第一篇：《分子生物學與基因工程》課程論文

植物基因工程研究進展

摘要：自1983年美國人首先成功地獲得抗卡那霉素的煙草再生植株開始，人類就開始了植物基因工程的研究。至今已在逾200種植物中成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株,并有近1000例轉(zhuǎn)基因植物獲準進行田間試驗,更有十余種轉(zhuǎn)基因植物(如轉(zhuǎn)基因棉花.大豆)已進入商業(yè)化種植.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品已進入人們?nèi)粘Ｉ?。植物基因工程的應用已進入蓬勃發(fā)展階段。下面是我從植物基因工程改善生物質(zhì)能利用的研究進展做一說明。

關鍵詞：木質(zhì)纖維素 細胞壁 水解酶

近幾年來全世界對能源的需求量急劇增加加速了對有限的不可再生礦物質(zhì) 能源的消耗資源的利用也增加了CO2及粉塵的排放,造成環(huán)境破壞和全球氣候變 化[1]可再生的清潔的生物質(zhì)能成為人們關注的熱點。其中的燃料乙醇工業(yè),近年來在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的發(fā)展,我國也大力支持發(fā)酵乙醇用作能源[2]。目前,絕大部分乙醇來源于玉米淀粉發(fā)酵生產(chǎn)。但是由于淀粉本身又作為食品和飼料,產(chǎn)量有限,成本較高,阻礙了乙醇工業(yè)的發(fā)展。于是,人們把注意力轉(zhuǎn)移到谷物秸稈等廉價 的含有大量 的木質(zhì) 纖維素 的生物質(zhì) 材料上希望 能夠被 充分利用 [3]。但由于木質(zhì)纖維素本身難以分解,許多研究利用 基 因工程 方法 改善植物,使自生產(chǎn)生的多糖資源更利于降解,用于發(fā)酵產(chǎn)乙醇。1.木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇發(fā)展現(xiàn)狀

在中國,大約每年會產(chǎn)生10t億農(nóng)林業(yè)廢棄物這些資源用于造紙、紡織或者直接作為燃料這些占到很少一部分。絕大部分被廢棄了木質(zhì)纖維素是光合作用的基本產(chǎn)物 , 也是生物圈產(chǎn)生的最充足的可再 生生物資源被認為是地球上最豐富的生物高分子聚合[4]。

大部分的高等植物細胞壁由膠聯(lián)多糖、糖蛋白和木質(zhì)素組成雙 子 葉植物 , 如擬南芥等,細胞壁多糖主要有三種:纖維素半、纖維素和果膠質(zhì),包埋在非 纖 維多糖基質(zhì)(半纖維素和果膠)中的纖維素網(wǎng)絡,與木質(zhì)素和結(jié)構(gòu)蛋白共同構(gòu)成植物細胞壁的聚合液晶結(jié)構(gòu)[5]天然狀態(tài)下由于木質(zhì)素的保護作用,阻礙了水解 纖維素酶與纖維素的接觸并發(fā)揮作用,成為影響纖維素水解的重要因素 [3, 4]。YangB等人發(fā)酵降解實驗證明,雖然半纖維素對纖維素。也有一定保護作用 , 但木質(zhì)素的去除對于纖維素有效降解是最關鍵的[6]。一般對木質(zhì)纖維素材料 的利用,首先要進行粉碎,然后預處理(酸堿處理等),最后 添 加 微 生物 來源 的纖維素復合水解酶類,使之與處理過的木質(zhì)纖維充分接觸,將其降解為單糖 , 從而用于乙醇發(fā)酵?，F(xiàn)在雖然前期的粉碎和預處理工藝研究取得了很大進展但成本仍然較高，而且后期發(fā)酵分解處理。要添加來源于微生物的纖維素水解復合酶,價格仍十分昂貴[7]。這些因素導致目前用木質(zhì)纖維素作為這些因素 導致 目前用木質(zhì)纖維素作為原料發(fā)酵產(chǎn)乙醇,成本較高發(fā)展緩慢因此,現(xiàn)在對木質(zhì)纖維素進行高效降解使用,仍然是個很大的難題。2.植物基因工程與植物木質(zhì)纖維素利用

近年來隨著生物技術的不斷進步,人們開始嘗試利用植物基因工程方法來 解決植物木質(zhì)纖維素有效利用問題研究主要集中在改善植物細胞壁木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)和含量比例等方面,使植物多糖資源利于降解使用，或者利用植物作為生物反應器,在植物內(nèi)表達微生物來源的強活性纖維素降解酶,使植物自身表達高活性纖維素水解 酶類等研究。2.1 改善植物細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成

過去幾十年的研究,改善木質(zhì)素含量及細胞壁已成為可能。利用基 因工程方法,控制植物內(nèi)木質(zhì)素合成相關基因的表達,可以改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和含量木質(zhì)素對纖維素形成的保護作用是導致 纖維素資源利用 的主要障礙,降低木質(zhì)素含量或改變其結(jié)構(gòu),將利于纖維素 的分解[8]。雖然植物體木質(zhì)素的合成過程還不是十分清楚,但近幾年的研究,已使大量降低木質(zhì)素含量成為可能。

在玉米和苜蓿的研究中發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素合成單體之一的芥子醇, 其前體的甲基化合成酶基因COMT(caffeate/5-hydroxyferulate O-methyltransferase),如果被抑制表達,芥子單體含量會明顯減少,可導致木質(zhì)素含量降低 [9, 10]但是在楊樹中抑制這種酶的表達卻不能夠改善材質(zhì),木質(zhì)素含量反而增加[11]。Li L等人在楊樹中研究發(fā)現(xiàn),通過反義表達4CL基因(4-coumarate-CoA ligase)時,木質(zhì)素含量了減少了約40%,并且導致10%的纖維素含量的增加，如果正義表達控制木質(zhì)素組成單體紫丁香基丙 烷(syringyl)和愈瘡木基丙烷(guaiacyl)比率的CAld5H基因(Coniferaldehyde 5-hydroxylase),可導致紫丁香基丙烷的量明顯增 高,但木質(zhì)素含量沒有變化[12]。當兩基因同時轉(zhuǎn)化時,木質(zhì)素含量減少可達53%,紫丁香基丙烷含量進一步增加,而纖維素含量能夠增加30%。Cano-Delgado A等人研究擬南芥CESA3突變體發(fā)現(xiàn),纖維素合成酶受損時,導致了木質(zhì)素大量合成[13]這表明在植物木質(zhì)部細胞中可能存在一種調(diào)控機制,當木質(zhì)素含量減少時,為了維持支撐作用,纖維素含量會相應增加。Chabannes M等人在煙草中研究發(fā)現(xiàn),同時抑制CCR(Cinnamoyl CoA reductase)和 CAD(Cinnamyl alcohol dehydrogenase)的表達,可大量減少木質(zhì)素含量,但非預期 的還引起了細胞壁多糖酚類物質(zhì)及可溶性酚類物質(zhì)含量的變化[14]等人在番茄中抑制表達木質(zhì)素合成相關的CCR基因,導致木質(zhì)素含量降低,同時與木質(zhì)素形成具有共同前體的酚類復合物增加[15]。Boudet AM等人通過抑制楊樹木質(zhì)素合成酶基因CCR,可導致植物細胞壁纖維 素成分更容易被纖維素分解菌Clostridium產(chǎn)糖量達到原來的2倍[16]這表明,降低木質(zhì)素等物質(zhì)含量后,非常利于纖維資源的利用。Li Y等人研究發(fā)現(xiàn),過氧化酶影響了木質(zhì)化過程[17]。Blee KA等人在煙草中反義抑制過氧化酶FBP1(French bean cationic peroxidase)同系物表達,在不影響植物生長發(fā)育的情況下,使木質(zhì)素含量降低了40%~50% [18]。通過基因工程方法,改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)與含量的方法改善植物細胞壁結(jié)構(gòu),利于作為能源植物,具有重要的研究價值。

2.2 植物體內(nèi)表達木質(zhì)纖維素水解酶

過去幾十年的發(fā)展,植物已成功的作為重組蛋白表達的生物反應器,它相對于微生物和動物表達的優(yōu)勢是具有較低的成本已在多種植物里面進行了異源重組蛋白的表達研究(如疫苗和工業(yè)用酶等),蛋白表達量高且保持了很好的生物學活性[19]。近幾年,人們開始在植物體內(nèi)進行微生物來源的研究,希望這些植物作為生物反應器,大量表達并在細胞內(nèi)積累纖維素酶。收獲的植物,經(jīng)過粉碎和預處理(酸堿處理等)后,在分解過程中能利用自身表達的酶,不添加加來源于微生物的酶,就可以將纖維素充分分解為單糖, 進一步用于生產(chǎn)乙醇,降低生產(chǎn)成本(Sticklen M,2006)[20]?？紤]到細胞質(zhì)表達對植物生長影響較大,一般采用定向胞外或細胞器積累表達（如定向質(zhì)外體葉綠體溶酶體等）Ziegler MT等人在擬南芥中,定向質(zhì)外體,積累表達了來源于Acidothermus cellulolyticus的耐熱內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶(Endo-1,4-β-glucanase),表達量約達到葉子總可溶性蛋白的26%,并且保持了很好的活性[21]，同樣是在擬南芥中,Hyunjong B等人定向葉綠體和過氧化酶體,積累表達來源于Trichoderma reesei的木聚糖酶(Xylase),達到了總可溶性蛋白的4.6%,明顯 高于細胞質(zhì)表達和單一細胞器定向表達[22]在煙草中Dai Z等人定向葉綠體,積累表達了A.cellulolyticu 的耐熱內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶,達到總可溶性蛋白的1.35%[23]。Dai Z等人采用同樣的酶,比較了定向不同細胞器積累表達的差異,發(fā)現(xiàn)定向質(zhì)外體表達蛋 白量最高,且保持了較好的活性[24]。在其它的植物中,也進行了相關的研究, Xue GP等人在大麥的胚乳中,特異表達來源于Neocallimastix patriciarum 的內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶,約達到了總種子蛋白的1.5%[25]。Oraby H 等人在水稻中,定向質(zhì)外體積累表達了A.cellulolyticu耐熱內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶,達到了葉子總可溶性蛋白的 4.9%。

目前的研究集中于將植物作為生物反應器,盡可能多的表達并積累纖維素酶,用于后期的處理。在發(fā)酵分解過程可以利用植物自身表達的異源纖維素水解酶,節(jié)省了額外添加酶的量。表達 的大都是內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶或木聚糖酶,為了預處理后還 能保持較好活性,多采用穩(wěn)定性強的耐高溫酶。由于纖維素有效降解需要復合水解酶,并且木質(zhì)素對其具有很強的保護作用,這些植物不會發(fā)生自身降解。3.前景與展望

利用不斷發(fā)展的植物基因工程技術,在能源植物研究方面已經(jīng)取得了不錯的研究進展。但是,目前要實現(xiàn)廉價充分的利用纖維資源,還有一定的困難。通過對植物細胞壁合成 代謝研究的不斷深入,應該能夠獲得對自身生長發(fā)育不影響的低木質(zhì)素植物細胞壁木質(zhì)素結(jié)構(gòu)及含量改善纖維素含量增加,利于降解發(fā)酵產(chǎn)乙醇。還希望最終能夠獲得一種能源植物,這種植物通過自身表達異源的高活性木質(zhì)纖維水解復合酶,酶的表達受到誘導調(diào)控,收獲前誘導表達,收獲后送往生物能源發(fā)酵工廠。這期間,木質(zhì)纖維素多糖在植物體內(nèi)也可進行持續(xù)降解,在發(fā)酵工廠只需添加一些簡單的輔助分解酶就可以徹底降解掉,使木質(zhì)纖維資源產(chǎn)乙醇變得十分簡單 參 考 文 獻: 1.Dorian JP, Franssen HT, Simbeck DR.Energy Policy, 2006, 34 : 1984~1991.2.Yang B, Lu Y.J Chem Technol Biotechnol, 2007, 82 : 6~10.3.Himmel ME, et al.Science, 2007, 315 : 804~807.4.Ding SY, Himmel ME.J Agric Food Chem, 2006, 54(3): 597~606.5.Cosgrove DJ.Nat Rev Mol Cell Biol 2005 6 11 850~861.6.Yang B Wyman CE.Biotechnol Bioeng 2004 86 1 88~95.7.Kabel MA, et al.Biotechnol Bioeng, 2005, 93 : 56~63.8.Ragauskas AJ, et al.Science, 2006, 311 :484~489.9.Piquemal J et al.Plant Physiol 2002 130 4 1675~1685.10.Guo D et al.Transgenic Res 2001 10 5 457~464.11.Pilate G et al.Nat Biotechnol 2002 20 6 607~612.12.Li L et al.Proc Natl Acad Sci USA 2003 100 8 4939~4944.13.Cano Delgado A, et al.Plant J, 2003, 34(3): 351~362.14.Chabannes M et al.Plant J 2001 28 3 257~270.15.van der Rest B et al.J Exp Bot 2006 57 6 1399~1411.16.Boudet AM Kajita S Grima Pettenati J et al.Trends Plant Sci2003 8 12 576~581.17.Li Y et al.J Plant Res 2003 116 3 175~182.18.Blee KA, et al.Phytochemistry, 2003, 64(1): 163~176.19.Streatfield SJ.Plant Biotechnol J 2007 5 1 2~15.20.Sticklen M.Curr Opin Biotechnol 2006 17 3 315~319.21.Ziegler MT, Thomas SR, Danna KJ.Mol Breed, 2000, 6 : 37~46.22.Hyunjong B, Lee DS, Hwang I.J Exp Bot, 2006, 57 : 161~169.23.Dai Z, Hooker BS, Anderson DB, et al.Transgenic Res, 2000, 9(1):43~54.24.Dai Z, et al.Transgenic Res, 2005, 14(5): 627~643.25.Xue GP et al.Plant Cell Rep 2003 21 11 1088~1094.

