第一篇：western 內(nèi)參選擇 大討論

在western blot 實驗中，內(nèi)參的使用是個很重要的部分，看到很多站友對內(nèi)參的選擇 經(jīng)常有些疑問，鑒于此，希望能在一個帖子里面綜合所有相關(guān)問題，展開討論，共同學(xué)習(xí)。

我先提幾個，拋磚引玉，希望大家繼續(xù)。1。為什么一定需要內(nèi)參？內(nèi)參的重要性。2。常用的幾種內(nèi)參。

3。不同的情況如何選擇不同的內(nèi)參。支持一下！

1：用內(nèi)參照是為了評價你的各個上樣孔內(nèi)蛋白的總量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。這些蛋白在所有細胞中的表達量基本一致，所以用他們來作為你加樣量的對照。這樣western結(jié)果中你的目的蛋白經(jīng)過處理后發(fā)生變化，而內(nèi)參的條帶基本均勻一致。這樣才有說服力，表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或是人為造成目的條帶濃度的變化。嚴(yán)格意義上說，內(nèi)參事必須做的。

2：常用的內(nèi)參有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更詳細的研究發(fā)現(xiàn)，β-Tubulin(球管蛋白)，被廣泛應(yīng)用于Western Blotting，β－Tubolin分子量為55KD左右。

3：一般我們選擇內(nèi)參與要檢測的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你檢測的蛋白的分子量來選擇合適的內(nèi)參！個人一些見解，供參考！

內(nèi)參的重要性，必要性：

要檢測一個基因的表達產(chǎn)物是否正確，或者比較表達產(chǎn)物量的相對變化，首選方法是Western Blot。因為Western Blot操作相對簡單方便，既可以定性分析表達產(chǎn)物，同時還可以指示目的蛋白量的相對變化。雖然，順利的時候Western Blot做起來很簡單，可不順的時候也很令人心煩――做不出結(jié)果啦、假陽性啦、結(jié)果出現(xiàn)多條帶啦、到底是一抗有問題還是二抗有問題啦……畢竟，作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應(yīng)畢竟不象1+1那么明確，而用這種不確定的試劑來測定同樣知之甚少的表達產(chǎn)物，確實是有一定的不確定性的。所以，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤estern Blot實驗設(shè)計中要求有良好的參照體系，對實驗結(jié)果分析是非常有用。特別是當(dāng)實驗出現(xiàn)問題時，借助參照體系很容易就可以查出問題所在，而不必抓耳撓腮怨天尤人。良好的參照體系通常包括分子量Marker（用來確定蛋白條帶對應(yīng)的分子量大?。?，空白載體對照（如果是誘導(dǎo)表達體系還應(yīng)該有誘導(dǎo)前的對照），已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對照；另外還有內(nèi)參。可是由于經(jīng)費限制或者偷懶的原因，國內(nèi)的不少人做Western Blot往往省略參照，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)問題時無法分析結(jié)果――即便有結(jié)果也可能影響結(jié)果的分析。

內(nèi)參是最容易被忽略的一項。我們知道，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的細胞上樣，才有比較的基礎(chǔ)。特別表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析。所以你需要內(nèi)參。

內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting 實驗中，除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進行內(nèi)參的檢測，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在國外發(fā)表的文章中，Western Blotting 實驗結(jié)果須進行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是，國內(nèi)仍有不少科研人員在Western Blotting實驗中忽略了內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法，都存在局限性，不能完全準(zhǔn)確的確定各種樣品的準(zhǔn)確蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)，相對于比色法來說，操作簡單，但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度最高，且與一系列干擾Lowry，BCA 反應(yīng)的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。另外，蛋白質(zhì)定量以后進行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Western blotting實驗時使用內(nèi)參，即可簡便地對定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進行校正。

在Western Blotting中使用內(nèi)參其實就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達，由于內(nèi)參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

我想問一下,內(nèi)參和目的蛋白相差15kD能不能將膜上他門的位置(用預(yù)染)分別剪下來,孵育啊?還是必須得跑兩張膜一個內(nèi)參一個目的蛋白啊?洗膜的時候可以放在一起洗么?如果他們是同源的二抗可以放在一起孵育么? 回答樓上的問題：完全可以剪開分別加一抗孵育，我就是這么做的；洗膜時最好分開洗滌，放在一起的話兩張膜可能重疊在一起，影響洗膜效果；如果不剪膜，你兩個一抗來源相同而且特異性很好（單抗）的話，可以一起孵育，不過應(yīng)該注意可能存在的交叉反應(yīng)，你可以嘗試一下看看結(jié)果再定。本人是新手，問一個很汗的問題，原核表達也需要做內(nèi)參么？做內(nèi)參的蛋白在哪里找？ 不甚感激

在Western Blotting實驗過程中使用內(nèi)參的方法有：

一、超級簡便的標(biāo)記內(nèi)參使用法：只要在二抗孵育時加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。

二、普通內(nèi)參：當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。

三、當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。

常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和細胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。我們實驗室使用最多的是***工程有限公司與國外實驗室合作開發(fā)的GAPDH，100μl一支，濃度為100μg/100μl，價格為988元人民幣。雖然公司網(wǎng)上稱稀釋比達1：10000以上，至少可做100次Western mini-blots，但我們一般按照1：5000～6000稀釋，不過效果確實非常好，熒光條帶非常亮，而且抗體使用3～4次也沒太大改變。

我們也使用過博奧森的beta-actin，200ul 480元，稀釋比1：200～500。因為稀釋比不高，所以價格并不便宜。更可氣的是，我PC 12細胞居然有兩條條帶，小鼠也是兩條。我也同意剪開,但是別忘記一個問題.你 要確保你剪開的部位沒有蛋白.kang chen的HRP－標(biāo)記內(nèi)參很好

