第一篇：PCR過(guò)程問(wèn)題全解
如何防止PCR形成引物二聚體？
在PCR后的電泳帶形成很寬很亮的帶，對(duì)照marker時(shí)都不容易看出其大小，具體是什么原因呢？PCR時(shí)模板DNA濃度一般是多少最合適？
答：1這條亮帶如果在100bp一下就可以考慮是引物二聚體了，形成引物二聚體的原因很多，如引物設(shè)計(jì)的不好，在兩端容易形成回文結(jié)構(gòu)或是兩條引物之間也可能會(huì)互補(bǔ)配對(duì)；退火溫度沒(méi)有達(dá)到最佳，實(shí)在不行就做個(gè)溫度梯度吧；再就是試著改變一下循環(huán)數(shù)，也許會(huì)有幫助。
PCR模板大約在104-106個(gè)拷貝。
答2：我覺(jué)得是目的條帶含量太多了，如果點(diǎn)樣太多，負(fù)載量太大，就會(huì)造成跑膠時(shí)條帶太寬?？梢栽囍鴾p少模板量，稀釋10倍或是減少循環(huán)數(shù)。
答3：1.從引物自身著手，重新設(shè)計(jì)引物，這是最根本解決這一問(wèn)題的辦法；
2.可能模板有問(wèn)題；PCR后的電泳帶形成很寬很亮的帶，可能是模板濃度過(guò)高或者循環(huán)次數(shù)過(guò)多所導(dǎo)致；
3.Taq酶，引物，Mg2+濃度可能過(guò)高，可降低它們的濃度；
4.取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時(shí)冷卻，這時(shí)再加入反應(yīng)體系當(dāng)中，引物二聚體就會(huì)消失的；
5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增強(qiáng)特異性；
6.PCR反應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行，最后加TAq酶，PCR結(jié)束后，產(chǎn)物勿放置在室溫下過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，有人認(rèn)為室溫下有些Taq酶會(huì)將多余的引物合成為二聚體。
7.增加循環(huán)數(shù)可以適當(dāng)降低引物二聚體；
8.降低退火溫度后有條帶，則應(yīng)逐漸提高溫度，若提高溫度的同時(shí)產(chǎn)物量減少，則考慮增加鎂離子濃度（根據(jù)擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度而定，片段長(zhǎng)則相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該高一些）；
9.若降低退火溫度，發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在 20-25mmol/l沒(méi)有區(qū)別，則考慮Buffer等試劑沒(méi)有完全融解、混勻，導(dǎo)致吸取的試劑濃度不對(duì)。
10.以上次的pcr產(chǎn)物作模板二次pcr，可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時(shí)間間隔短的話(huà)，可以把原產(chǎn)物稀釋100－1000倍，如果間隔較長(zhǎng)可以稀釋50－100倍。
PCR假陰性的原因分析
PCR的假陽(yáng)性問(wèn)題是在PCR誕生之初就被深刻認(rèn)識(shí)到了，同時(shí)由于造成假陽(yáng)性的因素相對(duì)單一，因此假陽(yáng)性并不是困惑檢驗(yàn)工作的主要原因。如果一個(gè)項(xiàng)目只是陽(yáng)性率高敏感性好的話(huà)，那么可以認(rèn)為其陰性結(jié)果具備很高的可排除性，仍然有相當(dāng)?shù)呐R床適用價(jià)值。但PCR的假陰性在檢驗(yàn)工作中仍很?chē)?yán)重，并且用些因素經(jīng)常被人忽略，嚴(yán)重的影響了PCR的使用?？梢韵胂笠环N假陽(yáng)性和假陰性都很高的項(xiàng)目，有什么樣的診斷價(jià)值。造成PCR假陰性的原因是復(fù)雜的，也是多樣的。主要有：
1.PCR儀本身的質(zhì)量問(wèn)題。PCR儀設(shè)計(jì)原理上的差異和經(jīng)常出現(xiàn)的質(zhì)量問(wèn)題（如：溫控不準(zhǔn)等）給臨床帶來(lái)了諸如非特異性擴(kuò)增（假陽(yáng)性）、擴(kuò)增效率下降(假陰性）等問(wèn)題.2.離心機(jī)問(wèn)題。離心機(jī)的質(zhì)量或使用不正確，造成離心標(biāo)本模板沒(méi)有分離出來(lái)造成假陰性，竊以為這是最易被忽視的問(wèn)題。其時(shí)離心機(jī)使用問(wèn)題不僅在PCR，在整個(gè)檢驗(yàn)工作中都是最易被忽視的問(wèn)題，只是因?yàn)樵谄渌ぷ髦胁幌驪CR那樣明顯影響檢測(cè)結(jié)果罷了。
離心機(jī)是常用的固液分離設(shè)備，其利用離心過(guò)程中的離心力而將密度不同的物質(zhì)分離出來(lái)。因此離心機(jī)的關(guān)鍵在于離心加速度而不是轉(zhuǎn)速，根據(jù)牛頓定律可知離心力加速度與轉(zhuǎn)速和有效半徑的有關(guān)的，因此對(duì)于不同有效半徑的離心機(jī)相同的轉(zhuǎn)速其離心加速度是不同的，轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)要因離心機(jī)而異，但很遺憾，日常工作中忽視了這個(gè)問(wèn)題。有效半徑短的離心加速度就小，同樣的時(shí)間離心效果就差可能造成分離不出導(dǎo)致假陰性。同時(shí)由于高速離心機(jī)高速旋轉(zhuǎn)與空氣摩擦?xí)a(chǎn)生大量的熱，因此對(duì)于稱(chēng)能上幾萬(wàn)轉(zhuǎn)/分而沒(méi)有抽真空的離心機(jī)實(shí)際轉(zhuǎn)速本人持懷疑態(tài)度。
3.試劑開(kāi)殼劑和操作問(wèn)題造成標(biāo)本DNA沒(méi)有暴露出來(lái)，致使擴(kuò)增無(wú)法進(jìn)行，這是造成假陰性的又一主要因素。
問(wèn)題1：無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物