第二篇：分子生物學與基因工程結(jié)課論文

《分子生物學與基因工程》

結(jié)課論文

Real-Time PCR在分子生物學中的應用

姓

名：XXX 學

號：AXXXXXXX 院

系：生命科學學院 班

級：生科XXX班 任課教師：XXX

二零一二年十二月 Real-Time PCR在分子生物學中的應用

XXX XXX大學生命科學學院 黑龍江哈爾濱 150xxx

摘 要：聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）可對特定基因進行擴增，因此被廣泛應用于分子生物學領域中獲取特定基因或基因片段。定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術，即實時定量PCR（real-time quantitative PCR）。該技術實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等特點，目前實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域，成為了分子生物學研究中的重要工具。關鍵詞：實時定量PCR；基因擴增；分子生物學

1971年Khorana等最早提出PCR理論：―DNA變性解鏈后與相應引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，重復該過程便可克隆tRNA 基因‖。因當時基因序列分析方法尚未成熟、熱穩(wěn)定DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)及寡聚核苷酸引物合成仍處于手工和半自動階段，核酸體外擴增設想似乎不切實際，且Smith等已發(fā)現(xiàn)了DNA限制性內(nèi)切酶，使體外克隆基因成為可能，Khorana 等的早期設想被忽視。1985年Mullis等用大腸桿菌DNA聚合酶 ⅠKlenow片段體外擴增哺乳動物單拷貝基因成功以及1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR，使擴增反應的特異性和效率大大提高，并簡化了操作程序,最終實現(xiàn)了DNA擴增的自動化，迅速推動了PCR的應用和普及。

自從PCR技術問世便很快成為科研、臨床診斷的熱點技術。但是傳統(tǒng)PCR技術在應用中一是不能準確定量，二是容易交叉污染，產(chǎn)生假陽性。直到1996年由美國Applied Biosystems公司推出的實時熒光定量PCR技術，上述問題才得到較好的解決[1]。實時熒光定量PCR（real-time fluoro-genetic quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）是通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR反應中，引入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。該技術不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性強、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領域[2]。

1.實時熒光定量PCR技術概述

1.1 實時熒光定量PCR原理

1992年Higuchi等首次提出了采用動態(tài)PCR方法和封閉式檢測方式對目的核酸數(shù)量進行定量分析，熒光探針技術是基于標記基團的FRET原理而實現(xiàn)的，當某個熒光基團的發(fā)射譜與另一個熒光基團的吸收光譜重疊，且兩個基團距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到長波長（低能量）的熒光基團，相當于短波長熒光基團釋放的熒光被屏蔽，這個過程稱為FRET。在探針5’端標記一個報告基團（R），在3’端標記一個淬滅基團（quencher，Q），兩者距離很近時（7-10nm），報告基團發(fā)出的熒光能被淬滅基團所吸收，并依賴其較高的S/N比值（信-噪比, signal-to-noise ratio）和良好的辨別能力進行定量檢測。

熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般將熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（threshold value）。CT值與起始模板的關系研究表明，每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。[4][3]1.2 常用實時熒光定量PCR分類

1.2.1 實時熒光定量PCR熒光染料法

實時熒光定量PCR熒光染料法包括非飽和染料SYBR Green法和飽和染料LC Green法[5]。非飽和染料SYBR Green染料法定量成本低，方法簡便，不需要設計探針，但是特異性低。熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，使實驗容易產(chǎn)生假陽性信號。引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線（melting curve）分析的軟件加以解決。飽和染料LC Green法與SYBR染料法工作原理是一樣的，但與傳統(tǒng)的熒光染料SYBR Green相比有如下優(yōu)點：LC Green染料在進行PCR 時可以以飽和的濃度加入，不會抑制PCR反應，而Sybr Green 染料濃度過高會抑制PCR反應。從而，利用LC Green染料可以進行高分辨率熔解曲線分析。在進行HRM分析時，由于飽和染料占據(jù)了DNA雙鏈上每一對堿基上的空位，所以在雙鏈解鏈時，染料立即與雙鏈脫離，使得熒光信號發(fā)生較大的變化，而非飽和染料常發(fā)生位置上的遷移，從而對熒光信號沒有大的影響。除LC Green染料外，常用的染料還有Reso Light、Ever Green等，這些都是綠色熒光染料，最佳激發(fā)波長范圍440-470nm，發(fā)射熒光波長470-520nm。

1.2.1 實時熒光定量PCR探針法

實時熒光定量PCR寡核苷酸探針法包括TaqMan探針法和TaqMan-MGB探針法。TaqMan 探針法技術原理是利用Taq酶的5’—3’外切酶活性，在傳統(tǒng)PCR技術一對特異性引物的基礎上增加了一條熒光雙標記探針。該探針可與上、下游引物之間的DNA模板序列特異性結(jié)合。探針的5’端標以熒光報告基團，3’端標以熒光淬滅基團。在PCR退火復性期，探針與DNA模板特異性結(jié)合。在PCR延伸階段，Taq酶在引物的引導下，沿著模板合成新鏈，當移動至探針結(jié)合的位置時便發(fā)揮其5’—3’外切酶活性將探針降解成單核苷酸，使得熒光報告基團與淬滅基團分離，前者的熒光信號釋放并被檢測。因此，每合成一條新鏈就有一個探針被裂解并釋放出一個熒光信號。熒光信號強度與PCR產(chǎn)物量相對應。

MGB探針與傳統(tǒng)的TaqMan探針比較，有很大的優(yōu)勢。它可以使探針的長度縮短，尤其對AT含量高的序列的 MGB探針的設計有很大的幫助；同時可以提高配對與非配對模板間的Tm值差異； 由于在探針的3’端的Quencher基團為不發(fā)光的熒光基團，并且與Report基團在空間的位置更接近，使雜交的穩(wěn)定性大大提高，實驗的結(jié)果更精確，分辨率更高，可 以進行SNP分析。MGB探針實驗步驟簡單，使雜交的重復性大大提高。

1.3 實時熒光定量PCR定量方法

在實時熒光PCR中，模板的定量有兩種方法：絕對定量和相對定量。絕對定量指用已知的標準曲線來推算未知的樣本量；相對定量指在一定樣品中靶序列相對于另一參照序列的量的變化。由于每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，利用已知起始DNA濃度的標準品可做出標準曲線。

1.3.1 絕對定量法

該方法是利用標準品作一條標準曲線，通過標準曲線對樣本進行定量。絕對定量標準品一般是用質(zhì)粒DNA或是PCR擴增產(chǎn)物等制備的。標準品的量根據(jù)260nm的吸光度值計算得出。由于樣本的濃度完全是通過標準曲線來確定，所以合適的標準品是定量準確的關鍵。一方面標準品與未知樣本應具有一致的擴增效率，另一方面標準品的定量必須準確。這就要求標準品的擴增序列與樣本完全一致，制備的標準品純度要高，不應含有影響定量的因素如Dnase、標準品與未知樣本各自反應體系內(nèi)的干擾因素要一致等。該方法的優(yōu)點就是測定范圍很廣（10～1010拷貝），結(jié)果可直接通過軟件得出，不需額外計算。1.3.2 相對定量法

相相對定量是指在測定目的基因的同時測定某一內(nèi)源性管家基因，該管家基因主要是用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較、反映反應體系內(nèi)是否存在PCR擴增的影響因素，通常選用的管家基因有GAPDH、β-2微球蛋白和rRNA。使用的β-actin、相對定量較為早期的方法是用一系列已知外參物做標準曲線，根據(jù)該標準曲線得到目的基因和管家基因的量，再將目的基因同管家基因的比值作為定量的最后結(jié)果。此種方法計算出未知樣品的量是相對于某個參照物的量而言，因此，相對定量的標準曲線比較容易制備，對于所用的標準品只需知道其稀釋度即可。在整個試驗中，待測樣品的量來自于標準曲線，最終必須除以參照基因的量，即參照基因是1×的樣本，其他的樣本為參照基因的n倍。由于管家基因在各種組織中的恒定表達，所以可用管家基因的量來作為標準，以比較來源不同的樣本，目的基因表達量的差異，此即相對定量。這一方法的缺陷是要求外參、目的基因和管家基因的擴增效率一致；此外加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標相當于是進行雙重PCR反應，存在兩種模板相互的干擾和競爭[7]。

1.3.3 相對定量反應循環(huán)值（Ct）比較法

[6]即ΔCT值法，該方法是同時擴增待測靶基因片段和一個作為內(nèi)參照的基因片段，一般是一個內(nèi)源性管家基因片段。這兩個擴增反應可在2管中分別進行，也可在同一反應管中進行，測得兩者的CT值之差，即ΔCT。該方法不需要標準曲線。它是根據(jù)PCR擴增反應的原理，假設每個循環(huán)增加倍的產(chǎn)物數(shù)量PCR反應的指數(shù)期得到擴增產(chǎn)物的值來反映起始模板的量通過數(shù)學公式來計算相對量。比較Ct法與標準曲線法的相對定量的不同之處在于其運用了數(shù)學公式來計算相對量，前提是假設每個循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量，在PCR反應的指數(shù)期得到Ct值來反應起始模板的量，一個循環(huán)（Ct=1）的不同相當于起始模板數(shù)2倍的差異。比較不同待測標本DNA的ΔCT值與正常標本DNA的ΔCT值的變化，即可對未知標本靶基因的原始拷貝數(shù)作出判斷，從而對病理狀態(tài)進行判斷或診斷。但是此方法是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴增效率基本一致為前提的，效率的偏移將影響實際拷貝數(shù)的估計[8]。最終結(jié)果也是靶序列和參考品的相對比值。該方法需確定靶序列和參考品的擴增效率是否一致；如不一致，則會影響結(jié)果的準確性。

2.實時熒光定量PCR技術的應用

實時定量PCR的應用非常廣泛。在科研方面，可定量分析各種基因的表達[ 9 ]、分析基因變和多態(tài)性[ 10 ]、分析細胞因子的表達

[ 11 ]、單核苷酸多態(tài)性（SNP）

[ 12 ]

測定及易位基因的檢測

[ 15 ]

[ 13 ]

等；在醫(yī)療方面，可用于免疫組分分析

[ 14 ]、臨床疾病早期診斷、病原體檢測、耐藥性分析

[ 16 ]、腫瘤研究[ 17 ]和微小殘留病變（MRD）[ 18 ]檢測等。

以下就其在基因工程研究、病原體的檢測和腫瘤分子診斷等方面的應用及其新進展作一簡述。2.1 基因工程研究領域

實時熒光定量技術的出現(xiàn)不僅加強了有關對基因的量的研究方法，而且也加強了對基因的質(zhì)所發(fā)生變化的研究。它可以檢測基因突變和基因組的不穩(wěn)定性，已經(jīng)被廣泛應用于遺傳分析[19]。

