第一篇：分子生物學(xué)論文

分子生物學(xué)論文

姓名：

專業(yè)：藥學(xué)

班級(jí)：11級(jí)藥學(xué)三班 學(xué)號(hào)：

基因工程抗體治療白血病的研究進(jìn)展

【摘要】目前采用基因工程藥物治療白血病逐漸成為熱點(diǎn)。研究表明白血病在獲得緩解后用基因工程藥物治療即可提高療效，又可減輕化療藥物的毒副反應(yīng)，并可望達(dá)到治愈白血病的目的。

【關(guān)鍵詞】白血病；基因工程抗體；研究進(jìn)展

引文

白血病是一類造血干細(xì)胞的克隆性疾病，在骨髓和其他造血組織中白血病細(xì)胞大量增生積聚，并浸潤(rùn)其他器官和組織，而使正常造血受抑制。在兒童至35歲以下青壯年人群中因患惡性腫瘤致死的以白血病為首，故可稱為“第一殺手” [1]。治療白血病通常采用細(xì)胞毒藥物，雖然能使大部分患者病狀緩解和生存期延長(zhǎng)，但治愈率仍很低?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展為降低單克隆抗體的免疫源性提供了一個(gè)有力的手段。目前嵌合抗體、人源化抗體和全人抗體三種人源抗體很好地克服了HAMA反應(yīng)的缺陷。2 正文

Campath一1H是在體內(nèi)外對(duì)大部分正常和惡性淋巴細(xì)胞都有溶解殺傷作用的人源化CD52抗體，但對(duì)造血干細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用。起初，Campath一1H主要集中在對(duì)非霍奇金淋巴瘤(NHL)的臨床試驗(yàn)中，但由于Campath一1H對(duì)血循環(huán)中的淋巴細(xì)胞有強(qiáng)力的清除作用，現(xiàn)已經(jīng)將其應(yīng)用到CLL、T— PLL疾病中。

氟達(dá)拉濱等嘌呤類似物在各種慢性淋巴細(xì)胞白血病的治療中獲得較高的緩解率，但完全根除疾病的報(bào)道很少。將Campath一1H給予預(yù)先接受氟達(dá)拉濱治療的CLL患者，來(lái)清除微小殘留病變(MRD)，從而提高完全緩解率和持續(xù)時(shí)間，這可以使難治性CLL患者的總生存率(overall survival，OS)得到改善。Galimbeai[2] 等對(duì)8名CLL患者在氟達(dá)拉濱治療后給予Campath一1H治療。在Campath一1H治療后，5例患者獲得分子學(xué)緩解(62．5％)，其中4例在治療結(jié)束后一個(gè)月內(nèi)獲得。OR(overall response)率為72％，CR率為43％，因此Campath一1H對(duì)CLL的治療作用是顯著的。

另外，Keating[3]等 2002年對(duì)76例先前治療過(guò)的T—PLL患者給予Campath—IH治療的安全性和功效進(jìn)行了回顧性的分析。接受Campath一1H治療的患者，其OR率為51％，CR為39．5％，CR中位持續(xù)時(shí)間8．7個(gè)月，0s率為7．5個(gè)月(CR者14．8個(gè)月)。作者認(rèn)為Campath一1H是補(bǔ)救T—PLL一線治療失敗__的較好藥物。

在造血干細(xì)胞移植中，Campath一1H還能有效地清除供者的T淋巴細(xì)胞而不影響采集的干細(xì)胞的數(shù)目和功能，成為預(yù)防異基因移植中預(yù)防移植物抗宿主病(GVHD)較為理想的藥物。

隨著減輕強(qiáng)度的預(yù)處理(RIC)方案的發(fā)展，出現(xiàn)了“非清髓性”造血干細(xì)胞移植。這種方案主要是靠免疫活性細(xì)胞作用，目的是使供體干細(xì)胞既易于植入，又最終起到根除腫瘤的作用。通常是包括氟達(dá)拉濱等藥物的聯(lián)合應(yīng)用，但仍然有較高的慢性GVHD的發(fā)生和死亡率。而Campath一1H能有效地清除供受者的T淋巴細(xì)胞，從而減少了排斥反應(yīng)和GVHD的發(fā)生，為“非清髓性”移植提供了一種較為理想的免疫抑制效應(yīng)。Faulkner[4] 等報(bào)道了65例接受BEAM+Campath一1H預(yù)處理方案進(jìn)行異基因移植的患者，包括CLL、PLL，中位年齡為45．6歲。其中Campath—IH每天用10mg。11例發(fā)生了急性GVHD(I一Ⅱ)，9例發(fā)生了慢性GVHD。55例獲得了反應(yīng)，其中41例為CR，6例復(fù)發(fā)。2年Os率為68．1％，無(wú)事件生存率(EFS)為57．7％。結(jié)果2年移植相關(guān)死亡率(TRM)為13．3％。3 結(jié)語(yǔ)

基因工程藥物治療白血病首先可以有效的避免治愈白血病過(guò)程中由于腫瘤的微小殘留病變(MRD)不能被徹底清除而引起的疾病復(fù)發(fā)；其次是避免單純化療帶來(lái)的毒副反應(yīng)而引起機(jī)體的損傷以及機(jī)體對(duì)化療藥物的耐受性。因此用基因工程藥物治療白血病的方法成為了國(guó)內(nèi)外科學(xué)家研究熱點(diǎn)。我國(guó)與國(guó)外相比，雖起步較晚，但也獲得了較大的發(fā)展，取得了一定的科研成果。例如，已經(jīng)研制成功和正在研制的基因工程產(chǎn)品就有幾十種，有些已經(jīng)投產(chǎn)并開(kāi)始使用，女ⅡIFN一、rhIL一

2、rhG—CSF、rhGM—CSF等?？傊?，基因工程藥物治療前景是十分誘人的，還有待于科研工作者的繼續(xù)努力，讓它為人類的健康作出更大的貢獻(xiàn)。

【參考獻(xiàn)文】

[1] 楊進(jìn)．血液病中西醫(yī)結(jié)合治療學(xué)[M]．北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2005：65．

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[3]Keating MJ，Cazin B，Coutre S，et a1．Campatb一1H treatment of T—cell prolymphocytie leukemia in patients for whom at I east oneprior chemotherapy regimen has failed[J]．J Clin Oncol，2002，20(1)：205—213． [4] Faulkner RD，Craddock C，Byrne JI，et a1．BEAM—alemtuzumabreduced intensity allogeneic stem cell transplantation for lympho—proliferative diseases；GVHD，toxicity，and survival in 65patients[J]．Blood，2004，103(2)：428-434．

第二篇：淺談分子生物學(xué)發(fā)展期中論文

淺談分子生物學(xué)的未來(lái)發(fā)展

摘要：在生命科學(xué)飛速發(fā)展的時(shí)代里，分子生物學(xué)的發(fā)展揭示了生命本質(zhì)的高度有序性和一致性，生命活動(dòng)的一致性，是生物學(xué)范圍內(nèi)所有學(xué)科在分子水平上的統(tǒng)一，分子生物學(xué)是目前自然學(xué)科中進(jìn)展最迅速、最具活力的領(lǐng)域之一，本文在分析分子生物學(xué)的現(xiàn)狀基礎(chǔ)上淺談分子生物學(xué)的未來(lái)發(fā)展里比較感興趣的幾方面，其中包括醫(yī)學(xué)方面中，RNA干擾技術(shù)從基因水平上進(jìn)行基因診斷和基因治療和Micro RNA（Mi RNA）對(duì)治療腫瘤疾病的研究進(jìn)展，同時(shí)還有在基因工程方面轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的培育里對(duì)DNA重組技術(shù)的研究。