不需要剪膜 更為直觀，有說服力 我做了半年的western,就我對內(nèi)參的理解如下

1.所選內(nèi)參有一下:GAPDH,beta-actin,beta-tubulin等是一些細胞的基本結(jié)構(gòu)蛋白或是管家蛋白,細胞表達穩(wěn)定,且表達水平高,在同一種類的細胞上表達基本一致.2.做內(nèi)參可以:一,檢驗?zāi)愕恼譿estern裝置是否正常run effectively.包括你的配液,你的膠以及電泳和轉(zhuǎn)移,一抗的效價以及顯色等.二檢測你的樣品蛋白含量是否相等.3.選擇內(nèi)參要根據(jù)你的目的蛋白的性質(zhì)即你的 目的蛋白是胞內(nèi)還是核內(nèi),你蛋白的 分子量是大是小,當(dāng)然還有價錢以及你的目的.4.一般內(nèi)參是比較容易作出來的,同時它也是幫助你摸索條件的,你把其做漂亮,你后面就很順利了,只是轉(zhuǎn)移的條件有點變化.其余照樣或根據(jù)說明書操作.我想請問一下如果內(nèi)參和目的蛋白的差距很大，比如我的目的蛋白是一百多ＫＤ，可是常用的內(nèi)參都是３０～５０ＫＤ，是不是一定要分塊膠來跑呢？

那么，我想請教一下用過β-actin做內(nèi)參的朋友，有沒有遇到過β-actin抗體檢測不到小鼠心肌和肌肉組織β-actin的情況？當(dāng)然前提是：1，我的確提取到了心肌和肌肉組織的總蛋白，且檢測到了我的目的條帶。2，用此抗體可以檢測到其他組織中β-actin條帶。

也發(fā)現(xiàn)，在碧云天網(wǎng)站上，曾提及“本抗體不能用于成年動物心肌或骨骼肌的免疫染色”。http:// http:// https:// http://

2, 選用C-端16aa短肽作為抗原制備抗體。主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等).相關(guān)網(wǎng)址如下: http:// http:// http://004km.cnA，TATA-box bingding protein（TBP）甚至線粒體的內(nèi)參來代替，當(dāng)然我認為這種可能性出現(xiàn)的幾率比我買彩票中大獎差不多。今晚回答這個問題對于我來說也是一個考驗，很多基礎(chǔ)知識都是通過網(wǎng)絡(luò)和拚命的回憶來的，也算是對于actin這個內(nèi)參的一個全面了解了，希望有所幫助。

補充一點選內(nèi)參的原則：所選的內(nèi)參與目的基因之間不能有調(diào)節(jié)關(guān)系，否則內(nèi)參就不客觀了，如：你是做與糖代謝相關(guān)的基因就不能選GAPDH，與細胞骨架相關(guān)的就不能選β-actin。

在Western Blotting中使用內(nèi)參其實就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達，由于內(nèi)參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

實驗結(jié)果分析其實很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進行一次電泳轉(zhuǎn)膜實驗時，分別檢測樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數(shù)值進行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結(jié)果。如果樣品量充分，可以先檢測內(nèi)參，觀測樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致，根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進行Western Blotting實驗，至內(nèi)參量一致為止；若內(nèi)參一致，即可進行不同樣品間目的蛋白表達變化分析。這樣雖然麻煩一點，但是可以保證結(jié)果更有說服力，更可信。畢竟我們的實驗是一種嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ?在Western Blotting實驗過程中使用內(nèi)參的方法有：

一、超級簡便的標(biāo)記內(nèi)參使用法：只要在二抗孵育時加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。

二、普通內(nèi)參：當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。

三、當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。

內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting 實驗中，除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進行內(nèi)參的檢測，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

實際上內(nèi)參是最容易被忽略的一項。我們知道，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的細胞上樣，才有比較的基礎(chǔ)，特別表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析，所以需要內(nèi)參。在國外發(fā)表的文章中，Western Blotting 實驗結(jié)果須進行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是，國內(nèi)仍有不少科研人員在Western Blotting實驗中忽略了內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。

不同異構(gòu)體表達對蛋白的檢測是有很大的影響，買抗體前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗體雜不出條帶其實未必是抗體質(zhì)量的問題。很多公司的內(nèi)參抗體是用抗原片段制備的，不同的公司選擇的片段不一樣。以最常用的beta-actin為例，有的公司選擇N-端，有的選擇C－端。選用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作為抗原制備抗體(單抗和多抗)的占大多數(shù)，主要有santa cruz(Cat# sc-69879),sigma(Cat# A1978等)，ProSci(Cat# 3779),Cell Signaling(Cat#4967)，Axxora PLATFORM(BET-A300)等，這類抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C-端16aa短肽作為抗原制備抗體的主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777)，EPITOMICS(1784-1,1854-1等)，這類抗體可以在肌肉細胞中檢測到actin陽性信號。有時候在實驗中檢測內(nèi)參時產(chǎn)生“組織特異性”，就是由于抗體選擇不對造成的。我來說點不同看法

內(nèi)參是western中重要的一步,但是是不是每次都要做,答案顯然是否定的.只有在需要得到可發(fā)表的結(jié)果的情況下,才有必要做一個漂亮的內(nèi)參.1: western本身就是一個很粗略的定量方法,嚴(yán)格的說,根本不具有定量的能力,所有從werster里出來的表達量的區(qū)別(明顯的“有”“沒有”的區(qū)別屬于定性），都是不精確的，苛刻點說，壓根就是不可采信的。所以內(nèi)參只是一個為了結(jié)果完整性而出現(xiàn)的東西，平時做western如果次次做內(nèi)參，完全沒有必要，也沒什么太大幫助