2.1.1

基因表達研究

由不同的熒光報告基團標記的探針分別與野生型和突變基因雜交，探針雜交的效率和其后的切除與雜交有關。如果一種染料的熒光信號明顯強于另一種，說明它是一個純合子，如果熒光信號都增加則表明是一個雜合子。從使用范圍來看，它能用于檢測已知基因序列的任何遺傳病基因的突變和缺失及表達量的異常，從靈敏度方面看，它能從單細胞進行特異基因擴增，實現(xiàn)植入前基因診斷。PCR技術還可用于端粒酶的檢測。使用雙色熒光標記探針，結(jié)合不同的引物設計，可以實現(xiàn)對某些先天性疾病的定量檢測。應用實時熒光定量PCR方法對β地中海貧血癥（β地貧）患者β與γ球蛋白mRNA水平進行檢測，其結(jié)果特異性強、定量準確，為了解β地貧的分子病理機制及其臨床診斷提供了可靠的檢測數(shù)據(jù)。迄今對遺傳性物質(zhì)改變引起的疾病還無法根治，只能通過產(chǎn)前監(jiān)測和產(chǎn)前基因診斷，減少病嬰出生[20]

。因此，實時熒光定量PCR方法可用于產(chǎn)前監(jiān)測和產(chǎn)前基因診斷。

2.1.2

單核苷酸多態(tài)性（SNP）及突變分析

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。實時熒光定量PCR一個誘人的應用前景是用于檢測基因突變和基因組的不穩(wěn)定性[21]?；蛲蛔兊臋z測基于兩條探針，一條探針橫跨突變位點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團標記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對，如有突變，則探針與靶序列不完全配對，會降低雜交體的穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對突變和多態(tài)性進行分析。

2.1.3

轉(zhuǎn)基因研究

Tesson等確定了實時定量PCR的技術條件，利用兩種發(fā)光探針及適當?shù)难h(huán)域值，擴增一個轉(zhuǎn)移后的基因和一個對照基因，以分析轉(zhuǎn)基因鼠的接合性[22]。同型結(jié)合的和異質(zhì)接合的動物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律，通過實時定量PCR檢測，該方法為轉(zhuǎn)基因動物的同型結(jié)合及異質(zhì)接合提供了明確的鑒定結(jié)果。這項技術在轉(zhuǎn)基因動物繁育及基因劑量功能效應實驗中將有很大用途。

2.2 腫瘤的分子診斷

腫瘤的本質(zhì)是細胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實時熒光定量PCR方法都可以檢測出來。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病ER基因、腫瘤MDR1基因等，盡管腫瘤發(fā)病的分子機制尚未完全闡明，但相關基因的遺傳學改變的積累是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因之一已得到普遍承認[23]。癌基因的突變和表達增加，在許多腫瘤早期就出現(xiàn)。實時熒光PCR技術不僅能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。如定量結(jié)直腸癌淋巴結(jié)的癌胚抗原(CEA)mRNA的表達量，可作為診斷癌癥微轉(zhuǎn)移的重要依據(jù)[24]。目前，腫瘤患者的生存期已有所延長，但是緩解期的患者仍存在復發(fā)的危險，因此，微小殘留病變的檢測對于進一步調(diào)整治療方案至關重要。實時熒光PCR技術正成為檢測腫瘤微小殘留分子標志的一種必備工具[25]。Eckert等提出采用實時熒光PCR技術檢測兒童急性淋巴細胞白血病微殘留病灶，對兒童急性白血病的治療有重要指導意義。

2.3 病原體的分子檢測

目前，用此方法還進行了對人類結(jié)核桿菌、免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、巨細胞病毒、EB病毒等病原體的檢測[26]。同樣在國內(nèi)，2004年針對SARS流行性病的檢測和診斷使得熒光定量PCR技術得以應用和發(fā)展。熒光定量PCR問世后的幾年中，積累了大量有關病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預后之間關系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標準。目前, 實時熒光PCR技術已應用于肝病、性病以及人類免疫缺陷病毒（HIV）等各種病原體的臨床診斷，為實現(xiàn)快速準確診斷提供了有效的檢測方法。

3.小結(jié)

時熒光定量PCR與其他一些技術的結(jié)合應用，是今后發(fā)展的方向，如與高級微型解剖技術結(jié)合后，能提高形態(tài)學損傷所至低水平擴增的檢測能力[ 27 ]、可定量分析石蠟包埋儲存樣本中的核酸[ 28]及少量細胞中的全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[ 29 ]等。此外，微陣列實驗中所選基因表達水平的測定仍需使用實時PCR技術[ 30 ,31 ]，利用該技術還可使等位基因特異表達分析以及生化武器證據(jù)甄別成為可能。

通過設計針對目的基因的特異性引物和探針，并優(yōu)化反應體系和反應循環(huán)參數(shù)，已成功地建立了快速、靈敏、特異的Q-PCR檢測方法?？蓪崿F(xiàn)大量樣本同時檢測，并節(jié)省大量試驗時間和反應成本，為基因定量檢測和準確定量疾病相關基因的表達提供了有效的技術手段；同時實現(xiàn)對人類和動物疾病的早期診斷與基因分期、分型，以及對人類腫瘤轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)及預后判斷[32]。因此Q-PCR技術將成為未來分子生物學實驗室必備的研究工具，在臨床上將有更加廣闊的應用前景。

參考文獻：

[1] Clegg RM.Fluorescence resonance energy transfer.Curr Opin Biotechnol, 1995, 6(1):103-110 [2] Mikael KA, Jose MA, Martin B, et al.The real-time polymerase chain reaction.Molecular Aspects of Medicine, 2006, 27: 95–125 [3] Walsh PS, Erlich H A, Higuchi R.Preferential PCR amplification of alleles: mechanisms and solutions.Genome Res.1992, 1:241-250 [4] 歐陽松應, 楊冬, 歐陽紅生, 馬鶴雯.實時熒光定量PCR技術及其應用.生命的化學, 2004, 24(1):74-76 [5] Bengtsson M, Karlsson HJ, Westman G, et a1.A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter dye for real-time PCR.Nucleic Acids Res, 2003, 31(8):e45 [6] Galbiati S, Smid M, Gambini D, et al.Fetal DNA detection in maternal plasma throughout gestation.Hum Genet, 2005, 117(2-3): 243-248 [7] Robert M W, Stella L, Michael G, et al.Measurement of Epstein barr virus DNA loads in whole blood and plasma by TaqMan PCR and in peripheral blood lymphocytes by competitive PCR.J Clin Microbiol, 2003, 41 : 5245-5249 [8] Magnus L, Charles H.Dynamic range and reproducibility of hepatitis B virus(HBV)DNA detection and quantification by cobas Taqman HBV, a real-time semiautomated assay.J Clin Microbiol, 2005, 43: 4251-4254 [9] Hirayama Y , Sakamaki S, Matsunaga T, et al.Concentrations of thrombopoietin in bone marrow in normal subjects and in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura, aplastic anemia, and essential thrombocythemia correlate with its mRNA expression of bone marrow stromal cells.Blood, 1998, 92(1):46-52 [10] Kyger EM, Krevolin MD, Powell MJ.Detection of the hereditary hemochromatosis gene mutation by real-time fluorescence polymerase chain reaction and peptide nucleic acid clamping.Anal Biochem, 1998, 260(2):142-148 [11] Ueda M, Imada K, Imura A, et al.Expression of functional interleukin-21 receptor on adult T-cell leukaemia cells.Br J Haematol, 2005, 128(2):169-176 [12] Johnson VJ, Yucesoy B, Luster MI.Genotyping of single nucleotide polymorphisms in cytokine genes using real-time PCR allelic discrimination technology.Cytokine, 2004, 27(6):135-141 [13] Taube T, Eckert C, Korner G ,et al.Real-time quantification of TELAML1 fusion transcripts for MRD detection in relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia.Comparison with antigen receptor-based MRD quantification methods.Leuk Res, 2004, 28(7):699-706 [14] Lang R, Pfeffer K, Wagner H, et al.A rapid method for semiquantitative analysis of the human V beta-repertoire using TaqManR PCR.J Immunol Methods, 1997, 203(2):181-192 [15] Swan DC, Tucker RA, Holloway BP, et al.A sensitive, type-specific, fluorogenic probe assay for detection of human papillomavirus DNA.J Clin Microbiol, 1997, 35(4):886-891 [16] Piatek AS, Tyagi S, Pol AC, et al.Molecular beacon sequence analysis for detecting drug resistance in Mycobacterium tuberculosis.Nat Biotechnol, 1998, 16(4): 359-363 [17] Cheung IY, Cheung NK.Quantitation of marrow disease in neuroblastoma by real-time reverse transcription-PCR.Clin Cancer Res, 2001, 7(6):1698-1705 [18] van der Velden VH, Boeckx N, van Wering ER, et al.Detection of minimal residual disease in acute leukemia.J Biol Regul Homeost Agents, 2004, 18(2):146-154 [19] Hwa HL, Ko TM, Yen ML, et al.Fetal gender determination using real-time quantitative polymerase chain reaction analysis of maternal plasma.J Formos Med As-soc, 2004, 103(5)：364-368 [20] UenoH, Yoshida K, Hirai T.Quantitative detection of carcinoembryonic antigen messenger RNA in the peritoneal cavity of gastric cancer patients by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction.Anticancer Res, 2003, 23(2C):1701-1708 [21] Nieuwenhuis EJ , Jaspars LH, Castelijns JA, et al.Quantitative molecular detection of minimal residual head and neck cancer in lymph node aspirates.Clin Cancer Res, 2003, 9(2):755-761 [22] Liew M, Pryor R, Palais R, et al.Genotyping of single nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.Clin Chem, 2004, 50(7):1156-1164 [23] Piet A, van Rijn, Gerard JW, et al.Detectionof economically important viruses in boar semen by quantitative Real Time PCR technology.Journal of Virologica1 Methods, 2004, 120:151-160 [24] Andersen CL, Jensen JL, Orntoft TF.Normalisation of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalisation, applied to bladder and coloncancer data sets.Cancer Res, 2004, 64:5245-5250 [25] Pont-Kingdon G, Lyon E.Direct molecular haplotyping by melting curve analysis of hybridization probes: beta2-adrenergic receptor hapotypes as an example.Nucleic AcidsRes, 2005, 33:89

[26] Janet Barletta.Applications of real-time immuno-polymerase chain reaction(rt-IPCR)for the rapid diagnoses of viral antigens and pathologic proteins.Molecular Aspects of Medicine, 2006, 27:224-253 [27] Glockner S, Lehmann U, Wilke N, et al.Detection of gene amplification in intraductal and infiltrating breast cancer by laser-assisted microdissection and quantitative real-time PCR.Pathobiology, 2000, 68(4-5):173-179 [28] Specht K, Richter T, Muller U, et al.Quantitative gene expression analysis in microdissected archival formalin-fixed and paraffin-embedded tumor tissue.Am J Pathol, 2001, 158(2):419-429 [29] Al-Taher A, Bashein A, Nolan T, et al.Global cDNA amplification combined with real-time RT-PCR:accurate quantification of multiple human potassium channel genes at the single cell level.Yeast, 2000, 17(3):201-210 [30] Rozzo SJ, Allard JD, Choubey D, et al.Evidence for an interferon-inducible gene, Ifi202, in the susceptibility to systemic lupus.Immunity, 2001, 15(3):435-443 [31] Rickman DS, Bobek MP, Misek DE, et al.Distinctive molecular profiles of high-grade and low-grade gliomas based on oligonucleotide microarray analysis.Cancer Res, 2001, 61(18):6885-6891 [32] Neil J, Gibson.The use of real-time PCR methods in DNA sequence ariation analysis.Clinica Chimica Acta, 2006, 363:32-47

