第一篇：RNA 抽提之應(yīng)知應(yīng)會(huì)

RNA 抽提之應(yīng)知應(yīng)會(huì)

背景介紹

對(duì)大部分實(shí)驗(yàn)人員來(lái)說(shuō)，RNA 抽提比基因組 DNA 抽提要困難得多。事實(shí)上，現(xiàn)有的 RNA 抽提方法/試劑，如果用于從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提 RNA，比抽提基因組 DNA 更方便，成功率也更高。那為什么同樣的方法用于組織 RNA 的抽提，總會(huì)碰到問(wèn)題呢？

組織 RNA 抽提失敗的兩大現(xiàn)象是： RNA 降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留。關(guān)于降解問(wèn)題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提 RNA 不容易降解?，F(xiàn)有的 RNA 抽提試劑，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入裂解液，簡(jiǎn)單的混勻，即可使所有的細(xì)胞與裂解液充分混勻，細(xì)胞被徹底裂解。細(xì)胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細(xì)胞內(nèi)的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是說(shuō)，培養(yǎng)細(xì)胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其 RNA 不容易被降解；反過(guò)來(lái)講，組織中的 RNA 之所以容易被降解，是因?yàn)榻M織中的細(xì)胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制 RNA 活性的同時(shí)能使組織變成單個(gè)細(xì)胞，降解問(wèn)題也就可以徹底解決了。液氮碾磨就是最有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時(shí)候更加會(huì)有此感覺(jué)。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒(méi)有考慮細(xì)胞與裂解液接觸前如何抑制 Rnase 活性這個(gè)問(wèn)題，而是祈禱破碎組織的速度比細(xì)胞內(nèi)的 Rnase 降解 RNA 的速度快。電動(dòng)勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來(lái)說(shuō)，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來(lái)用電動(dòng)勻漿器的，改用液氮碾磨；原來(lái)用玻璃勻漿器的，改用電動(dòng)勻漿器或者直接用液氮碾磨，問(wèn)題幾乎 100% 能獲得解決。影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的雜質(zhì)殘留問(wèn)題，其原因比降解更多樣，解決方法相應(yīng)也不同。總之，如果出現(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質(zhì)殘留現(xiàn)象，則必須對(duì)具體實(shí)驗(yàn)材料的抽提方法/試劑進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場(chǎng)上購(gòu)買一些魚/雞之類的小動(dòng)物，取相應(yīng)部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白質(zhì) – 用嘴碾磨，腸胃抽提。

究竟怎樣才能確保 RNA 抽提的成功率呢？實(shí)驗(yàn)前選擇合適的方法/試劑，這是最重要的一步；好的方法/試劑在確保成功的同時(shí)，操作方便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。當(dāng)然，您的選擇可能仍然有問(wèn)題，這就需要能正確分析實(shí)驗(yàn)失敗的原因，以便改進(jìn)。

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實(shí)驗(yàn)前方法/試劑的選擇

0：抽提 RNA 的目的

RNA 用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA 文庫(kù)構(gòu)建要求 RNA 完整而無(wú)酶反應(yīng)抑制物殘留；Northern 對(duì) RNA 完整性要求較高，對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR 對(duì) RNA 完整性要求不太高，但對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。投入決定產(chǎn)出；每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的，勞民傷財(cái)。

1：樣品的收集/保存 – 影響降解的因素 樣品離開(kāi)活體/或者原來(lái)的生長(zhǎng)環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會(huì)開(kāi)始降解 RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。傳統(tǒng)上，只有兩個(gè)辦法可以徹底抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。這兩個(gè)辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來(lái)，再往下做。

2：樣品的破碎及勻漿 – 影響降解和得率的因素

樣品的破碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使 RNA 徹底完整地釋放出來(lái)。細(xì)胞無(wú)須破碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細(xì)菌需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過(guò)勻漿器一次完成破碎和勻漿過(guò)程；植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的破碎和勻漿分開(kāi)操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的勻漿方法是使用電動(dòng)勻漿器。使用液氮碾磨要特別注意一點(diǎn)：在整個(gè)碾磨過(guò)程中，樣品不得融化，因?yàn)槔鋬龊髢?nèi)源酶更容易起作用。

3：裂解液的選擇 – 影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素

常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點(diǎn)是要結(jié)合純化方法一起考慮。只有一個(gè)例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。

4：純化方法的選擇 – 影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留，抽提速度的因素

對(duì)于干凈的樣品，如細(xì)胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。但對(duì)于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細(xì)菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，但價(jià)格較貴；使用經(jīng)濟(jì)而經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時(shí)間長(zhǎng)。

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RNA 抽提的“三大紀(jì)律八項(xiàng)注意”

紀(jì)律一：杜絕外源酶的污染。

注意一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。

注意二：實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要

徹底處理。

注意三：實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。

紀(jì)律二：阻止內(nèi)源酶的活性 注意四：選擇合適的勻漿方法。

注意五：選擇合適的裂解液。

注意六：控制好樣品的起始量。

紀(jì)律三：明確自己的抽提目的

注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時(shí)，抽提成功率急劇下降。

注意八：RNA 抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一次成功，而不是得

率。(go top)

