎn)不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。

輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2%的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無(wú)非是為了保證NaOH沒(méi)有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer(雙層膜)結(jié)構(gòu)向micelle(微囊)結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌(不妨可以自己試一下)，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)镾DS也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對(duì)NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒(méi)有正確理解一些書(shū)上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問(wèn)，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢?那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，千萬(wàn)不要這時(shí)候去接電話，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會(huì)斷裂?；蚪MDNA的斷裂會(huì)帶來(lái)麻煩。

溶液III加入后就會(huì)有大量的沉淀，但大部分人卻不明白沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加2M醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS，也會(huì)有少量沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會(huì)不會(huì)是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉(SDS)遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀(PDS)，而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來(lái)，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門(mén)喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過(guò)程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長(zhǎng)了，長(zhǎng)長(zhǎng)的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。(二)細(xì)菌的收獲和裂解。

細(xì)菌的收獲可通過(guò)離心來(lái)進(jìn)行，而細(xì)菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于3個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。盡管針對(duì)質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出精確的裂解條件不切實(shí)際，但仍可據(jù)下述一般準(zhǔn)則來(lái)選擇適當(dāng)方法，以取得滿意的結(jié)果。

1、大質(zhì)粒(大于15kb)容易受損，故應(yīng)采用漫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來(lái)。將細(xì)菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進(jìn)生處理，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，再加入SDS一類(lèi)去污劑溶解球形體。這種方法最大限度地減小了從具有正壓的細(xì)菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來(lái)所需要的作用力。

2、可用更劇烈的方法來(lái)分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后，有時(shí)還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌暴露于去污劑，通過(guò)煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對(duì)，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開(kāi)。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。

3、一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株)用去污劑或加熱裂解時(shí)可釋放相對(duì)大量的糖類(lèi)，當(dāng)隨后用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時(shí)它們會(huì)惹出麻煩。糖類(lèi)會(huì)在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類(lèi)，而糖類(lèi)可抑制多種限制酶的活性。故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時(shí)，不宜使用煮沸法。

4、當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA 株，如HB101)中小量制備質(zhì)粒時(shí)，建議不使用煮沸法。因?yàn)橹蠓胁荒芡耆珳缁顑?nèi)切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時(shí)，質(zhì)粒DNA會(huì)被降解。但如果通過(guò)一個(gè)附加步驟(用酚：氯仿進(jìn)行抽提)可以避免此問(wèn)題。

5、目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不需要用氯霉素進(jìn)行選擇性擴(kuò)增就可獲得高產(chǎn)。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，而是要降低細(xì)菌細(xì)胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細(xì)菌裂解物，處理起來(lái)煞為費(fèi)事，而在對(duì)數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉素存在時(shí)從較少量細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加氯霉素時(shí)從較大量細(xì)胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。(三)質(zhì)粒DNA的純化。

常用的純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀這樣兩個(gè)性質(zhì)。如，用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。溴化乙錠通過(guò)嵌入堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長(zhǎng)度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。最后，超螺旋度大為增加，從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多的染料，直至達(dá)到飽和(每2個(gè)堿基對(duì)大約結(jié)合1個(gè)溴化乙錠分子)。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來(lái)，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。然而該過(guò)程既昂貴又費(fèi)時(shí)，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、分級(jí)沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。

二、質(zhì)粒DNA的小量制備(一)細(xì)菌的收獲和裂解。

1、收獲。

1)將2ml含相應(yīng)抗生素的LB加入到容量為15ml 并通氣良好(不蓋緊)的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過(guò)夜。

2)將1.5ml培養(yǎng)物倒入離心管中，4℃、12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。3)吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。

2、堿法裂解。

1)將細(xì)菌沉淀，所得重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩。溶液I可成批配制，高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。須確使細(xì)菌沉淀在溶液I中完全分散。

2)加200μl新配制的溶液Ⅱ。蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。

3)加150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ。蓋緊管口，將管倒置后溫和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3-5分鐘。

4)用離心機(jī)于4℃、12000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。

5)可做可不做：加等量酚：氯念，振蕩混勻，用微量離心機(jī)于4 ℃以12000g離心 2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。有些工作者認(rèn)為不必用酚：氯仿進(jìn)行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會(huì)得到可耐受限制酶切反應(yīng)的DNA。6)用2倍體積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合，于室溫放置2分鐘。7)用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘。

8)小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。9)用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。i.此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒(如Xf3或pUC)，其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌培養(yǎng)物3-5μg。

ii.如果要通過(guò)限制酶切割反應(yīng)來(lái)分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量離心管內(nèi)，加1μl 10×限制酶緩沖液和1單位所需限制酶，在適宜溫育1-2小時(shí)。將剩余的DNA貯存于-20℃。iii.此方法按適當(dāng)比例放大可適用于100ml細(xì)菌培養(yǎng)物：。

3、煮沸裂解。

1)將細(xì)菌沉淀，所得重懸于350μlSTET中。STET：0.1mol/L NaCL，10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，5% Triton X-100。

2)加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮作用。3)將離心管放入煮沸的水浴中，時(shí)間恰為40秒。4)用微量離心機(jī)于室溫以12000g離心10分種。5)用無(wú)菌牙簽從微量離心管中去除細(xì)菌碎片。

6)在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉(pH5.2)和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。7)用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。

8)小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管的液滴。9)加1ml 70%乙醇，于4℃以12 000g離心2分鐘。

10)按步驟8)所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因?yàn)橛袝r(shí)沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開(kāi)管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無(wú)可見(jiàn)的液體(2-5)分鐘。11)用50μl含無(wú)DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。注：當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌株(endA 株，如HB101)中小量制粒尤其DNA時(shí)，建議舍棄煮沸法。因?yàn)橹蠓胁襟E不能完全滅活內(nèi)切核酸酶A，以后在Mg 2 存在下溫育(V中用限制酶時(shí))質(zhì)粒DNA可被降解。在上述方案的步驟9)之間增加一步，即用酚：氯仿進(jìn)行抽提，可以避免這一問(wèn)題。(二)質(zhì)粒DNA小量制備的問(wèn)題與對(duì)策。

堿裂解和煮沸都極其可靠，重復(fù)性也很好，而且一般沒(méi)有什么麻煩。多年來(lái)，在我們實(shí)驗(yàn)室中日常使用這兩種方法的過(guò)程中，只碰到過(guò)兩個(gè)問(wèn)題：

1、有些工作者首次進(jìn)行小量制備時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對(duì)溶液進(jìn)行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA。

2、在十分偶然的情況下，個(gè)別小時(shí)制備物會(huì)出現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒DNA的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。

三、質(zhì)粒DNA的大量制備(一)在豐富培養(yǎng)基中擴(kuò)增質(zhì)粒

許多年來(lái)，一直認(rèn)為在氯霉素存在下擴(kuò)增質(zhì)粒只對(duì)生長(zhǎng)在基本培養(yǎng)基上的細(xì)菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl復(fù)制子的高拷貝數(shù)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產(chǎn)量至每500ml培養(yǎng)物2-5mg質(zhì)粒DNA，而且重復(fù)性也很好。

1)將30ml含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對(duì)數(shù)晚期(DNA 600約0.6)。培養(yǎng)基中應(yīng)含有相應(yīng)抗生素，用單菌落或從單菌落中生長(zhǎng)起來(lái)的小量液體閉關(guān)物進(jìn)行接種。

2)將含相應(yīng)抗生素的500ml LB或Terrific肉湯培養(yǎng)基(預(yù)加溫至37℃)施放入25ml對(duì)數(shù)晚期的培養(yǎng)物，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時(shí)(搖床轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分)，所得培養(yǎng)物的OD 600值約為0.4。3)可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇)，使終濃度為170μg/ml。像pBR322一類(lèi)在宿主菌內(nèi)只以中等拷貝婁竿行復(fù)的質(zhì)粒，有必要通過(guò)擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長(zhǎng)達(dá)到餉新一代的質(zhì)粒(如pUC質(zhì)粒)可復(fù)制達(dá)到很高的拷貝數(shù)，因此無(wú)需擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長(zhǎng)達(dá)到飽和的細(xì)菌培養(yǎng)物即可大量提純。但用氯霉素進(jìn)行處理，具有抑制細(xì)菌復(fù)制的優(yōu)點(diǎn)，可減少細(xì)菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡(jiǎn)化質(zhì)粒純化的過(guò)程。所以一般說(shuō)來(lái)，盡管要在生長(zhǎng)中的細(xì)菌培養(yǎng)物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊。

4)于37℃劇烈振搖(300轉(zhuǎn)/分)，繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí)。(二)細(xì)菌的收獲和裂解。

1、收獲。

1)4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清，敞開(kāi)離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。2)將細(xì)菌沉淀重懸于100ml用冰預(yù)冷的STE中。STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。

3)按步驟1)所述方法離心，以收集細(xì)菌細(xì)胞。

2、堿裂解法。

1)將冼過(guò)的500ml 培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀物[來(lái)自收獲細(xì)菌的步驟3] 重懸于10ml(18ml)溶液I中。2)加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，溶于10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)]。當(dāng)溶液的pH值低于8.0時(shí)，溶菌酶不能有效工作。

3)加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物。于室溫放置5-10分鐘。

4)加15nl(20ml)用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ。封住瓶口，搖動(dòng)離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，此時(shí)應(yīng)不再出現(xiàn)分明的兩個(gè)液相。置冰上放10分鐘，應(yīng)形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應(yīng)包括染體DNA、高分子量RNA和鉀-SDS-蛋白質(zhì)-膜復(fù)合物。