現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú)
原因:
1.模板:含有抑制物，含量低
2.Buffer對(duì)樣品不合適
3.引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解
4.反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短
對(duì)策:
1.純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量
2.更換Buffer或調(diào)整濃度
3.重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物
4.降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間
問(wèn)題2：非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶原因：
1.引物特異性差
2.模板或引物濃度過(guò)高
3.酶量過(guò)多
4.Mg2+濃度偏高
5.退火溫度偏低
6.循環(huán)次數(shù)過(guò)多
對(duì)策：
1.重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR
2.適當(dāng)降低模板或引物濃度
3.適當(dāng)減少酶量
4.降低鎂離子濃度
5.適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法
6.減少循環(huán)次數(shù) 問(wèn)題3：拖尾
現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。
原因：
1.模板不純
2.Buffer不合適
3.退火溫度偏低
4.酶量過(guò)多
5.dNTP、Mg 2+濃度偏高
6.循環(huán)次數(shù)過(guò)多
對(duì)策：
1.純化模板
2.更換Buffer
3.適當(dāng)提高退火溫度
4.適量用酶
5.適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度
6.減少循環(huán)次數(shù)
問(wèn)題4：假陽(yáng)性
現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物
原因：
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物
的交*污染
對(duì)策：
1.操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；
2.除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管
及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。
3.各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存
請(qǐng)問(wèn)PCR引物存放時(shí)間是多少？
這要看是什么狀態(tài)，要是粉末的話(huà)，在－20度可以存放好幾年；要是已經(jīng)把引物稀釋成液體狀態(tài)的話(huà)，存放時(shí)間就要短一點(diǎn)了，但也可以存放一年左右的時(shí)間，甚至更長(zhǎng)。
不過(guò)這也要看你們實(shí)驗(yàn)室的冰箱是不是經(jīng)常開(kāi)啟，要是是的話(huà)，存放時(shí)間就很受影響，實(shí)驗(yàn)室的冰箱就是經(jīng)常打開(kāi)，而且有時(shí)候大家找東西要找好長(zhǎng)時(shí)間，所以引物總是用半個(gè)多月的時(shí)間，效力就下降了，PCR后的條帶明顯就沒(méi)有以前亮了。
建議你合成引物的時(shí)候，讓公司每個(gè)OD分裝成一管，每次你用的時(shí)候，取一管稀釋成使用濃度；或者先稀釋到儲(chǔ)存濃度，分裝后要用的時(shí)候再稀釋到使用濃度。另外一定要注意避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融會(huì)使存放時(shí)間變短的。
最簡(jiǎn)單的就是分裝了,以?xún)?chǔ)存濃度保存,稀釋10或20微升,就可以用好些次,即可避免反復(fù)凍融還可以避免整管引物都被污染.干粉－20度可以保存一年，稀釋后－20度可以保存半年。
可以先稀釋成100uM，分裝成幾管。然后再稀釋成50uM和20uM的。每次用20uM的做PCR即可。盡量避免反復(fù)凍融。
稀釋用的水PH值要求大于7（TE比滅菌去離子水好），并且無(wú)菌。
真空干燥的DNA呈干膜狀或粉末狀在離心管底部，開(kāi)啟瓶蓋時(shí)小心不要丟失.稀釋方法：1 OD260引物干粉約為33微克；
堿基的平均分子量為324.5；
引物的分子量=堿基數(shù) x 堿基的平均分子量；
引物的摩爾數(shù)=質(zhì)量數(shù) / 引物分子量
舉例：一管標(biāo)明為2 OD的20堿基的引物，分子量=20 x 324.5=6490 質(zhì)量數(shù)=2 x 33 =66μg
摩爾數(shù)=66 / 6490 =0.010 μmol= 10 nmol
若您需要溶解為10μM(=10pmol/μl)的溶液，只需加10/=10pmol/ul,=1mlddH2O充分溶解即可。
如何提高PCR反應(yīng)的特異性引物
引物設(shè)計(jì)：引物長(zhǎng)度適當(dāng)，18-24mers，并保證序列獨(dú)特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著有更高的特異性，較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，反而降低特異性，而且長(zhǎng)序列比短序列雜交慢，影響產(chǎn)量； 引物濃度：引物的濃度會(huì)影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。---生物秀實(shí)驗(yàn)頻道
Mg2+