RNase 污染的10大來(lái)源

1：手指頭 – 手指頭是外源酶的第一來(lái)源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因?yàn)楹粑彩且粋€(gè)重要的酶來(lái)源。戴手套口罩的另外的好處是保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員。

2：槍頭，離心管，移液器 – 單純的滅菌是不能滅活 Rnase 的，所以槍頭和離心管要用 DEPC 處理，即使是標(biāo)明為 DEPC 處理過(guò)的。移液器最好是專用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。

3：水/緩沖液 – 一定要確保無(wú) Rnase 污染。

4：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面 – 最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。

5：內(nèi)源 Rnase – 所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對(duì)有一些內(nèi)源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。

6：RNA 樣品 – RNA 抽提產(chǎn)物可能都會(huì)含痕量的 Rnase 污染。7：質(zhì)粒抽提 – 質(zhì)粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，殘留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。

8：RNA 保存 – 即使低溫保存，痕量的 Rnase 亦會(huì)導(dǎo)致 RNA 降解。長(zhǎng)期保存 RNA 的最好辦法是鹽/醇懸液，因?yàn)榇荚诘蜏貢r(shí)抑制所有的酶活性。

9：陽(yáng)離子(Ca, Mg)– 在含這些離子時(shí)，80C 加熱 5 分鐘會(huì)導(dǎo)致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加熱，保存液需要含螯合劑(1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。

10：后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的酶 – 酶均有可能被 Rnase 污染。

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RNase 和 DEPC 處理

1：高壓滅菌是可以滅活部分 Rnase A 的。實(shí)驗(yàn)證明：37 C 與 RNA 反應(yīng)，沒(méi)有滅菌的 PBS，活性點(diǎn)為 100 pg/ml；滅菌后，活性點(diǎn)為 100 ng/ml。當(dāng)然，滅菌后 Rnase 仍然不能認(rèn)為沒(méi)有殘留。

2：DEPC 在水中半衰期為 30 分鐘。0.1% 的 DEPC 滅菌 15 分鐘可以認(rèn)為徹底破壞了 DEPC。破壞后可以聞到一點(diǎn)氣味。

3：在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分別加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果提示，0.1% DEPC 只對(duì) MOPS 有效，而 1% DEPC 對(duì)三種試劑都有效。4：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC 有效去除 Rnase A 的濃度分別為：100 ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC 滅活后的副產(chǎn)品，對(duì)有些后續(xù)實(shí)驗(yàn)是有影響的。

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RNA 抽提的10大竅門

1：快速阻止 Rnase 活性 – 樣品收集后快速冷凍，裂解時(shí)快速操作滅活 Rnase。2：選擇合適的抽提方法 – 高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。3：預(yù)判質(zhì)量要求 – Northern，cDNA 文庫(kù)構(gòu)建對(duì)完整性要求高，RT-PCR, RPA(Ribonuclease protection assay)對(duì)完整性要求不是很高。RT-PCR 對(duì)純度(酶抑制物殘留)要求很高。

4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。

5：檢查 RNA 的完整性 – 電泳檢測(cè)，28S:18S =2:1 是完整的標(biāo)志，1:1 對(duì)大部分實(shí)驗(yàn)也是可以接受的。

6：去除 DNA – 用于 RT-PCR, array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。

7：降低外源酶的污染 – 不能從外面又導(dǎo)入酶。

8：低濃度的核酸濃縮時(shí)，要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及 DNA 污染。

9：徹底溶解 RNA，必要時(shí)可以 65C 加熱 5 分鐘。

10：合適的保存方法 – 短時(shí)間可以 –20C 保存，長(zhǎng)期請(qǐng)保存于 –80C。

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提高 RNA 得率

首先要意識(shí)到不同得樣品其 RNA 含量差別很大。高豐度(2-4ug/mg)的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度(0.05-2ug/mg)的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度(<0.05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪。

1：裂解細(xì)胞使 RNA 釋放出來(lái) – RNA 如果不被釋放出來(lái)，得率是會(huì)降低的。電動(dòng)勻漿比其它勻漿方法效果更好，但也可能需要結(jié)合其它得方法，如液氮搗碎，酶消化(Lysozyme/Lyticase)

2：抽提方法的優(yōu)化。基于苯酚的方法的最大問(wèn)題是分層不徹底和部分 RNA 的丟失(不能全部將上清取出)。分層不徹底是因?yàn)楹怂岷偷鞍踪|(zhì)含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低樣品量解決。脂肪組織要增加一步氯仿抽提。RNA 的丟失可以用反抽方法或者去除有機(jī)層后再離心的方法降低?；谥x心式方法的最大問(wèn)題是樣品過(guò)量。(go top)

經(jīng)典抽提小技巧

1：Phenol 純化：將等體積的 1:1 Phenol/Chloroform 加入，劇烈混允 1-2 分鐘。高速離心 2 分鐘。小心取上清(80-90%)。決不能取到中間層。可以使用等體積的反應(yīng)液加入 Phenol/Chloroform 中，同樣再取出上清。將兩次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率。混允時(shí)不能太溫和，也不要試圖取出全部上清。2：70-80% 乙醇洗滌：洗滌時(shí)，一定要將核酸懸浮起來(lái)，才能保證殘留的鹽被洗去。同時(shí)，在倒掉乙醇后，立即高速離心數(shù)秒，再用移液器去除殘留的乙醇。室溫靜置 5-10分鐘后，溶解。