2: 那么如何控制上樣量，有很多辦法，可以通過SDS-PAGE粗略判定，這個方法一點不比用內(nèi)參差，那些abundant protein在膠上完全可以通過肉眼辨別條帶的深淺，反倒是用western判斷很困難，在western結(jié)果出來都是很黑的條帶，不一定在膠上看起來就一樣.而最直接的辦法是在準(zhǔn)備sample的時候就下好功夫，取多少個細胞，最終溶解在多少sample buffer里面，是可以控制出load的時候每條lane大概有多少細胞的.內(nèi)參，尤其是werstern的內(nèi)參，絕大多數(shù)情況是作為“漂亮的馬后炮”出現(xiàn)的,當(dāng)你前期控制完之后，再放上一個內(nèi)參告訴別人“看，的確如我所料”.werstern次次做內(nèi)參,完全沒有必要

要發(fā)文章還是要用內(nèi)參更有說服力，前面的同志們在討論的時候主要針對的是動物體系，不知生物公司的內(nèi)參一抗對植物材料WB是否通用？我想請教一下；做水稻受病原菌處理后線粒體的蛋白的變化，采用什么內(nèi)參比較好？一般病原菌處理植物后發(fā)生的PCD會不會影響action的表達差異性？選擇GAPDH可以嗎？希望針對植物蛋白和動物蛋白在WB過程中選擇內(nèi)參需要注意的事項進行交流討論！

可供選擇的內(nèi)參除了前面說過的actin和tubulin，還有Ubquitin，elgf等。但是，最重要的是一定要確定試驗的處理因素不會對選擇的內(nèi)參蛋白表達產(chǎn)生影響，比如常用的tubulin，可能就不太適合用來定量有絲分裂相期的蛋白表達情況。因此，如果有條件，最好在預(yù)實驗中平衡比較一下多種內(nèi)參再選擇最優(yōu)。當(dāng)然，對于我們大多數(shù)人來說，只要回顧一下本研究領(lǐng)域的權(quán)威參考文獻，大概就可以確定哪種內(nèi)參在這種實驗中已經(jīng)得到公認了！

關(guān)于內(nèi)參的應(yīng)用問題，國內(nèi)一直還沒有形成應(yīng)用的習(xí)慣，可能是有研究水平的原因，也有可能是內(nèi)參的抗體大部分是國外產(chǎn)的，超級貴！前段時間為了一篇文章，用的內(nèi)參外國人老不相信，老板一狠心買了兩只chemicon內(nèi)參，50ug包裝，每支3000多！不過好在我們有自己做的一支很好用的內(nèi)參單抗，平常的實驗可以保證敞開用，國內(nèi)其他大部分實驗室可能就沒這么好的運氣了！但是老板經(jīng)過此事也下決心要把這個抗體完整詳細的鑒定出來，然后推出去讓大家都來用提高它的可信度。目前，鑒定的工作已經(jīng)差不多完成了，剩下的就是申請專利，不管最后是怎么賣出去，國產(chǎn)的東西應(yīng)該會大大便宜于國外的，這對大家來說可能也算一個好消息吧

不太茍同 sixday1004兄對內(nèi)參的某些看法.sixday1004 wrote: 我來說點不同看法

內(nèi)參是western中重要的一步,但是是不是每次都要做,答案顯然是否定的.只有在需要得到可發(fā)表的結(jié)果的情況下,才有必要做一個漂亮的內(nèi)參.這么肯定的將內(nèi)參的作用局限在“需要得到可發(fā)表的結(jié)果的情況下”的狹小范圍內(nèi)，似乎有些不妥?？蒲羞^程中，有誰能未卜先知到實驗結(jié)果？沒有內(nèi)參的作用，我們?nèi)绾蔚弥玫降慕Y(jié)果就是“可發(fā)表的結(jié)果”？

1: western本身就是一個很粗略的定量方法,嚴(yán)格的說,根本不具有定量的能力,所有從werster里出來的表達量的區(qū)別(明顯的“有”“沒有”的區(qū)別屬于定性），都是不精確的，苛刻點說，壓根就是不可采信的。所以內(nèi)參只是一個為了結(jié)果完整性而出現(xiàn)的東西，平時做western如果次次做內(nèi)參，完全沒有必要，也沒什么太大幫助

western的確是一種半定量的方式，不是很精確，但這決不是因噎廢食甚至是“破罐子破摔”的理由。內(nèi)參的出現(xiàn)，就是為了在一定程度上彌補WB的不足而必須的一種實驗設(shè)計，只有這樣我們才有可能對每次的WB結(jié)果進行分析。請注意，內(nèi)參不是完整性結(jié)果的“果”或“附屬品”，而是“因”或“前提”，顛倒了兩者的關(guān)系，可不是一種科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒瀾B(tài)度哦。

當(dāng)然，如果是同一批樣品，在保證上樣體積一致的情況下，是可以不必次次做內(nèi)參的。

2: 那么如何控制上樣量，有很多辦法，可以通過SDS-PAGE粗略判定，這個方法一點不比用內(nèi)參差，那些abundant protein在膠上完全可以通過肉眼辨別條帶的深淺，反倒是用western判斷很困難，在western結(jié)果出來都是很黑的條帶，不一定在膠上看起來就一樣.而最直接的辦法是在準(zhǔn)備sample的時候就下好功夫，取多少個細胞，最終溶解在多少sample buffer里面，是可以控制出load的時候每條lane大概有多少細胞的.WB結(jié)果出來很深的條帶，那是因為曝光時間太長的緣故，可以適當(dāng)減少曝光時間或通過其它有效方法來降低條帶的亮度，這樣之后還是能夠很容易在膠片上判別的。條帶的亮度與上樣量并不是一直都是線形關(guān)系的，不僅WB如此，考馬斯亮藍染色也是如此。SDS-PAGE上的豐度蛋白本身就具有很多不確定性，比起已知的內(nèi)參，利用其作為判定標(biāo)準(zhǔn)更在無形中增加了判斷誤差的風(fēng)險。

比較認同您關(guān)于“準(zhǔn)備樣品時下好功夫”的觀點，不僅僅是可以盡量保證總蛋白量的一致，更重要的是良好的蛋白樣品會有好的電泳行為，直接影響到WB條帶的質(zhì)量。即便如此，每次準(zhǔn)備樣品后，內(nèi)參還是要有的。