較高的Mg2+濃度可以增加產(chǎn)量，但也會(huì)降低特異性。為了確定最佳濃度，從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進(jìn)行最適Mg2+濃度測(cè)定
退火溫度
Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。退火溫度一般設(shè)定為比引物的Tm低5℃的溫度。合理的退火溫度為55-70℃。在理想狀態(tài)下，退火溫度應(yīng)足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合 巢式PCR 使用巢式引物進(jìn)行連續(xù)多輪擴(kuò)增，由于同兩套引物都互補(bǔ)的靶序列很少，巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，從而提高PCR反應(yīng)的特異性和靈敏度 遞減PCR 通過(guò)在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開(kāi)始，然后每個(gè)循環(huán)降低1℃到2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃。這樣，特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，并在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢(shì)
熱啟動(dòng)PCR 通過(guò)抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR 儀達(dá)到變性溫度。最常用的是熱啟動(dòng)DNA 聚合酶，常溫時(shí)該酶活性被抑制，94-95℃加熱數(shù)分鐘后回復(fù)正?；盍﹂_(kāi)始反應(yīng)，這樣可以避免起始循環(huán)溫度下的非特異性擴(kuò)增，大大提高了PCR反應(yīng)的靈敏度及特異性。熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一
PCR增強(qiáng)劑
包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等，能構(gòu)降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。
PCR擴(kuò)增過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題及解決方法
PCR技術(shù)具有高度的特異性、選擇性、靈敏性，而且快速、簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化，因此在臨床醫(yī)學(xué)工作中受到廣泛的重視及合理的應(yīng)用。目前在我國(guó)許多基層醫(yī)療單位均已相繼開(kāi)展PCR研究用應(yīng)用工作。PCR技術(shù)很簡(jiǎn)單，原理也很清楚，因此有條件的單位都能較順利地上馬，但畢竟PCR技術(shù)是一種新生事物，受到許多條件因素的影響，所以要做得好也不容易。在PCR技術(shù)應(yīng)用過(guò)程中會(huì)遇到這樣或那樣的問(wèn)題，更甚至?xí)玫脚c事實(shí)完成相反的結(jié)果。為了使我們能夠順利地開(kāi)展PCR工作，更好地發(fā)揮PCR技術(shù)的工具作用，我們根據(jù)多年來(lái)PCR工作總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)PCR擴(kuò)增過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)的一些問(wèn)題進(jìn)行簡(jiǎn)要的總結(jié)，提供給廣大科研工作者作為參考，拋磚引玉，不足之處歡迎指正。
一、假陽(yáng)性擴(kuò)增
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有時(shí)會(huì)碰到所檢驗(yàn)的樣本全部陽(yáng)性，而且擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶亮度均一，這是擴(kuò)增系統(tǒng)受到污染時(shí)最典型的一種表現(xiàn)，需仔細(xì)檢查，排除污染源，一般應(yīng)從以下步驟著手：
⒈ 試劑污染：
廠方提供的試劑或其中的某種組分在出廠或運(yùn)輸、貯存過(guò)程中受到污染。檢測(cè)方法，可按試劑盒說(shuō)明書(shū)將試劑分裝好，直接置于PCR儀中擴(kuò)增（不加陰性對(duì)照，可加適量蒸餾水），便可簡(jiǎn)單而有效地判斷試劑是否已受到污染。
⒉ 實(shí)驗(yàn)室污染：
這是最常見(jiàn)的污染源，由于PCR技術(shù)可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)將模板中某些特異性序列擴(kuò)增到數(shù)百萬(wàn)倍以上，擴(kuò)弗產(chǎn)物可能在電泳等過(guò)程中污染移液器、操作臺(tái)或隨著蒸發(fā)所形成氣溶膠而污染整個(gè)實(shí)驗(yàn)室。擴(kuò)增產(chǎn)物又是最有效的模板，一旦出現(xiàn)產(chǎn)物污染其污染程度都較嚴(yán)重。判斷方法：可以將實(shí)驗(yàn)中最關(guān)鍵步驟如試劑分裝、樣品處理等轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的環(huán)境中或轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)中完成。當(dāng)然，所用的移液器、吸咀管（離心管）都應(yīng)徹底更換。解決方法：實(shí)驗(yàn)室污染是PCR擴(kuò)增過(guò)程中最易出現(xiàn)的現(xiàn)象，而且一旦出現(xiàn)污染，消除污染源又極其困難，往往需對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)器材徹底清洗處理，所以應(yīng)該以預(yù)防為主，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)基本要求，樣品處理與擴(kuò)增產(chǎn)物及電泳應(yīng)盡量分開(kāi)，最好能在兩個(gè)房間進(jìn)行。擴(kuò)增前處理所用的移液器及擴(kuò)增后點(diǎn)樣用的移液器應(yīng)嚴(yán)格地分開(kāi)，不可互換。PCR室應(yīng)保持良好的通風(fēng)、清潔、最好能專(zhuān)用。