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特殊組織的抽提

纖維組織：心臟/骨骼肌等纖維組織抽提 RNA 關(guān)鍵在徹底破碎組織。這些組織細(xì)胞密度低，故單位重量的組織 RNA 的含量就少，最好用盡可能多的起始量。一定要在冷凍條件下將組織徹底磨碎。

蛋白/脂肪含量高的組織：腦/植物脂肪含量高，PCI 抽提后，上清含白色絮狀物。必須用氯仿再次對(duì)上清進(jìn)行抽提。

核酸/核酶含量高的組織：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。在冷凍條件下碾磨組織，再快速勻漿，能有效滅活核酶。但如果裂解液太粘稠(因?yàn)楹怂岷扛叩木壒?，PCI 抽提不能有效分層；加入更多裂解液可以解決此問(wèn)題。多次PCI抽提可以去除更多殘留的 DNA。如果加入醇后馬上有白色沉淀形成提示有 DNA 污染。溶解后用酸性 PCI 再次抽提，可以去除 DNA 污染。

植物組織：植物組織比動(dòng)物組織更為復(fù)雜。一般，大家都是在液氮條件下對(duì)植物進(jìn)行碾磨的，所以內(nèi)源酶作用使 RNA 降解的現(xiàn)象不常見(jiàn)。如果降解問(wèn)題不能解決，幾乎可以肯定是樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導(dǎo)致。許多植物的內(nèi)含雜質(zhì)都會(huì)導(dǎo)致殘留，之所以殘留，往往是因?yàn)檫@些雜質(zhì)與 RNA 有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。這些特點(diǎn)決定了它們是非常強(qiáng)的酶抑制劑。目前，商品化的 RNA 抽提試劑經(jīng)過(guò)小量調(diào)整，可以適合幾乎所有的動(dòng)物組織，但卻沒(méi)有一種商品化的 RNA 抽提試劑，可以適合大部分植物組織。

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樣品凍融的影響

冷凍的樣品可能較大，用于抽提 RNA 之前，需要切割。切割過(guò)程中樣品往往出現(xiàn)融化(可能是部分融化)。冷凍的樣品抽提 RNA 前可能還要稱重，這個(gè)過(guò)程肯定會(huì)出現(xiàn)融化。有時(shí)候，液氮碾磨過(guò)程中也會(huì)出現(xiàn)樣品的融化；或者冷凍樣品不經(jīng)過(guò)液氮碾磨直接加入裂解液中，在徹底勻漿前肯定會(huì)出現(xiàn)融化。實(shí)驗(yàn)表明，冷凍組織在融化過(guò)程中比新鮮組織更容易發(fā)生 RNA 的降解?？赡艿脑蚴牵簝鋈谶^(guò)程破壞了細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)，使內(nèi)源酶更容易與 RNA 直接接觸。

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RNA 質(zhì)量的判斷

通常，使用電泳判斷 RNA 的完整性，使用 A260/A280 判斷 RNA 的純度。理論上，完整的 RNA 擁有 28S:18S = 2.7:1 的比例，大部分資料則強(qiáng)調(diào) 28S:18S = 2:1 的比例。事實(shí)是，除了細(xì)胞外，從其它樣品中抽提的 RNA 幾乎都得不到 2:1 的比例(此結(jié)論使用 Agilent Bioanalyzer 獲得)。RNA 的電泳結(jié)果受許多因素的影響，包括二級(jí)結(jié)構(gòu)，電泳條件，上樣量，被 EB 飽和的程度等。使用非變性電泳檢測(cè) RNA，以 DNA Marker 做對(duì)照，如果 2kb 處的 28S 和 0.9kb 處的 18S 條帶清晰，且 28S:18S > 1，該完整性可以滿足絕大部分后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求了。A260/A280 是一個(gè)給大家?guī)?lái)許多困惑的指標(biāo)。首先要明確該指標(biāo)用于核酸的原始含義是：純的 RNA，其 A260/280 = 2.0 左右。純 RNA 是‘因’，A260/A280 = 2 是‘果’?，F(xiàn)在大家卻在拿 A260/A280 當(dāng)‘因’用，認(rèn)為“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是純的”，自然會(huì)產(chǎn)生困惑。有興趣的話，可以在您的 RNA 樣品中加入一點(diǎn)抽提中經(jīng)常使用的試劑，如苯酚，異硫氰酸胍，PEG 等，再測(cè) A260/A280 比值。現(xiàn)實(shí)是，許多抽提 RNA 時(shí)使用的試劑，以及樣品中的許多雜質(zhì)都在 A260 和 A280 處附近有吸收，對(duì) A260/A280 產(chǎn)生影響。目前最具有指導(dǎo)性的做法是：對(duì) RNA 樣品在 200-300 nm 范圍掃描。純 RNA 的曲線具有如下特點(diǎn)：曲線平滑，A230 和 A260 是兩個(gè)拐點(diǎn)，A300 接近0，A260/A280 = 2.0 左右，A260/A230 = 2.0 左右。如果沒(méi)有掃描數(shù)據(jù)，也一定要測(cè)定 A260/A230 比值，因?yàn)樵摫戎祵?duì)所有影響酶反應(yīng)的雜質(zhì)的殘留更敏感。要考慮設(shè)備的線形范圍(A260 要處于 0.1 – 0.5 之間)。另外有兩個(gè)有用的現(xiàn)象：在水中測(cè)定 A260/A280，比值將變低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中測(cè)定的比值比在 1mM EDTA 中測(cè)定的高 0.2 左右。