第三篇：基因工程課程論文

基因治療在傳染病防治中的應用研究進展

姓名（學號）（學校 郵編）

[摘要] 傳染病是目前人類所面臨的一類重大疾病，在某些疾病狀態(tài)下，人類還未尋找到理想的治療方法，如病毒感染等?，F(xiàn)代基因治療是一種應用基因工程技術和分子遺傳學原理，對人類疾病進行治療的新療法。主要是指對致病基因的修正和基因增強及采用外源性細胞因子基因、核酶、基因藥物進行疾病治療的方法。經(jīng)過幾十多年的發(fā)展，技術逐步走向成熟，在傳染性疾病的防治中顯示了重大的臨床應用前景。傳染性疾病的基因治療包括：基因疫苗、RNA干擾、胞內(nèi)抗體、淋巴基因表達等。

[關鍵詞] 基因疫苗 RNA干擾 胞內(nèi)抗體 淋巴基因表達 1.現(xiàn)狀

1.1 我國傳染病現(xiàn)狀 21世紀人類依然面臨著傳染病的挑戰(zhàn)首先，是新發(fā)傳染病的挑戰(zhàn)。就全球而言，艾滋病是當前首惡，因其主要通過血液、吸毒、性行為傳播，潛伏期長、隱襲性強、控制難度大；特別是婦女感染率高且可以垂直傳播，嚴重危害兒童的身體健康。由于其病毒極易發(fā)生變異，所以到目前為止疫苗仍在試驗階段，缺乏理想的特效藥物，免疫損傷治療難度大，以致非洲個別國家感染人數(shù)達其全國人口的一半。我國2003年比2002年發(fā)病率上升44．39％，人類免疫缺陷病毒檢出率提高了55％。2004新年伊始在東北亞韓國、日本及東南亞越南、泰國、柬埔寨以及中國和美國部分地區(qū)禽流感暴發(fā)，導致大量家禽死亡，同時H5N1病毒在人群感染使20多人喪命，又一 次引起全球震驚。更有嚴重者，引起瘋牛病(在人類稱為克雅克病)的朊毒蛋白對煮沸等常用消毒方法不起作用，疾病潛伏期長，病死率高達100％。這兩種傳染病不但對人類健康造成了威脅，而且給人的兩種主要食物—— 牛肉、禽肉的供應造成困難。由于人與動物關系的密切，氣候的變化，以及化學物質(zhì)的廣泛應用，微生物發(fā)生變異導致新的傳染病，甚至恐怖主義制作生物武器，人類勢必將面臨更多的新的挑戰(zhàn)。其次，老的傳染病對人類健康的影響同樣不容忽視。以2002年為例，WHO統(tǒng)計全球發(fā)生各類傳染病共計356 824 000例次，占各病種總發(fā)病數(shù)的23．9％，位居第一，死亡共11 122 000例，占19．5％，僅次于心血管病?。這說明就全球而言，特別是發(fā)展中國家，傳染病不可忽視。據(jù)中國疾病預防控制中心報道，我國傳染病同年發(fā)病2 320 764例，死亡4520例，病死率0．0195％，均遠低于全球平均水平。但近年除新發(fā)傳染病外，傳統(tǒng)性傳染病一些情況值得我們注意：(1)發(fā)病數(shù)和發(fā)病率：我國2002年全國傳染病報告發(fā)病數(shù)2 440 588例次，發(fā)病率比2001年下降了5．74％，而2003年發(fā)病數(shù)2 591 512例次，發(fā)病率比2002年上升5．45％。(2)死亡例數(shù)和病死率：從死亡人數(shù)看，2002年死亡4520例，比前一年死亡3576例增加了26．4％，且2003年比2002年同期又上升了17．43％，增加了1280例。2003年死亡人數(shù)中死于SARS者349例，狂犬病1980例，且后者比2002年增加821例，高于SARS。(3)病種分布：2002年和2003年發(fā)病數(shù)居前3位的均是病毒性肝炎、結(jié)核與細菌性痢疾，死亡人數(shù)居前3位的是狂犬病、肺結(jié)核及病毒性肝炎，其中乙型病毒性肝炎及結(jié)核無論發(fā)病率及死亡數(shù)均居前3位。乙型肝炎療效有限，加上慢性化、肝硬化及部分發(fā)生肝癌呈鏈式發(fā)展，危害人民健康。同樣，最老的傳染病結(jié)核主要由于耐藥增加近年全球復燃，我國亦面臨結(jié)核的嚴重挑戰(zhàn)。2003年其余死亡數(shù)位居前 10位的其他傳染病還有新生兒破傷風、艾滋病、乙型腦炎、SARS、細菌性痢疾、出血熱、流行性腦脊髓膜炎。其中除SARS及艾滋病外，均是老的傳染病控制不力出現(xiàn)反復。兒童傳染病死亡原因以破傷風、中毒性菌痢、麻疹與流行性腦膜脊髓炎為主，說明傳染病主要危害兒童的特點，影響了國家優(yōu)生優(yōu)育的大計。

1.2 基因治療研究現(xiàn)狀

1.2.1 多種疾病的基因治療 目前，基因治療的范圍已從過去罕見的單基因疾病擴大至常見的單基因疾病和多基因疾病。遺傳性疾病的基因治療多數(shù)屬于單基因缺陷所引起的疾病的基因治療。Fang等以腺病毒為載體，靶向肝細胞對苯丙氨酸羥化酶(PAH)缺陷癥小鼠模型進行了研究，結(jié)果表明小鼠的傷寒表型癥狀得到明顯改善。而un等則通過反轉(zhuǎn)錄狀病童T淋巴細胞中苯丙氨酸羥化酶(PAH)活性的改變狀況。惡性腫瘤的基因治療已進行了大量的預備性實驗，美國科學家構(gòu)建了重組的TIL(腫瘤浸潤淋巴細胞)，能表達100倍于正常水平的TNF并應用于黑色素瘤的臨床治療。另外，用表達IL-

2、IFN．2和IL廣1的TIL治療神經(jīng)母細胞瘤及白等的研究工作也已見報道；還有應用反轉(zhuǎn)錄病毒將毒素基因(蓖麻毒素和脊髓灰質(zhì)炎病毒素中所含的一種蛋白酶的基因)導人癌細胞內(nèi)，只在靶細胞內(nèi)表達毒素并發(fā)揮殺傷作用，但對其他細胞毒性較低。對于艾滋病等傳染類基因疾病，有研究將HIV LTR3’、5’寡腺苷酸合成酶雜合基因轉(zhuǎn)染HeLa．T4+細胞。結(jié)果表明：經(jīng)修飾的帶有CD4受體的細胞具有抗HIV感染的作用。還有將編碼可使艾滋病毒HIV RNA降解的核酶基因轉(zhuǎn)染人淋巴細胞，從而抑制HIV的傳播。

1.2.2 多種藥物的基因治療隨著對基因治療機制本身的不斷深人探討，用于基因治療的藥物形式也不斷創(chuàng)新?；谌淒NA形成脫氧寡核苷酸('rro)[3]的反基因技術能夠通過阻止基因轉(zhuǎn)錄和DNA復制而達到治療目的。Cohen等曾用此技術抑制淋巴瘤的bc1．2基因，而Noonberg等以此對乳腺癌的HER2基因進行了相應的探索?；蛑委煆膫鹘y(tǒng)意義上的DNA治療擴展至RNA水平。有治療作用的目的基因的mRNA已用作體內(nèi)、體外基因治療的研究。Nair等Is J從腫瘤細胞或活組織分離出mRNA，以其對自身提呈抗原的樹突細胞進行轉(zhuǎn)染，最終表達出了初始癌抗原(CEA)一T淋巴細胞特異性細胞毒素。Thierry等采用體外轉(zhuǎn)錄的方式，以GFP為報告基因，研究了mRNA在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)、鼠黑色素瘤細胞B16．F10、人海拉細胞(子宮頸癌組織細胞株HeLa)、鼠成纖維細胞Ratl等不同細胞系中的表達狀況，同時還探討了不同轉(zhuǎn)染試劑對轉(zhuǎn)染效果的影響，并以蜂毒素肽介導并提高了mRNA的轉(zhuǎn)染效率。1.2.3 多種途徑的基因治療在探討不同疾病的發(fā)病機制、嘗試不同基因藥物，進行基因治療的同時，有研究者對基因治療的新方法新途徑進行了大膽的探索。斯坦福大學研究組采用轉(zhuǎn)座子作為基因載體，在患有血友病的小鼠模型上，將來自魚的一種編碼轉(zhuǎn)座酶的基因與宿主染色體上的凝血因子Ⅸ 基因相連接，使小鼠的血液凝結(jié)狀況大大改善。基因槍法被證明能夠介導外源基因快速進人靶器官。Takuji等利用基因槍將成骨蛋白．1基因轉(zhuǎn)入椎間盤細胞中并使其獲得有效表達。Weiss等利用基因槍將包裹的細菌疏螺旋體OspC蛋白基因打人Balb／c小鼠體內(nèi)，介導了Th2反應，并與注射方式進行比較，發(fā)現(xiàn)基因槍只介導Th2反應而非Thl反應的原因并非是由于相比注射方式其所輸送的DNA數(shù)量太少，于CpG的臨界濃度所致。利用消化道大量的黏膜表面以及其中所含有豐富的免疫介導組織，以口服的方式將具有治療或免疫作用的目的基因1199運送到靶器官已成為基因治療領域研究的熱點。在以腺病毒為載體對腸上皮細胞進行轉(zhuǎn)導的研究中，During等Luj將帶有l(wèi)acZ基因的 腺伴隨病毒口服給乳糖不耐癥的小鼠模型，在祖干細胞、腸道細胞、固有膜細胞中，外源基因的表達可持續(xù)六個月。MacLaughlin等用殼聚糖作為運送報告基因(編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)的載體，經(jīng)消化道后在體內(nèi)得到表達。另外，Sizemore等發(fā)現(xiàn)當減毒的志賀氏菌進人細胞傳遞質(zhì)粒后，質(zhì)粒編碼的B半乳糖苷酶引起黏膜免疫。Ayub等用減毒的沙門氏菌為載體，攜帶李斯特病菌的單細胞基因毒力因子，對小鼠管飼后發(fā)現(xiàn)明顯的細胞毒性及輔助T細胞反應，同時也檢測到特異性抗體的產(chǎn)生[4]。

2.基因治療的方法

2.1 基因疫苗

基因疫苗及DNA疫苗是20世紀90年代發(fā)展起來的第3代疫苗。其原理是將編碼病原體抗原的基因分離純化，克隆至真核細胞表達質(zhì)粒載體，經(jīng)皮下、肌肉注射或口服等方式進入機體，基因在體內(nèi)表達相對應抗原并刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應答，從而使機體獲得針對病原微生物、病毒的特異性抵抗能力，達到預防和治療傳染病的目的。與傳統(tǒng)的第1代疫苗一減毒、脫毒病原微生物成分及第2代疫苗一基因工程蛋白多肽相比，基因疫苗具有能把抗原以自然狀態(tài)形式提供給機體、保護力強、無毒力回復并對不同亞型病原體產(chǎn)生交叉抵抗、易于制備和聯(lián)合接種、生產(chǎn)成本低、易于保存和運輸?shù)葍?yōu)點，已成為具有廣泛應用前景的新型生物技術。它不僅可用來預防和治療細菌、病毒、寄生蟲等傳染性疾病，而且在腫瘤、自身免疫性疾病的治療中具有重要的價值。DNA疫苗是利用分子生物學技術，根據(jù)編碼抗原堿基序列，設計并合成特異性引物，用RT—PCR方法從病原微生物RNA分離純化抗原基因，再通過限制性內(nèi)切酶方法將DNA克隆至真核細胞表達質(zhì)粒載體。通過特定的方法將質(zhì)粒載體制備成注射制劑或口服制劑。當這 種制劑進入機體后通過載體的作用，DNA可進入機體細胞，在細胞內(nèi)表達。病原抗原滯留于細胞內(nèi)或分泌到細胞外，滯留于細胞內(nèi)的抗原可特異性活化CD8+ Tc細胞，分泌到細胞外的抗原可活化CD4+ Th細胞或刺激B細胞產(chǎn)生抗體。因此，DNA疫苗不僅可誘導體液免疫，還可誘導細胞免疫，比傳統(tǒng)疫苗只誘導體液免疫具有顯著的優(yōu)越性。