內(nèi)參，尤其是werstern的內(nèi)參，絕大多數(shù)情況是作為“漂亮的馬后炮”出現(xiàn)的,當(dāng)你前期控制完之后，再放上一個內(nèi)參告訴別人“看，的確如我所料”.“漂亮的馬后炮”，我們的確也常在茶余飯后這樣調(diào)侃內(nèi)參的作用。但在實驗中，它的確是我們評價實驗結(jié)果的“基石”，只有這樣，我們才能理直氣壯的指著內(nèi)參告訴別人，“看，的確如我所料”。

werstern次次做內(nèi)參,完全沒有必要

請sixday1004兄三思，指教。

個人觀點，僅對事，僅供參考。

做內(nèi)參的目的是為了保證蛋白上樣量相近/相等.仔細想一下到底有多少實驗需要相對精確的上樣量就知道了,其實并沒有太多.1: 如果你是為了做kinetic assey之類的,那么蛋白量是需要相當(dāng)?shù)木_,靠WB的內(nèi)參顯然是遠遠不夠的

2: 如果是為了detect到不同sample蛋白量的區(qū)分,那是需要并且如果想發(fā)表,結(jié)果中是必定要有內(nèi)參的.但是,依然有精確度的問題.倘若變化范圍很小,光靠內(nèi)參有說服力么?還是要回到更精確的蛋白定量上去;而倘若范圍變化很大,例如RNAi之類的,又需要用到內(nèi)參這樣相對“精確”的方法么? SDSPAGE甚至sample制備的時候做的一些控制已經(jīng)綽綽有余了.3: 還有一個是順序問題,請問有哪個人在做RNAi screening之類實驗的時候,每個sample做內(nèi)參的?都是挑好clone了之后想做個發(fā)表結(jié)果的圖的時候才放上內(nèi)參的吧.否則先不談浪費antibody的問題,光是花掉的時間和獲得的效果,有性價比么?很多人做fusion protein detection的時候甚至連SDS-PAGE都省了,直接上DOT BLOT(一般買的tag antibody質(zhì)量都很好).內(nèi)參用在一些“關(guān)鍵性”的情況下才有意義.并且這個范圍還很狹小,既不能太小(內(nèi)參不夠精確),也不能太大(SDSPAGE可以做到同樣效果).4: 至于LS某人提到的習(xí)慣問題,我只想說..國外好象也沒聽過WB次次用內(nèi)參的,這個和科研水平高低毫無關(guān)系,因地制宜吧,不用這么死板.WB常用內(nèi)參及其技術(shù)參數(shù)

內(nèi)參名稱 分子量大小 適用范圍 beta-actin 43kDa 胞漿和全細胞 GAPDH 30-40kDa 胞漿和全細胞 Tubulin 55kDa 胞漿和全細胞 VCDA1/Porin 31kDa 線粒體 COXIV 16kDa 線粒體 TBP 38kDa 細胞核

第二篇：大討論

唐山市公共交通總公司

關(guān)于開展“解放思想、改革開放、創(chuàng)新驅(qū)動、科學(xué)發(fā)展”

大討論活動的情況匯報

城管局：

根據(jù)市委“大討論”活動的實施方案要求，唐山市公共交通總公司聯(lián)系工作實際，認真開展了大討論活動，努力實現(xiàn)在解放思想上有新進步、在體制上有新突破、在工作上有新作為，確保城市公交與全市發(fā)展大局同步推進。現(xiàn)將我單位在大討論活動中發(fā)現(xiàn)的問題及改進措施匯報如下：

一、具體問題的查找情況

（一）從外部講，公交面臨的問題主要是：

1、新一輪城市發(fā)展帶來的壓力。隨著我市城市快速擴容，城市人口以及機動車出行率的急劇增長，給公交帶來了前所未有的困境。一是公交路權(quán)問題。目前，我市僅在建設(shè)路使用了一條公交專用道，致使我市公交車正常運營得不到保障，難以吸引群眾愿意乘公交、更多的乘公交。二是擴容區(qū)域群眾需求問題。今年，我們已收到人大、政協(xié)有關(guān)開通、延伸公交線路的建議和提案18件，但均存在很大難度。主要原因有：（1）由于現(xiàn)有公交車數(shù)量有限，難以抽調(diào)車輛開通新線路；（2）開通冷辟線路，會給 1

公交帶來更大的政策性虧損；（3）個體班線在城市區(qū)域運營，致使公交線路開通受到阻撓。

2、綜合治理帶來的壓力。社會車輛侵占公交車?？空竞蛨稣镜倪M出口不按規(guī)定停放等現(xiàn)象嚴(yán)重，而公交沒有執(zhí)法權(quán)，對此也是力不從心。

3、缺少履行公益性的政策保障機制。唐山公交自1996年以來，一直嚴(yán)格執(zhí)行政府指定的低票價，較好的履行了社會公益性職責(zé)。因我市至今沒有對公交政策性虧損建立保障機制，雖然自2011年開始實行了定額（非足額）補貼，2013年增加到8000萬元，但仍與履行公益性帶來的政策性虧損有很大差距，致使企業(yè)正常經(jīng)營資金缺口較大，影響了企業(yè)良性發(fā)展。

（二）從內(nèi)部看，公交面臨的問題主要是：

1、公交車保有量不足?，F(xiàn)階段萬人擁有公交車僅為10.37標(biāo)臺（按照2011年統(tǒng)計城市人口197.08萬計算）。按照現(xiàn)有的人口總量計算，距省要求到2015年達到15臺標(biāo)還需凈增加900余量公交車（按照10米車計算）；再有按照《河北省機動車氮氧化合物排放總量減排實施方案》以及我市據(jù)此擬定的實施方案（代擬稿）要求，我市有890車黃標(biāo)車應(yīng)在2015年前淘汰。現(xiàn)階段，我市已高度重視了公交車的更新，但按照每年500輛更新的速度，到2015年仍達不到省要求，難以滿足城市擴容需求。