5)用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，不開(kāi)剎車(chē)而使轉(zhuǎn)頭自然停轉(zhuǎn)。如果細(xì)菌碎片貼壁不緊，可以5000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘，然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細(xì)菌裂解物混合不充分[步驟4)]。6)上清過(guò)濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。7)用合適轉(zhuǎn)頭于室溫以500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會(huì)了生沉淀。

8)小心倒掉上清，敞開(kāi)瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70%乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。

9)用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。

四、質(zhì)粒DNA的純化

(一)聚乙二醇沉淀法提取質(zhì)粒DNA。

1、將核酸溶液所得]轉(zhuǎn)入15mlCorex 管中，再加3ml 用冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉(zhuǎn)頭于4℃下以10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。

2、將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇，充分混勻，用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭(或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖)于室溫以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分釧，回收沉淀的核酸。

3、小心去掉上清，敞開(kāi)管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70%乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開(kāi)管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。

4、用500μl含無(wú)DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。

5、加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心5分鐘，以回收質(zhì)粒DNA。

6、吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。

7、將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中，加100μl 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加2倍體積(約1ml)乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12 000g離心5分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒DNA。

8、吸去上清，加200μl處于4℃以12 000g離心2分鐘。

9、吸去上清，敞開(kāi)管口，將管置于實(shí)驗(yàn)桌上直到最后可見(jiàn)的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。10)用500μl TE(pH8.0)溶解沉淀1：100稀釋[用TE(pH8.0)] 后測(cè)量OD 260，計(jì)算質(zhì)粒DNA的濃度(1OD260=50μg質(zhì)粒DNA/ml)，然后將DNA貯于-20℃。

10、純化。

一些試劑的生化作用原理

1、溶液Ⅰ

溶霉菌：水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。葡萄糖：增加溶液的粘度，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。

EDTA：金屬離子螯合劑，螯合Mg2+，Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶(DNase)對(duì)DNA的降解作用(DNase 作用時(shí)需要一定的金屬離子強(qiáng)度作輔基)，同時(shí)EDTA的存在，有利于溶霉菌的作用。因?yàn)槿苊咕姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度環(huán)境。

2、溶液Ⅱ-NaOH-SDS液

NaOH：核酸在pH值為5~9的溶液中是最穩(wěn)定的，但pH大于12或小于3時(shí)，就會(huì)引起雙鍵之間氫鍵的解離而變性。在溶液Ⅱ中的NaOH濃度為0.2N，加入提取液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就會(huì)高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。

SDS：為陰離子表面活性劑，主要功能有：溶解細(xì)胞膜上的脂肪與蛋白，從而破壞細(xì)胞膜；解聚細(xì)胞中的核蛋白SDS蛋白質(zhì)結(jié)合為復(fù)合物，使蛋白變性沉淀下來(lái)，但SDS能抑制核糖核酸沒(méi)的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除干凈，以防用RNase去除RNA時(shí)受到干擾。

3、溶液Ⅲ-3M KAc(pH4.8)溶液：

KAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸，所以該溶液實(shí)際上是KAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的KAc溶液是為了把pH 12.6的抽取液pH調(diào)回到中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol∕L KAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?。減少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物作用后，能形成溶解度較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀完全。

4、為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA: 此為實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是低度極性，可以以任意比例和水相混容，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。

DNA溶液時(shí)以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在的DNA，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周?chē)乃肿樱笵NA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合。其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來(lái)代替無(wú)水乙醇(因無(wú)水乙醇價(jià)格更貴)，但加95%乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中總有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，會(huì)影響收得率。折衷的做法是初次沉淀DNA是可用95%乙醇代替無(wú)水乙醇，最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用異丙醇選擇性沉淀DNA，一般在室溫下放置15~30min即可。

使用乙醇在低溫條件下沉淀DNA，分子運(yùn)動(dòng)大大減少，DNA易于聚合而沉淀，且溫度越低，DNA沉淀得越快。

5、RNase處理核糖核酸后，再次沉淀DNA時(shí)為什么一定要加NaAc至最濃度達(dá)0.1~0.25M。

在pH 8左右的DNA溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA納鹽沉淀。當(dāng)加入大量鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全。當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不太好，在沉淀的DNA中，由于過(guò)多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。

6、為什么將DNA保存于TE緩沖液中？ 在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(pKa2=7.2)、硼酸系統(tǒng)(pKal=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可以作為DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根將與Ca2+產(chǎn)生沉淀；在DNA酶反應(yīng)時(shí)，不同的煤對(duì)輔助因子的種類(lèi)及數(shù)量要求不同，有的要求高鹽離子濃度，有哦則要求低鹽離子濃度，采用Tris-HCL(pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖對(duì)時(shí)Tris+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用Tris-HCL系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。

操作要領(lǐng)：

1、該實(shí)驗(yàn)成功的標(biāo)志是把染色體DNA，蛋白質(zhì)與RNA去除干凈。獲得一定收得率的質(zhì)粒DNA。去掉染色體DNA最為重要，也較困難。因?yàn)樵谌刻崛∵^(guò)程中，只有一次機(jī)會(huì)去除染色體DNA，其關(guān)鍵步驟是加入溶液Ⅱ與溶液Ⅲ時(shí)，控制變性與復(fù)性操作時(shí)機(jī)，既要使試劑與染色體DNA充分作用使之變性；又要使染色體DNA不斷裂成小片段而能與質(zhì)粒DNA相分離。這就要求試劑與溶菌液充分搖勻。搖動(dòng)時(shí)用力適當(dāng)。一般加入SDS后要注意不能過(guò)分用力振蕩，但又必須讓它反應(yīng)充分。

2、當(dāng)加入溶液Ⅱ5min后，若沒(méi)有看到溶液變稠時(shí)，實(shí)驗(yàn)不能再繼續(xù)做下去了。

3、配置試劑時(shí)，要用重蒸水配置外，其器皿必須嚴(yán)格清洗，最后要用重蒸水沖洗三次，凡可以進(jìn)行滅菌的試劑與用具都要經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌，防止其他雜質(zhì)或酶對(duì)DNA的降解，對(duì)Ep管、Tip頭與非玻璃離心管等只能濕熱滅菌，然后放置在50℃溫箱中烘干使用。

4、用乙醇沉淀DNA時(shí)，要觀察水相與乙醇之間沒(méi)有分層現(xiàn)象之后，才可放在冰箱中去沉淀DNA。

第二篇：質(zhì)粒提取有關(guān)問(wèn)題及注意點(diǎn)

質(zhì)粒提取常見(jiàn)問(wèn)題解析

涂布棒在酒精蘸一下，然后燒一下，能不能保證把所用的菌燒死？

參考見(jiàn)解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即時(shí)殺菌。蘸了酒精后再燒一小會(huì)，燒的是酒精而不是涂布棒。建議涂布棒還是干燒較長(zhǎng)時(shí)間后，冷卻了再涂。同時(shí)作多個(gè)轉(zhuǎn)化時(shí)，應(yīng)用幾個(gè)涂布棒免得交叉污染。

原先測(cè)序鑒定沒(méi)有問(wèn)題的細(xì)菌，37℃搖菌后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小或序列出現(xiàn)異常? 參考見(jiàn)解：這種情況出現(xiàn)的幾率較小，常出現(xiàn)在較大質(zhì)?；虮容^特殊的序列中。解決辦法：

1、降低培養(yǎng)溫度，在20～25℃下培養(yǎng)，或室溫培養(yǎng)可明顯減少發(fā)生概率。

2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類(lèi)等，使得質(zhì)粒復(fù)制更加穩(wěn)定。

3、質(zhì)粒抽提有一個(gè)酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH濃度過(guò)高造成的，請(qǐng)大家注意一下！

【有兩種方法可以在提質(zhì)粒前判斷菌生長(zhǎng)是否正常：

1、利用你的嗅覺(jué)。只要平時(shí)做實(shí)驗(yàn)仔細(xì)點(diǎn)就能聞出大腸桿菌的氣味，新鮮的大腸桿菌是略帶一點(diǎn)刺鼻的氣味，但不至于反感。而在泥水狀的菌液中你只要一湊過(guò)去就感覺(jué)到其臭無(wú)比或者沒(méi)有氣味，可以和正常菌液對(duì)照。

2、肉眼觀察活化菌株。對(duì)于生長(zhǎng)不正常的菌液進(jìn)行劃板驗(yàn)證或者稀釋到濃度足夠低涂板，第二天觀察單克隆生長(zhǎng)情況，LB平板生長(zhǎng)的DH5A正常形態(tài)在37℃16h后直徑在1mm左右，顏色偏白，半透明狀，濕潤(rùn)的圓形菌斑，如果觀察到生長(zhǎng)過(guò)快，顏色又是泛黃的話基本上不正常了?！?/p>

未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒得率較低，如何解決？ 參考見(jiàn)解：

1、大腸桿菌老化：涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。

2、質(zhì)?？截悢?shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。

3、菌體中無(wú)質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長(zhǎng)期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

4、堿裂解不充分：使用過(guò)多菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液的用量。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)可加大菌體用量并加倍使用溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。

5、溶液使用不當(dāng)：溶液2和3在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

6、吸附柱過(guò)載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請(qǐng)分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長(zhǎng)率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。

7、質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí))：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。