關(guān)鍵字：分子生物學(xué)，RNA干擾技術(shù)，Micro RNA，肺癌靶向治療

在生命科學(xué)飛速發(fā)展的時(shí)代里，分子生物學(xué)的發(fā)展揭示了生命本質(zhì)的高度有序性和一致性，生命活動(dòng)的一致性，是生物學(xué)范圍內(nèi)所有學(xué)科在分子水平上的統(tǒng)一，分子生物學(xué)是目前自然學(xué)科中進(jìn)展最迅速、最具活力的領(lǐng)域之一。要談分子生物學(xué)的未來(lái)發(fā)展，首先就分子生物學(xué)的現(xiàn)狀來(lái)看，分子生物學(xué)的發(fā)展及其在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用已經(jīng)走過(guò)了半個(gè)多世紀(jì)的路程，目前在醫(yī)學(xué)院校和省級(jí)以上的醫(yī)院均建立了臨床分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。隨著分子生物學(xué)的興起，分子生物學(xué)滲入到各個(gè)分支學(xué)科中，比如在發(fā)育生物學(xué)產(chǎn)生了分子發(fā)育生物學(xué);與細(xì)胞生物學(xué)關(guān)系密切,已形成一門新的分子細(xì)胞生物學(xué)，許多細(xì)胞生物學(xué)問(wèn)題如細(xì)胞分裂、細(xì)胞骨架、細(xì)胞因子的研究都進(jìn)入了分子水平;與免疫學(xué)結(jié)合,產(chǎn)生了分子免疫學(xué)；與病理學(xué)結(jié)合,產(chǎn)生了分子病理學(xué)。因?yàn)榉肿由飳W(xué)的廣泛滲透與應(yīng)用，推動(dòng)了分子生物學(xué)對(duì)生命現(xiàn)象和本質(zhì)的研究不斷深入和擴(kuò)大，其發(fā)展也為其他相關(guān)科學(xué)提出了許多新的研究課題，開(kāi)辟了許多新的研究領(lǐng)域，所以在分子生物學(xué)的未來(lái)發(fā)展中，前景是相當(dāng)可觀的。

在醫(yī)學(xué)方面，生物學(xué)的一些重大問(wèn)題，比如癌、艾滋病、遺傳病激增（從400種到4000種），一直沒(méi)有獲得解決。對(duì)于癌癥，癌癥是人體中一部分生長(zhǎng)、增殖和分化失去控制的細(xì)胞。癌細(xì)胞具有脫分化、癌異質(zhì)型性(DNA、蛋白質(zhì)或量的增加)、無(wú)限增殖性、浸潤(rùn)性、癌DNA、蛋白質(zhì)高螺旋化、甲基化、它失去接觸抑制、對(duì)生長(zhǎng)因子需求降低、細(xì)胞骨架紊亂、細(xì)胞表面和黏附性質(zhì)改變等主要特征。在針對(duì)癌物質(zhì)變化的研究中，從分子上入手對(duì)癌物質(zhì)進(jìn)行透徹了解，會(huì)揭開(kāi)新一輪的癌癥治愈革命。

RNA干擾的發(fā)現(xiàn)是一大壯舉，近幾年來(lái)一直成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。21世紀(jì)初，人類完成了基因組計(jì)劃，破譯人類全部的遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面認(rèn)識(shí)自我。因此，很多疾病的病因也將揭開(kāi)神秘的面紗，這位這些疾病的基因診斷和基因治療奠定了基礎(chǔ)。因此，利用RNA干擾技術(shù)抑制基因組的基因表達(dá)的技術(shù)手段，有可能在基因治療方面開(kāi)辟一條心的途徑，克服醫(yī)學(xué)上許多疑難雜癥，例如，病毒性疾病，腫瘤心血管疾病和遺傳性疾病。在癌癥研究中，通過(guò)shRNA表達(dá)載體成功抑制了成年大鼠腦癌細(xì)胞，同時(shí)對(duì)RNAi遠(yuǎn)程基因沉默進(jìn)行了非常有益的探索。RNAi干擾的進(jìn)展給研究很多啟示,我們可以通過(guò)構(gòu)建RNA干擾系統(tǒng)來(lái)下調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)，從而研究該基因的功能或者用于基因治療。以往，我們?nèi)绻胂抡{(diào)一個(gè)基因的表達(dá)往往要使用核酶、定點(diǎn)突變。這些方法與RNAi技術(shù)相比，有很多缺陷；此外，RNAi干擾還表現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景，我們可以研究腫瘤細(xì)胞，制備相應(yīng)的RNA，對(duì)腫瘤細(xì)胞的相關(guān)關(guān)鍵基因進(jìn)行干擾，從而抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。

最新的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RNAi技術(shù)用于抑制腫瘤生長(zhǎng)因子的表達(dá)可以抑制動(dòng)物模型的腫瘤生長(zhǎng)，并已經(jīng)應(yīng)用于快速鑒別新的腫瘤靶目標(biāo)，所以這項(xiàng)技術(shù)在腫瘤的基因治療七有光明的應(yīng)用前景。再則，腫瘤是多基因、多因素疾病，單個(gè)癌基因的抑制往往很難達(dá)到治療效果。RNAi技術(shù)能夠同時(shí)抑制多個(gè)不同基因，而且抑制效果互不干擾。

盡管目前對(duì)這項(xiàng)功能強(qiáng)大的技術(shù)已經(jīng)有深入的了解，新的結(jié)果不斷涌現(xiàn)，但RNAi技術(shù)應(yīng)用與腫瘤的基因治療還需要進(jìn)一步探索，相關(guān)問(wèn)題有dsRNA序列的不同而產(chǎn)生不同抑制療效，不同的mRNA對(duì)RNAi的敏感性不同及大于30個(gè)bp的dsRNA可導(dǎo)致非特異性反應(yīng)等。雖然如此，因RNAi在基因特異性治療方面的突出優(yōu)勢(shì)，使其在腫瘤的基因治療方面將會(huì)具有更加廣闊的應(yīng)用前景。

還有，近年來(lái)，關(guān)于miRNA(Micro RNA簡(jiǎn)寫)的研究新進(jìn)展很多，我在中國(guó)腫瘤生物治療雜志中有個(gè)較為感興趣的研究進(jìn)展，miRNA是一類內(nèi)源性、非編碼的單鏈小分子RNA，作用廣泛，參與生命活動(dòng)的一系列重要進(jìn)程，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。最近研究表明，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞可利用miRNAs調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤形成或被抑制。比如，某些miRNAs上調(diào)抗凋亡基因，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡；而另外一些miRNAs則可以下調(diào)抗凋亡基因而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡

miRNA let-7是最早發(fā)現(xiàn)之一，在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖，且在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，miRNA let-7與人類多種癌癥的發(fā)生有關(guān)，其中與肺癌的關(guān)系最為密切，miRNA let-7在肺癌中表達(dá)顯著降低，在非小細(xì)胞肺癌中尤為多見(jiàn)，其低表達(dá)可能與腫瘤預(yù)后不良有關(guān)，而高表達(dá)則直接抑制肺癌生長(zhǎng)，miRNA let-7作為腫瘤抑制因子負(fù)性調(diào)控多種癌基因，同時(shí)也負(fù)性調(diào)控多種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，在肺癌組織中起到了腫瘤抑制因子的作用，有望成為肺癌基因治療和預(yù)后判斷的一個(gè)新靶標(biāo)。