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RNAguard：抑制組織/細(xì)胞內(nèi)源酶的試劑

綜上所述，確保 RNA 不降解的傳統(tǒng)做法是：在取組織前將含液氮的容器放在手邊，一旦取出所需組織，立即切割小后投入液氮中。抽提前先在碾缽中加入適量的液氮，再將組織從液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾缽中碾磨。碾磨過(guò)程中要及時(shí)補(bǔ)充液氮以防止組織融化。待組織徹底碾磨碎后，等待剩余液氮恰好揮發(fā)完時(shí)，立即將碾磨碎的組織移入裂解液中快速勻漿......安全的稱重幾乎不可能。這么嚴(yán)格的操作，是沒(méi)有多少實(shí)驗(yàn)人員去認(rèn)真執(zhí)行的。

RNAguard 能快速抑制樣品中的內(nèi)源酶活性，確保動(dòng)物組織/細(xì)胞中的 RNA 在 37C 一天不降解，25C 一周不降解，4C 一個(gè)月不降解，-20C 一年以上不降解。RNAguard 適用的樣品包括：動(dòng)物組織，培養(yǎng)細(xì)胞，昆蟲(chóng)，及部分植物組織。經(jīng)過(guò) RNAguard 處理的樣品可以用幾乎所有常用的 RNA 方法/試劑抽提 RNA，所有的操作與用新鮮組織沒(méi)有什么不同。

使用 RNAguard 的操作非常簡(jiǎn)單：在取組織前預(yù)先估計(jì)組織的重量，在一個(gè)容器中加入 5-10 倍體積的 RNAguard，放在手邊。取出所需組織后，立即切割成厚度小于 0.5 厘米，放入含 RNAguard 的容器中即可。抽提前先用鑷子將組織從 RNAguard 中取出，在室溫進(jìn)行切割和稱重后，移入裂解液中快速勻漿。

如果您面臨下面的情況之一，您一定會(huì)發(fā)現(xiàn)使用 RNAguard 的好處：

實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有液氮罐或者 –70C 冰箱保存樣品

易降解樣品的 RNA 抽提或者抽提 RNA 經(jīng)常碰到降解問(wèn)題

樣品必須準(zhǔn)確稱重 大規(guī)模 RNA 的抽提

樣品的采集 – 手術(shù)室，野外

樣品的郵寄

第二篇：RNA抽提知識(shí)

RNA抽提

1：RNA抽提原理

簡(jiǎn)單地講，RNA抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的RNA游離在裂解體系中的過(guò)程，純化則是使RNA與裂解體系中的其它成分，如DNA、蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過(guò)程。Trizol試劑的出現(xiàn)基本能解決絕大部分樣品RNA抽提，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流。

2：了解你的實(shí)驗(yàn)樣品

如果你研究某個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品，并且要抽提它的RNA，以下的信息一定要先行收集：該樣品的RNA含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量。如果你對(duì)樣品的特點(diǎn)一無(wú)所知，當(dāng)樣品稍微有一點(diǎn)復(fù)雜時(shí)，抽提RNA的實(shí)驗(yàn)就會(huì)碰到許多問(wèn)題。以血液為例，如果你不知道鳥(niǎo)的血液中有核細(xì)胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥(niǎo)血的基因組 DNA，怎么可能成功？失敗了又怎么知道原因所在？同時(shí)，只有對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品有所了解，才能正確選擇抽提方法。但同時(shí)提醒的是：沒(méi)有信息是可怕的，更可怕的是將錯(cuò)誤的信息當(dāng)真的了。

3：實(shí)驗(yàn)樣品量的取用

樣品與Trizol的比例。這個(gè)問(wèn)題非常重要，應(yīng)該獲得足夠的重視。Trizol的Protocol，提供了一個(gè)簡(jiǎn)單的比例，1ml 裂解液可以用于 50-100mg 組織或5-10X106個(gè)細(xì)胞；我的建議是，樣品量絕對(duì)要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒(méi)有具體的說(shuō)法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實(shí)驗(yàn)所需的RNA，作為決定樣品起始量的基礎(chǔ)，會(huì)比較合理的。不要因?yàn)?1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品，就一定使用 100mg 樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果(純度及得率)沒(méi)有關(guān)系，然而，在實(shí)際操作中，對(duì)結(jié)果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時(shí)使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過(guò)低，將導(dǎo)致沉淀效率低，影響得率；濃度過(guò)高，去除雜質(zhì)的過(guò)程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。不同得樣品其RNA含量差別很大。高豐度(2-4ug/mg)的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度(0.05-2ug/mg)的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度(<0.05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪。考慮后續(xù)實(shí)驗(yàn)，一般情況下，高豐度的樣品取用量大概是10-20mg/ml Trizol,中豐度樣品50mg/ml Trizol,低豐度樣品我們可以根據(jù)客戶提供的實(shí)驗(yàn)樣品量酌情取用。重申一下，不是越多越好，在考慮樣品在1ml Trizol里能充分裂解的同時(shí)，還得考慮大量的樣品可能也會(huì)帶來(lái)大量的雜質(zhì)！利用Trizol試劑抽提血清樣品時(shí)，Trizol /血清比值不要小于7/3。石蠟樣品由于RNA降解嚴(yán)重，含量大打折扣，所以取樣時(shí)應(yīng)該按低豐度樣品原則取用。