22、公交場站不健全。我市公交車進場率為62%，與國家要求的90%以上標(biāo)準(zhǔn)差距甚遠，場站缺口為11.9萬平方米。

3、職工隊伍穩(wěn)定的壓力。公交駕駛員工作時間長、壓力大，但收入和福利待遇低，目前，駕駛員的流失現(xiàn)象凸顯，職工隊伍出現(xiàn)了不穩(wěn)定。

二、采取的舉措及解決的問題

通過大討論對問題進行查找、剖析，我們深刻感到企業(yè)發(fā)展還面臨著諸多困難和挑戰(zhàn)，為此，我們采取了以下措施，讓思想更新，讓理念更新，讓舉措創(chuàng)新，將從思想、行為根源上實現(xiàn)嶄新地突破。

（一）加大全員解放思想、更新觀念的力度。

為貫徹落實市領(lǐng)導(dǎo)提出的“建設(shè)具有實力、活力、魅力的沿海強市、美麗唐山”的總體目標(biāo)，我們結(jié)合大討論活動提出了“建設(shè)美麗公交”的具體要求。美麗公交的標(biāo)準(zhǔn)是要具有“好的班子、好的素質(zhì)、好的環(huán)境、好的秩序”。為此，在全公司開展了“建設(shè)美麗公交、打好四個攻堅戰(zhàn)、優(yōu)化公交發(fā)展環(huán)境”的專項整治活動。四個攻堅戰(zhàn)分別是：勞動用工管理攻堅戰(zhàn)、環(huán)境整治攻堅戰(zhàn)、客運秩序整治攻堅戰(zhàn)、安全管理達標(biāo)攻堅戰(zhàn)。我們以此為契機，形成督導(dǎo)檢查的長效管理機制，促進各項工作不斷邁向新臺階。開展了以提升基礎(chǔ)班組的凝聚力、執(zhí)行力、戰(zhàn)斗力和民主決

3策力為目標(biāo)的“基層班組建設(shè)”活動，進一步強化基層班組民主管理、規(guī)范化管理，全面提升員工的整體素質(zhì)。

（二）不斷延伸精細化管理工作。

挖潛增效是公益性企業(yè)做到讓政府放心、百姓滿意的根本所在。今年唐山公交以“務(wù)實創(chuàng)新年”為主題，再次推進了縱向到底、橫向到邊功能更深層次的精細化目標(biāo)預(yù)算責(zé)任管理，系統(tǒng)推進了五大體系建設(shè)，即：為確保公交運營及公共安全，推進了安全管理體系建設(shè)；為確保車輛保持良好狀況，推進了技術(shù)保障體系建設(shè)；為確保文明服務(wù)再上新臺階，推進了行風(fēng)管理體系建設(shè)；為確保員工素質(zhì)提升，推進了員工培訓(xùn)管理體系建設(shè)；為確保企業(yè)綜治、消防安全，推進了安保管理體系建設(shè)。五大體系將實現(xiàn)全面閉環(huán)運行，使企業(yè)精細化管理程度進一步提升。

（三）提高干部隊伍整體素質(zhì)。

一是開展了中層以上干部軍訓(xùn)活動，以軍養(yǎng)德、以軍強身、以軍促智，使干部在身體和思想上得到磨礪。二是按計劃系統(tǒng)、有序的推進干部培訓(xùn)工作，不斷提升干部素養(yǎng)和能力。三是組織中層干部參觀了開元集團，組織各級管理人員拓展視野、找差距。四是在全體機關(guān)干部中開展“轉(zhuǎn)作風(fēng)、樹形象、促發(fā)展、提素質(zhì)”為主題的“下基層、結(jié)對子”活動，幫助基層搞好基礎(chǔ)建設(shè)，通過下基層活動的開展，力求達到“四個促進”，即促進

4我公司基層路隊建設(shè)、促進中層干部素質(zhì)提高、促進基層職工隊伍穩(wěn)定、促進總公司的各項工作任務(wù)的完成。

三、下一步具體措施

下一步，我們針對尚未解決的問題做具體安排如下：

（一）全面落實本重點工作安排。

（二）針對世園會，結(jié)合南湖區(qū)域規(guī)劃，做好公交大客流集散規(guī)劃。

（三）積極與財政、廠家配合推進，盡快落實本500部公交車更新的政府實事工程。

（四）積極探討黃標(biāo)車以外公交車輛的油改氣工作。

（五）在完成OA辦公系統(tǒng)和ERP系統(tǒng)基礎(chǔ)建設(shè)的基礎(chǔ)上，全面推廣實施。

（六）推進智能調(diào)度系統(tǒng)的全面應(yīng)用，取代人工核算。

（七）積極推進公交場站的規(guī)劃和建設(shè)。

（八）進一步學(xué)習(xí)先進企業(yè)管理經(jīng)驗，做好走出去、引進來，提升公交現(xiàn)代化管理程度。

（九）進一步與同行業(yè)做好對標(biāo)定位，查找不足，提升精細化程度。

（十）努力爭取環(huán)保資金、數(shù)據(jù)采集及信息管理平臺課題費、節(jié)水基金、信息服務(wù)系統(tǒng)建設(shè)資金（電子站牌建設(shè)資金）等項目資金的支持，減輕政府財政投入負擔(dān)，為企業(yè)發(fā)展增強后勁。

（十一）拓展思路，積極推進與開灤、唐鋼等大企業(yè)集團在班車托管運營合作，尋求新的經(jīng)濟增長點。

（十二）積極與市規(guī)劃局溝通，本著切合實際、科學(xué)合理的原則，積極推進加氣站建設(shè)，形成供氣網(wǎng)絡(luò)，保障公交加氣，同時減少運行成本。