8、乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。

9、洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。

10、洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過(guò)低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。

11、洗脫體積太?。合疵擉w積對(duì)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

12、洗脫時(shí)間過(guò)短：洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)放置1min可達(dá)到較好的效果。

細(xì)菌離心加入溶液I蝸旋振蕩后，發(fā)現(xiàn)菌體呈絮狀不均勻或呈細(xì)砂狀？ 參考見(jiàn)解：

1、很可能是細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時(shí)間或者試試平板培養(yǎng)，質(zhì)粒提取前用PBS將菌落洗下，相較來(lái)說(shuō)固體培養(yǎng)基上細(xì)菌生長(zhǎng)的要好一些。

2、質(zhì)粒抽提過(guò)程很大程度上是受細(xì)菌生長(zhǎng)情況決定的，剛活化的菌比負(fù)80℃保存菌種所培養(yǎng)出來(lái)的菌液狀態(tài)好，保存久的菌株可能會(huì)造成質(zhì)粒濃度低，質(zhì)粒丟失等不明原因。

3、判斷生長(zhǎng)的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線明亮處搖蕩新鮮培養(yǎng)液，如果發(fā)現(xiàn)菌液呈漂絮狀，情況很好。如果發(fā)現(xiàn)呈泥水狀，即看不到絮狀，只是感覺(jué)很渾濁，則可能提不出好的質(zhì)粒，或者沒(méi)有質(zhì)粒。

4、菌液不宜生長(zhǎng)太濃，搖床速度不宜過(guò)高。達(dá)到OD600 1.5就可以了，（尤其是對(duì)于試劑盒提取要注意）另外如果只是簡(jiǎn)單的酶切驗(yàn)證根本無(wú)需酚氯仿抽提（安全考慮，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰當(dāng)，轉(zhuǎn)管過(guò)程仔細(xì)吸取不會(huì)有太多雜志。

為什么加了溶液Ⅱ后，菌體沒(méi)有逐漸由混濁變澄清？提出來(lái)的條帶幾乎沒(méi)有，但是RNA很亮（沒(méi)加RNA酶）？

溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液沒(méi)有由混濁變澄清，參考見(jiàn)解：

1、可能是因?yàn)槿芤簝?chǔ)存不當(dāng)，或?qū)掖尾僮鳑](méi)有及時(shí)蓋好溶液瓶蓋，導(dǎo)致其吸收空氣中的CO2失效。RNA在菌體中量較多，相對(duì)少量的菌體裂解，可有較DNA明顯的條帶。

2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌體并不能完全裂解，所以沒(méi)有變清，這也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)率低下．

3、可能是質(zhì)粒的拷貝數(shù)不高，質(zhì)粒產(chǎn)率不高．如果是使用自己配的試劑，建議做中提或大提；或者買(mǎi)試劑盒提．用自己配的試劑，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干凈就要用比較好的ＲＮＡ酶。

4、如果不是試劑的原因，可能是質(zhì)粒表達(dá)的過(guò)程中使膜蛋白變化（數(shù)量變多），很難使用堿裂解法，可以嘗試用其他比較劇烈的方法(比如高溫或者低溫研磨等),然后使用一般的發(fā)放。

5、可能質(zhì)粒隨乙醇一起倒掉了。

加入溶液II后，菌液仍然呈渾濁狀態(tài)，或者混濁度沒(méi)有明顯的改變？ 裂解不完全,參考見(jiàn)解：

1、問(wèn)題可能是發(fā)生在溶液II上。首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是試劑盒，也要首先確認(rèn)溶液II是否澄清沒(méi)有沉淀？

2、可能是細(xì)菌濃度很高，適當(dāng)調(diào)整增加溶液I/II/III的體積。

3、可能是“雜菌”污染，如果菌液生長(zhǎng)異?？欤陀锌赡鼙浑s菌污染。這種情況一般表現(xiàn)為和目的菌有相同的抗性，生長(zhǎng)速度異常，能夠提出質(zhì)粒，跑膠的條帶也異常的亮，但產(chǎn)物不是自己想要的質(zhì)粒，要特別注意一下。抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，為什么要是酚/氯仿混合使用？怎樣使用酚與氯仿較好？

參考見(jiàn)解：酚與氯仿都是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開(kāi)。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA。所以在抽提過(guò)程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合（1:1）使用。

呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？

參考見(jiàn)解：保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以使用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮?dú)夥乐古c空氣接觸而被氧化。平時(shí)保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時(shí)，打開(kāi)蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。

為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戊醇？

參考見(jiàn)解：在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，可以降低抽提過(guò)程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。加入酚/仿抽提，離心后在水相和有機(jī)相間沒(méi)有出現(xiàn)變性蛋白相層，在隨后的乙醇沉淀步驟中卻出現(xiàn)大量的半透明沉淀，溶解后發(fā)現(xiàn)蛋白濃度很高？

乙醇沉淀時(shí)，較純的質(zhì)粒沉淀是白色的（PEG純化的沉淀是透明的肉眼不易發(fā)現(xiàn)），如沉淀是半透明的凝膠狀，則應(yīng)是蛋白含量高。參考見(jiàn)解：首先看看平衡酚是否已被氧化？pH是否是8.0？其次檢測(cè)溶液III反應(yīng)完成后的離心上清pH是否在8.0左右？有時(shí)由于溶液III配置的問(wèn)題，會(huì)出現(xiàn)溶液III反應(yīng)后離心的上清pH與8.0偏差較大的現(xiàn)象，這會(huì)降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差過(guò)大也會(huì)導(dǎo)致水相和平衡酚互溶。使用酚仿抽提方法，質(zhì)粒的純度很好，但酶切不能完全切開(kāi)? 參考見(jiàn)解：

1、確認(rèn)酶的有效性。

2、平衡酚是否被氧化（正常是黃色，而氧化后是棕色的）。

3、是否不小心吸入了痕量的酚。

4、乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（殘留的鹽類(lèi)會(huì)影響酶切）。

5、乙醇漂洗后是否完全干燥（殘留的乙醇會(huì)影響酶切）。

堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定時(shí)，看到的三條帶分別是什么？

參考見(jiàn)解：堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，得到的三條帶是以電泳速度的快慢排序的，分別是超螺旋、開(kāi)環(huán)和復(fù)制中間體（即沒(méi)有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過(guò)度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。提取質(zhì)粒中RNA沒(méi)有去除？

可能是RNase失效或效率不高。參考見(jiàn)解：

1、更換RNase A，并保證其儲(chǔ)存條件是正確的

2、手工提取質(zhì)粒的，可單獨(dú)增加一步去除RNA的步驟，溶液III反應(yīng)后，在離心的上清中加RNase，室溫下去除RNA 10min～30min（需要保證RNase A是經(jīng)過(guò)失活DNase的），同時(shí)較高溫度（如50℃）會(huì)更加快速完全的去除RNA，經(jīng)驗(yàn)所得經(jīng)過(guò)高溫處理的質(zhì)粒質(zhì)量不是很高。提取的質(zhì)粒電泳后，為連續(xù)的一片火箭狀？ 參考見(jiàn)解：

1、質(zhì)粒如果鹽離子多，會(huì)有走膠變形的現(xiàn)象，如果提到的質(zhì)粒不夠純，會(huì)有電泳條帶不平齊的現(xiàn)象。

2、當(dāng)電壓太大時(shí)，容易出現(xiàn)火箭狀，而降解應(yīng)該是彌散狀。

3、可能是宿主菌影響的，質(zhì)粒抽提好后，用酚-氯仿處理一下再酶切，若有改善，則為宿主菌影響。轉(zhuǎn)化到其它宿主菌再切。

4、NaOH的濃度過(guò)高，會(huì)出現(xiàn)火箭狀的結(jié)果。

用堿裂解法提取質(zhì)粒，裂解5分鐘，沒(méi)有用酚 / 氯仿抽提，最后用滅菌水溶解質(zhì)粒DNA15min。雙酶切后跑膠一條帶都沒(méi)有，原因是什么？ 參考見(jiàn)解：

1、溶解時(shí)間稍微短了點(diǎn)，但是根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室RNase不同，這個(gè)條件是不同的。在溶解的過(guò)程要渦旋處理促進(jìn)溶解。

2、確認(rèn)一下酶切過(guò)程中是不是有DNA酶的污染，比如酶切體系的Buffer或者是水，特別是水中；其次是酶切體系的問(wèn)題；建議再把提取的產(chǎn)物用70%酒精重新洗滌一遍，也可以用酚 / 氯仿重新抽提一下。

3、也可能在用乙醇洗時(shí)把質(zhì)粒倒掉了。

4、沒(méi)有用RNase消化，不要用放久的 RNase否則會(huì)有DNA酶的污染；

5、在沒(méi)有進(jìn)行酶切時(shí),把所提的質(zhì)粒跑一下核酸電泳看看,如果是提核酸的問(wèn)題那這一步電泳結(jié)果應(yīng)該沒(méi)有大于三千的條帶,這樣可以先排除核酸提取的問(wèn)題.若是沒(méi)有酶切時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等其他問(wèn)題的話可以那可以檢查一下所用的溶解DNA的溶液是否有DNAse污染的問(wèn)題，建議將超純水換成TE。