盡管大量研究表明，miRNA表達(dá)改變與多種腫瘤發(fā)生關(guān)系密切,但目前利用miRNA作為腫瘤基因診斷指標(biāo)，尚缺乏一套成熟的判斷標(biāo)準(zhǔn)。而通過(guò)導(dǎo)人外源miRNA或抑制細(xì)胞內(nèi)miRNA表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)抑制癌基因或上調(diào)抑癌基因表達(dá)目的的基因治療,也由于靶向性、安全性和有效性等問(wèn)題,使基因治療研究面臨重重困難。盡管如此,作為一類新型分子標(biāo)記物，miRNA在肺癌發(fā)生發(fā)展、基因診斷和基因治療中的應(yīng)用價(jià)值仍然是今后研究的熱點(diǎn)。

除了醫(yī)學(xué)的疾病，動(dòng)植物方面轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的培育也是一大重點(diǎn)研究方向，尤其是轉(zhuǎn)基因食品一直都是熱題。對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的限制，以及對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)植樹(shù)技術(shù)的審慎，意味著人類已經(jīng)意識(shí)到，DNA重組技術(shù)是對(duì)人類和其他生物的基因組即遺傳內(nèi)環(huán)境的破壞。這與世界的科技進(jìn)步對(duì)整個(gè)地球大環(huán)境的破壞一樣：我們?cè)讷@得現(xiàn)實(shí)利益的同時(shí)，可能要承受未來(lái)無(wú)法預(yù)料的災(zāi)難。因此，在進(jìn)行基因工程的同時(shí)，我們必須考慮到維持體內(nèi)基因環(huán)境的平衡。這是21世紀(jì)的一個(gè)新課題，是一大新的挑戰(zhàn)與機(jī)遇。

[5]

[4]

[3]

[2]

[1]隨著生物科學(xué)的眾多分支學(xué)科也將在更高層次上實(shí)現(xiàn)理論的大綜合，分子生物學(xué)技術(shù)將會(huì)進(jìn)一步普及，21世紀(jì)分子生物學(xué)的發(fā)展將進(jìn)入一個(gè)新時(shí)代。

參考文獻(xiàn)：

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第三篇：《分子生物學(xué)與基因工程》課程論文

植物基因工程研究進(jìn)展

摘要：自1983年美國(guó)人首先成功地獲得抗卡那霉素的煙草再生植株開(kāi)始，人類就開(kāi)始了植物基因工程的研究。至今已在逾200種植物中成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株,并有近1000例轉(zhuǎn)基因植物獲準(zhǔn)進(jìn)行田間試驗(yàn),更有十余種轉(zhuǎn)基因植物(如轉(zhuǎn)基因棉花.大豆)已進(jìn)入商業(yè)化種植.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品已進(jìn)入人們?nèi)粘Ｉ?。植物基因工程的?yīng)用已進(jìn)入蓬勃發(fā)展階段。下面是我從植物基因工程改善生物質(zhì)能利用的研究進(jìn)展做一說(shuō)明。

關(guān)鍵詞：木質(zhì)纖維素 細(xì)胞壁 水解酶

近幾年來(lái)全世界對(duì)能源的需求量急劇增加加速了對(duì)有限的不可再生礦物質(zhì) 能源的消耗資源的利用也增加了CO2及粉塵的排放,造成環(huán)境破壞和全球氣候變 化[1]可再生的清潔的生物質(zhì)能成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。其中的燃料乙醇工業(yè),近年來(lái)在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的發(fā)展,我國(guó)也大力支持發(fā)酵乙醇用作能源[2]。目前,絕大部分乙醇來(lái)源于玉米淀粉發(fā)酵生產(chǎn)。但是由于淀粉本身又作為食品和飼料,產(chǎn)量有限,成本較高,阻礙了乙醇工業(yè)的發(fā)展。于是,人們把注意力轉(zhuǎn)移到谷物秸稈等廉價(jià) 的含有大量 的木質(zhì) 纖維素 的生物質(zhì) 材料上希望 能夠被 充分利用 [3]。但由于木質(zhì)纖維素本身難以分解,許多研究利用 基 因工程 方法 改善植物,使自生產(chǎn)生的多糖資源更利于降解,用于發(fā)酵產(chǎn)乙醇。1.木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇發(fā)展現(xiàn)狀

在中國(guó),大約每年會(huì)產(chǎn)生10t億農(nóng)林業(yè)廢棄物這些資源用于造紙、紡織或者直接作為燃料這些占到很少一部分。絕大部分被廢棄了木質(zhì)纖維素是光合作用的基本產(chǎn)物 , 也是生物圈產(chǎn)生的最充足的可再 生生物資源被認(rèn)為是地球上最豐富的生物高分子聚合[4]。

大部分的高等植物細(xì)胞壁由膠聯(lián)多糖、糖蛋白和木質(zhì)素組成雙 子 葉植物 , 如擬南芥等,細(xì)胞壁多糖主要有三種:纖維素半、纖維素和果膠質(zhì),包埋在非 纖 維多糖基質(zhì)(半纖維素和果膠)中的纖維素網(wǎng)絡(luò),與木質(zhì)素和結(jié)構(gòu)蛋白共同構(gòu)成植物細(xì)胞壁的聚合液晶結(jié)構(gòu)[5]天然狀態(tài)下由于木質(zhì)素的保護(hù)作用,阻礙了水解 纖維素酶與纖維素的接觸并發(fā)揮作用,成為影響纖維素水解的重要因素 [3, 4]。YangB等人發(fā)酵降解實(shí)驗(yàn)證明,雖然半纖維素對(duì)纖維素。也有一定保護(hù)作用 , 但木質(zhì)素的去除對(duì)于纖維素有效降解是最關(guān)鍵的[6]。一般對(duì)木質(zhì)纖維素材料 的利用,首先要進(jìn)行粉碎,然后預(yù)處理(酸堿處理等),最后 添 加 微 生物 來(lái)源 的纖維素復(fù)合水解酶類,使之與處理過(guò)的木質(zhì)纖維充分接觸,將其降解為單糖 , 從而用于乙醇發(fā)酵?，F(xiàn)在雖然前期的粉碎和預(yù)處理工藝研究取得了很大進(jìn)展但成本仍然較高，而且后期發(fā)酵分解處理。要添加來(lái)源于微生物的纖維素水解復(fù)合酶,價(jià)格仍十分昂貴[7]。這些因素導(dǎo)致目前用木質(zhì)纖維素作為這些因素 導(dǎo)致 目前用木質(zhì)纖維素作為原料發(fā)酵產(chǎn)乙醇,成本較高發(fā)展緩慢因此,現(xiàn)在對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行高效降解使用,仍然是個(gè)很大的難題。2.植物基因工程與植物木質(zhì)纖維素利用

近年來(lái)隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步,人們開(kāi)始嘗試?yán)弥参锘蚬こ谭椒▉?lái) 解決植物木質(zhì)纖維素有效利用問(wèn)題研究主要集中在改善植物細(xì)胞壁木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)和含量比例等方面,使植物多糖資源利于降解使用，或者利用植物作為生物反應(yīng)器,在植物內(nèi)表達(dá)微生物來(lái)源的強(qiáng)活性纖維素降解酶,使植物自身表達(dá)高活性纖維素水解 酶類等研究。2.1 改善植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成