3：裂解方法

裂解的目的就是破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，釋放出里面的RNA，使其溶解于裂解液中。絕大部分樣品的裂解，比如凍存的細(xì)胞，心、肝、脾、肺、腎等，利用Trizol試劑，普通的勻漿方法就可以達(dá)到滿意的效果！但是如果碰到比較特殊的樣品，我們可能要附加一些其他的輔助手段。1）骨骼。骨骼組織質(zhì)地堅(jiān)硬，普通的勻漿器根本無(wú)法使其破碎，以致RNA不能完全釋放溶解在TRIZOL試劑中，碰到這種類型的樣品，我們必須先利用液氮把樣品破碎成粉末狀，Trizol懸浮混勻再利用Minibeadbeater勻漿5分鐘。取上清, 2000g 4℃離心5min再取上清 去沉淀。2）細(xì)菌 Trizol雖然對(duì)細(xì)胞的裂解效果出眾，但是對(duì)細(xì)菌堅(jiān)韌的細(xì)胞壁還是無(wú)可奈何，這時(shí)我們可以利用超聲來(lái)輔助破壁。將細(xì)菌重懸于300ul的Trizol中，置于Bioruptor冰水浴中，M 檔 30s “on”、30“off”超聲處理1—2 min.取出用Trizol將體積補(bǔ)至1ml。3)酵母 酵母細(xì)胞跟細(xì)菌一樣，還是因?yàn)榧?xì)胞壁的原因，不能充分裂解。Zymolyase在37℃ 40分鐘可以很好的消化掉酵母細(xì)胞壁，這里需要提醒的是消化緩沖液不能有外源性RNA酶污染，最好附加使用RNA酶抑制劑，做好了這點(diǎn)就不用擔(dān)心這步有RNA降解的問(wèn)題。4）石蠟包埋樣品 石蠟包埋的組織樣品在加Trizol裂解前必須先脫蠟，脫蠟的效果直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所以我們?yōu)槭姑撓灣浞?，選用高溫脫蠟與二甲苯脫蠟相結(jié)合的兩步脫蠟法。脫蠟后加入Trizol勻漿。5）脂肪 脂肪組織可以直接用Trizol 勻漿，這里需要提醒的是脂肪組織勻漿后，需室溫靜置5min，再室溫7500g 離心5分鐘，去除上面的脂肪層再繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)！

4：分相

Trizol里含有的物質(zhì)之一“酚”去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超過(guò)了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會(huì)被一次去除，裂解勻漿后的樣品，按1ml Trizol 加200ul 的氯仿，震蕩離心，絕大部分樣品在這一步是不需要用特殊方法對(duì)待的，但對(duì)于蛋白含量比較高的組織樣品必須要二次抽提，甚至多次抽提方可徹底去除。這里要著重提到的是血清樣品！離心分相后，取上清這一步是分相實(shí)驗(yàn)的操作難點(diǎn)，一定要謹(jǐn)慎，萬(wàn)不可混入有機(jī)相污染，原則是寧缺勿濫！

5:異丙醇的沉淀

異丙醇的沉淀，目的是使RNA從裂解體系中沉淀下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)RNA與其它雜質(zhì) – 主要是鹽 – 的分離。實(shí)際操作中，有的雜質(zhì)也會(huì)與RNA一起被醇沉淀下來(lái)，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時(shí)候。異丙醇的沉淀并不是非常特異性的，有機(jī)大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達(dá)到一定水平后，都可能同步被沉淀下來(lái)。在不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的情況下，我們是可以忽略這些鹽污染。有些實(shí)驗(yàn)樣品，由于前期用藥物或某種方法處理過(guò)，導(dǎo)致會(huì)殘留有一些特殊的雜質(zhì)，之所以殘留，往往是因?yàn)檫@些雜質(zhì)與RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。這些特點(diǎn)決定了它們往往是非常強(qiáng)的酶抑制劑，對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)影響非常大。這里介紹有幾種方法除去這些雜質(zhì)：1）TRIzol 提供的一個(gè)沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。2）介質(zhì)純化：遇到一些與RNA共同沉淀下來(lái)且影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一些雜質(zhì)，可以利用BioMag公司提供的連有 Oligo dT的磁珠純化出總RNA中的mRNA，這個(gè)方法優(yōu)點(diǎn)是基本能解決絕大多數(shù)有雜質(zhì)污染的總RNA（目前沒(méi)有遇到這種方法處理不了的），缺點(diǎn)是成本比較高。對(duì)與RNA含量少的樣品，直接異丙醇沉淀得率會(huì)很低，而且基本看不見(jiàn)沉淀物，這也會(huì)給后續(xù)的操作帶來(lái)很大的麻煩，進(jìn)一步損失RNA。遇到這種情況我們可以使用一種媒介(Golycogen)跟RNA共同沉淀下來(lái)，這種媒介物質(zhì)既能很好的跟RNA共同沉淀下來(lái)，又不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。不要迷信試劑說(shuō)明書里的標(biāo)準(zhǔn)方法；有時(shí)，使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問(wèn)題在標(biāo)準(zhǔn)方法中是找不到答案的，要具體問(wèn)題具體分析。