用堿裂解法提取的質(zhì)粒,取3ul轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌涂amp抗性平板，卻出現(xiàn)陽(yáng)性克隆較少（含綠色熒光蛋白，陽(yáng)性克隆應(yīng)該顯綠色，在紫外燈下非常明顯，就幾十個(gè)菌落）大部分菌落不發(fā)綠，這些菌落比發(fā)綠的菌落小一些的現(xiàn)象，為什么？ 參考見(jiàn)解：

1、做一次陰性對(duì)照,拿空白菌涂布在含amp的平板上,如生長(zhǎng),說(shuō)明amp過(guò)期,一般這種情況不多見(jiàn)。一般粉末狀的amp不容易失效,如果amp有效的話,可以配制遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)的濃度,如果細(xì)菌耐藥的話,也能生長(zhǎng)良好,如不耐藥,則放置數(shù)天仍不見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2、拿陰性和陽(yáng)性的細(xì)菌各取數(shù)個(gè)放于高濃度的amp液體培養(yǎng)基中,如能生長(zhǎng),說(shuō)明空白菌中帶有耐藥菌,建議換菌.3、提質(zhì)粒的菌受污染了，重新劃線挑單克隆。

培養(yǎng)基、抗生素、質(zhì)粒提取都沒(méi)有問(wèn)題，而細(xì)菌菌液提取不到質(zhì)粒？

參考見(jiàn)解：如果是氨芐抗性的，有可能是質(zhì)粒丟失造成的。主要是培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的beta-內(nèi)酰胺酶過(guò)多，作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，同時(shí)培養(yǎng)基pH值降低，氨芐青霉素失活，從而使無(wú)質(zhì)粒的菌株大量增殖。解決的辦法：可以添加葡萄糖，縮短培養(yǎng)時(shí)間，改用羧芐青霉素。|||謝謝樓主,還有什么專題也要貼出來(lái)啊!|||謝謝分享

到一個(gè)小tips。轉(zhuǎn)帖過(guò)來(lái)和菜鳥(niǎo)分享。大蝦憑手感就可以了,我們還是要學(xué)學(xué)的,受益匪淺 1．溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用（DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。2．溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH＞12或pH＜3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-?R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時(shí)）受到干擾。

3.溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：

NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。

4．為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA？

用無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周?chē)乃肿?，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95％乙醇代替無(wú)水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15－30分鐘即可。

5．在用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.1～0.25mol/L？ 在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過(guò)多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來(lái)處理？

加進(jìn)去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。

7．為什么在保存或抽提DNA過(guò)程中，一般采用TE緩沖液？

在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa＝7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子的種類(lèi)及數(shù)量將與Ca2＋產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時(shí)，不同的酶對(duì)輔助因子的種類(lèi)及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。8．如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來(lái)沉淀DNA？

采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1％左右，小分子所需PEG濃度高達(dá)20％。本實(shí)驗(yàn)選擇性沉淀4.3kb的pBR322質(zhì)粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最終PEG濃度為12％。PEG選擇性沉淀DNA的分辨率大約100bp。9．抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，怎樣使用酚與氯仿較好？

酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開(kāi)。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA。所以在抽提過(guò)程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合（1:1）使用。

10．為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戊酵？

在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過(guò)程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

11．為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚？呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？

因?yàn)榉优c水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過(guò)程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調(diào)節(jié)至pH為8是因?yàn)镈NA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。

保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮?dú)?，防止與空氣接觸而被氧化。平時(shí)保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時(shí)，打開(kāi)蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。

去年做了半年載體構(gòu)建，連接無(wú)疑是其中重要的一關(guān)，根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)心得和已有資料做個(gè)總結(jié)，希望對(duì)大家有用，同時(shí)希望戰(zhàn)友們批評(píng)指正！互相進(jìn)步！首先說(shuō)說(shuō)2片段連接

通常是指目的片斷和載體片斷的連接，包括①小片段（目的片斷小于載體片斷的大小）和載體片段的連接，這種情況多些，也比較容易連接，按照說(shuō)明書(shū)要求的比例進(jìn)行即可，比如TAKARA的pMD19-T Simple Vector連接時(shí)Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為1 ：2～10即可，如果效果不佳，檢測(cè)一下感受態(tài)細(xì)胞，如果片斷過(guò)小比如幾十bp，連接時(shí)要加大小片段的摩爾數(shù)，多連幾管，挑選白斑，以上是指雙酶切后的連接，即載體和目的片斷倆端的酶切位點(diǎn)相同；②大片段（目的片斷與載體片斷的大小差不多甚至大于載體的大?。┖洼d體片段的連接，目的片斷與載體片斷的大小差不多的情況應(yīng)盡量避免，因?yàn)檫@會(huì)給目的片斷膠回收帶來(lái)麻煩，我就遇到過(guò)這種情況，膠回收時(shí)很是費(fèi)盡，最后勉強(qiáng)分開(kāi)，當(dāng)然換個(gè)載體也許就解決問(wèn)題了。我做過(guò)3000多bp和pMD19-T Simple Vector的連接，開(kāi)始不行，后來(lái)成功了，連接率不高，我的經(jīng)驗(yàn)是如果感受態(tài)細(xì)胞沒(méi)問(wèn)題，那就反復(fù)試目的片斷和載體片斷的連接比例，可以超出此范圍1 ：2～10一試。再說(shuō)說(shuō)多片斷的連接

做多個(gè)片斷的連接，首先強(qiáng)調(diào)一個(gè)問(wèn)題，那就是大家一定要注意所有片斷倆端的酶，把他們的特征要弄得清清楚楚，是否存在同尾酶和同裂酶，多片段同時(shí)連接時(shí)這個(gè)問(wèn)題就太重要了；多片段連接要總體先規(guī)劃好了，再開(kāi)始入手設(shè)計(jì)引物，否則考慮不周后患無(wú)窮啊,呵呵?、俣嗥瑪嗟倪B接最經(jīng)常的做法是順次倆倆連接（目的片斷和載體片斷的連接），就采用載體上的多克隆位點(diǎn)，注意順序！如果所選載體多克隆位點(diǎn)上的倆個(gè)酶切位點(diǎn)比較近，甚至相鄰，最好分步酶切載體，比雙酶切效果好的多，經(jīng)驗(yàn)！接下來(lái)的方法和前面的差不多，就是麻煩些

②多片斷的同時(shí)連接，我最多做過(guò)四個(gè)片斷的同時(shí)的連接，當(dāng)然，其中包括載體片斷。做多個(gè)片斷的同時(shí)連接，不得不把我走過(guò)的彎路告訴大家！那就是同尾酶的問(wèn)題，我也是在合成引物后發(fā)現(xiàn)的這個(gè)問(wèn)題，我的其中一個(gè)片斷倆端分別是XhoI和SalI，結(jié)果問(wèn)題來(lái)了，酶切后連接時(shí)有可能正連也可能反向連接，如果連正了還好，反了就比較郁悶了，根據(jù)當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如果想改就得改所有其他片段的引物，硬著頭皮來(lái)吧！篩吧！一個(gè)原則，小片段要量大，多設(shè)計(jì)幾種比例，連吧，挑選白斑，做菌落PCR檢測(cè)連接情況，想想覺(jué)得痛苦，每個(gè)板挑幾十個(gè)白斑做鑒定，大部分假陽(yáng)性，不過(guò)最后還是找到了正確連接的克隆，可是浪費(fèi)了很多時(shí)間和金錢(qián)，慘痛的教訓(xùn)！感覺(jué)多片斷的連接，關(guān)鍵還是片斷之間的摩爾比，大膽嘗試吧！

需要說(shuō)明的一點(diǎn)，以上主要是針對(duì)粘性末端的連接，關(guān)于平端連接，我做的比較少，歡迎其他同學(xué)總結(jié)！

分子克隆實(shí)驗(yàn)專題--

（五）感受態(tài)細(xì)胞的選擇與使用 分子克隆實(shí)驗(yàn)專題--

（五）感受態(tài)細(xì)胞的選擇與使用 常用感受態(tài)細(xì)胞的特性：

TOP10，DH5α：藍(lán)白斑篩選，高效克隆，質(zhì)粒抽提 JM110：甲基化酶缺陷型

SURE：克隆不穩(wěn)定插入片段，降低同源重組 DH10B：文庫(kù)構(gòu)建，長(zhǎng)片段質(zhì)粒的克?。?50kp

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化）

Stbl2：克隆不穩(wěn)定插入片段，正向重復(fù)，逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，克隆甲基化基因組序列。

Stbl3：克隆慢病毒表達(dá)載體中的正向重復(fù)序列，降低逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中長(zhǎng)末端重復(fù)序列的非目標(biāo)同源重組。

選擇適宜的感受態(tài)細(xì)胞

序列的結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度，載體種類(lèi)以及特殊要求等。

選擇適宜的轉(zhuǎn)化方式

熱激轉(zhuǎn)化：常規(guī)克隆，片段較短（<10kb)

電轉(zhuǎn)化: 建庫(kù)，基因敲除，長(zhǎng)片段（>10kb)感受態(tài)細(xì)胞使用的注意事項(xiàng)

連接產(chǎn)物或質(zhì)粒的量

效價(jià)：1μg標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆的數(shù)目，單位為cfu。

化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞：106，107，108，109cfu

電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞：108，109，1010cfu

常規(guī)的克隆根據(jù)連接產(chǎn)物和質(zhì)粒的量選擇適當(dāng)效價(jià)的感受態(tài)細(xì)胞，特殊轉(zhuǎn)化（如建庫(kù)）則選擇最高效價(jià)的感受態(tài)細(xì)胞，一般選用電轉(zhuǎn)。