過(guò)去幾十年的研究,改善木質(zhì)素含量及細(xì)胞壁已成為可能。利用基 因工程方法,控制植物內(nèi)木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá),可以改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和含量木質(zhì)素對(duì)纖維素形成的保護(hù)作用是導(dǎo)致 纖維素資源利用 的主要障礙,降低木質(zhì)素含量或改變其結(jié)構(gòu),將利于纖維素 的分解[8]。雖然植物體木質(zhì)素的合成過(guò)程還不是十分清楚,但近幾年的研究,已使大量降低木質(zhì)素含量成為可能。

在玉米和苜蓿的研究中發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素合成單體之一的芥子醇, 其前體的甲基化合成酶基因COMT(caffeate/5-hydroxyferulate O-methyltransferase),如果被抑制表達(dá),芥子單體含量會(huì)明顯減少,可導(dǎo)致木質(zhì)素含量降低 [9, 10]但是在楊樹(shù)中抑制這種酶的表達(dá)卻不能夠改善材質(zhì),木質(zhì)素含量反而增加[11]。Li L等人在楊樹(shù)中研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)反義表達(dá)4CL基因(4-coumarate-CoA ligase)時(shí),木質(zhì)素含量了減少了約40%,并且導(dǎo)致10%的纖維素含量的增加，如果正義表達(dá)控制木質(zhì)素組成單體紫丁香基丙 烷(syringyl)和愈瘡木基丙烷(guaiacyl)比率的CAld5H基因(Coniferaldehyde 5-hydroxylase),可導(dǎo)致紫丁香基丙烷的量明顯增 高,但木質(zhì)素含量沒(méi)有變化[12]。當(dāng)兩基因同時(shí)轉(zhuǎn)化時(shí),木質(zhì)素含量減少可達(dá)53%,紫丁香基丙烷含量進(jìn)一步增加,而纖維素含量能夠增加30%。Cano-Delgado A等人研究擬南芥CESA3突變體發(fā)現(xiàn),纖維素合成酶受損時(shí),導(dǎo)致了木質(zhì)素大量合成[13]這表明在植物木質(zhì)部細(xì)胞中可能存在一種調(diào)控機(jī)制,當(dāng)木質(zhì)素含量減少時(shí),為了維持支撐作用,纖維素含量會(huì)相應(yīng)增加。Chabannes M等人在煙草中研究發(fā)現(xiàn),同時(shí)抑制CCR(Cinnamoyl CoA reductase)和 CAD(Cinnamyl alcohol dehydrogenase)的表達(dá),可大量減少木質(zhì)素含量,但非預(yù)期 的還引起了細(xì)胞壁多糖酚類物質(zhì)及可溶性酚類物質(zhì)含量的變化[14]等人在番茄中抑制表達(dá)木質(zhì)素合成相關(guān)的CCR基因,導(dǎo)致木質(zhì)素含量降低,同時(shí)與木質(zhì)素形成具有共同前體的酚類復(fù)合物增加[15]。Boudet AM等人通過(guò)抑制楊樹(shù)木質(zhì)素合成酶基因CCR,可導(dǎo)致植物細(xì)胞壁纖維 素成分更容易被纖維素分解菌Clostridium產(chǎn)糖量達(dá)到原來(lái)的2倍[16]這表明,降低木質(zhì)素等物質(zhì)含量后,非常利于纖維資源的利用。Li Y等人研究發(fā)現(xiàn),過(guò)氧化酶影響了木質(zhì)化過(guò)程[17]。Blee KA等人在煙草中反義抑制過(guò)氧化酶FBP1(French bean cationic peroxidase)同系物表達(dá),在不影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的情況下,使木質(zhì)素含量降低了40%~50% [18]。通過(guò)基因工程方法,改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)與含量的方法改善植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),利于作為能源植物,具有重要的研究?jī)r(jià)值。

2.2 植物體內(nèi)表達(dá)木質(zhì)纖維素水解酶

過(guò)去幾十年的發(fā)展,植物已成功的作為重組蛋白表達(dá)的生物反應(yīng)器,它相對(duì)于微生物和動(dòng)物表達(dá)的優(yōu)勢(shì)是具有較低的成本已在多種植物里面進(jìn)行了異源重組蛋白的表達(dá)研究(如疫苗和工業(yè)用酶等),蛋白表達(dá)量高且保持了很好的生物學(xué)活性[19]。近幾年,人們開(kāi)始在植物體內(nèi)進(jìn)行微生物來(lái)源的研究,希望這些植物作為生物反應(yīng)器,大量表達(dá)并在細(xì)胞內(nèi)積累纖維素酶。收獲的植物,經(jīng)過(guò)粉碎和預(yù)處理(酸堿處理等)后,在分解過(guò)程中能利用自身表達(dá)的酶,不添加加來(lái)源于微生物的酶,就可以將纖維素充分分解為單糖, 進(jìn)一步用于生產(chǎn)乙醇,降低生產(chǎn)成本(Sticklen M,2006)[20]?？紤]到細(xì)胞質(zhì)表達(dá)對(duì)植物生長(zhǎng)影響較大,一般采用定向胞外或細(xì)胞器積累表達(dá)（如定向質(zhì)外體葉綠體溶酶體等）Ziegler MT等人在擬南芥中,定向質(zhì)外體,積累表達(dá)了來(lái)源于Acidothermus cellulolyticus的耐熱內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶(Endo-1,4-β-glucanase),表達(dá)量約達(dá)到葉子總可溶性蛋白的26%,并且保持了很好的活性[21]，同樣是在擬南芥中,Hyunjong B等人定向葉綠體和過(guò)氧化酶體,積累表達(dá)來(lái)源于Trichoderma reesei的木聚糖酶(Xylase),達(dá)到了總可溶性蛋白的4.6%,明顯 高于細(xì)胞質(zhì)表達(dá)和單一細(xì)胞器定向表達(dá)[22]在煙草中Dai Z等人定向葉綠體,積累表達(dá)了A.cellulolyticu 的耐熱內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶,達(dá)到總可溶性蛋白的1.35%[23]。Dai Z等人采用同樣的酶,比較了定向不同細(xì)胞器積累表達(dá)的差異,發(fā)現(xiàn)定向質(zhì)外體表達(dá)蛋 白量最高,且保持了較好的活性[24]。在其它的植物中,也進(jìn)行了相關(guān)的研究, Xue GP等人在大麥的胚乳中,特異表達(dá)來(lái)源于Neocallimastix patriciarum 的內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶,約達(dá)到了總種子蛋白的1.5%[25]。Oraby H 等人在水稻中,定向質(zhì)外體積累表達(dá)了A.cellulolyticu耐熱內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶,達(dá)到了葉子總可溶性蛋白的 4.9%。

目前的研究集中于將植物作為生物反應(yīng)器,盡可能多的表達(dá)并積累纖維素酶,用于后期的處理。在發(fā)酵分解過(guò)程可以利用植物自身表達(dá)的異源纖維素水解酶,節(jié)省了額外添加酶的量。表達(dá) 的大都是內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶或木聚糖酶,為了預(yù)處理后還 能保持較好活性,多采用穩(wěn)定性強(qiáng)的耐高溫酶。由于纖維素有效降解需要復(fù)合水解酶,并且木質(zhì)素對(duì)其具有很強(qiáng)的保護(hù)作用,這些植物不會(huì)發(fā)生自身降解。3.前景與展望