⒊ 采樣污染：
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)一批結(jié)果陽(yáng)性率很高，一批結(jié)果陽(yáng)性率又下降很多，如此反復(fù)，這種現(xiàn)象大都是由于采樣時(shí)污染所致，一般來(lái)講正規(guī)試劑生產(chǎn)廠家，其試劑出廠時(shí)都要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)、批間，特別是批內(nèi)差異都極小，不致出現(xiàn)如此明顯的反復(fù)，這種現(xiàn)象主要是由于收集樣本的試管或吸管受到污染所致。PCR擴(kuò)增非常敏感，而一般實(shí)驗(yàn)室對(duì)重復(fù)使用的試管所進(jìn)行的洗滌方法往注不能去除痕量DNA，這些痕量DNA便成為PCR模板，出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，由于采樣試管受污染程度不一，所以出現(xiàn)忽高忽低的現(xiàn)象解決方法建議使用一次試管及吸咀取樣。
二、假陰性擴(kuò)增：
如果連續(xù)幾次擴(kuò)增結(jié)果都是陰性，或已知陽(yáng)性樣本出現(xiàn)陰性擴(kuò)增結(jié)果，一般認(rèn)為這是假陰性，出現(xiàn)這現(xiàn)象有以下幾種原因：
⒈ 儀器故障：
出現(xiàn)全陰結(jié)果，首先考慮到儀器運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常。正確判斷儀器的工作狀況，是排除假陰性其它原因的基礎(chǔ)，儀器運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常是PCR擴(kuò)增最關(guān)鍵的步聚之一。判斷儀器是否正常，首先要測(cè)定加熱體的溫度是否準(zhǔn)確，波動(dòng)范圍是否答合要求，各孔之間差異是否符合要求，PCR擴(kuò)增往往對(duì)儀器加熱溫度及各管間的差異要求有很高的精度，如果誤差太大，勢(shì)必出現(xiàn)假陰性。必須注意的是不能過(guò)信名牌，我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)一些名牌機(jī)器溫度差異高達(dá)二度以上。
⒉ 試劑失效或無(wú)效：
了解機(jī)器是否正常，便可對(duì)試劑進(jìn)行檢測(cè)。首先要了解試劑是否超過(guò)有效期，試存放方法是否達(dá)到要求，如果試劑盒在有效期內(nèi)，貯存方法是正確，那么就應(yīng)該仔細(xì)、慎重地判斷試劑是否是無(wú)效試劑或稱(chēng)不合格試劑?？梢杂靡阎?yáng)性樣本，或試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作擴(kuò)增一次，然后把擴(kuò)增產(chǎn)物用雙蒸水稀釋1000倍，作為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增，判斷結(jié)果，如果是陰性說(shuō)明試劑無(wú)效或不合格，如果結(jié)果陽(yáng)性那么可用以下方法判定試劑的靈敏度。
⒊ 試劑的敏感度：
有時(shí)試劑檢測(cè)的陽(yáng)性率偏低，所謂陽(yáng)性率偏率就是指出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這種現(xiàn)象往往與以下三種因素有關(guān)：①試劑質(zhì)量不過(guò)關(guān)；②操作方法不規(guī)范；③主觀判斷標(biāo)準(zhǔn)不科學(xué)。對(duì)于試劑質(zhì)量及操作是否正確這兩點(diǎn)是比較容易檢查并合理改進(jìn)。這里著重提一下：目前經(jīng)常碰到的一些不科學(xué)概念，我們習(xí)慣用某些樣本應(yīng)該陰性，某些樣本應(yīng)該陽(yáng)性，或簡(jiǎn)單地以陽(yáng)性率。主觀概念判斷試劑是否合格這是極不科學(xué)的主觀推論。如對(duì)乙肝血清的測(cè)定，就不能用抽象的陽(yáng)性率應(yīng)該是60％或20％這樣的概念來(lái)判斷，同樣也不能用“二對(duì)半”的結(jié)果評(píng)判“PCR結(jié)果”，這是因?yàn)椤岸?duì)半”與“PCR”是兩種完全不同的檢測(cè)方法，其檢測(cè)結(jié)果的意義有質(zhì)的區(qū)別，它為醫(yī)務(wù)人員提供的信息是大不相同的，更加之所使用的“二對(duì)半”試劑是否能作為質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)仍待考定。目前世界上較公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)品只有雅培的“兩對(duì)半”試劑，國(guó)內(nèi)的“二對(duì)半”試劑據(jù)衛(wèi)生部抽查資料表明，一度合格率在50％以下，怎么可能作為質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)呢！對(duì)試劑敏感度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該使用下述方法科學(xué)地評(píng)價(jià)，首先選擇標(biāo)準(zhǔn)樣本如HBV全序列質(zhì)粒，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，結(jié)核菌菌體等用合適的介質(zhì)如血清、痰液等進(jìn)行有限稀釋按1：