感受態(tài)細(xì)胞效價(jià)測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒：pUC18, pUC19,pBR322

超螺旋，超純

質(zhì)粒使用量：<5μl, <1ng

設(shè)立陰性對(duì)照，多涂幾板(3塊以上）取平均值。

化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的使用

質(zhì)粒PCR擴(kuò)環(huán)的產(chǎn)物以及進(jìn)行體內(nèi)重組的線性片段不宜選用DH5α高效感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

可能原因： DH5α本身不適合這種操作；高效感受態(tài)制備的試劑對(duì)于這種轉(zhuǎn)化有抑制作用。

可選用TOP10感受態(tài)細(xì)胞。

電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的使用

盡量降低轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的離子濃度，防止細(xì)胞被擊穿。

大量的連接產(chǎn)物提純后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，或者進(jìn)行透析后再轉(zhuǎn)化，有些進(jìn)行體內(nèi)重組的酶切產(chǎn)物進(jìn)行提純后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

氨芐平板的衛(wèi)星菌落

氨芐平板涂板后如果時(shí)間太長(zhǎng)，就會(huì)產(chǎn)生衛(wèi)星菌落，在單克隆周?chē)尚〉目寺　?/p>

氨芐抗生素只能抑制菌落生長(zhǎng)，而不能殺死，當(dāng)抗生素降解失效后，被抑制的菌體重新形成菌斑。

解決方法：使用新鮮配置的氨芐培養(yǎng)基平板，提高氨芐的使用量，選用高質(zhì)量的氨芐抗生素。

感受態(tài)細(xì)胞的取用

特殊制備的感受態(tài)細(xì)胞在超低溫條件下可以維持效價(jià)半年以上，在制成之后要立即放入超低溫冰箱。

感受態(tài)細(xì)胞對(duì)溫度的變化非常敏感，取用時(shí)要快取快放，不能將整包的細(xì)胞放在外面然后取用。

看清標(biāo)記，防止拿錯(cuò)。分子克隆實(shí)驗(yàn)專題-

（二）酶切連接要點(diǎn)探討 分子克隆實(shí)驗(yàn)專題-

（二）酶切連接要點(diǎn)探討

聲明：關(guān)于酶切連接的實(shí)驗(yàn)做法我在之前的帖子里已經(jīng)非常詳細(xì)的介紹了，原帖鏈接：http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=2311683 我們?cè)谶@里對(duì)相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行探討 1.酶切

（1）

PCR產(chǎn)物的酶切

①酶切位點(diǎn)兩端要有適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)堿基。一般在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候會(huì)在新添加的酶切位點(diǎn)前加4-5個(gè)堿基當(dāng)做保護(hù)堿基，這種保護(hù)堿基的序列沒(méi)有特殊的要求，不要添加完后使你的引物不能用就行了（好引物應(yīng)該具備的條件大家應(yīng)該都知道吧）

–

NEB http:// ?

分步酶切順序的選擇：選擇適當(dāng)?shù)拿盖许樞?低鹽-----高鹽）甲基化位點(diǎn)的影響

設(shè)計(jì)方案時(shí)盡量避免使用 ?

JM110

PCR 擴(kuò)增后再切 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量與定量

質(zhì)量：抽提過(guò)程中雜質(zhì)的殘留

定量：分步酶切時(shí),酶切足夠的DNA,保證第二步回收到濃度較高的載體或片段 酶切不完全

公用buffer選擇不當(dāng) ?

質(zhì)粒DNA量過(guò)多 ?

酶的活性不高 酶切出的小片段回收效率低 ?

PCR擴(kuò)增后再酶切

回收上柱時(shí)加終濃度為20%的異丙醇 ?

Glass beads

(> 40 bp)3.影響連接的因素

（1）

片段的質(zhì)量

片段回收時(shí)紫外線照射對(duì)克隆效率的影響

（2）摩爾比

In general, maximum cloning efficiency is achieved when using a 2:1 molar ratio of insert: vector.分子克隆實(shí)驗(yàn)專題-

（一）質(zhì)粒提取 分子克隆實(shí)驗(yàn)專題-

（一）質(zhì)粒提取 知識(shí)儲(chǔ)備：

質(zhì)粒(Plasmid)是一種宿主染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主的細(xì)胞質(zhì)中。

質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對(duì)抗生素的抗性等。常見(jiàn)的天然質(zhì)粒有F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒和Col質(zhì)粒。

質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類(lèi)型: 緊密控制型(Stringent control)-低拷貝和松馳控制型(Relaxed control)-高拷貝。

前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制,當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí),它也不能復(fù)制,通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有 1 個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒,如 BAC。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制,在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝,一般在 20 個(gè)以上,如 pUC57,~200 copies。質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

堿裂解法提取質(zhì)粒DNA原理：

根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA的結(jié)構(gòu)差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。在pH12-12.5時(shí)，線性DNA被徹底變性，但共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA雖然H鍵也發(fā)生斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈仍會(huì)緊密纏繞結(jié)合在一起。當(dāng)在溶液體系中加入pH4.8的KAC時(shí)，溶液恢復(fù)中性，質(zhì)粒DNA迅速?gòu)?fù)性，染色體DNA則由于變性而相互混亂纏繞，不能復(fù)性，從而離心即可以把變性的染色體DNA沉淀和蛋白-SDS復(fù)合物沉淀分離出來(lái)。試劑成分：

Buffer S1(pH 8.0)

+RNase

50mmol/L 葡萄糖

25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)

10mmol/L EDTA(pH 8.0)Buffer S2(pH12-12.5)

0.2mol/L NaOH

1%SDS Buffer S3(pH4.8)

3mol/L 乙酸鉀

冰醋酸(HAC,乙酸）

異硫氰酸胍或鹽酸胍 質(zhì)粒檢測(cè)：

電泳檢測(cè)：質(zhì)粒電泳一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開(kāi)環(huán)、線型三種構(gòu)型。

吸光值檢測(cè)：采用分光光度計(jì)檢測(cè)260nm、280nm波長(zhǎng)吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之間，說(shuō)明質(zhì)粒質(zhì)量較好，1.8為最佳，低于1.8說(shuō)明有蛋白質(zhì)污染，大于1.8說(shuō)明有RNA污染。Buffer S1的作用：

任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的p H，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-HCl溶液，是再自然不過(guò)的了。

那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說(shuō)起來(lái)不可思議，加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)對(duì)質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒(méi)有任何影響。所以說(shuō)溶液I中葡萄糖是可缺的。

那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長(zhǎng)。在溶液I中加入高達(dá)10 mM的EDTA，無(wú)非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實(shí)也沒(méi)什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長(zhǎng)的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會(huì)迅速被降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA.如果哪天你手上正好缺了Buffer S1，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話告訴你，只要用等體積的水來(lái)懸浮菌體就可以了。有一點(diǎn)不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。

Buffer S2的作用

用完后一定要把蓋子擰緊，無(wú)非是為了保證NaOH沒(méi)有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。

很多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的NaOH，即便是有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)?SDS也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。

很多人對(duì)NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒(méi)有正確理解一些書(shū)上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問(wèn)，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，千萬(wàn)不要這時(shí)候去接電話，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對(duì)待女孩子一樣），不然基因組DNA也會(huì)斷裂。基因組DNA的斷裂會(huì)帶來(lái)麻煩。Buffer S3的作用

每個(gè)人都知道，Buffer S3加入后就會(huì)有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。

最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在Buffer S2中不加SDS會(huì)怎樣呢，也會(huì)有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)。既然 SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會(huì)不會(huì)是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate，PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來(lái)，Buffer S3加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的納離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門(mén)喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過(guò)程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長(zhǎng)了，長(zhǎng)長(zhǎng)的DNA 自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。

那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，所以要中和之?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50-100 kb大小的片斷，就沒(méi)有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是Buffer S3加入后基因組DNA無(wú)法快速?gòu)?fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會(huì)，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來(lái)是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實(shí)是個(gè)副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來(lái)其實(shí)沒(méi)有關(guān)系。Buffer S3加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點(diǎn)。

第三篇：質(zhì)粒提取常見(jiàn)問(wèn)題解析

質(zhì)粒提取常見(jiàn)問(wèn)題解析

涂布棒在酒精蘸一下，然后燒一下，能不能保證把所用的菌燒死？

參考見(jiàn)解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即時(shí)殺菌。蘸了酒精后再燒一小會(huì)，燒的是酒精而不是涂布棒。建議涂布棒還是干燒較長(zhǎng)時(shí)間后，冷卻了再涂。同時(shí)作多個(gè)轉(zhuǎn)化時(shí)，應(yīng)用幾個(gè)涂布棒免得交叉污染。

原先測(cè)序鑒定沒(méi)有問(wèn)題的細(xì)菌，37℃搖菌后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小或序列出現(xiàn)異常? 參考見(jiàn)解：這種情況出現(xiàn)的幾率較小，常出現(xiàn)在較大質(zhì)?；虮容^特殊的序列中。解決辦法：

1、降低培養(yǎng)溫度，在20～25℃下培養(yǎng)，或室溫培養(yǎng)可明顯減少發(fā)生概率。

2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類(lèi)等，使得質(zhì)粒復(fù)制更加穩(wěn)定。

3、質(zhì)粒抽提有一個(gè)酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH濃度過(guò)高造成的，請(qǐng)大家注意一下！