6：洗滌

洗滌注意四點(diǎn)：首先一定要將沉淀懸浮起來(lái)；第二就是要有一定的時(shí)間，尤其是當(dāng)RNA沉淀比較大時(shí) ；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。在異丙醇沉淀后，絕大多數(shù)時(shí)是能看見(jiàn)管底的白色沉淀，但還是有時(shí)候是看不見(jiàn)的，即使是加過(guò)Golycogen的。遇到這種情況不要慌，沒(méi)看見(jiàn)不等于沒(méi)有，遇到這種情況可以先用移液器小心的吸去上清，注意槍頭不要碰到管壁。加入75%乙醇，上下顛倒幾次，短暫離心后用移液器吸去上清，同時(shí)仔細(xì)觀察管壁是否有掛液。如果有，那沒(méi)問(wèn)題，可以確定沉淀都附在管壁上了。

7：RNA的溶解和保存

純化后的RNA溶解以水為主，用無(wú)Rnase酶的水溶解的RNA基本上還算穩(wěn)定，其穩(wěn)定與溫度成反比，與濃度成正比。所以抽提好的RNA應(yīng)盡快保存在-70℃，避免反復(fù)凍融，同時(shí)注意不要把濃度稀釋的太低，大概保持在1000ng/ul。如果溫度合適，保存中RNA發(fā)生降解或者消失，其原因應(yīng)該是酶殘留導(dǎo)致的酶解。

8：RNA質(zhì)量的檢測(cè)問(wèn)題

將抽提好的RNA直接用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，是唯一可靠的檢測(cè)方法；除此之外的檢測(cè)方法，都是相對(duì)的，不可全信。目前實(shí)驗(yàn)室用于正式實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)RNA質(zhì)量的方法，一是電泳，二是NANO-Drop。電泳檢測(cè)的主要是RNA的完整性和大小，該方法還是比較可信的；同時(shí)電泳還可以用于估計(jì)核酸的濃度，其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)。NANO-Drop檢測(cè)的是純度和核酸含量。然而，由于NANO-Drop不能確保非常準(zhǔn)確，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時(shí)進(jìn)行NANO-Drop檢測(cè)和電泳檢測(cè)，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個(gè)更合理的判斷。但由于這兩個(gè)方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，也不用大驚小怪。（A260/A280 比值低 – 蛋白質(zhì)殘留但更可能是苯酚殘留。A260 值提示的含量與電泳檢測(cè)時(shí)提示的含量有可見(jiàn)的誤差可初步判斷是苯酚殘留。）

第三篇：血液總RNA抽提

血液總RNA抽提

1.取250ul血清加入750ul Trizol LS（用于液體中RNA的抽提）中，劇烈震蕩，靜置。2.加入200ul 三氯甲烷，劇烈震蕩，靜置10min。3.4度，12000g 離心15min。4.吸上清至新的EP管，加入500ul(與所吸出的上清比列為1:1)異丙醇，并加入1ul的糖原，輕輕上下顛倒混勻，-20度冰箱沉淀過(guò)夜。5.4度，12000g 離心15min。留沉淀（RNA），將上清倒掉，加入1ml 75%的乙醇（DEPC水配），上下顛倒，洗滌RNA沉淀。6.4度7500g離心10min。去上清，將沉淀晾干（不能太干）加入10ul左右的Rnase free 的水溶解即可。

第四篇：RNA的抽提與鑒定

RNA的抽提與鑒定

背景

核糖核酸(RiboNucleic Acid，簡(jiǎn)稱RNA)是由至少幾十個(gè)核糖核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接而成的一類核酸,因含核糖而得名,簡(jiǎn)稱RNA。

遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再?gòu)腞NA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程。也可以從DNA傳遞給DNA，即完成DNA的復(fù)制過(guò)程。這是所有有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物所遵循的法則。在某些病毒中的RNA自我復(fù)制(如煙草花葉病毒等)和在某些病毒中能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA的過(guò)程(某些致癌病毒)是對(duì)中心法則的補(bǔ)充。

三種常見(jiàn)的RNA 1.mRNA 信使RNA 功能：蛋白質(zhì)合成的直接模板 2.tRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 功能：氨基酸的運(yùn)載體

3.rRNA 核糖體RNA 功能：核糖體的組成成分，蛋白質(zhì)的合成場(chǎng)所

其他小分子RNA 1.hnRNA 核內(nèi)不均一RNA 成熟mRNA的前提 2.snRNA 核內(nèi)小RNA 參與hnRNA的剪接與轉(zhuǎn)運(yùn) 3.snoRNA 核仁小RNA rRNA的加工與修飾