2.2 RNA干擾 RNA干擾主要是利用雙鏈RNA在mRNA水平關閉特異序列基因表達或使其沉默的過程，又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post—transcriptional gene silencing．PT—GS)，能特異性使外源性入侵基因沉默。RNA干擾最早在植物和線蟲細胞中發(fā)現(xiàn)，被認為是它們抵抗病毒感染的一種天然免疫防御機制。目前普遍認為其機制是核糖核酸酶首先將雙鏈RNA切割成21～23個核苷酸的片段，然后酶又與片段結(jié)合，由這些片段將酶引導至特異的mRNA上，從而降解mRNA，使特異基因沉默，抑制基因表達[1]。

2.3 胞內(nèi)抗體

胞內(nèi)抗體是一種基因工程抗體。其方法是采用分子生物學手段，從免疫脾細胞或雜交瘤細胞分離純化抗體VH和VL基因片段。再通過特定的連接肽將VH和VL連接起來，構(gòu)建單鏈抗體(ScFv)基因，并在基因上加上細胞滯留信號序列，將該基因克隆至真核細胞表達質(zhì)粒載體，通過特定的方法將質(zhì)粒載體制備成注射制劑或口服制劑。當這種制劑進入機體后通過載體的作用，DNA可進入機體細胞，表達單鏈抗體定向分布于細胞的核、胞漿或特定細胞器中與病毒蛋白結(jié)合，干擾病毒蛋白的分泌、加工和活性，從而阻止病毒復制和病毒顆粒組裝釋放[1]。

2.4淋巴因子轉(zhuǎn)基因表達

淋巴因子在傳染病治療中具有十分重要的作用和廣泛的應用前景。其中的干擾素（IFN）已成為目前抗肝炎病毒治療唯一公認有效的基因工程藥物。利用淋巴基因表達進行傳染病的基因治療研

[1]究，是基因治療在傳染病中的一個重要應用和重要的研究方向[2]。2.5 反義RNA 彭國平[5]綜述中談到HBV、HCV是引起慢性肝炎以及肝硬化、肝細胞肝癌等相關疾病的重要病原體，而有效防治此類肝病的關鍵在于抗病毒，反義核酸技術最早是人工合成或生物合成特定互補的DNA或RNA 序列導入靶細胞，形成mRNA—DNA 或mRNA—RNA雜交雙鏈，從而抑制或封閉靶基因表達，達到基因控制和治療的目的[5]。

3.基因治療在傳染病防治中的應用

3.1 DNA疫苗

乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因疫苗在國外已進入I期臨床實驗，其結(jié)果顯示：該疫苗可在體內(nèi)有效表達HBsAg，并可誘導強烈的免疫反應，產(chǎn)生高效價抗體，同時，志愿者對疫苗具有良好的耐受性。我國科學家將S抗原基因與IL一

2、INF基因連接在同一載體上，構(gòu)建融合基因給健康小鼠、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠使用后，發(fā)現(xiàn)CTL活性顯著升高，HBsAg特異T細胞增殖能力顯著高于對照組，血清抗HBs抗體顯著升高。HIV一1基因疫苗在動物體內(nèi)可產(chǎn)生有效的免疫應答，減少病毒顆粒釋放和對T細胞的損害，在人體內(nèi)的實驗證明它可有效誘導抗HIV抗體產(chǎn)生。沙眼衣原體MOMP—DNA疫苗給小鼠免疫后可有效誘導抗體產(chǎn)生，其效價高達1: 1250，脾細胞對衣原體的刺激指數(shù)顯著高于對照組，說明該基因疫苗不僅誘導了體液免疫，同時還誘導了細胞免疫[1]。

3.2 RNA干擾(RNAi)近年來隨著對RNA干擾研究的深入，一種能在哺乳動物細胞中抑制特異基因表達、只有21個核苷酸的小干擾雙鏈RNA(small interfering RNA，siRNA)被發(fā)現(xiàn)。將特異的siRNA通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入Hela細胞和人胚腎293細胞等不同哺乳動物細胞中，獲得了可重復的序列 特異的RNA干擾，而將長序列的雙鏈RNA轉(zhuǎn)入則出現(xiàn)了非特異抑制。這些研究成果為RNA干擾的研制提供了前提。Randall等人發(fā)現(xiàn)HCV特異的siRNA可抑制AC和Huh一7肝細胞株中HCV復制，清除細胞內(nèi)HCV病毒[1]。3.3 胞內(nèi)抗體

在傳染性疾病，尤其是病毒感染中的應用越來越受到人們的關注。抗HIV結(jié)構(gòu)和功能蛋白scFv基因?qū)際IV感染的淋巴細胞后能干擾HIV病毒轉(zhuǎn)錄和復制，而對細胞生長和CD4表達無影響，將其導入表達有CD4和CCR的人骨肉瘤細胞，可抵抗HIV的感染?？笻IV逆轉(zhuǎn)錄酶和抗整合酶的胞內(nèi)抗體可抑制酶活性，減少病毒復制?？笴CR5和CD4的胞內(nèi)抗體可抑制CCR5和CD4的表達并防止HIV感染?？笻CV外膜蛋白E2的胞內(nèi)抗體能抑制病毒與靶細胞結(jié)合，發(fā)揮治療作用?？笻CV核心抗原的ScFv能抑制核心蛋白功能和HCV的裝配。我國研究者成軍等人報道：將抗HBV核心抗原SeFv基因克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，構(gòu)建的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染2 215細胞后能有效抑制Ⅶ 和HBsAg的表達。

3.4 干擾素的基因轉(zhuǎn)移與表達

Seif等將小鼠的干擾素β（IFNβ）的基因置于主要組織相容性復合體（MHC）的啟動子序列的控制之下，構(gòu)建重組表達載體，轉(zhuǎn)染Babl/c小鼠的成纖維細胞系NIH3T3，得到了持續(xù)的IFNβ的表達。表達IFNβ的細胞系，對濾泡口炎病毒（VSV），腦心肌炎病毒（EMCV）和塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus）的復制和表達均有明顯的抑制作用。并發(fā)現(xiàn)持續(xù)低水平的IFNβ的分泌表達，就可以使這一細胞系產(chǎn)生明顯的抗病毒狀態(tài)。然而，用等量的外源重組的IFNβ則無此效果。而且，加入相應的IFNβ的單克隆抗體并不能阻斷這種轉(zhuǎn)導的細胞系對上述三種病毒的抑制效應。因此認為，此細胞系的抗病毒狀態(tài)的產(chǎn)生，除了和分泌型IFNβ的表達有關以外，還有可能存在其它的作用方式。另外，Bednarik

[1]等將人的α2干擾素（IFNα2）的基因重組到人免疫缺陷病毒（HIV）的長未端重復序列（LTR）中的啟動子下游，轉(zhuǎn)入非洲綠腎細胞系中，IFNα2的分泌表達水平持續(xù)在50~150u/ml之間。這一低水平的IFNα2的表達完全可以抑制HIV的復制和轉(zhuǎn)錄。同樣地也發(fā)現(xiàn)就用相應水平的外源重組的IFNα2也無此效果。而且IFNα2的單抗也不能阻斷IFNα2的抗病毒作用。這一差別的原因，作者認為體內(nèi)產(chǎn)生的IFNα2與體外重組的IFNα2的抗病毒機理不同。外源重組的IFNα2的抗病毒機理，是抑制HIV的成熟和裝配過程，而內(nèi)源表達的IFNα2的抗病毒作用，似乎是主要作用在轉(zhuǎn)錄水平以及HIV mRNA的穩(wěn)定性等方面[2]。問題與展望

基因治療在染性疾病的體內(nèi)外實驗生物治療中均顯示了療效。尤其是基因疫苗對機體的保護作用已得到了公認，但其真正進入臨床廣泛應用尚有一段距離。還有許多問題須要進一步的驗證： 4.1 基因疫苗編碼抗原的表達問題?；蛞呙缡褂脮r進入機體的是一段DNA片段，其作用的發(fā)揮須要DNA在細胞內(nèi)有效轉(zhuǎn)錄和翻譯成相應的蛋白，如何能使DNA高效率進入機體細胞并得到高效轉(zhuǎn)錄和翻譯；

4.2 DNA疫苗目前的動物實驗顯示其免疫效果存在較大的個體差異，總的來看其免疫原性不高

4.3 RNA干擾目前雖然是一個研究熱點，但其研究工作才起步，其導人體內(nèi)的方法、穩(wěn)定性等問題還需要解決；

4.4 基因治療的安全性問題，尤其是選用的載體對機體的影響還須要進一步證實，這一問題在短時間內(nèi)無法解決。4.5 倫理道德方面的爭論也是影響因素之一。4.6 基因轉(zhuǎn)移中的副作用和抗體形成問題。

雖然基因治療還存在如此諸多問題，但它的理論基礎和強大生命力是顯而易見的。經(jīng)過幾年來的發(fā)展，基因治療的研究已逐步從理論走向了臨床的實驗，人們已獲得了不少寶貴的知識與經(jīng)驗，隨著分子生物學、免疫學的發(fā)展，人類及細菌、病毒等基因組測序的完成，為進一步發(fā)展和完善基因治療奠定了良好的基礎，相信不久的將來，基因治療將在傳染性疾病的預防和治療中發(fā)揮重要作用。

參考文獻

1.顏漫江.基因治療在傳染病防治中的應用研究進展，傳染病信息2004，17（1）：14-15.2.http://004km.cn/list6.asp?class=683 3.姜素椿.我國傳染病的現(xiàn)狀與思考，中華內(nèi)科雜志2004年7月，43（7）：481-482 4.王弘?；蛑委煱l(fā)展研究現(xiàn)狀，實用醫(yī)學雜志2004，20（10）：1199。5.彭國平.反義RNA應用于抗HBV、HCV 肝炎病毒的研究進展，國外醫(yī)學病毒學分冊2005，8，12（4）：114-116.10

第四篇：動物基因工程課程論文

青島農(nóng)業(yè)大學 動物基因工程課程論文

題 目：

核酸分子雜交技術

姓 名：

學 院： 動物科技學院 專 業(yè)： 班 級： 學 號：

任課教師： 閔令江

二〇一二年四月二十日

…1…

核酸分子雜交技術

閔令江

閔令江

摘要：核酸分子雜交是核酸研究中一項最基本的實驗技術，其基本原理就是應用核酸分子的變性和復性的性質(zhì)，使來源不同的DNA(RNA)片段按堿基互補關系形成雜交雙鏈分子。雜交雙鏈可以在DNA鏈和DNA鏈之間，也可以在RNA鏈和DNA鏈之間形成。雜交的實質(zhì)就是在一定條件下使互補的核酸鏈實現(xiàn)復性，使雙螺旋解開成為單鏈。變性指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈的無規(guī)則線團，使核酸的某些光學性質(zhì)和流體力學性質(zhì)發(fā)生改變，有時部分或全部生物活性喪失，并不涉及共價鍵的斷裂。復性指變性DNA在適當條件下，兩條彼此分開的鏈重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。核酸分子雜交具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，主要用于DNA或RAN的定性、定量檢測。該技術已取得巨大突破，在醫(yī)學診斷中應用廣泛，而且DNA芯片技術已取得顯著成就。

關鍵詞：核酸分子

雜交

變性

復性

應用+

…2…

Nucleic acid member hybrid technology

majoring in Animal Medicine

Name GaoZhiCan

MiLingJiang

MiLingJiang Abstract: Nucleic acid hybridization in nucleic acids research is one of the most basic experimental technique, its basic principle is the application of nucleic acid denaturation and refolding of the nature, sources of DNA(RNA)fragment bases complementary relationship forming hybrid double-stranded molecules.Hybrids between double-stranded DNA DNA chain and chain, can also be formed between the DNA and RNA chains chains.Nature of the hybrid is the complementary nucleic acid chain under certain conditions of realization of complex, make double helix solved a single chain.Modified double helix of nucleic acids hydrogen bonds break, into a single chain of random coil so changed for some optical properties and fluid mechanics properties of nucleic acid, sometimes partial or total loss of biological activity, does not involve the breaking of covalent bond.Refolding of denatured DNA under appropriate conditions, two separate chains of association become the double-helix structure of process again.Nucleic acid hybridization with high sensitivity, specificity, and other advantages, mainly for qualitative and quantitative detection of DNA or RAN.The technology have made great breakthrough, widely used in medical diagnosis and DNA Microarray Technology has made remarkable achievements.Key words: Nucleic acid molecules Hybrid Degeneration Renaturation Application