【有兩種方法可以在提質(zhì)粒前判斷菌生長(zhǎng)是否正常：

1、利用你的嗅覺(jué)。只要平時(shí)做實(shí)驗(yàn)仔細(xì)點(diǎn)就能聞出大腸桿菌的氣味，新鮮的大腸桿菌是略帶一點(diǎn)刺鼻的氣味，但不至于反感。而在泥水狀的菌液中你只要一湊過(guò)去就感覺(jué)到其臭無(wú)比或者沒(méi)有氣味，可以和正常菌液對(duì)照。

2、肉眼觀察活化菌株。對(duì)于生長(zhǎng)不正常的菌液進(jìn)行劃板驗(yàn)證或者稀釋到濃度足夠低涂板，第二天觀察單克隆生長(zhǎng)情況，LB平板生長(zhǎng)的DH5A正常形態(tài)在37℃16h后直徑在1mm左右，顏色偏白，半透明狀，濕潤(rùn)的圓形菌斑，如果觀察到生長(zhǎng)過(guò)快，顏色又是泛黃的話基本上不正常了?！?/p>

未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒得率較低，如何解決？ 參考見(jiàn)解：

1、大腸桿菌老化：涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。

2、質(zhì)?？截悢?shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。

3、菌體中無(wú)質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長(zhǎng)期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

4、堿裂解不充分：使用過(guò)多菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液的用量。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)可加大菌體用量并加倍使用溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。

5、溶液使用不當(dāng)：溶液2和3在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

6、吸附柱過(guò)載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請(qǐng)分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長(zhǎng)率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。

7、質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí))：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。

8、乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。

9、洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。

10、洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過(guò)低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。

11、洗脫體積太?。合疵擉w積對(duì)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

12、洗脫時(shí)間過(guò)短：洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)放置1min可達(dá)到較好的效果。

細(xì)菌離心加入溶液I蝸旋振蕩后，發(fā)現(xiàn)菌體呈絮狀不均勻或呈細(xì)砂狀？ 參考見(jiàn)解：

1、很可能是細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時(shí)間或者試試平板培養(yǎng)，質(zhì)粒提取前用PBS將菌落洗下，相較來(lái)說(shuō)固體培養(yǎng)基上細(xì)菌生長(zhǎng)的要好一些。

2、質(zhì)粒抽提過(guò)程很大程度上是受細(xì)菌生長(zhǎng)情況決定的，剛活化的菌比負(fù)80℃保存菌種所培養(yǎng)出來(lái)的菌液狀態(tài)好，保存久的菌株可能會(huì)造成質(zhì)粒濃度低，質(zhì)粒丟失等不明原因。

3、判斷生長(zhǎng)的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線明亮處搖蕩新鮮培養(yǎng)液，如果發(fā)現(xiàn)菌液呈漂絮狀，情況很好。如果發(fā)現(xiàn)呈泥水狀，即看不到絮狀，只是感覺(jué)很渾濁，則可能提不出好的質(zhì)粒，或者沒(méi)有質(zhì)粒。

4、菌液不宜生長(zhǎng)太濃，搖床速度不宜過(guò)高。達(dá)到OD600 1.5就可以了，（尤其是對(duì)于試劑盒提取要注意）另外如果只是簡(jiǎn)單的酶切驗(yàn)證根本無(wú)需酚氯仿抽提（安全考慮，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰當(dāng)，轉(zhuǎn)管過(guò)程仔細(xì)吸取不會(huì)有太多雜志。

為什么加了溶液Ⅱ后，菌體沒(méi)有逐漸由混濁變澄清？提出來(lái)的條帶幾乎沒(méi)有，但是RNA很亮（沒(méi)加RNA酶）？

溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液沒(méi)有由混濁變澄清，參考見(jiàn)解：

1、可能是因?yàn)槿芤簝?chǔ)存不當(dāng)，或?qū)掖尾僮鳑](méi)有及時(shí)蓋好溶液瓶蓋，導(dǎo)致其吸收空氣中的CO2失效。RNA在菌體中量較多，相對(duì)少量的菌體裂解，可有較DNA明顯的條帶。

2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌體并不能完全裂解，所以沒(méi)有變清，這也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)率低下．

3、可能是質(zhì)粒的拷貝數(shù)不高，質(zhì)粒產(chǎn)率不高．如果是使用自己配的試劑，建議做中提或大提；或者買(mǎi)試劑盒提．用自己配的試劑，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干凈就要用比較好的ＲＮＡ酶。

4、如果不是試劑的原因，可能是質(zhì)粒表達(dá)的過(guò)程中使膜蛋白變化（數(shù)量變多），很難使用堿裂解法，可以嘗試用其他比較劇烈的方法(比如高溫或者低溫研磨等),然后使用一般的發(fā)放。

5、可能質(zhì)粒隨乙醇一起倒掉了。

加入溶液II后，菌液仍然呈渾濁狀態(tài)，或者混濁度沒(méi)有明顯的改變？ 裂解不完全,參考見(jiàn)解：

1、問(wèn)題可能是發(fā)生在溶液II上。首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是試劑盒，也要首先確認(rèn)溶液II是否澄清沒(méi)有沉淀？

2、可能是細(xì)菌濃度很高，適當(dāng)調(diào)整增加溶液I/II/III的體積。

3、可能是“雜菌”污染，如果菌液生長(zhǎng)異?？?，就有可能被雜菌污染。這種情況一般表現(xiàn)為和目的菌有相同的抗性，生長(zhǎng)速度異常，能夠提出質(zhì)粒，跑膠的條帶也異常的亮，但產(chǎn)物不是自己想要的質(zhì)粒，要特別注意一下。抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，為什么要是酚/氯仿混合使用？怎樣使用酚與氯仿較好？ 參考見(jiàn)解：酚與氯仿都是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開(kāi)。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA。所以在抽提過(guò)程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合（1:1）使用。

呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？

參考見(jiàn)解：保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以使用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮?dú)夥乐古c空氣接觸而被氧化。平時(shí)保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時(shí)，打開(kāi)蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。

為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戊醇？

參考見(jiàn)解：在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，可以降低抽提過(guò)程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。加入酚/仿抽提，離心后在水相和有機(jī)相間沒(méi)有出現(xiàn)變性蛋白相層，在隨后的乙醇沉淀步驟中卻出現(xiàn)大量的半透明沉淀，溶解后發(fā)現(xiàn)蛋白濃度很高？

乙醇沉淀時(shí)，較純的質(zhì)粒沉淀是白色的（PEG純化的沉淀是透明的肉眼不易發(fā)現(xiàn)），如沉淀是半透明的凝膠狀，則應(yīng)是蛋白含量高。參考見(jiàn)解：首先看看平衡酚是否已被氧化？pH是否是8.0？其次檢測(cè)溶液III反應(yīng)完成后的離心上清pH是否在8.0左右？有時(shí)由于溶液III配置的問(wèn)題，會(huì)出現(xiàn)溶液III反應(yīng)后離心的上清pH與8.0偏差較大的現(xiàn)象，這會(huì)降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差過(guò)大也會(huì)導(dǎo)致水相和平衡酚互溶。使用酚仿抽提方法，質(zhì)粒的純度很好，但酶切不能完全切開(kāi)? 參考見(jiàn)解：

1、確認(rèn)酶的有效性。

2、平衡酚是否被氧化（正常是黃色，而氧化后是棕色的）。

3、是否不小心吸入了痕量的酚。

4、乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（殘留的鹽類(lèi)會(huì)影響酶切）。

5、乙醇漂洗后是否完全干燥（殘留的乙醇會(huì)影響酶切）。

堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定時(shí)，看到的三條帶分別是什么？ 參考見(jiàn)解：堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，得到的三條帶是以電泳速度的快慢排序的，分別是超螺旋、開(kāi)環(huán)和復(fù)制中間體（即沒(méi)有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過(guò)度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。提取質(zhì)粒中RNA沒(méi)有去除？ 可能是RNase失效或效率不高。參考見(jiàn)解：

1、更換RNase A，并保證其儲(chǔ)存條件是正確的

2、手工提取質(zhì)粒的，可單獨(dú)增加一步去除RNA的步驟，溶液III反應(yīng)后，在離心的上清中加RNase，室溫下去除RNA 10min～30min（需要保證RNase A是經(jīng)過(guò)失活DNase的），同時(shí)較高溫度（如50℃）會(huì)更加快速完全的去除RNA，經(jīng)驗(yàn)所得經(jīng)過(guò)高溫處理的質(zhì)粒質(zhì)量不是很高。

提取的質(zhì)粒電泳后，為連續(xù)的一片火箭狀？ 參考見(jiàn)解：

1、質(zhì)粒如果鹽離子多，會(huì)有走膠變形的現(xiàn)象，如果提到的質(zhì)粒不夠純，會(huì)有電泳條帶不平齊的現(xiàn)象。

2、當(dāng)電壓太大時(shí)，容易出現(xiàn)火箭狀，而降解應(yīng)該是彌散狀。

3、可能是宿主菌影響的，質(zhì)粒抽提好后，用酚-氯仿處理一下再酶切，若有改善，則為宿主菌影響。轉(zhuǎn)化到其它宿主菌再切。

4、NaOH的濃度過(guò)高，會(huì)出現(xiàn)火箭狀的結(jié)果。

用堿裂解法提取質(zhì)粒，裂解5分鐘，沒(méi)有用酚 / 氯仿抽提，最后用滅菌水溶解質(zhì)粒DNA15min。雙酶切后跑膠一條帶都沒(méi)有，原因是什么？ 參考見(jiàn)解：