利用不斷發(fā)展的植物基因工程技術(shù),在能源植物研究方面已經(jīng)取得了不錯(cuò)的研究進(jìn)展。但是,目前要實(shí)現(xiàn)廉價(jià)充分的利用纖維資源,還有一定的困難。通過(guò)對(duì)植物細(xì)胞壁合成 代謝研究的不斷深入,應(yīng)該能夠獲得對(duì)自身生長(zhǎng)發(fā)育不影響的低木質(zhì)素植物細(xì)胞壁木質(zhì)素結(jié)構(gòu)及含量改善纖維素含量增加,利于降解發(fā)酵產(chǎn)乙醇。還希望最終能夠獲得一種能源植物,這種植物通過(guò)自身表達(dá)異源的高活性木質(zhì)纖維水解復(fù)合酶,酶的表達(dá)受到誘導(dǎo)調(diào)控,收獲前誘導(dǎo)表達(dá),收獲后送往生物能源發(fā)酵工廠。這期間,木質(zhì)纖維素多糖在植物體內(nèi)也可進(jìn)行持續(xù)降解,在發(fā)酵工廠只需添加一些簡(jiǎn)單的輔助分解酶就可以徹底降解掉,使木質(zhì)纖維資源產(chǎn)乙醇變得十分簡(jiǎn)單 參 考 文 獻(xiàn): 1.Dorian JP, Franssen HT, Simbeck DR.Energy Policy, 2006, 34 : 1984~1991.2.Yang B, Lu Y.J Chem Technol Biotechnol, 2007, 82 : 6~10.3.Himmel ME, et al.Science, 2007, 315 : 804~807.4.Ding SY, Himmel ME.J Agric Food Chem, 2006, 54(3): 597~606.5.Cosgrove DJ.Nat Rev Mol Cell Biol 2005 6 11 850~861.6.Yang B Wyman CE.Biotechnol Bioeng 2004 86 1 88~95.7.Kabel MA, et al.Biotechnol Bioeng, 2005, 93 : 56~63.8.Ragauskas AJ, et al.Science, 2006, 311 :484~489.9.Piquemal J et al.Plant Physiol 2002 130 4 1675~1685.10.Guo D et al.Transgenic Res 2001 10 5 457~464.11.Pilate G et al.Nat Biotechnol 2002 20 6 607~612.12.Li L et al.Proc Natl Acad Sci USA 2003 100 8 4939~4944.13.Cano Delgado A, et al.Plant J, 2003, 34(3): 351~362.14.Chabannes M et al.Plant J 2001 28 3 257~270.15.van der Rest B et al.J Exp Bot 2006 57 6 1399~1411.16.Boudet AM Kajita S Grima Pettenati J et al.Trends Plant Sci2003 8 12 576~581.17.Li Y et al.J Plant Res 2003 116 3 175~182.18.Blee KA, et al.Phytochemistry, 2003, 64(1): 163~176.19.Streatfield SJ.Plant Biotechnol J 2007 5 1 2~15.20.Sticklen M.Curr Opin Biotechnol 2006 17 3 315~319.21.Ziegler MT, Thomas SR, Danna KJ.Mol Breed, 2000, 6 : 37~46.22.Hyunjong B, Lee DS, Hwang I.J Exp Bot, 2006, 57 : 161~169.23.Dai Z, Hooker BS, Anderson DB, et al.Transgenic Res, 2000, 9(1):43~54.24.Dai Z, et al.Transgenic Res, 2005, 14(5): 627~643.25.Xue GP et al.Plant Cell Rep 2003 21 11 1088~1094.

第四篇：分子生物學(xué)與基因工程結(jié)課論文

《分子生物學(xué)與基因工程》

結(jié)課論文

Real-Time PCR在分子生物學(xué)中的應(yīng)用

姓

名：XXX 學(xué)

號(hào)：AXXXXXXX 院

系：生命科學(xué)學(xué)院 班

級(jí)：生科XXX班 任課教師：XXX

二零一二年十二月 Real-Time PCR在分子生物學(xué)中的應(yīng)用

XXX XXX大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江哈爾濱 150xxx

摘 要：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）可對(duì)特定基因進(jìn)行擴(kuò)增，因此被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域中獲取特定基因或基因片段。定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術(shù)，即實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR）。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等特點(diǎn)，目前實(shí)時(shí)定量PCR作為一個(gè)極有效的實(shí)驗(yàn)方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)定量PCR；基因擴(kuò)增；分子生物學(xué)

1971年Khorana等最早提出PCR理論：―DNA變性解鏈后與相應(yīng)引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA 基因‖。因當(dāng)時(shí)基因序列分析方法尚未成熟、熱穩(wěn)定DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)及寡聚核苷酸引物合成仍處于手工和半自動(dòng)階段，核酸體外擴(kuò)增設(shè)想似乎不切實(shí)際，且Smith等已發(fā)現(xiàn)了DNA限制性內(nèi)切酶，使體外克隆基因成為可能，Khorana 等的早期設(shè)想被忽視。1985年Mullis等用大腸桿菌DNA聚合酶 ⅠKlenow片段體外擴(kuò)增哺乳動(dòng)物單拷貝基因成功以及1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR，使擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和效率大大提高，并簡(jiǎn)化了操作程序,最終實(shí)現(xiàn)了DNA擴(kuò)增的自動(dòng)化，迅速推動(dòng)了PCR的應(yīng)用和普及。

自從PCR技術(shù)問(wèn)世便很快成為科研、臨床診斷的熱點(diǎn)技術(shù)。但是傳統(tǒng)PCR技術(shù)在應(yīng)用中一是不能準(zhǔn)確定量，二是容易交叉污染，產(chǎn)生假陽(yáng)性。直到1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，上述問(wèn)題才得到較好的解決[1]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluoro-genetic quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染性、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域[2]。

1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)概述

1.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

1992年Higuchi等首次提出了采用動(dòng)態(tài)PCR方法和封閉式檢測(cè)方式對(duì)目的核酸數(shù)量進(jìn)行定量分析，熒光探針技術(shù)是基于標(biāo)記基團(tuán)的FRET原理而實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)某個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一個(gè)熒光基團(tuán)的吸收光譜重疊，且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長(zhǎng)（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長(zhǎng)波長(zhǎng)（低能量）的熒光基團(tuán)，相當(dāng)于短波長(zhǎng)熒光基團(tuán)釋放的熒光被屏蔽，這個(gè)過(guò)程稱為FRET。在探針5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告基團(tuán)（R），在3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（quencher，Q），兩者距離很近時(shí)（7-10nm），報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能被淬滅基團(tuán)所吸收，并依賴其較高的S/N比值（信-噪比, signal-to-noise ratio）和良好的辨別能力進(jìn)行定量檢測(cè)。

熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（threshold value）。CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。[4][3]1.2 常用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分類

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR熒光染料法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR熒光染料法包括非飽和染料SYBR Green法和飽和染料LC Green法[5]。非飽和染料SYBR Green染料法定量成本低，方法簡(jiǎn)便，不需要設(shè)計(jì)探針，但是特異性低。熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。引物二聚體的問(wèn)題目前可以用帶有熔解曲線（melting curve）分析的軟件加以解決。飽和染料LC Green法與SYBR染料法工作原理是一樣的，但與傳統(tǒng)的熒光染料SYBR Green相比有如下優(yōu)點(diǎn)：LC Green染料在進(jìn)行PCR 時(shí)可以以飽和的濃度加入，不會(huì)抑制PCR反應(yīng)，而Sybr Green 染料濃度過(guò)高會(huì)抑制PCR反應(yīng)。從而，利用LC Green染料可以進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析。在進(jìn)行HRM分析時(shí)，由于飽和染料占據(jù)了DNA雙鏈上每一對(duì)堿基上的空位，所以在雙鏈解鏈時(shí)，染料立即與雙鏈脫離，使得熒光信號(hào)發(fā)生較大的變化，而非飽和染料常發(fā)生位置上的遷移，從而對(duì)熒光信號(hào)沒(méi)有大的影響。除LC Green染料外，常用的染料還有Reso Light、Ever Green等，這些都是綠色熒光染料，最佳激發(fā)波長(zhǎng)范圍440-470nm，發(fā)射熒光波長(zhǎng)470-520nm。