10、1：100、1：1000、1：10000如此逐步提高稀釋度價(jià)其試劑的敏感度，一般認(rèn)為如果標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性乙肝的血清用正常血清稀釋10000倍以上，結(jié)核菌每毫升中在100個(gè)左右仍能測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，試劑的敏感度是足夠的，判斷試劑的靈敏度是足夠的，判斷試劑的靈敏度后仍需判斷試劑的檢測(cè)覆蓋，因?yàn)椴≡⑸镉胁煌男突蜃儺愔?，合格的試劑不?yīng)漏檢。最后還要判斷試劑盒的異性，一般的實(shí)驗(yàn)室可以用不同病原體的樣本按說(shuō)明書(shū)操作來(lái)判斷其對(duì)其它病原體擴(kuò)增時(shí)是否也有陽(yáng)性出現(xiàn)，其特異可達(dá)到怎樣的精度，經(jīng)過(guò)以上三個(gè)方面的研究便可以科學(xué)地判斷試劑的質(zhì)量。
三、擴(kuò)增產(chǎn)物拖尾
有時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)一個(gè)個(gè)螢光團(tuán)（Smear現(xiàn)象）或出現(xiàn)一連串的條帶，這些種現(xiàn)象主要與以下幾種因素有關(guān)：
⒈ 擴(kuò)增系統(tǒng)不完善：
這種現(xiàn)象表明出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，而產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增與擴(kuò)增系統(tǒng)中鎂離子濃度、引物濃度、DNTP濃度有密切關(guān)系，需認(rèn)真調(diào)整以期避免這種現(xiàn)象出現(xiàn)。另外也可以適當(dāng)提高退火溫度，從而提高擴(kuò)增特異性。
⒉ 模板處理方法不完善：
PCR擴(kuò)增技術(shù)的原理雖然非常簡(jiǎn)單，但這一技術(shù)的合理應(yīng)用是極其復(fù)雜的，如對(duì)PCR主要成分之一DNA聚合酶的影響因素很多，這些因子是怎樣作用于聚合酶，其作用機(jī)制至今仍不清楚，因此對(duì)樣本處理不當(dāng)不妥可能抑制擴(kuò)增，也可能導(dǎo)致非特異擴(kuò)增。一般分泌物樣本，應(yīng)取脫落細(xì)胞為主，避免采集過(guò)多的膿性分泌物，痰液樣本一定要充分液化，等等。
⒊ 引物設(shè)計(jì)不合理：
引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循以下幾個(gè)原則。首先，引物一般應(yīng)由15-30個(gè)BP組成；其次，引物中堿基應(yīng)是隨機(jī)分布，不能有一串相同堿基或出現(xiàn)其它不常見(jiàn)結(jié)構(gòu)；第三，GC堿基含量應(yīng)在45-55％左右；第四，兩個(gè)引物在3′未端不能出現(xiàn)同源性。其中以引物與基因組之間的同源性是產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的最主要原因，而我們一般在設(shè)計(jì)引物時(shí)往往只了解其基因組中的某一段序列，因此我們必須充分利用這些資料巧妙地設(shè)計(jì)出一組合理的引物，并通過(guò)反復(fù)比較、證實(shí)，最后才能確定其能否用于檢測(cè)。
四、產(chǎn)物電泳單螢光帶及多螢光帶一般PCR擴(kuò)增后，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的判斷最簡(jiǎn)單的方法是，瓊脂糖電泳，溴乙淀染色，在320nm的紫外激發(fā)觀察其螢光條帶，如果有明顯和特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，就會(huì)在電泳平板預(yù)期的位置出現(xiàn)一條清晰的螢光亮帶，按標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增系統(tǒng)配制的反應(yīng)液，其引物濃度在0.1-0.5mM，一般經(jīng)30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后，仍有相當(dāng)數(shù)量的游離引物存在，因此在電泳平板就有一條20BP左右（電泳速度較快）的淡淡的引物螢光帶，這樣每次電泳結(jié)果就有兩條滎光帶，一條在前面的，每個(gè)點(diǎn)樣樣本都有的引物帶。
引物設(shè)計(jì)相當(dāng)重要，由于基因組有龐大數(shù)量的DNA序列，除了特異性的擴(kuò)增外，往往很容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。如果引物與基因組存在較廣泛的同源性，那么就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的非特異性擴(kuò)弗，引物不僅與特異性的擴(kuò)增區(qū)域結(jié)合，而且也與其它區(qū)域發(fā)生一系列非特異性結(jié)合，而選擇引物時(shí)，常須考慮敏感性問(wèn)題，特別是臨床檢驗(yàn)試劑盒，為了能把少至幾個(gè)病原體檢出，我們大都采用在病原體基因組中重復(fù)出現(xiàn)的DNA序列設(shè)計(jì)引物，如果這些重復(fù)序列沒(méi)有嚴(yán)格的同源性，就在可能出現(xiàn)不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物而出現(xiàn)多條帶擴(kuò)增。
病原體變異，與前面所述一樣，我們?yōu)榈酶呙舾行越?jīng)常使用具有重復(fù)序列的基因作為引物設(shè)計(jì)的區(qū)段，在有些病原體，比如結(jié)核桿菌在治病過(guò)程中，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重畸變，也包括其遺傳物質(zhì)的變化，出現(xiàn)染色體的缺失、不等位交換、其它序列的插入等。如果這些缺失與不等位交換正好發(fā)生在我們所選擇的擴(kuò)增序列上，也會(huì)出現(xiàn)不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而產(chǎn)生多條擴(kuò)增產(chǎn)物帶。