1、溶解時(shí)間稍微短了點(diǎn)，但是根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室RNase不同，這個(gè)條件是不同的。在溶解的過(guò)程要渦旋處理促進(jìn)溶解。

2、確認(rèn)一下酶切過(guò)程中是不是有DNA酶的污染，比如酶切體系的Buffer或者是水，特別是水中；其次是酶切體系的問(wèn)題；建議再把提取的產(chǎn)物用70%酒精重新洗滌一遍，也可以用酚 / 氯仿重新抽提一下。

3、也可能在用乙醇洗時(shí)把質(zhì)粒倒掉了。

4、沒(méi)有用RNase消化，不要用放久的 RNase否則會(huì)有DNA酶的污染；

5、在沒(méi)有進(jìn)行酶切時(shí),把所提的質(zhì)粒跑一下核酸電泳看看,如果是提核酸的問(wèn)題那這一步電泳結(jié)果應(yīng)該沒(méi)有大于三千的條帶,這樣可以先排除核酸提取的問(wèn)題.若是沒(méi)有酶切時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等其他問(wèn)題的話可以那可以檢查一下所用的溶解DNA的溶液是否有DNAse污染的問(wèn)題，建議將超純水換成TE。

用堿裂解法提取的質(zhì)粒,取3ul轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌涂amp抗性平板，卻出現(xiàn)陽(yáng)性克隆較少（含綠色熒光蛋白，陽(yáng)性克隆應(yīng)該顯綠色，在紫外燈下非常明顯，就幾十個(gè)菌落）大部分菌落不發(fā)綠，這些菌落比發(fā)綠的菌落小一些的現(xiàn)象，為什么？ 參考見(jiàn)解：

1、做一次陰性對(duì)照,拿空白菌涂布在含amp的平板上,如生長(zhǎng),說(shuō)明amp過(guò)期,一般這種情況不多見(jiàn)。一般粉末狀的amp不容易失效,如果amp有效的話,可以配制遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)的濃度,如果細(xì)菌耐藥的話,也能生長(zhǎng)良好,如不耐藥,則放置數(shù)天仍不見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2、拿陰性和陽(yáng)性的細(xì)菌各取數(shù)個(gè)放于高濃度的amp液體培養(yǎng)基中,如能生長(zhǎng),說(shuō)明空白菌中帶有耐藥菌,建議換菌.3、提質(zhì)粒的菌受污染了，重新劃線挑單克隆。

培養(yǎng)基、抗生素、質(zhì)粒提取都沒(méi)有問(wèn)題，而細(xì)菌菌液提取不到質(zhì)粒？

參考見(jiàn)解：如果是氨芐抗性的，有可能是質(zhì)粒丟失造成的。主要是培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的beta-內(nèi)酰胺酶過(guò)多，作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，同時(shí)培養(yǎng)基pH值降低，氨芐青霉素失活，從而使無(wú)質(zhì)粒的菌株大量增殖。解決的辦法：可以添加葡萄糖，縮短培養(yǎng)時(shí)間，改用羧芐青霉素。|||謝謝樓主,還有什么專題也要貼出來(lái)啊!|||謝謝分享

到一個(gè)小tips。轉(zhuǎn)帖過(guò)來(lái)和菜鳥(niǎo)分享。大蝦憑手感就可以了,我們還是要學(xué)學(xué)的,受益匪淺

1．溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。

EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用（DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。

2．溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH＞12或pH＜3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。

SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-?R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時(shí)）受到干擾。

3.溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：

NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。

4．為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA？

用無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周?chē)乃肿樱笵NA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95％乙醇代替無(wú)水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15－30分鐘即可。

5．在用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.1～0.25mol/L？ 在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過(guò)多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。

6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來(lái)處理？

加進(jìn)去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。

7．為什么在保存或抽提DNA過(guò)程中，一般采用TE緩沖液？

在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa＝7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子的種類(lèi)及數(shù)量將與Ca2＋產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時(shí)，不同的酶對(duì)輔助因子的種類(lèi)及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。

8．如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來(lái)沉淀DNA？

采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1％左右，小分子所需PEG濃度高達(dá)20％。本實(shí)驗(yàn)選擇性沉淀4.3kb的pBR322質(zhì)粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最終PEG濃度為12％。PEG選擇性沉淀DNA的分辨率大約100bp。

9．抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，怎樣使用酚與氯仿較好？

酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開(kāi)。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA。所以在抽提過(guò)程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合（1:1）使用。

10．為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戊酵？

在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過(guò)程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

11．為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚？呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？

因?yàn)榉优c水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過(guò)程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調(diào)節(jié)至pH為8是因?yàn)镈NA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。

保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮?dú)?，防止與空氣接觸而被氧化。平時(shí)保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時(shí)，打開(kāi)蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。

第四篇：公積金提取簡(jiǎn)介

昆明市住房公積金提取轉(zhuǎn)移實(shí)施細(xì)則

第一條 為加強(qiáng)住房公積金提取轉(zhuǎn)移的管理，規(guī)范住房公積金的使用，發(fā)揮住房公積 金的保障作用，根據(jù)《住房公積金管理?xiàng)l例》（國(guó)務(wù)院令第350號(hào)）、《昆明市住房公積金管理規(guī)定》（昆明市人民政府令第75號(hào)）制定本《細(xì)則》。

第二條 昆明市住房公積金管理中心（以下簡(jiǎn)稱公積金中心）所屬分中心、管理部按各自管轄范圍設(shè)服務(wù)窗口受理職工的住房公積金提取、轉(zhuǎn)移業(yè)務(wù)。

第三條 職工住房公積金的提取范圍：

（一）職工本人購(gòu)買(mǎi)、建造、翻建、大修自住住房的；

（二）償還住房貸款本息的；

（三）離休、退休的；

（四）工作調(diào)動(dòng)、辭職、解聘的(住房公積金需作轉(zhuǎn)移的，按第七條辦理)；

（五）職工死亡或者被宣告死亡的；

（六）出境定居的；

（七）應(yīng)征入伍的；

（八）房租超出家庭收入25%的；

（九）重大疾病、自然災(zāi)害等特殊情況的。

第四條 職工申請(qǐng)?zhí)崛∽》抗e金按以下要求和規(guī)定辦理：

（一）職工申請(qǐng)?zhí)崛∽》抗e金，須由本人持有效身份證件、單位提取證明及有關(guān)資料到公積金中心服務(wù)窗口辦理，職工本人不能親自辦理提取手續(xù)的，可以委托他人辦理：

1、由配偶代為辦理的，除提供本人的有效身份證件、單位提取證明外，還須提供結(jié)婚證和配偶的有效身份證；

2、委托他人辦理的，除提供本人的有效身份證件、單位提取證明外，還須提供本人的授權(quán)委托書(shū)（簽名加手?。⑹芡腥说挠行矸葑C。

（二）職工購(gòu)買(mǎi)自住住房，提取住房公積金的額度不得超過(guò)房?jī)r(jià)總額。擁有房屋產(chǎn)權(quán)的共同買(mǎi)受人（配偶、未成年子女除外），按份額提取本人賬戶內(nèi)不超過(guò)所占份額的住房公積金：

1、房屋共有權(quán)證中明確產(chǎn)權(quán)份額的按份額支??；

2、房屋共有權(quán)證中未明確產(chǎn)權(quán)份額的，買(mǎi)受人及擁有房屋產(chǎn)權(quán)的共同買(mǎi)受人按平均份額支取。

（三）職工貸款購(gòu)買(mǎi)自住住房，共同還款人、擁有房屋產(chǎn)權(quán)的共同買(mǎi)受人，可以申請(qǐng)?zhí)崛∽》抗e金用于償還該筆貸款合同中的住房貸款，在該筆貸款未還清前，共同還款人、房屋共同買(mǎi)受人不得以任何其它事由申請(qǐng)使用住房公積金。

（六）職工有住房公積金貸款的（含共同買(mǎi)受人、共同還款人），在還貸過(guò)程中，住房公積金不得提取銷(xiāo)戶，其所提取的住房公積金也只能用于償還住房公積金貸款，不得挪作它用。

（七）職工提取的住房公積金，未按批準(zhǔn)用途使用的，在申請(qǐng)人未糾正之前，不得再次申請(qǐng)使用住房公積金。

（八）提供虛假資料騙取、套取住房公積金的，公積金中心除追回騙、套取的住房公積金外，自追回之日起兩年內(nèi)不得申請(qǐng)使用住房公積金和辦理住房公積金貸款業(yè)務(wù)；觸犯法律的，移交司法部門(mén)依法追究其責(zé)任。

（九）辦理提取、轉(zhuǎn)移住房公積金的資料，除職工單位出具的提取證明、轉(zhuǎn)移證明、授權(quán)委托書(shū)需收取原件外，其它證明材料驗(yàn)證原件，收復(fù)印件。