總之，針對本次活動查擺的問題及不足，唐山公交將以解放思想為先導(dǎo)、以改革開放為動力、以創(chuàng)新驅(qū)動為抓手、以科學(xué)發(fā)展為目標(biāo)，在主管局指導(dǎo)下，以打造“美麗公交”為主題，努力為建設(shè)具有實力、活力、魅力的沿海強市、美麗唐山”做出新的更大的貢獻。

第三篇：大討論

小學(xué)語文教學(xué)中存在的問題、原因以及整改措施

語文課程改革實驗已經(jīng)走過了幾個年頭，語文閱讀教學(xué)也在悄然間發(fā)生了很多可喜的變化。學(xué)生的主體地位得以體現(xiàn)，“以讀代講”的理念得以落實。但是，在欣喜之余我們也發(fā)現(xiàn)，在當(dāng)前的閱讀教學(xué)中仍存在著一些亟待解決的問題。

一、教師教學(xué)拔高要求，教學(xué)繁雜。

小學(xué)語文閱讀教學(xué)倡簡、務(wù)本、求實、有度。教材處理要簡約而不簡單。因此，教師要對教材進行挖掘、梳理、濃縮，從而使課堂教學(xué)內(nèi)容化難為易，以簡馭繁。其次，教師如果瞄準(zhǔn)課文的重點，訓(xùn)練的難點，學(xué)生的疑點，語言發(fā)展的生長點，就可以在一定程度上克服“拔高要求，教學(xué)繁雜”的問題。

二、教師教學(xué)死摳教材或無度拓展。

有些教師認為，凡是教材中出現(xiàn)的內(nèi)容，都是正確的；凡是教材中提到的知識，都是重要的。因此，從字詞句段篇等角度一一出題讓學(xué)生回答，把學(xué)生當(dāng)作規(guī)范答題的機器，不考慮問題的難易度以及學(xué)生回答問題的角度和思路。教材是最重要的、最基本的課程資源，體現(xiàn)了課程目標(biāo)和能力培養(yǎng)的要求，但教材不是給教師樹立一個必須遵從的“權(quán)威”，而是搭建一個創(chuàng)造性勞動的“平臺”。新課程倡導(dǎo)開發(fā)的教材觀，要求教師做教材的主人，成為教材的鑒賞者和開發(fā)者，創(chuàng)造性的使用教材，做到“用教材而不是教教材”。創(chuàng)造性的使用教材是一個優(yōu)秀教師必須具備的基本素養(yǎng)。

三、朗讀指導(dǎo)重技巧，情感體驗不深刻。

當(dāng)前，很多教師都認識到了“以讀代講”的重要性，并努力在閱讀教學(xué)中加以實施。但在實踐過程中，更多的教師將重點放在朗讀技巧的指導(dǎo)上，如重音、停頓、節(jié)奏等，或是籠統(tǒng)地提出朗讀的要求，如“讀得美一些”、“讀出作者??的感情”等。這樣的指導(dǎo)，不能觸及文本的深層，學(xué)生的朗讀只能是飄浮在文字的表面，不能對課文有更加深入的理解，也無法表達自己的真實情感。朗讀技巧的指導(dǎo)是必要的，但重要的是從重點的詞句入手，從學(xué)生的情感體驗著眼，結(jié)合文本的內(nèi)容和語言文字表達的思想感情，通過教師的點撥、引導(dǎo)和啟發(fā)，體會語句暗含的意思，學(xué)生的讀才有根。在實踐中可嘗試以下做法。

讓學(xué)生了解作者以及文本創(chuàng)作的相關(guān)背景資料，拉近學(xué)生與文本之間的距離，讓學(xué)生與文本零距離接觸；借助媒體手段和教師語言等創(chuàng)設(shè)情境甚至再現(xiàn)情境，讓學(xué)生感同身受；開啟學(xué)生想象的大門讓學(xué)生換位體驗。在學(xué)生情感體驗的過程中，教師加以點撥、指導(dǎo)，引領(lǐng)學(xué)生在讀中體會、讀中感悟，達到以讀代講的目的?？傊?，只有用心靈引導(dǎo)心靈誦讀心靈，才能讀出形，讀出意，讀出情，讀出味，讀出神。

四、教師教學(xué)過分依賴教材和備課資料。

在備課時，一些教師大致看看課文，就急于讀教材，甚至照著教參寫教案，搞"教材搬家”。這中間缺少獨立思考，沒有“化”的過程，雖然把教學(xué)要求、教學(xué)步驟方法寫在了自己的教案上，但由于沒有消化，還是人家的，肯定不會收到好的閱讀效果。

五、教師對教材把握不準(zhǔn)、處理不當(dāng)。

仔細分析一些課例，許多課的問題都出在教材的把握和處理上，有文意把握不準(zhǔn)、教材理解有誤、切入點找的不好，缺乏整體把握問題。引導(dǎo)學(xué)生鉆研文本，教師必先鉆研文本，才能幫助學(xué)生提高語文素養(yǎng)。

六、追求形式，浮華空泛

閱讀教學(xué)時常遭遇這樣的尷尬：教師神采飛揚、學(xué)生積極踴躍、教學(xué)進程順利，課后反饋卻很不理想。為什么？環(huán)節(jié)設(shè)計似乎沒什么疏漏，學(xué)生的發(fā)言也都切合文本主題，那么問題出在哪里？

小組討論、多媒體輔助??教學(xué)方式、手段本身無錯，關(guān)鍵在于教師運用是否妥當(dāng)。有的老師過于追求形式，使語文課堂呈現(xiàn)浮躁之氣，其間欠缺了思考——冷靜的、有深度的思考。很多時候?qū)W生沒有充足“讀”（尤其是默讀）的時間，發(fā)言順應(yīng)老師思路，而非自我生成。更直白些講，過分形式化的課堂，使學(xué)生的視覺聽覺不斷受到?jīng)_擊，容易產(chǎn)生思維疲憊。這種情況下，學(xué)生往往是根據(jù)老師的暗示，猜測老師想要什么樣的答案，而不是考慮自己收獲了什么。沒有思考，何來感悟？浮華之下，自然只剩了空泛。