PCR基因擴(kuò)增技術(shù)簡(jiǎn)單易行，應(yīng)用日趨廣泛，但其影響因素很多，在實(shí)踐過(guò)程中時(shí)常現(xiàn)現(xiàn)這樣或那樣的問(wèn)題，甚至得不到預(yù)期的結(jié)果，或出現(xiàn)無(wú)法解釋的現(xiàn)象。誠(chéng)然，近年來(lái)在大量科學(xué)工作者的共同努力下，取得了許多寶貴的經(jīng)驗(yàn)，使這一技術(shù)日趨完善，畢竟PCR是一項(xiàng)近幾年才出現(xiàn)的新技術(shù)，許多問(wèn)題至今仍然不能得到很好地解釋或解決。想信隨著對(duì)PCR的深入研究，在PCR的應(yīng)用過(guò)程中不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，PCR這一新技術(shù)將會(huì)為人類(lèi)的發(fā)展作出更大的貢獻(xiàn)。
PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間
一般為48h以?xún)?nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。
引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。
假陽(yáng)性
出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。
出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
克隆PCR產(chǎn)物
1)克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？
最佳插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4℃過(guò)夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿(mǎn)足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4℃過(guò)夜。
2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見(jiàn)其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。
3)如果沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？
A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。
如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。
B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。
例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過(guò)夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為：
1000克隆X10（3次方）ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞
如沒(méi)有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。
C）如用pGEM-T正對(duì)照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。
T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無(wú)核酸酶污染，不應(yīng)用其它來(lái)源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對(duì)照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑, 沒(méi)有菌落或少有菌落，連接有問(wèn)題。
4)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒(méi)有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問(wèn)題？
A）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿(mǎn)足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4℃過(guò)夜。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過(guò)度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過(guò)度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。
D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無(wú)A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。
E）高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞
PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：
10×擴(kuò)增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物
各200umol/L
引物
各10～100pmol
模板DNA
0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+
1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul
PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。
設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。做配藥品，稀釋引物，PCR實(shí)驗(yàn)中，對(duì)水的要求要很高么?