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針?lè)?/p>

實(shí)時(shí)熒光定量PCR寡核苷酸探針?lè)ò═aqMan探針?lè)ê蚑aqMan-MGB探針?lè)?。TaqMan 探針?lè)夹g(shù)原理是利用Taq酶的5’—3’外切酶活性，在傳統(tǒng)PCR技術(shù)一對(duì)特異性引物的基礎(chǔ)上增加了一條熒光雙標(biāo)記探針。該探針可與上、下游引物之間的DNA模板序列特異性結(jié)合。探針的5’端標(biāo)以熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)。在PCR退火復(fù)性期，探針與DNA模板特異性結(jié)合。在PCR延伸階段，Taq酶在引物的引導(dǎo)下，沿著模板合成新鏈，當(dāng)移動(dòng)至探針結(jié)合的位置時(shí)便發(fā)揮其5’—3’外切酶活性將探針降解成單核苷酸，使得熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，前者的熒光信號(hào)釋放并被檢測(cè)。因此，每合成一條新鏈就有一個(gè)探針被裂解并釋放出一個(gè)熒光信號(hào)。熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物量相對(duì)應(yīng)。

MGB探針與傳統(tǒng)的TaqMan探針比較，有很大的優(yōu)勢(shì)。它可以使探針的長(zhǎng)度縮短，尤其對(duì)AT含量高的序列的 MGB探針的設(shè)計(jì)有很大的幫助；同時(shí)可以提高配對(duì)與非配對(duì)模板間的Tm值差異； 由于在探針的3’端的Quencher基團(tuán)為不發(fā)光的熒光基團(tuán)，并且與Report基團(tuán)在空間的位置更接近，使雜交的穩(wěn)定性大大提高，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更精確，分辨率更高，可 以進(jìn)行SNP分析。MGB探針實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單，使雜交的重復(fù)性大大提高。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量方法

在實(shí)時(shí)熒光PCR中，模板的定量有兩種方法：絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量指用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推算未知的樣本量；相對(duì)定量指在一定樣品中靶序列相對(duì)于另一參照序列的量的變化。由于每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，利用已知起始DNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1 絕對(duì)定量法

該方法是利用標(biāo)準(zhǔn)品作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣本進(jìn)行定量。絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品一般是用質(zhì)粒DNA或是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物等制備的。標(biāo)準(zhǔn)品的量根據(jù)260nm的吸光度值計(jì)算得出。由于樣本的濃度完全是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定，所以合適的標(biāo)準(zhǔn)品是定量準(zhǔn)確的關(guān)鍵。一方面標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣本應(yīng)具有一致的擴(kuò)增效率，另一方面標(biāo)準(zhǔn)品的定量必須準(zhǔn)確。這就要求標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增序列與樣本完全一致，制備的標(biāo)準(zhǔn)品純度要高，不應(yīng)含有影響定量的因素如Dnase、標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣本各自反應(yīng)體系內(nèi)的干擾因素要一致等。該方法的優(yōu)點(diǎn)就是測(cè)定范圍很廣（10～1010拷貝），結(jié)果可直接通過(guò)軟件得出，不需額外計(jì)算。1.3.2 相對(duì)定量法

相相對(duì)定量是指在測(cè)定目的基因的同時(shí)測(cè)定某一內(nèi)源性管家基因，該管家基因主要是用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較、反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在PCR擴(kuò)增的影響因素，通常選用的管家基因有GAPDH、β-2微球蛋白和rRNA。使用的β-actin、相對(duì)定量較為早期的方法是用一系列已知外參物做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線得到目的基因和管家基因的量，再將目的基因同管家基因的比值作為定量的最后結(jié)果。此種方法計(jì)算出未知樣品的量是相對(duì)于某個(gè)參照物的量而言，因此，相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較容易制備，對(duì)于所用的標(biāo)準(zhǔn)品只需知道其稀釋度即可。在整個(gè)試驗(yàn)中，待測(cè)樣品的量來(lái)自于標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終必須除以參照基因的量，即參照基因是1×的樣本，其他的樣本為參照基因的n倍。由于管家基因在各種組織中的恒定表達(dá)，所以可用管家基因的量來(lái)作為標(biāo)準(zhǔn)，以比較來(lái)源不同的樣本，目的基因表達(dá)量的差異，此即相對(duì)定量。這一方法的缺陷是要求外參、目的基因和管家基因的擴(kuò)增效率一致；此外加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)相當(dāng)于是進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，存在兩種模板相互的干擾和競(jìng)爭(zhēng)[7]。

1.3.3 相對(duì)定量反應(yīng)循環(huán)值（Ct）比較法

[6]即ΔCT值法，該方法是同時(shí)擴(kuò)增待測(cè)靶基因片段和一個(gè)作為內(nèi)參照的基因片段，一般是一個(gè)內(nèi)源性管家基因片段。這兩個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)可在2管中分別進(jìn)行，也可在同一反應(yīng)管中進(jìn)行，測(cè)得兩者的CT值之差，即ΔCT。該方法不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。它是根據(jù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的原理，假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加倍的產(chǎn)物數(shù)量PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到擴(kuò)增產(chǎn)物的值來(lái)反映起始模板的量通過(guò)數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算相對(duì)量。比較Ct法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)定量的不同之處在于其運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算相對(duì)量，前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到Ct值來(lái)反應(yīng)起始模板的量，一個(gè)循環(huán)（Ct=1）的不同相當(dāng)于起始模板數(shù)2倍的差異。比較不同待測(cè)標(biāo)本DNA的ΔCT值與正常標(biāo)本DNA的ΔCT值的變化，即可對(duì)未知標(biāo)本靶基因的原始拷貝數(shù)作出判斷，從而對(duì)病理狀態(tài)進(jìn)行判斷或診斷。但是此方法是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率基本一致為前提的，效率的偏移將影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計(jì)[8]。最終結(jié)果也是靶序列和參考品的相對(duì)比值。該方法需確定靶序列和參考品的擴(kuò)增效率是否一致；如不一致，則會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

實(shí)時(shí)定量PCR的應(yīng)用非常廣泛。在科研方面，可定量分析各種基因的表達(dá)[ 9 ]、分析基因變和多態(tài)性[ 10 ]、分析細(xì)胞因子的表達(dá)

[ 11 ]、單核苷酸多態(tài)性（SNP）

[ 12 ]

測(cè)定及易位基因的檢測(cè)

[ 15 ]

[ 13 ]