改進措施：

1、要以情感人，引起共鳴。學(xué)生情感發(fā)展容易受到老師語言、神態(tài)的感染，在課堂上教師應(yīng)充分發(fā)揮語言神態(tài)等感召效應(yīng)，引起學(xué)生的情感轉(zhuǎn)移，最終能達到共鳴的學(xué)習(xí)效果。

2、巧設(shè)問題，啟發(fā)討論。如《六個小矮人》一文，這六個小矮人以什么來生活？他們過得幸福嗎？為什么？引導(dǎo)學(xué)生討論，使學(xué)生興趣濃厚，積極思考，大膽展開想象，作出判斷，讓學(xué)生通過這篇課文，得到啟發(fā)：懂得只有靠辛勤的勞動才能獲得幸福的道理。

3、要借助情景，導(dǎo)情入文。即借助生活展現(xiàn)、實物演示、圖畫再現(xiàn)、播放音樂、扮演角色、語言描繪等情境的創(chuàng)設(shè)，來引發(fā)學(xué)生情感的共鳴，豐富學(xué)生的經(jīng)歷和經(jīng)驗，實現(xiàn)知識傳承、能力發(fā)展、態(tài)度和價值觀形成的統(tǒng)一。

4、教師要在閱讀教學(xué)中，想方設(shè)法構(gòu)建學(xué)生自主學(xué)習(xí)的課堂，讓學(xué)生自主選擇喜歡的學(xué)習(xí)方式、閱讀的內(nèi)容、幫助自己解決問題的伙伴；讓學(xué)生自主地進行質(zhì)疑問難，讓學(xué)生自己去提出問題、分析問題、解決問題。這些由學(xué)生自主參與課堂的實踐活動，使學(xué)生能夠通過語文課的學(xué)習(xí)，有可能成為具有生活情趣的文化人。

5、少做或者不做追求形式，浮華空泛的課堂教學(xué)。不盲目進行“精彩賞析”，不顧文本特點，經(jīng)常拋出類似“讀喜歡的段落”的籠統(tǒng)要求，忽略全局，肢解課文，造成閱讀的“斷層”。

總而言之，學(xué)生只有具備了廣泛的閱讀興趣，才會積極主動地去閱讀，才會自主地選擇閱讀材料，不斷擴大自己的閱讀面，增加自己的閱讀量。

公會鎮(zhèn)中心小學(xué)2011年9月

第四篇：大討論

關(guān)于參加“組工論壇——什么是組工干部的黨性”

大討論活動的通知

各鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）黨委：

為認真落實中組部提出的?以‘一迎雙爭’為主題，深化‘講黨性、重品行、作表率’活動?精神要求，結(jié)合正在開展的保持黨的純潔性學(xué)習(xí)教育活動，經(jīng)縣委組織部部務(wù)會議研究，決定在全縣組織系統(tǒng)開展?組工論壇——什么是組工干部的黨性?大討論活動。現(xiàn)將有關(guān)事宜通知如下:

一、參加討論人員：

1、縣委組織部各科（室）負責(zé)人；

2、各鄉(xiāng)鎮(zhèn)黨委確定1名副書記或組織委員。

二、討論時間：

擬定3月13日（星期二）

三、有關(guān)要求：

1、每人登臺發(fā)言時間3—5分鐘，不超過5分鐘；

2、3月12日（星期一）上午前將討論稿發(fā)至whj9637@163.com，不超1000字；

3、討論稿要緊密結(jié)合崗位或工作實際，從一個側(cè)面或角度闡述對?什么是組工干部的黨性?的看法，有觀點，有事例，有理有據(jù)，簡明扼要，不要泛泛而談、空洞說教；

4、參加討論時要脫稿，不要照本宣科；

5、因本次討論要進行現(xiàn)場錄播，參加討論時要注意儀表和著裝。望接知后迅速確定參加討論人員，并積極做好準(zhǔn)備工作，于3月8日（星期四）前將參加討論人員名單上報。具體討論時間及地點另行通知。

中共陵川縣委組織部

2012年3月6日

第五篇：解放思想大討論

中學(xué)“解放思想大討論”活動

專題討論稿

(2018年10月8日)按照《榆中縣教育系統(tǒng)“解放思想大討論”活動實施方案》的要求，自開展解放思想大討論活動以來，按照學(xué)校的統(tǒng)一安排，通過集中學(xué)習(xí)和自學(xué)，對照“七破七立”要求，逐條逐項認真查擺思想觀念方面存在的問題，深入剖析問題根源及原因，認真制定切實可行的整改措施。通過學(xué)習(xí)和討論深刻地認識到這次活動，是解放思想、搶抓機遇、做好本職、奮力趕超的活動?，F(xiàn)就結(jié)合自己的實際，對照“滿、窄、庸、散”等方面進行認真反思擺查，現(xiàn)將個人在思想、紀(jì)律、作風(fēng)和工作中存在的問題與差距，結(jié)合自身實際做以下分析：

一、查找存在的主要問題

（一）學(xué)習(xí)方面

學(xué)習(xí)上存在“懶、滿”等思想。平時只知道干完自己的本職教學(xué)工作，不加強政治、思想理論學(xué)習(xí)，甘于現(xiàn)狀、沒有居安思危的意識，主動性不強，常以時間不足為由放松學(xué)習(xí)，沒有抽、擠時間進行學(xué)習(xí)，比較懈怠。學(xué)習(xí)面有一定局限性，看書主要局限于專業(yè)書籍，對黨的知識、社會知識涉及較少，造成知識面有一定局限性；對青少年身心健康相關(guān)的法律法規(guī)、教學(xué)案例等學(xué)習(xí)不到位。目前，雖了解了不少課堂的管理和教學(xué)方法，但認為自己主動去請求別人以及打聽優(yōu)秀教師從而去聽課的情況不太多，以致有事在實際工作中遇到難一點的知識點和特殊情況時無從下手、運用也不熟練，造成自身素質(zhì)與新形勢下的教育教學(xué)工作不相適應(yīng)。