第五條 住房公積金提取的條件及所需資料：

（一）購(gòu)買(mǎi)自住住房的：

1、職工購(gòu)買(mǎi)自住住房一次性付清房款的（含經(jīng)濟(jì)適用房），自購(gòu)房合同簽訂之日起一年內(nèi)，可以一次性提取本人及其配偶、擁有房屋產(chǎn)權(quán)的共同買(mǎi)受人不超過(guò)房?jī)r(jià)總額的住房公積金。職工同時(shí)購(gòu)有多套住房的，由本人確定其中一套的相關(guān)資料作為支取住房公積金的依據(jù)。需提供的資料：本人有效身份證件、單位提取證明、經(jīng)房地產(chǎn)管理部門(mén)登記備案后的購(gòu)房合同（以下簡(jiǎn)稱購(gòu)房合同）、付款發(fā)票。購(gòu)買(mǎi)二手房辦理提取住房公積金時(shí)需提交的資料：本人有效身份證件、單位提取證明、購(gòu)房合同（協(xié)議）、契稅完稅發(fā)票、產(chǎn)權(quán)證。購(gòu)房的一年時(shí)限以契稅發(fā)票上的時(shí)間為依據(jù)開(kāi)始計(jì)算。

提取配偶住房公積金的，還需提供結(jié)婚證、配偶的身份證及其配偶的單位證明。

2、職工購(gòu)買(mǎi)自住住房并辦有住房貸款的：

（1）購(gòu)房后，職工及其配偶、擁有房屋產(chǎn)權(quán)的共同買(mǎi)受人自購(gòu)房合同簽訂之日起一年內(nèi)，可以一次性提取不超過(guò)房?jī)r(jià)總額的住房公積金。如首次提取住房公積金未達(dá)房?jī)r(jià)總額的，還貸期間每年可以提取一次住房公積金用于償還貸款本息，所提金額之和不得超過(guò)當(dāng)年償還貸款本息的總額，累計(jì)提取額不得超過(guò)房?jī)r(jià)總額。需提供的資料：①首次提取住房公積金需提供的資料參照第五條第一款第1點(diǎn)執(zhí)行；②按還貸條件支取住房公積金的，需提供本人有效身份證件、單位提取證明、購(gòu)房合同、貸款合同、銀行還貸系統(tǒng)中打印的當(dāng)月還款余額表并加蓋公章；

（2）職工提前歸還貸款申請(qǐng)?zhí)崛∽》抗e金的，自提前還貸之日起一年內(nèi)可以提取一次住房公積金，其提取金額在累計(jì)不超過(guò)房?jī)r(jià)總額的前提下，實(shí)際提取額不超過(guò)該筆貸款到期應(yīng)還額。需提供的資料：本人有效身份證件、單位提取證明、購(gòu)房合同、貸款合同、提前還款票據(jù)、銀行還貸系統(tǒng)中打印的當(dāng)月還款余額表并加蓋公章；

（3）職工貸款購(gòu)有多套商品住房的，由職工本人確定其中一套商品房的相關(guān)資料作為提取住房公積金的依據(jù)（有住房公積金貸款的應(yīng)優(yōu)先確定），在該套住房貸款未還清之前，公積金中心不受理其它所購(gòu)住房資料的住房公積金提取申請(qǐng)。

3、購(gòu)買(mǎi)自住住房分期付款的，每次提取住房公積金的額度不超過(guò)當(dāng)期實(shí)際付款額，最后一期付款應(yīng)在付款之日起一年內(nèi)提取。需提交的資料：本人有效身份證件、單位提取證明、購(gòu)房合同、分期付款發(fā)票。

4、貸款合同中的主借款人及所列共同還款人，每年提取用于還貸的住房公積金合計(jì)金額，不得超過(guò)該筆貸款當(dāng)年的還貸總額，其所提款項(xiàng)只能用于償還該筆貸款合同中的本息。需提供的資料：本人有效身份證件、單位提取證明、購(gòu)房合同、貸款合同、銀行還貸系統(tǒng)中打印的當(dāng)月還款余額表并加蓋公章。

（二）職工建造自住住房申請(qǐng)使用住房公積金的，應(yīng)在施工之日起一年內(nèi)提取住房公積金。需提供的資料：本人有效身份證件、單位提取證明、土地部門(mén)頒發(fā)的《土地使用證》、城鄉(xiāng)規(guī)劃部門(mén)或者鄉(xiāng)、鎮(zhèn)人民政府頒發(fā)的《建設(shè)用地規(guī)劃許可證》、建設(shè)行政主管部門(mén)頒發(fā)的《建設(shè)工程施工許可證》或者鄉(xiāng)、鎮(zhèn)人民政府頒發(fā)的《開(kāi)工批準(zhǔn)意見(jiàn)書(shū)》等資料。

翻建、擴(kuò)建自住住房的，須持有《土地使用證》和城鄉(xiāng)、規(guī)劃、建設(shè)行政主管部門(mén)或者鄉(xiāng)、鎮(zhèn)人民政府頒發(fā)的許可文件方可辦理提取。

（三）職工參加單位集資建蓋住房的，先由單位向公積金中心提供規(guī)劃、用地、建設(shè)許可證、參加集資建房人的名單等材料備案。職工個(gè)人持本人有效身份證件、單位提取證明和職工與單位簽訂的集資建房協(xié)議、集資款票據(jù)提取住房公積金，每次提取的住房公積金，不得超過(guò)當(dāng)期交納集資款的數(shù)額，累計(jì)提取額不得超過(guò)房?jī)r(jià)總額。

第八條 本《細(xì)則》自二○○八年八月五日起實(shí)施，《昆明市職工個(gè)人提取、轉(zhuǎn)移住房公積金暫行規(guī)定》（昆房公積金委〔2003〕4號(hào)）廢止執(zhí)行。

第九條 本《細(xì)則》如遇國(guó)家有關(guān)政策的調(diào)整將做相應(yīng)修改，修改后的《細(xì)則》另行公布。

第十條 本《細(xì)則》由昆明市住房公積金管理中心負(fù)責(zé)解釋。

1、《入戶申請(qǐng)表》(公安辦證中心現(xiàn)場(chǎng)領(lǐng)取)

2、產(chǎn)權(quán)人和入戶人員戶籍證明(或戶口簿)及居民身份證(原件和復(fù)印件);

3、申請(qǐng)配偶、未成年子女隨遷的提供親屬關(guān)系證明(原件和復(fù)印件)

4、入住證明(由入戶地派出所、社區(qū)居委會(huì)、物業(yè)管理部門(mén)出具)(原件和復(fù)印件)

5、遷入地派出所出具的《街門(mén)牌詳址證明》(遷入地址不詳?shù)奶峁?;

7、按揭購(gòu)房入戶所需材料：(1)與前款1——5項(xiàng)相同;(2)購(gòu)房合同、銀行按揭公證書(shū)、最近6個(gè)月銀行按揭繳款證明(原件);(3)按揭購(gòu)買(mǎi)二手房的，提供房管局打印的房屋產(chǎn)權(quán)檔案摘要、銀行按揭公證書(shū)、最近6個(gè)月銀行按揭繳款證明(原件)。

第五篇：質(zhì)粒提取的原理、操作步驟、各溶液的作用

質(zhì)粒提取的原理、操作步驟、各溶液的作用

(2010-11-11 17:19:05)轉(zhuǎn)載標(biāo)簽： 質(zhì)粒

溶液

無(wú)水乙醇

大腸桿菌

雜談 ▼

分類(lèi)： Biology

細(xì)菌質(zhì)粒是一類(lèi)雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。

質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，下面主要介紹堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法。

堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和 SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來(lái)。

純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉環(huán)兩個(gè)性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、聚乙二醇分級(jí)沉淀等方法，但這些方法相對(duì)昂貴或費(fèi)時(shí)。對(duì)于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過(guò)苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀 等簡(jiǎn)單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用。

堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析。方法如下：

1、接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2ml LB培養(yǎng)基。

2、37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

3、取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。

4、加0.lml溶液I（1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0）充分混合。

5、加入0.2ml溶液 II（0.2 mM/L NaOH，1％ SDS），輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min.6、加入0.15m1預(yù)冷溶液III（5 mol/L KAc，pH4.8），輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min.7、以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管

8、加入等體積的異戊醇，混勻后靜置10min.9、再以10，000rpm離心20min，棄上清。

10、用70％乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。

11、待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE緩沖液中

試劑準(zhǔn)備

1.溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。

在10 lbf/in2高壓滅菌15min，貯存于4℃。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)對(duì)質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒(méi)有任何影響。所以說(shuō)溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長(zhǎng)。在溶液I中加入高達(dá)10 mM的EDTA，無(wú)非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實(shí)也沒(méi)什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長(zhǎng)的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會(huì)迅速被降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話告訴你，只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來(lái)懸浮菌體就可以了。

2.溶液II：是用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無(wú)非是為了保證NaOH沒(méi)有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向 micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)?SDS也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對(duì)NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒(méi)有正確理解一些書(shū)上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問(wèn)，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，千萬(wàn)不要這時(shí)候去接電話，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對(duì)待女孩子一樣），不然基因組DNA也會(huì)斷裂?；蚪M DNA的斷裂會(huì)帶來(lái)麻煩。

3.溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。

5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

溶液III加入后就會(huì)有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的 SDS溶液中加入2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS會(huì)怎樣呢，也會(huì)有少量 的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會(huì)不會(huì)是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加 入5 N的NaCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量 要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來(lái)，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門(mén)喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過(guò)程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長(zhǎng)了，長(zhǎng)長(zhǎng)的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。

1.為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA？

用無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。

DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周?chē)乃肿樱笵NA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95％乙醇代替無(wú)水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15－30分鐘即可。

2.在用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.1～0.25mol/L？

在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過(guò)多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。