…3…

引言

1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發(fā)展，特別是20世紀70年代末到80年代初，分子克隆技術的出現(xiàn)、質(zhì)粒和噬菌體DNA的構(gòu)建成功、核酸自動合成儀的誕生，大大核酸探針的來源，新的核酸分子雜交類型和方法不斷涌現(xiàn)。按其作用方式可大致分為固相雜交和液相雜交兩種：液相雜交是指參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中，而固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈固定在固體支持物的支持物上，另一條參加反應的核酸鏈則游離在溶液中。

常用的固相雜交類型有菌落原位雜交、斑點雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交和組織原位雜交。液相分子雜交技術包括吸附雜交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交和復性速率液相分子雜交等。液相雜交是一種研究最早且技術較復雜的雜交類型，不如固相雜交那樣應用普遍，主要是因為雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。因此在此主要介紹固相分子雜交類型及其應用。

一、斑點雜交

1、概述

斑點雜交首先由Kafatos等發(fā)展起來，用于在同一固相支持物上固定幾種核酸樣品，然后用合適的探針與已固定的樣品雜交，并由此判斷靶序列的濃度。通過估計樣品點發(fā)射出的信號的強度，與已知濃度的標準品信號強度進行比較，確定待測樣品中靶序列的量。

斑點雜交的原理是將DNA或RNA變性后直接點樣吸附于固相支持濾膜上，即印跡之后，膜作變性和中和處理，用UV照射尼龍膜或用烘烤法處理纖維素膜，將DNA固定。然后用標記探針與之雜交，洗滌去除未反應的探針，采用放射自顯影或顯色反應檢測顯示雜交信號，分析結(jié)果。將核酸樣品點種于固相支持濾膜上，可采用手工直接點樣或采用真空抽濾加樣器。后者點樣準確方便。

2、雜交方法【1】（1）、材料

20×SSC,甲醛，去離子甲酰胺。10%SDS,20×Denhardt液，1mol/L磷酸一氫 …4…

鈉（PH7.0）,底物緩沖液，親和素-堿性磷酸酶，5-溴-4-氫-3-吲哚乙酸，淡藍四唑等。其他還有恒溫水浴鍋、同位素探測儀、自動光密度掃描儀、真空抽濾加樣器、恒溫搖床、移液器、印跡等。（2）、操作步驟和方法

①樣膜的制備

a.核酸樣品的預變性 所取DNA及RNA樣品的量視情況而定，一般可加10～20ug.b.尼龍膜的預處理 c.點樣 d.固定

②預雜交

③雜交 a.配制雜交液 b.探針變性 c.雜交

④洗膜

⑤放射自顯影

⑥結(jié)果觀察

根據(jù)曝光點的有無、強弱，可以判定目的基因的有無及用量的多少。利用自動灰度掃描儀掃描曝光點，計算光密度值，可以進行半定量分析。對光敏生物素標記DNA探針的斑點雜交，出現(xiàn)藍紫色斑點者為陽性，未著色者為隱性。根據(jù)著色的深淺可以判定目的基因的多少。（3）、注意事項

①DNA的變性 斑點印跡的關鍵是DNA在轉(zhuǎn)錄后要完全變性，至少所有樣品的變性程度要一致。

②DNA樣品的純度 用Southern轉(zhuǎn)移時，電泳步驟有利于把雜質(zhì)分出去，剩下要轉(zhuǎn)移的DNA就比較干凈。

③固相支持膜的選擇 理想的膜應符合以下要求：a.具有較強的結(jié)合核酸分子的能力；b.與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定牢固；c.與核酸分子結(jié)合后，應不影響其與探針分子的雜交反應；d.非特異性吸附少；d.具有良好的機械性能。（4）、斑點雜交的應用 【2】

…5…

現(xiàn)在已有眾多學者應用該方法進行分支桿菌及其他病原菌的檢測和種屬鑒定，均取得了較敏感的檢測結(jié)果。同時應用該方法檢測序列變異時，若靶序列內(nèi)存在突變，則其擴增產(chǎn)物在嚴格的條件下無法與探針雜交，無雜交信號就表示目的基因存在突變。近年來研究應用于單個堿基突變基因的診斷方法，其最大的特點就是簡便、快速而分辨率高。其最突出的優(yōu)點是進行一個標本的基因分型只需1次雜交即可完成配合快速的DNA提取方法及電腦分析軟件得出，可以在一個工作日內(nèi)完成所需的分型工作。

二、Southern印跡雜交

1、Southern印跡雜交的基本原理【3】

Southern印跡雜交指將經(jīng)凝膠電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到合適的固相支持物上，再通過特異性的探針雜交來檢測被轉(zhuǎn)移的DNA片段的一種技術。其基本過程包括：樣品DNA的限制性內(nèi)切酶水解，水解片段的瓊脂糖凝膠電泳分離，分離后水解片段的轉(zhuǎn)移，特異性的DNA片段的分子雜交，探針在雜交前用放射性標記或酶學標記，最后采用放射自顯影或化學發(fā)光法進行檢測。

2、Southern印跡法的基本過程【4】（1）、DNA樣品的酶切和電泳

a.用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化基因組DNA樣品；b.瓊脂糖凝膠電泳（2）、準備用于轉(zhuǎn)移的凝膠

（3）、DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物

a.緩沖液的配制；b.準備轉(zhuǎn)移用膜；c.固定DNA于膜上

（4）、探針標記（5）、雜交

a.緩沖液及溶液

磷酸-SDS洗液Ⅰ

SDS洗液Ⅱ

預雜交/雜交液；b.預雜交；c.雜交（6）、洗膜

取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列條件洗膜：

2×SSC/0.1%SDS,42攝氏度，10min

1×SSC/0.1%SDS,42攝氏度，10min

0.5×SSC/0.1%SDS,42攝氏度，10min

0.2×SSC/0.1%SDS,56攝氏度，10min …6…

0.1×SSC/0.1%SDS,56攝氏度，10min 實踐證明，當放射強度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1～2倍時，是洗膜的終止點。上述洗膜過程中無論哪一步到達終點。都必須停止洗膜。（7）、雜交結(jié)果的檢測

a.放射性核酸標記探針的檢測

洗膜結(jié)束后，將洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水分，并用保鮮膜包裹。將膜正面向上，放入暗箱中，經(jīng)磷鎢酸鈣增感屏前屏置于濾膜下，光面向上。在暗室的紅光下，將兩張X射線膠片壓在雜交膜上，再壓上增感屏后屏，光面向X射線膠片。合上暗盒，置-70攝氏度低溫冰箱中曝光。根據(jù)放射性的強度曝光一定時間后，在暗箱中去除X射線膠片，顯影、定影，一般用1～3天時間。洗片時，先洗一張X射線膠片，若感光偏弱，則多加兩天曝光時間，再洗第二張片子。b.非放射性核酸標記探針的檢測（8）、雜交膜的重復使用

將結(jié)合有探針的雜交膜浸入大量的洗脫液中，75攝氏度下溫育2h或在含有50%的甲酰胺與2×SSPE的溶液中于65攝氏度下保溫1h.然后取出雜交膜，在室溫下用0.1%×SSPE短暫漂洗，再將雜交膜置于紙巾上。除去大部分液體。用保鮮膜包裹。置暗箱中進行放射自顯影，以檢查是否所有探針已被除去，如果沒有雜交信號，說明探針已被洗脫干凈，可以用于第二輪雜交或干燥后保存?zhèn)溆?。?）、注意事項

a.雜交膜只能用干凈的平頭鑷子接觸，不可接觸手指，否則將造成背景問題。b.電泳結(jié)束后，應該確定酶切是否完全、電泳分離效果是否良好、DNA樣品有無降解等。

c.硝酸纖維素膜只能通過徹底干燥來進行固定，干燥后核酸與硝酸纖維素膜通過疏水相互作用力結(jié)合在一起，相互之間的結(jié)合力較弱。d.雜交體系的體積越小，效果越好。

e.雜交膜上出現(xiàn)斑點可能是由于封閉液中封閉劑濃度過低或封閉緩沖液配制時間過長，不能封閉雜交膜上的非特異性位點。

f.采用毛細管轉(zhuǎn)移法進行核酸轉(zhuǎn)移時，用prarfilm膜圍繞凝膠周邊，但不是覆蓋凝膠，依次作為屏障，阻止液體自流池直接流至凝膠上方的紙巾層中，紙巾對方不整齊容易從凝膠的邊緣垂下并與平臺接觸，這種液流的短路是導致凝膠中核酸轉(zhuǎn) …7…

移效率下降的主要原因。

3、Southern雜交的應用進展【5】

不同個體在DNA結(jié)構(gòu)上存在著差異，在不編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域及沒有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域，DNA結(jié)構(gòu)的個體差異更為明顯?；蚪M中一個特定的基因座位若存在兩種或兩種以上的狀態(tài)，而且其中任何一個等位基因在人群中的頻率不低于10%，這一現(xiàn)象稱為多態(tài)性。DNA多態(tài)性本質(zhì)上是染色體DNA中核苷酸數(shù)目或排列順序的個體差異。

（1）、限制性片段長度多態(tài)性（RELP）

這種在同種生物不同個體間出現(xiàn)不同長度限制性片段的類型，稱為限制性片段長度多態(tài)性（RELP）。RELP具有極廣泛的用途，利用廣泛分布的RELP作為遺傳標記可以稱為對人類基因組制圖的基礎。當多態(tài)性順序與人類遺傳病基因位點相連鎖時，可以作為遺傳缺陷的產(chǎn)前診斷或鑒別雜合子攜帶者的標記，以及用于親子鑒定和群體研究等。主要方面包括：①生物體基因分型、分亞型；②癌基因分析；③遺傳病的診斷④HLA分型及遺傳結(jié)構(gòu)分析。（2）、可變串聯(lián)重復多態(tài)性（VNTR）

人類基因組含有一些DNA重復序列家族，有些重復序列分散在基因組中，有些是以一系列短的串聯(lián)重復序列組成高變區(qū)，其串聯(lián)；串聯(lián)重復序列拷貝數(shù)可以相差很多，即出現(xiàn)可變數(shù)的串聯(lián)重復，因而高變區(qū)的長度變化很大，使高變區(qū)兩側(cè)限制性內(nèi)切酶識別位點的固定位置隨高變區(qū)的大小變化而發(fā)生相對位移，造成RELP,稱為VNTR多態(tài)性。

迄今為止，VNTR的研究方法主要有四種：DNA指紋圖譜法、VNTR-RELP分析法、模板PCR擴增后的RELP或寡核苷酸探針（ASO）檢測法以及PCR擴增片段長度多態(tài)性分析法。（3）、擴增片段長度多態(tài)性(AELP)該法的分辨率、靈敏度明顯高于瓊脂糖凝膠電泳、放射性自顯影的方法，并且操作時間短，一般2h即可完成。他幾乎克服了Southern印跡雜交技術中的所有缺點，使VNTR在瓊脂糖電泳中連續(xù)分布的等為基因片段變成單獨分離的片段，使原來無法用Hardy-weinberg公式進行計算的基因頻率估計稱為可能。因此，該技術在遺傳病診斷、基因定位，尤其是法醫(yī)學上的應用日益廣泛。

三、Northern印跡雜交

…8…

1、Northern印跡雜交的基本原理【6】

與Southern雜交相似，Northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的RNA分離開來，隨后將其原位轉(zhuǎn)移至固相支持物上，再用放射性標記的DNA探針或RNA探針，依據(jù)其同源性進行雜交，最后進行放射自顯影。以目標RNA所在位置表示其分子量的大小，而其顯影強度則可提示目標RNA在所測樣品中的含量。