（二）工作方面

由于新知識涉及面廣，方法多，需要清理的思路多，時有疏忽，產(chǎn)生惰性；有時由于工作量大，很多工作時常同時安排下來，時有不能及時處理，不加班就無法按要求按時完成工作，但思想上有不愿經(jīng)常加班的情緒。工作中思想保守，怕出亂子、怕?lián)?zé)任的思想還比較突出。

（三）自身建設(shè)上有差距。

雖然注重加強了自身素質(zhì)建設(shè)，注重了各種場合嚴(yán)格要求自己、管住自己，但有時也有做不到真正的慎獨，平時沒有注意樹立正確的人生觀、世界觀、權(quán)力觀，全心全意為了學(xué)生意識不太牢固，平時雖然基本做到遵紀(jì)守法，沒有出現(xiàn)違法亂紀(jì)的問題。但有時工作紀(jì)律仍不夠嚴(yán)格，不時會出現(xiàn)遲到的現(xiàn)象，會存在人云亦云的思想。

（四）在創(chuàng)新教學(xué)工作中。

思想不夠解放，觀念陳，更新不到位，工作循規(guī)蹈矩，按部就班，不力求全面發(fā)展，缺乏主動性和創(chuàng)造性，滿足于應(yīng)付本職工作，只求完成任務(wù)，不求精益求精，沒有腳踏實地的用科學(xué)發(fā)展觀的理論去正確研究處理教育教學(xué)中存在的問題。

二、產(chǎn)生問題原因的剖析 深刻剖析自己存在的不足，雖然問題在表面，其實根子在思想。經(jīng)過認真剖析，自己感到主要有以下幾個原因：

（一）在更新教學(xué)方法上有點偷懶，自己學(xué)習(xí)的理論不太符合目前的教學(xué)狀態(tài)以后，沒有積極去尋找新方法。

在平常的教學(xué)中，上級領(lǐng)導(dǎo)機關(guān)，還是學(xué)校部門都會定期組織老師們開展各種類型的公開課及講座，但是在這些公開課有些是別的科目，不能立馬使得自己的教學(xué)水平提高，就不是很認真。對于講座，聽得時候非常的認真，但由于不是很系統(tǒng)，所以能力的提升上還不是全面。所以沒有及時并且很好的指導(dǎo)自己的教學(xué)工作。

（二）對于工作的積極性有所降低。在比較熟悉了解自己的工作以后，有些時候積極性不高，不能更加積極的去探討，研究自己所教的這門課及教學(xué)方法。

（三）工作紀(jì)律有所松懈。有時候會忘記打卡，沒有很好地遵循學(xué)校的規(guī)章制度，并且對于有些材料上交推遲，工作的紀(jì)律性不是很高。

（四）“教育”工作做的不到位。借由自己不是班主任，對教育學(xué)生沒有不遺余力地去付出，有時自己不去管理學(xué)生而是交給班主任，導(dǎo)致自己管理能力不高和與學(xué)生的距離比較遠。

三、存在問題整改措施

解放思想大討論排查問題階段，對個人來說，要用新思想、新觀念重新審視自我，反思自我，解剖自我，讓自己進一步增強責(zé)任感、壓力感，增加自豪感。通過學(xué)習(xí)討論和對照檢查不足，使我更加清醒地認識到自己存在的問題，我決心進一步解放思想、更新觀念，用全新的思想、全新的理念，提高自身素質(zhì)，為個人適應(yīng)安全生產(chǎn)監(jiān)管工作作出自己的努力。

（一）加強學(xué)習(xí)，不僅注重業(yè)務(wù)知識學(xué)習(xí)，而且加強政治理論，不斷增強自身的黨性修養(yǎng)。

通過學(xué)習(xí)，進一步增強服務(wù)意識、公仆意識，樹立正確的世界觀、人生觀、價值觀，發(fā)揚艱苦奮斗的優(yōu)良作風(fēng)，牢固樹立社會主義榮辱觀，提高業(yè)務(wù)能力，為做好優(yōu)秀的教育教學(xué)者打好基礎(chǔ)。

（二）加強服務(wù)，勇于創(chuàng)新。

1.善于總結(jié)工作的得與失，及時發(fā)現(xiàn)存在的問題和不足，不斷提出改進工作效率的新辦法、新思路；2.樹立強烈的自覺意識和責(zé)任意識，牢記全心全意為人民服務(wù)的宗旨，大膽工作；3.始終把學(xué)生的全面發(fā)展放在第一位，發(fā)揮自己的最大效力與學(xué)生溝通，解決學(xué)生學(xué)習(xí)與生活 中遇到的問題與難題。

（三）開展批評與自我批評。

一個人有缺點毛病并不可怕，可怕的是諱疾忌醫(yī)，以致“小疾”拖成“大病”，甚至病入膏肓，不可救藥?！傲妓幙嗫诶诓?，忠言逆耳利于行。”只有經(jīng)常地開展批評和自我批評，虛心地接受批評，才能不斷地改造自我、提高自我、完善自我。

（四）求實效，優(yōu)化工作。要創(chuàng)造一個好的局面不容易，在一個比較高的起點上鞏固保持、甚至謀求新的發(fā)展就更難。所以要想謀取新的進步，必須時刻保持高昂的斗志和頑強的進取精神，在務(wù)求實效上下功夫，時時處處嚴(yán)格要求自己，時時自重、自省、自警、自制、自律，增強防腐拒變的能力，適應(yīng)社會，適應(yīng)安全監(jiān)管工作。