配制一般化學(xué)試劑使用二級(jí)水即可。
配制生化試劑，包括引物稀釋、PCR所用水，以及轉(zhuǎn)膜、核酸抽提等，必須使用二次蒸餾水或一級(jí)水。
[1] PCR引物設(shè)計(jì)的原則
引物設(shè)計(jì)有3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。
具體實(shí)現(xiàn)這3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長(zhǎng)度（primer length），產(chǎn)物長(zhǎng)度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability, 用?G 值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplex formation and hairpin）的能值，在錯(cuò)配位點(diǎn)（false priming site）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC 含量（composition），等等。必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。根據(jù)有關(guān)參考資料和筆者在實(shí)踐中的總結(jié)，引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意如下要點(diǎn)：
1.引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)[2]。
2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3 個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加[2]。
3.引物3’端的末位堿基對(duì)Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A 的錯(cuò)配效率明顯高于其他3 個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR 反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR 影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物[2]。
4.引物序列的GC 含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5.引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。Tm 值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)[6][7]。
6.?G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G 值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），而5’端和中間?G 值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的?G 值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)[6]。
7.引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高（超過(guò)4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行[8]。
8.對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR 產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。
值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR 因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿(mǎn)足條件。
[2] 擴(kuò)增較大片段DNA的PCR方法
一般PCR方法在擴(kuò)增大片段DNA時(shí)的局限性：
通常所用的PCR方法都在兩個(gè)方面有局限，即目標(biāo)產(chǎn)物精確程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校讀活性（3'-editing-exonuclease），可以將每個(gè)循環(huán)中堿基的錯(cuò)配率由10*-4降到10*-3，從而提高PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。但它在擴(kuò)增1.5-2.0kb片段時(shí)，效率比Klentaq l(Taq DNA聚酶N-末端缺失突變體，類(lèi)似于E.coli DNA聚合酶I Klenow片段）或AmpliTaq（全長(zhǎng)的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在擴(kuò)增5.0-7.0kb片段時(shí)亦不比各種形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq
1、Klentaq 5等N-末端缺失的變異株）有明顯優(yōu)越之處。因而以往的PCR反應(yīng)產(chǎn)物限制在5.0kb以?xún)?nèi)。超出這一范圍，PCR擴(kuò)增反應(yīng)效率將明顯下降，同時(shí)產(chǎn)物會(huì)降解。即使將延伸時(shí)間定為30分鐘（10倍于通常所需）亦無(wú)改進(jìn)。
利用兩種DNA聚合酶進(jìn)行較大片段DNA的擴(kuò)增
美國(guó)華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Barnes WM等對(duì)前述問(wèn)題進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，認(rèn)為：PCR反應(yīng)效率低最主要的原因是由于錯(cuò)配的堿基阻礙了延伸反應(yīng)的正常進(jìn)行，Pfu DNA聚合酶雖然可以通過(guò)“校讀”功能糾正錯(cuò)配的堿基，但亦可能降解引物，尤其是在較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間下；酶濃度較高時(shí)，反應(yīng)效果更差。因此必需將Pfu DNA聚合酶的濃度控制在較低狀態(tài)，同時(shí)配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，這樣既可以有效地去除錯(cuò)配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反應(yīng)順暢進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小為27-33nt,即可使反應(yīng)有效進(jìn)行。當(dāng)然，對(duì)于各種不同條件的反應(yīng)，兩種類(lèi)型酶的最佳配比需要具體考慮。
控制脫嘌呤反應(yīng)增強(qiáng)擴(kuò)增效率
在PCR反應(yīng)體系中某些成分耐熱性較差，會(huì)影響反應(yīng)效率。DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性一般都是較好的，可能是模板DNA在溫度較高的環(huán)境中某些位點(diǎn)發(fā)生脫嘌呤反應(yīng)從而阻礙反應(yīng)的順利進(jìn)行。Lindahl和Nyberg的研究結(jié)果顯示：在70℃ pH7.4的條件下，單鏈DNA脫嘌 呤反應(yīng)的速度是雙鏈DNA的4倍；100℃ pH7.0時(shí)，100kb的堿基中每分鐘將有1個(gè)位點(diǎn)脫嘌呤。這一反應(yīng)與緩沖體系中酸堿度的變化有關(guān)。人們注意到：三羥甲基氨基甲烷（Tris）的酸解離常數(shù)（pKa）會(huì)隨溫度升高而改變，平均每升高1℃，pKa值降低0.03。因而，在25℃時(shí)pH8.55的PCR反應(yīng)體系，到95℃熱變性時(shí)，pH值將變?yōu)?.45，這就很可能誘導(dǎo)脫嘌呤反應(yīng)。為了解決這一問(wèn)題，可以采取下列措施：