2、雜交方法【7】

Northern雜交方法是單一基因表達分析的首先方法。經(jīng)過二十多年的發(fā)展，Northern雜交方法比以前有了較大改進，其操作方法變得更加簡單，時間也比以前縮短了，其基本操作過程分以下幾大步驟： ①RNA的變性和分離 ②RNA轉(zhuǎn)移至固相支持物中 ③固相RNA與探針分子雜交

④對特異結(jié)合的探針分子進行檢測和分析。

3、northern雜交的應用與進展【8】

RNA凝膠印跡分析即Northern雜交分析，是分子生物學最常用的研究基因表達的方法。它可以將恒定的mRNA水平量化，同時給出相關的RNA是否存在、分子大小以及離散的RNA種類間的整體性等信息。近年又出現(xiàn)了一些可以定量檢測RNA的更靈敏的技術，如核酸酶保護分析、RT-PCR等方法，但這些技術只是Northern雜交方法的補充而并非取代。Northern雜交仍被看作是mRNA研究的標準操作，以為它相對簡單并且可獲得關于mRNA的多種信息。

（1）、反向Northern雜交和Northern雜交篩選mRNA表達（2）、高通量反向Northern印跡雜交和Northern雜交

四、原味雜交

1、基本原理【9】

原位核酸分子雜交技術簡稱原味雜交（ISH）,是應用序列已知并帶有標記物的核酸探針與組織、細胞中待檢測的核酸按堿基互補配對原則特異性結(jié)合而形成雜交體，然后再應用與標記物相應的檢測系統(tǒng)，通過組織化學或免疫組織化學方法在被檢測的核酸原位形成帶顏色的雜交信號，在顯微鏡下進行觀察，從而對組織細胞中的待測核酸進行定性、定位和相對性定量的一種研究方法。原味雜交屬于固 …9…

相核酸分子雜交的范濤，但它區(qū)別于固相核酸分子雜交中其他任何一種核酸分子雜交技術。原味雜交可檢測形態(tài)保存完整的染色體、細胞或組織切片中的特異核酸序列，與免疫細胞化學結(jié)合時，原位雜交還可將顯微拓撲學信息與DNA、mRNA及蛋白質(zhì)水平的基因活動聯(lián)系起來，為從分子水平研究細胞內(nèi)基因表達及基因調(diào)控提供了有效的工具，是組織化學或免疫細胞化學中革命性的突破。

2、原味雜交技術的基本方法【10】

原位雜交技術主要涉及四個方面：①雜交前準備，包括玻片準備、組織的固定及預處理、預雜交；②雜交；③雜交后處理，涉及雜交后的清洗；④顯示及結(jié)果觀察，顯示包括放射自顯影和非放射性標記的組織化學或免疫組織化學顯色。（1）、破片準備和組織固定

玻片包括蓋玻片和載玻片，應用熱肥皂水清洗，用自來水清洗干凈后，置于清潔液浸泡24H，清水洗凈烘干，95%乙醇中浸泡24H后用蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150攝氏度或以上，過夜以除去任何RNA酶。

為保持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整及其DNA或RNA含量及位置盡可能的穩(wěn)定，被測的生物樣品必須固定。DNA比較穩(wěn)定而RNA很容易降解，對于DNA的固定來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。（2）、樣品的預處理

①內(nèi)源性酶的滅活；②RNA酶的處理；③鹽酸處理；④去污劑處理；⑤蛋白酶處理

（3）、預雜交

為防止背景污染，有時要進行預雜交。預雜交液和雜交液比較起來只是不含探針和硫酸葡萄糖，其他成分相同。如果檢測染色體DNA，預雜交及雜交中的DNA必須先變性，但變性處理可能破壞染色體的形態(tài)，實際操作時，必須找到適當?shù)姆椒ㄔ陔s交信號與形態(tài)間取得平衡。（4）、雜交

雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片以防止孵育過程中雜交液的蒸發(fā)，然后將玻片放在濕盒中進行孵育。（5）、雜交后的清洗

雜交后的清洗是為了除去非特異性的雜交，即探針與部分同源序列的結(jié)合、這種非特性雜交會干擾特異的雜交信號。由于這種雜交體的穩(wěn)定性不及完全互補配 …10…

對的雜交體，控制雜交后洗脫液的嚴謹度就可以除去非特異的雜交，即采用系列不同濃度、不同溫度的鹽溶液逐步漂洗。（6）、免疫學檢測

根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理。細胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進行半定量的測定。非放射性核酸探針雜交的細胞或組織可利用酶檢測系統(tǒng)顯色，然后利用顯微分光光度計對不同類型數(shù)量的核酸顯色強度進行檢測。

3、原位雜交的應用方向

原位雜交區(qū)別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術。其他雜交方法正能證明該病原體、細胞或組織中是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細胞或組織中存在的部位，而原位雜交是經(jīng)適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，因此可以確定探針的互補序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點具有重要的生物學和病理學意義。例如，對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示特定的序列的位置；對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排列；與細胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術。

五、菌落原位雜交【11】

菌落原味雜交是將細菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂解以釋放出的DNA。將DNA烘干固定于膜上與磷32標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。實驗步驟如下：

①將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平血瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌牙簽挑去單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同。②培養(yǎng)細菌至產(chǎn)生1~2mm大小的菌落。

③在一塊平血中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體。將帶有菌落的濾膜取下，輕輕置于濾紙上，菌落面朝上，注意防止在濾膜底面存有氣泡。④5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液，（0.5mol/L NaCl,0.5mol/L Tris-NaCl）浸濕的濾紙上，放置10min。

⑤將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶（0.5mol/L NaCl,0.5mol/L Tris-HCL，Ph8.0）浸濕的濾紙上，…11…

放置10min。重復中和一次。

⑥將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過的濾紙上，放置10min。SSPE配成20×貯備液：3.6mol/L NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(Ph7.4),20mmol/L EDTA(Ph7.4)。⑦將濾膜將濾紙吸干，80攝氏度真空烘干2h。

致謝:

化學工業(yè)出版社及生物-醫(yī)藥出版社聯(lián)合出版的《核酸分子雜交技術》 參考文獻：

[1] 瘋作化，皇甫永穆主編，醫(yī)學分子生物學。第2版，武漢：武漢出版社，2000 [2] 黃培堂等譯，分子克隆實驗指南，第3版，北京：科學出版社，2002

[3] Kroczek R A.Southern and northern analysis.J Chromatogra phy,1993,618(1~2):133~145 [4] Kido C, Murano S,Tsuruoka M.Rapid and simple detection of PCR product DNA: a comparison between southern hybridization and fluorescence polarization analysis.Gene,200,259(1～2)：123～127 [5] Lee H.Birren B ,Lai E.Ultraviolet nicking of large DNA molecules from pulsed-field gels for Southern transfer and hybirdzation.Anal Biochem, 1991,199(1):29～34 [6] Goldberg D A.Isolation and partial characterization of the Drosophila alcohol dehydrogenase.Proc Natl Acad Sci,1980,77:5794～5798 [7] Lehrach H, Diamond D,Wozney J M, et al.RNA molecular weight determinations by gel electrophoresis under denaturing cinditions:A critical reexamination.Biochemisty,1977,16:4743～4751 [8] Rosen K M,Lamperti E D, Villa-Komaroff L.Optimizing the northern blot procedure.Bio Techniques, 1990,8:398～403 [9] Pardue,M L, Gall J G.Moleccular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological Preparations.Proc Natl Acad Sci USA, 1969,64:600～604 [10]John H,Birnstiel M, Jones K.RNA-DNA hybrids at the cytological level.Nature,1969，223：582～587 [11]Grunstein M, Wallis j.Colony hybridization.Methods Enzymol, 1979,68:379～389 …12…

第五篇：基因工程論文

學號：13054107

基因工程結(jié)課論文

靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重組質(zhì)粒表達載體構(gòu)建

院（系）名

稱： 理學院 專業(yè)

名

稱： 生物科學 學

生

姓名： 姜己玉 所

在班

級： 13-1

目錄

摘要............................................................................................................................................2 第一章 緒論..............................................................3 1..1RNAi的研究進展....................................................3 1.1.1RNAi的分子作用機制...........................................3 1.1.2 RNAi 的特點..................................................3 1.1.3 siRNA簡介.........................................................3 1.1.4 s iRNA 的設計原則..........................................3 1.2 用于 RNA i 的載體....................................................4 1.2.1 載體的選擇..................................................4 1.2.2 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的.................................................4 1.3 MRP1 的研究進展......................................................4 第二章 實驗材料與方法.....................................................5 2.1 實驗材料.............................................................5 2.1.1 宿主菌.............................................................5 2.1.3 載體通用引物................................................5 2.1.5 主要儀器..........................................................5 2.2 試驗方法.........................................................5 2.2.1 shRNA 的設計與退火..................................................5 2.2.2 合成干涉片段的退火..........................................6 2.2.3 重組載體的構(gòu)建..............................................6 2.2.4 菌落PCR初步篩選陽性重組子..................................7 2.2.5 測序鑒定重組載體...............................................7 第三章 結(jié)果與分析.........................................................8 3.1 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后膠回收結(jié)果...........................8 3.1.1 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后結(jié)果.............................8 3.1.2 目的片段的回收................................................8 3.2 重組質(zhì)粒的菌落PCR...................................................8 3.3 重組質(zhì)粒大量提取......................................................8 3.4 重組質(zhì)粒測序結(jié)果.................................................8 參考文獻..................................................................9

摘 要

癌癥嚴重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢。化療作為其常規(guī)臨床治療手段，在癌癥治療中具有手術和放射治療不能替代的作用。腫瘤細胞的多藥耐藥性（multidrug resistance, MDR）是導致腫瘤細胞化療失敗的主要原因。腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥的原因較為復雜，多藥耐藥相關蛋白1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1）的過度表達是導致其產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因之一。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的能快速、高效、特異的沉默目的基因表達的技術，如能通過RNAi技術沉默MDR1基因，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎。

目的：本課題選用pRNAT-H1.1/shuttle-RFP表達穿梭載體。構(gòu)建針對mrp1 mRNA的RNA干擾表達載體。

方法：將預先根據(jù)MRP1基因序列設計合成的編碼siRNA的cDNA序列與pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒載體連接，構(gòu)建靶向mrp1 siRNA重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α后大量提取重組質(zhì)粒，經(jīng)菌落 PCR和 DNA測序分析檢測重組載體構(gòu)建結(jié)果。

結(jié)果：成功構(gòu)建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重組質(zhì)粒表達載體。為下一步抑制mrp1基因在腫瘤細胞中的表達奠定基礎。

關鍵詞：RNA干擾；MRP1；pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒；穿梭載體

第1章 緒 論

1.1 RNAi的研究進展

RNA干擾(RNA interference , RNAi)是由雙鏈RNA分子介導的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，為一種雙鏈RNA分子在mRNA 水平上關閉相關基因表達的過程，是一項新興的基因阻斷技術。RNAi有望成為分析人類基因組功能的有力工具，在腫瘤病因、免疫機制及治療等方面的研究上有廣闊的發(fā)展前景。

1.1.1 RNAi的分子作用機制

RNAi的作用機制在眾多學者的努力研究下日漸明朗。不同生物體內(nèi)的RNA干擾作用機制也各有不同，但是主要可以分為兩種類型：特異效應作用機制與非特異效應作用機制。特異性效應一般發(fā)生在短雙鏈RNA（21～23nt）上，非特異性效應發(fā)生于長雙鏈RNA（30nt以上）。

1.1.2 RNAi的特點

RNAi具有高效性，也就是說與細胞內(nèi)的mRNA的量相比，注入細胞內(nèi)的siRNA的量要少得多。但由于循環(huán)放大機制的存在，仍可以有效地阻斷目的基因的表達；同時，RNAi也具有高特異性，小干擾RNA由dsRNA降解得到的，除在序列識別中不起主要作用的正義鏈3′端的兩個堿基以外，其余堿基均為必需。

1.1.3 siRNA簡介

RNA干擾作用是通過siRNA（small interfering RNA，siRNA）這類小RNA分子作為較穩(wěn)定的中間介質(zhì)實現(xiàn)的。通過對植物的研究證明，雙鏈RNA復合體降解為35nt左右的小RNA分子后通過序列互補與mRNA結(jié)合，進而降解mRNA。