4.scRNA/7SL-RNA 胞質(zhì)小RNA 蛋白質(zhì)內(nèi)置為定位合成信號(hào)識(shí)別體組成成分 5.siRNA 小的干擾RNA siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是對(duì)特定信使RNA（mRNA）進(jìn)行降解的指導(dǎo)要素

實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞中的RNA可分為信使RNA，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA三類，這三種類型的RNA都存在于細(xì)胞質(zhì)中，所以從不同組織中提取的總RNA的本質(zhì)就是細(xì)胞的裂解，RNA的釋放，通過(guò)不同的方式去除蛋白質(zhì)，DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純度的RNA產(chǎn)品工藝。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1完整RNA的提取和純化,是進(jìn)行RNA方面的研究工作,如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。2臨床診斷中的應(yīng)用：病毒檢測(cè)等

RNA提取的方法及步驟

1提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來(lái)。（該方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。）

2在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相，而達(dá)到分離RNA的目的。

根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下兩種制備方法： 1胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍 2LiCl/尿素法 以胍鹽法最好，對(duì)于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）中提取RNA特別有效，可使RNase迅速變性，制備的RNA有較高翻譯活性。

Trizol（異硫氰酸胍-苯酚法）

1由苯酚和硫氰酸胍等配制而成的單相的快速抽提試劑；

2可在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其它成分的同時(shí)保持RNA的完整性；

3在氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀RNA； Trizol可以從最少100個(gè)細(xì)胞或1mg組織中提取RNA。如果細(xì)胞量過(guò)少或組織來(lái)源特異，可以采用相應(yīng)試劑盒提取RNA。

Trizol法的原理

1異硫氰酸，β-巰基乙醇，SDS裂解細(xì)胞

2酸性條件（pH4.0)下酚、氯仿抽提，離心，蛋白質(zhì)，DNA和脂質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相，而RNA存在于水相

3異丙醇沉淀水相中的RNA

Trizol法提取RNA操作步驟

1.剪碎的鼠肝中加入Trizol試劑，進(jìn)行機(jī)械勻漿，取1ml Trizol勻漿液于1.5ml離心管內(nèi)，室溫放置5分鐘，以充分裂解細(xì)胞。目的：變性劑充分作用裂解細(xì)胞，釋放核酸。2.每管加入200ul氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min；注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。

3.4℃ 12,000rpm離心15min；

4.吸取上層水相，至另一離心管中；注：不要吸取中間界面。目的：分離RNA、DNA、蛋白質(zhì)等。

5.加入0.5ml 異丙醇混勻，室溫放置5-10min；

6.4℃ 12,000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底；目的：沉淀RNA。異丙醇會(huì)奪取大量RNA分子間的水分子，因此RNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。7.按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。（此時(shí)可放-70℃保存）目的：洗滌RNA，去除殘余的鹽類等雜質(zhì)。8.4℃10000rpm離心5min，盡量棄上清。

9.短暫離心收集管壁液體并吸棄。室溫晾干2-3min。注：RNA樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。

10.用200ul(體積可根據(jù)RNA的沉淀量具體調(diào)整)DEPC處理的H2O溶解RNA樣品，溶解后立即置于冰上。注：H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓。

簡(jiǎn)易TBE電泳觀察RNA的完整度 1制膠：瓊脂糖凝膠粉（0.7%），消毒TBE緩沖液，Goldview顯色劑

2上樣：10ul樣品（含上樣緩沖液）混勻后，加入凝膠孔中；上樣緩沖液（loading Buffer): 溴酚藍(lán)、二甲苯青FF、蔗糖，甘油 3電泳：電泳110V，15min。4紫外燈下觀察

RNA 質(zhì)量及純度的分析

方法

一、檢測(cè)RNA溶液的吸光度 260、320、230、280nm的吸光度分別代表核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白質(zhì)的水平；

純的RNA，230：260：280＝1：2：1；

一般OD260/OD280= 1.8~2時(shí)，我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的； 當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯； 當(dāng)R>2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已經(jīng)水解成單核酸了； RNA濃度=OD260×40μg/ml×稀釋倍數(shù)。

方法

二、RNA的電泳圖譜

檢測(cè)28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量好。

方法

三、保溫試驗(yàn)

RNA溶液在70℃的恒溫水浴中保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。比較兩者的電泳條帶，說(shuō)明RNase的污染情況。

如何盡量避免RNA的降解？

1及時(shí)處理樣本，或置液氮中保存

2試驗(yàn)器皿及配置試劑用水用0.1%DEPC處理且高壓消毒 3盡可能早的去除組織與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì) 4聯(lián)合使用RNase抑制劑

5操作過(guò)程中，戴手套口罩，避免空氣流通 6進(jìn)行完整性的檢測(cè)

第五篇：invitrogen trizol rna抽提說(shuō)明書

RNA抽提全過(guò)程(TRIZOL)

一，準(zhǔn)備工作 1，實(shí)驗(yàn)器具與材料：

（1）移液槍：1ml、200ul、10ul（2）吸頭：1ml、200ul、20ul

（3）吸頭臺(tái)：放置1ml吸頭的一個(gè)，放置200ul和20ul的吸頭一個(gè)（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）鹽水瓶：100ml