等；在醫(yī)療方面，可用于免疫組分分析

[ 14 ]、臨床疾病早期診斷、病原體檢測(cè)、耐藥性分析

[ 16 ]、腫瘤研究[ 17 ]和微小殘留病變（MRD）[ 18 ]檢測(cè)等。

以下就其在基因工程研究、病原體的檢測(cè)和腫瘤分子診斷等方面的應(yīng)用及其新進(jìn)展作一簡(jiǎn)述。2.1 基因工程研究領(lǐng)域

實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)的出現(xiàn)不僅加強(qiáng)了有關(guān)對(duì)基因的量的研究方法，而且也加強(qiáng)了對(duì)基因的質(zhì)所發(fā)生變化的研究。它可以檢測(cè)基因突變和基因組的不穩(wěn)定性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于遺傳分析[19]。

2.1.1

基因表達(dá)研究

由不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的探針?lè)謩e與野生型和突變基因雜交，探針雜交的效率和其后的切除與雜交有關(guān)。如果一種染料的熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于另一種，說(shuō)明它是一個(gè)純合子，如果熒光信號(hào)都增加則表明是一個(gè)雜合子。從使用范圍來(lái)看，它能用于檢測(cè)已知基因序列的任何遺傳病基因的突變和缺失及表達(dá)量的異常，從靈敏度方面看，它能從單細(xì)胞進(jìn)行特異基因擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)植入前基因診斷。PCR技術(shù)還可用于端粒酶的檢測(cè)。使用雙色熒光標(biāo)記探針，結(jié)合不同的引物設(shè)計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)某些先天性疾病的定量檢測(cè)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)β地中海貧血癥（β地貧）患者β與γ球蛋白mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確，為了解β地貧的分子病理機(jī)制及其臨床診斷提供了可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。迄今對(duì)遺傳性物質(zhì)改變引起的疾病還無(wú)法根治，只能通過(guò)產(chǎn)前監(jiān)測(cè)和產(chǎn)前基因診斷，減少病嬰出生[20]

。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可用于產(chǎn)前監(jiān)測(cè)和產(chǎn)前基因診斷。

2.1.2

單核苷酸多態(tài)性（SNP）及突變分析

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR一個(gè)誘人的應(yīng)用前景是用于檢測(cè)基因突變和基因組的不穩(wěn)定性[21]?；蛲蛔兊臋z測(cè)基于兩條探針，一條探針橫跨突變位點(diǎn)，另一條為錨定探針，與無(wú)突變位點(diǎn)的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。如靶序列中無(wú)突變，探針雜交便完全配對(duì)，如有突變，則探針與靶序列不完全配對(duì)，會(huì)降低雜交體的穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對(duì)突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。

2.1.3

轉(zhuǎn)基因研究

Tesson等確定了實(shí)時(shí)定量PCR的技術(shù)條件，利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)域值，擴(kuò)增一個(gè)轉(zhuǎn)移后的基因和一個(gè)對(duì)照基因，以分析轉(zhuǎn)基因鼠的接合性[22]。同型結(jié)合的和異質(zhì)接合的動(dòng)物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，該方法為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的同型結(jié)合及異質(zhì)接合提供了明確的鑒定結(jié)果。這項(xiàng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中將有很大用途。

2.2 腫瘤的分子診斷

腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法都可以檢測(cè)出來(lái)。目前用此方法進(jìn)行過(guò)端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病ER基因、腫瘤MDR1基因等，盡管腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全闡明，但相關(guān)基因的遺傳學(xué)改變的積累是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因之一已得到普遍承認(rèn)[23]。癌基因的突變和表達(dá)增加，在許多腫瘤早期就出現(xiàn)。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)不僅能有效地檢測(cè)到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量。如定量結(jié)直腸癌淋巴結(jié)的癌胚抗原(CEA)mRNA的表達(dá)量，可作為診斷癌癥微轉(zhuǎn)移的重要依據(jù)[24]。目前，腫瘤患者的生存期已有所延長(zhǎng)，但是緩解期的患者仍存在復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)，因此，微小殘留病變的檢測(cè)對(duì)于進(jìn)一步調(diào)整治療方案至關(guān)重要。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)正成為檢測(cè)腫瘤微小殘留分子標(biāo)志的一種必備工具[25]。Eckert等提出采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病微殘留病灶，對(duì)兒童急性白血病的治療有重要指導(dǎo)意義。

2.3 病原體的分子檢測(cè)

目前，用此方法還進(jìn)行了對(duì)人類結(jié)核桿菌、免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒等病原體的檢測(cè)[26]。同樣在國(guó)內(nèi)，2004年針對(duì)SARS流行性病的檢測(cè)和診斷使得熒光定量PCR技術(shù)得以應(yīng)用和發(fā)展。熒光定量PCR問(wèn)世后的幾年中，積累了大量有關(guān)病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后之間關(guān)系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。目前, 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已應(yīng)用于肝病、性病以及人類免疫缺陷病毒（HIV）等各種病原體的臨床診斷，為實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確診斷提供了有效的檢測(cè)方法。

3.小結(jié)

時(shí)熒光定量PCR與其他一些技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用，是今后發(fā)展的方向，如與高級(jí)微型解剖技術(shù)結(jié)合后，能提高形態(tài)學(xué)損傷所至低水平擴(kuò)增的檢測(cè)能力[ 27 ]、可定量分析石蠟包埋儲(chǔ)存樣本中的核酸[ 28]及少量細(xì)胞中的全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[ 29 ]等。此外，微陣列實(shí)驗(yàn)中所選基因表達(dá)水平的測(cè)定仍需使用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)[ 30 ,31 ]，利用該技術(shù)還可使等位基因特異表達(dá)分析以及生化武器證據(jù)甄別成為可能。

通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因的特異性引物和探針，并優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)循環(huán)參數(shù)，已成功地建立了快速、靈敏、特異的Q-PCR檢測(cè)方法?？蓪?shí)現(xiàn)大量樣本同時(shí)檢測(cè)，并節(jié)省大量試驗(yàn)時(shí)間和反應(yīng)成本，為基因定量檢測(cè)和準(zhǔn)確定量疾病相關(guān)基因的表達(dá)提供了有效的技術(shù)手段；同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)人類和動(dòng)物疾病的早期診斷與基因分期、分型，以及對(duì)人類腫瘤轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)后判斷[32]。因此Q-PCR技術(shù)將成為未來(lái)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必備的研究工具，在臨床上將有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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第五篇：分子生物學(xué)

分子生物技術(shù)在微生物鑒定中的應(yīng)用

摘要：微生物多樣性是生物多樣性的重要組成部分。由于微生物和 動(dòng)、植物 相比, 存在著多種顯著差異。而傳統(tǒng)的基于微生物培養(yǎng)與純種分離的技術(shù)具有很大的局限性，分子生物學(xué)及其有關(guān)技術(shù)的長(zhǎng)足進(jìn)展及其在為生物中的使用, 使微生物的研究進(jìn)入了分子的階段。