1.1.4 siRNA的設計原則

RNAi 作用的成功與否，關鍵在于siRNA序列的結(jié)構(gòu)，不同結(jié)構(gòu)的siRNA序列沉默基因的效率差別很大，2001年，Elbashir S M等[應用化學合成法合成了siRNA，并發(fā)現(xiàn)可以誘導哺乳動物發(fā)生RNAi，他們進而據(jù)此提出了siRNA 設計方法：1)從起始密碼下游50~100nt開始搜索siRNA以避免出現(xiàn)于5′或3′端的UTRs 的蛋白結(jié)合位點，；

2)搜索5′AA(N19)UU序列，如果沒有相應序列，可以選擇5′AA(N21)或5′NA(N21)；3)G/C含量在32%~79%之間[16]； 4)要確定siRNA對靶基因的特異性，可以利用Blast軟件在基因組中進行比對，；5)設置在基因組中無對應序列的siRNA的對照siRNA。但是，Elbashir S M等的設計方法siRNA 篩選效率仍然很低，要更好的掌握RNAi。

1.2 用于RNAi的載體

基因工程中，攜帶目的基因進入宿主細胞進行擴增和表達的工具，稱為載體。是指能夠運載外源DNA片段進入受體細胞，具有自我復制能力，使外源DNA片段在受體細胞中得到擴增和表達，不被受體細胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類DNA分子。載體具有以下的功能：（1）運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞；（2）為外源基因提供復制能力或整合能力；（3）為外源基因的擴增或表達提供必要的條件。

1.2.1載體的選擇

質(zhì)粒是為一種1-200kb不等的雙鏈、閉環(huán)的DNA分子。是染色體外穩(wěn)定遺傳，并能以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中的因子。RNA干擾實驗通常選用質(zhì)粒作為載體。質(zhì)粒載體是為適應實驗室操作在天然質(zhì)粒的基礎上人工構(gòu)建的。但是，天然質(zhì)粒的缺點是分子量大，拷貝數(shù)低，所以為使分子量盡可能減少，必須去掉大部分的非必需序列，以便于基因工程操作。

1.2.2 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的

天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對之進行改造構(gòu)建

1.3 MRP1的研究進展

MRP1的底物 直接通過細胞毒性分析和底物刺激的ATP酶測量進行識別MRP1的底物的，底物是由大量的多樣化的疏水復合物，有機陰離子結(jié)合物以及陰離子非結(jié)合性底物所組成。典型的結(jié)合型底物包括：谷胱甘肽，葡糖醛酸和硫酸鹽結(jié)合物，MRP1的組織分布 MRP1在體內(nèi)的表達可以說是無所不在。

第2章 實驗材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 宿主菌

E.coli DH5α：為感受態(tài)宿主菌由北京鼎國生物技術有限責任公司提供。

2.1.2 質(zhì)粒載體

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒。pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒特性如下：pRNAT-H1.1/shuttle 是一種腺病毒siRNA穿梭質(zhì)粒，shRNA的表達由人的轉(zhuǎn)錄啟動子H1 Promoter啟動，H1啟動子屬于PolⅢ啟動子，該啟動子總在其下游的固定距離開始轉(zhuǎn)錄合成RNA，轉(zhuǎn)錄過程遇到4~5個連續(xù)的U即終止，非常精確；同時CMV Promoter為真核生物啟動子，可在該質(zhì)粒中高效啟動紅色熒光蛋白的表達；MCS為多克隆位點。

2.1.3 載體通用引物

正向引物（M13）：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ 反向引物（Rev）：5′-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3′

2.1.4 主要試劑、具酶及儀器

質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校琒anprep柱式DNA膠回收試劑盒，10×PCR buffer，dNTP，Marker(1kb,100bp)，Goldview DNA染料，EDTA Bio Basic Inc 溶菌酶，LiCl Amresco RNase Sigma bacto-typtone Bio Basic Inc bacto-yeast extract Bio Basic Inc PEG8000，HindⅢ NEB，BamHI NEB，T4DNA連接酶 NEB，Taq酶，微量振蕩器（MM-2型），微量振蕩器（MM-2型），恒溫空氣搖床，電子天平，紫外分析儀（ZF型），低溫離心機（SK18），低溫離心機（SK18），PCR儀（9600型），ABI 恒溫磁力攪拌器（2003-16），恒溫水浴鍋，自動雙重純水儀

2.2 實驗方法

2.2.1 shRNA的設計與退火

根據(jù)siRNA設計原則[34]，根據(jù)MRP1靶序列，設計合成四對互補反向重復脫氧核糖核酸序列，中間間隔9nt莖環(huán)序列(TTCAAGAGA)，5′端帶有BamHⅠ酶切位點，3′端帶有HindⅢ酶切位點，用BLAST進行同源性分析，確定與其他基因無同源性。shRNA的 5

DNA模板由上海生工合成，單鏈干涉片段退火后形成雙鏈。根據(jù)2個靶序列設計的2對DNA干涉片段mrp1-1，mrp1-2。

2.2.2 合成干涉片段的退火

合成片段的退火體系：各管混勻后90℃保溫3分鐘，37℃保溫1h，再取5μL退火溶液加45μL 滅菌雙蒸水混勻，使干涉片段終濃度為8ng/μL。

2.2.3 重組載體的構(gòu)建

（1）將含有pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒的大腸桿菌接種入盛有200mL LB培養(yǎng)基（含2μg/mL氨芐青霉素）的500mL三角瓶中，置37℃振蕩培養(yǎng)過夜（置搖床中160r/min）。（2）實驗前預先配制溶液Ⅱ，溶菌酶。預冷溶菌酶、溶液Ⅰ和溶液Ⅲ。取出菌懸液，觀察菌體生長狀況，將菌懸液分裝于兩個250ml離心桶中，調(diào)平。預冷離心機至4℃，4℃下8000r/min離心5min，棄上清，得菌體。（3）加預冷的溶液Ⅰ50ml于每離心桶，混勻，洗滌沉淀。8000r/min離心5min，棄上清，得沉淀。此步驟的目的為出去培養(yǎng)基，以獲得更純的細菌沉淀物。（4）用17ml溶液Ⅰ吹散重懸細菌沉淀物，加3ml新配制的溶菌酶溶液，溫和混勻，室溫放置10min，裂解大腸桿菌。（5）加40ml新配制的溶液Ⅱ，以使菌體破碎，釋放質(zhì)粒DNA等內(nèi)容物。緩慢顛倒數(shù)次，防止破壞基因組DNA，室溫放置3min。（6）加30ml預冷的溶液Ⅲ，緩慢顛倒數(shù)次，防止SDS破壞基因組DNA，冰浴放置15min。4℃下以10000r/min離心10min，然后將上清液全部倒入新離心桶中。（7）將上清液在4℃下以10000r/min離心10min，然后將上清液經(jīng)8層紗布過濾至新離心桶中。（8）加0.6倍體積（約54ml）的異丙醇，充分混勻，室溫放置15min，以沉淀核酸。8000r/min離心15min，小心倒掉上清，敞開瓶口倒置于紙巾上，使殘余上清液流盡，晾干。（9）加15ml水再加15ml LiCl（預冷）混勻，靜置沉淀15min，4℃下10000r/min離心15min，以出去蛋白質(zhì)和RNA。（10）倒上清于新的離心桶中，加30ml異丙醇，劇烈震蕩，靜置沉淀15min，在4℃下以10000r/min離心15min。再次沉淀核酸。（11）棄上清，得到沉淀的核酸。敞開瓶口倒置于紙巾上使殘余上清液流盡。（12）用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下以10000r/min離心5min，棄去乙醇，離心桶敞口倒置于紙巾上，使乙醇揮發(fā)殆盡。此步驟可以沉淀DNA。（13）加2ml無菌水溶解沉淀，將液體吸到10ml離心管中，再吸2ml ddH2O沖洗瓶壁，隨后將洗液加到同一10ml離心管中，隨后加100μl RNaseA，37℃，水浴30min。以使RNA徹底分解。（14）加等體積含13％（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量離心機于4℃以12000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，以回收質(zhì)粒DNA。（15）沉淀用3ml70%乙醇重懸清洗，以除去PEG，12000r/min離心8min。（16）重復上步操作，將離心管倒扣于紙巾上10min，加1ml H2O溶解，用等體積酚/氯仿/異戊醇再抽提一次蛋白質(zhì)，室溫下8000r/miin離心10min。（17）小心吸上清與另一離心管中，加2倍體積的預冷無水乙醇，再加0.1體積的NaAC（3mol，pH5.2），冰上沉淀20min，4℃下10000r/min離心15min，使DNA沉淀出來。（18）去上清加入3ml 70%乙醇重懸清洗，10000r/min 離心15min，晾干，用500μl無菌水溶解沉淀。

2.2.4菌落PCR初步篩選陽性重組子

滅菌牙簽挑取LB篩選平板上圓滑單菌落，先在預先分隔并標記的另一LB平皿上劃板，然后點入制備好的PCR反應混合液，開始擴增。PCR反應條件為：94℃預變性2分鐘；94℃ 變性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸45s，共35個循環(huán)；72℃ 延伸1分鐘，4℃保存，1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。劃板的平皿于37℃培養(yǎng)12-16h。

2.2.5 測序鑒定重組載體

將小提鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒送交上海生工生物工程技術服務有限司，以載體反向引物為測序引物。將經(jīng)鑒定后未發(fā)生突變的H1.1-

1、H1.1-2靶向MRP1基因siRNA重組質(zhì)粒的宿主菌搖瓶擴大培養(yǎng)后，進行質(zhì)粒大量提取,方法如2.1.2.3.1所述。

第3章 結(jié)果與分析

3.1 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后膠回收結(jié)果

3.1.1 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后結(jié)果

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切，結(jié)果顯示單酶切產(chǎn)物大小約為6200bp，雙酶切產(chǎn)物略小于單酶切產(chǎn)物，與預期結(jié)果相符。

3.1.2 目的片段的回收

目的片段回收 ,結(jié)果顯示回收產(chǎn)物大小約為6Kb，與預期結(jié)果相符。

3.2 重組載體的菌落PCR 重組載體菌落 PCR電泳，結(jié)果顯示PCR擴增產(chǎn)物,電泳分析發(fā)現(xiàn)陽性產(chǎn)物可以擴增出560bp大小的條帶，假陽性產(chǎn)物不能擴增出560bp大小的條帶,與預期結(jié)果相符，可以初步篩選出陽性產(chǎn)物。

3.3 重組質(zhì)粒大量提取

重組質(zhì)粒大量提取后的電泳，結(jié)果顯示pRNAT-H1.1/shuttle-RFP 重組質(zhì)粒大小約為6.2kb，與預期結(jié)果相符。

重組質(zhì)粒大提并稀釋50倍以后在紫外分光光度儀Genespec上測其OD值。

3.4 重組質(zhì)粒測序結(jié)果

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重組質(zhì)粒測序鑒定，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒的堿基序列與預期結(jié)果一致，未發(fā)生堿基突變，說明pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

參考文獻

[1] 張淑華.小干擾RNA靶向VEGF基因在體內(nèi)外抑制乳腺癌細胞增殖的研究[D].青島:青島大學碩士，2007.[2] Sharp PA.RNA interference-2001.Genes Dev.2001, 15: 485-490.[3] 康潔, 劉福林.RNAi的抗病毒作用及其機制[J].現(xiàn)代免疫學, 2004, 24(5): 439-441.[4] 林少微,王雪華,鄭高哲等.RNAi的研究進展 [J].中國醫(yī)藥導報, 2007, 4(29)_3.[5] 黃艷敏,賈欣秒.RNA干擾技術的研究進展 [J].河北化工, 2009, 32(1):213-216.[6] 鄧慶.E2F8及腫瘤-睪丸(CT)基因在肝癌中作用的研究[D].上海交通大學碩士.2009.[7] 賴長城.人類Pin1在食管癌組織中的表達[D].福建:廈門大學碩士.2008.[8] 魏群，分子生物學實驗指導（第二版）[Q]2007,11:3.[9] 陳愛葵,李梅紅.RNAi的研究及應用 [J].廣東教育學院學報, 2008, 28(3):5.[10] 王光海.MRP1與肺癌耐藥.臨床肺科雜志[J].2005,5，（3）：367.