（8）15ml塑料管一個(gè)（配75％乙醇用）

2，實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備

（1）塑料制品：（包括吸頭、EP管等）

將塑料制品逐個(gè)浸泡于1‰DEPC水中（必要時(shí)小槍頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過(guò)夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時(shí)左右烘干），試驗(yàn)前將槍頭放入吸頭臺(tái)?；蛑苯淤?gòu)買經(jīng)DEPC處理的槍頭和EP管,每盒大約30元,基本上試劑公司都可以購(gòu)買。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）

先泡酸過(guò)夜，沖洗干凈后，在1‰DEPC水中泡8小時(shí)左右，37℃烘干，用蒙錫紙包裹送至干烤3次（或180度干烤）。（3）金屬制品：（鑷子等）

先洗干凈，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3，試劑配制和準(zhǔn)備：

（1）DEPC水：泡實(shí)驗(yàn)器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)后備用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶?jī)?nèi)裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過(guò)夜，送至高壓。

（2）75％乙醇（要在抽提時(shí)現(xiàn)配）：用無(wú)水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:無(wú)水乙醇＝1:3），然后放于-20℃?zhèn)溆?。?）異丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶

（5）Trizol：100ml/瓶 存放于4℃

二，抽提時(shí)注意事項(xiàng)：

全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤換，避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。

三，抽提步驟 1． 勻漿化作用

取約100mg鼠腦組織放于玻璃研磨器內(nèi)，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨組織后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器內(nèi)加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。顛倒混勻10下，室溫靜置5分鐘。2． 分離階段

每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒，使其充分混勻，室溫靜置5分鐘。后12000rmp離心15分鐘。3． RNA的沉淀

將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5mlEP管中（約400-500ul），加入0.5ml異丙醇，混勻后放于-20℃中1小時(shí)，后12000rmp離心10分鐘。4． RNA的洗脫 小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml現(xiàn)配的75%的乙醇（預(yù)冷）振蕩洗滌RNA沉淀一次，后7500rmp離心5分鐘。5． RNA的再溶解

小心倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺(tái)開(kāi)風(fēng)機(jī)吹干（約30分鐘，此時(shí)RNA沉淀變透明）。注意不能讓RNA沉淀完全干燥（會(huì)極大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分鐘助溶。6，RNA的保存

提取的RNA保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。

TRIzol法抽提總RNA

組織100mg ↓

加1mlTRIzol ↓

研磨，勻漿（研磨時(shí)倒入液氮，研磨完后從研缽轉(zhuǎn)入EP管中，）（組織勻漿量>100mg時(shí)分裝1ml/每EP管）↓

顛倒混勻10下，室溫5分鐘 ↓

加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）↓

顛倒混勻15S，室溫5分鐘 ↓

4℃，離心12000rmp，15分鐘 ↓

轉(zhuǎn)上層水相（約400-500μl）于另一新1.5mlEP管中（注意勿吸入中間那層）↓

加等體積異丙醇（約400-500μl）↓

4℃，離心12000rmp，10分鐘 ↓

棄上清 ↓

加冰預(yù)冷的75%乙醇（用高壓后的DEPC水配）1ml ↓

4℃離心7500rmp，5分鐘 ↓

棄上清，超凈工作臺(tái)開(kāi)風(fēng)機(jī)干燥約30分鐘（不能完全干燥）↓

溶于DEPC水中至50μl（此處可按照實(shí)際情況修改，有人用50，也有人用100）（可在55-60℃水中，<10分鐘助溶）↓

立即保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄

RNA純度檢測(cè)及定量

從36μl中取6μl，用無(wú)RNA酶的水稀釋100倍至600μl，用DU70型分光光度儀分別測(cè)定樣品在260nm、280nm波長(zhǎng)的光密度值，計(jì)算出RNA的濃度（μg/ml）。

純RNA樣品的A260/A280比值為1.7-2.1，若低于此值，表明存在蛋白質(zhì)污染，需重新用酚/氯仿抽提。RNA樣品的A260/A230比值應(yīng)大于2.0，若低于該標(biāo)準(zhǔn)，提示有變性緩沖液殘留需重新用乙醇沉淀RNA，然后用750ml/L的乙醇洗滌，以除去殘留的變性緩沖液。

RNA電泳

用無(wú)Rnase水配TAE電泳液，稱1.0g新開(kāi)封的瓊脂糖，加TAE電泳液至100ml，煮沸，加溴乙錠20μl，降至室溫后灌膠置DEPC水處理過(guò)的電泳槽中，凝固20min，加TAE 緩沖液浸沒(méi)膠塊。取15μl RNA加6×RNA專用上樣緩沖液3μl，混勻，用移液槍將樣品加入上樣孔內(nèi)，待溴酚藍(lán)遷移至理想位置后，終止電泳，紫外燈下觀察、拍照。

上傳RNA電泳條帶如下

最下面條帶代表5s 色淺代表RNA基本無(wú)降解

如出現(xiàn)拖把狀條帶 則為降解較嚴(yán)重情況

但有時(shí)這種情況也可以照樣RT－PCR

我們同學(xué)就有在低溫冰箱放了幾個(gè)月的組織照樣可以出結(jié)果的