關(guān)鍵詞：16SrDNA PCR 溫度梯度電泳 變性梯度凝膠電泳 微生物包括了從原核到真核的不同類群的生物: 細(xì)菌、放線菌、原生動(dòng)物、真菌、部分藻類和病毒, 是生物多樣性的重要組成部分。此外, 微生物多樣性與其他生物類群相比有許多獨(dú)特之處, 包括: 1)生存環(huán)境多樣;2)生長(zhǎng)、繁殖速度多樣;3)營(yíng)養(yǎng)、代謝類型多樣;4)生活方式多樣。因而, 微生物多樣性的研究無(wú)論對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)功能的完整理解, 還是對(duì)于微生物資源的利用和開(kāi)發(fā)都具有特殊重要的意義[1]。微生物作為生態(tài)系統(tǒng)中極重要的一員, 對(duì)動(dòng)植物的生長(zhǎng)，生態(tài)系統(tǒng)中的能流和物質(zhì)循環(huán)及環(huán)境污染物的降解和解毒等方面起著重要作用并且與人的生活健康息息相關(guān)。隨著微生物的不斷發(fā)現(xiàn)及研究，傳統(tǒng)微生物技術(shù)越來(lái)越不能滿足其發(fā)展的需要，最主要的不足是丟失了微生物的多樣性, 許多報(bào)道都指出, 在自然環(huán)境中有相當(dāng)多的菌種(約90%-99%)用傳統(tǒng)方法無(wú)法培養(yǎng)出來(lái)[2].這對(duì)于微生物基因組學(xué)研究來(lái)說(shuō)是很不利的.，導(dǎo)致研究的片面性并且效率低下。而分子生物學(xué)技術(shù)則避開(kāi)了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)分離的環(huán)節(jié), 而是采取直接從樣品中抽取所含微生物總DNA, 然后通過(guò)16S rDNA, PCR, RAPD, DGGE

和RFLP 等多種分子生物學(xué)研究手段, 對(duì)直接提取的總DNA進(jìn)行分析, 了解其中所包含的微生物DNA 的種類和含量, 以研究樣品中微生物的實(shí)際組成, 同時(shí)可以利用直接提取得到的總DNA 建立基因文庫(kù), 并從中篩選有用的基因。由于是直接從樣品中提取總DNA, 中間沒(méi)有任何篩選性的過(guò)程, 因此, 所得DNA 能夠準(zhǔn)確地反映樣品中微生物的實(shí)際情況, 避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法不能真實(shí)反映微生態(tài)實(shí)際情況的缺點(diǎn), 也不會(huì)丟失樣品中存在的任何微生物,同時(shí), 這種方法能夠很容易、大批量地取得同一環(huán)境下乃至不同環(huán)境下的不同微生物的同源基因, 為微生物比較基因組學(xué)研究開(kāi)辟了道路.此外, 用直接提取的總DNA 構(gòu)建的基因文庫(kù), 包含了大量以前因?yàn)闊o(wú)法培養(yǎng)而不能獲得的微生物基因, 從這些文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)全新的具有巨大應(yīng)用價(jià)值的抗生素類、酶類及其他生物活性物質(zhì)的基因應(yīng)該是非常有潛力的。1．16SrRNA比較測(cè)序

16SrDNA是編碼原核生物16SrRNA的基因，長(zhǎng)度約1500bp，存在于所有的原核生物的基因組中，由多個(gè)保守區(qū)和與之相間的多個(gè)可變區(qū)組成。保守區(qū)為所有細(xì)菌共有，細(xì)菌之間無(wú)顯著差異；可變區(qū)在不同細(xì)菌之間存在一定程度的差異，具有細(xì)菌屬或種特異[3]。2.PCR近年來(lái),對(duì)環(huán)境樣品總DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 推動(dòng)了利用分子標(biāo)記技術(shù)研究微生物的多樣性。PCR技術(shù)是美國(guó)letus公司人類遺傳研究室的科學(xué)家與1983年發(fā)明的一種在體外快速擴(kuò)增特異基因或DNA 序列的方法, 其目的是將極微量DNA大量擴(kuò)增。該技術(shù)模仿生物體內(nèi)DNA 的復(fù)制過(guò)程,首先使DNA 變性, 兩條鏈解開(kāi);然后使引物模板退火, 二者堿基配對(duì);耐高溫的Taq DNA 聚合酶以4種dNTP為底物, 在引物的引導(dǎo)下合成與模板鏈互補(bǔ)的DNA 新鏈[4]。PCR 技術(shù)可在體外快速擴(kuò)增DNA, 具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高的特點(diǎn)。當(dāng)然常規(guī) PCR技術(shù)也存在很多的問(wèn)題，如出現(xiàn)假陽(yáng)性、形成引物二聚體、傳統(tǒng)的PCR技術(shù)一次擴(kuò)增只能檢測(cè)一種微生物、RNA病毒的PCR檢測(cè)操作繁瑣，中間污染環(huán)節(jié)多，易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果等.為了彌補(bǔ)上面這些不足，一些新的PCR技術(shù)逐漸衍生出來(lái)并被用于實(shí)踐，如熱啟動(dòng)PCR、巢式PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、隨機(jī)引物DNA 多態(tài)性擴(kuò)增（RAPD）、限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）、實(shí)時(shí)熒光PCR（real-time PCR）等[5]。3.電泳分離及其顯示方法

除過(guò)我們熟知的瓊脂糖凝膠電泳并用溴乙錠(EB)染色方法和聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE 分離)銀染方法外, 還有一些通過(guò)特殊的電泳分離技術(shù)而建立的分子標(biāo)記, 如變性梯度凝膠電泳(DGGE), 可分離長(zhǎng)度相同但是序列不同的DNA 片段的混合物。對(duì)于特異性引物PCR 擴(kuò)增的環(huán)境微生物的16SrRNA 基因, 一般的電泳很難將序列不同的片段分開(kāi)。DGGE膠在聚丙烯酰氨膠中添加了線性梯度的變性劑, 可以形成從低到高的線性梯度, 在一定溫度下, 同一濃度的變性劑中, 不同序列的產(chǎn)物，其部分解鏈程度不同。DNA 解鏈程度不同決定其電泳的遷移率, 結(jié)果不同的產(chǎn)物在凝膠上分離開(kāi)。在變性條件適當(dāng)?shù)那闆r下, 該技術(shù)能分辨一個(gè)堿基對(duì)。DGGE 技術(shù)在微生物群落結(jié)構(gòu) 的研究、微生物種群的動(dòng)態(tài)分析、富集培養(yǎng)以及分離物的分析、16SDNA 同源性的分析中得到廣泛應(yīng)用[6]。

溫度梯度電泳(TGGE)是利用不同構(gòu)象的分子具有不同的變 性溫度來(lái)進(jìn)行分離, 最先應(yīng)用于DNA /RNA 的分子構(gòu)象分析和序列變異分析, 是一種新出現(xiàn)的檢測(cè)點(diǎn)突變的電泳技術(shù), 其最大特點(diǎn)上具有高分辨能力。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)也是根據(jù)不同的結(jié)構(gòu)對(duì)DNA在凝膠中遷移速率影響很大, 結(jié)果不同序列的DNA 片段在凝膠上得以高分辨率的分離?；蛐酒煞譃閏DNA 芯片、寡核苷酸芯片及基因組芯片。在一定條件下, 載體上的核酸分子可以與來(lái)自樣品的序列互補(bǔ)的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進(jìn)行標(biāo)記, 在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測(cè)到雜交信號(hào)[7]。

分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用中rRNA 技術(shù)提供了一種擺脫傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)方法而鑒定環(huán)境微生的途徑,并已被廣泛應(yīng)用于微生物的各個(gè)領(lǐng)域。雖然當(dāng)前,標(biāo)準(zhǔn)rRNA 技術(shù)的靈敏度還難以檢測(cè)到低豐度的(低于1/ 1 000)在群落中僅占很小比例的微生物種類, 從而使之在微生物生態(tài)以及環(huán)境學(xué)上的應(yīng)用受到很大的限制。然而, rRNA 技術(shù)與其它的分子技術(shù)以及特別是與傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)方法相結(jié)合, 具備分析微生物多樣性的巨大潛力。隨著這些新的分子方法的不斷改進(jìn)以及rRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)中序列信息的不斷增加, 我們能探知更多的未知的微生物世界。

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