縮短熱變性時(shí)間，Barnes等在擴(kuò)增35kb的大片段時(shí)，變性條件為95℃5秒，取得滿(mǎn)意結(jié)果；
盡可能使升溫、降溫過(guò)程縮短，可選擇使用導(dǎo)熱性能優(yōu)越的薄壁反應(yīng)管及較為先進(jìn)的擴(kuò)增設(shè)備；
適當(dāng)提高反應(yīng)體系的pH值，反應(yīng)最初應(yīng)控制在pH8.8-9.2范圍；
適當(dāng)增加延伸時(shí)間（可長(zhǎng)至20分鐘）。使用這種方法可以擴(kuò)增最大為35kb的DNA片段，產(chǎn)物的準(zhǔn)確性亦有充分保證，克服了以往基因克隆過(guò)程中出現(xiàn)的DNA分子內(nèi)的堿基重排和可能的毒性危險(xiǎn)等問(wèn)題。
酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2。5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。
dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。
PCR反應(yīng)條件的選擇
PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。
溫度與時(shí)間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。
①變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。
②退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。
③延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。
一、RT-PCR
1.cDNA產(chǎn)量的很低
可能的原因：
*RNA模板質(zhì)量低
*對(duì)mRNA濃度估計(jì)過(guò)高
*反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足
*同位素磷32過(guò)期
*反應(yīng)體積過(guò)大，不應(yīng)超過(guò)50μl
2.擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒(méi)有條帶或條帶很淺
*最常見(jiàn)的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系
*與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)
*建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA *第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過(guò)1/10
*建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無(wú)法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。
*目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：
a.將第一鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。b.使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行第一鏈反應(yīng)。
3.產(chǎn)生非特異性條帶
*用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。
*在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。
*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。
4.產(chǎn)生彌散（smear）條帶
*在PCR反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高
*減少引物的用量
*優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)
*在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。
5.產(chǎn)生大分子量的彌散條帶
*大多數(shù)情況下是由于退火溫度過(guò)低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的 *對(duì)于長(zhǎng)片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）
6.在無(wú)反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對(duì)照RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果
*通常是由于對(duì)照RNA中含有痕量DNA而導(dǎo)致的。由于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:
10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。
*有可能是引物二聚體的條帶
7.擴(kuò)增產(chǎn)物滯留在加樣孔中
*有可能是由于模板量過(guò)高而導(dǎo)致PCR結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。建議將第一鏈結(jié)果至少稀釋100倍再進(jìn)行二次擴(kuò)增。
*另外，在二次PCR時(shí)使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。
8.SSⅢ與SSⅡ有何不同？
*具有更高的熱穩(wěn)定性（達(dá)50℃）
*具有更長(zhǎng)的半衰期（達(dá)220分鐘）
*對(duì)PCR無(wú)抑制
*干冰運(yùn)輸
*Tdt活性更低
SuperScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶
9.為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript？
ThermoScript如果保存不當(dāng)會(huì)引起活性很快降低，SSⅢ則更穩(wěn)定。
10.為什么使用基因特異性引物（GSP）？
GSP在擴(kuò)增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時(shí)是最好的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄；隨機(jī)引物用于mRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄。
11.什么情況下需要使用RNase H？
在第一輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時(shí)
12.根據(jù)不同的目的選擇不同的系統(tǒng)：
目的建議
RT與PCR使用不同的引物
或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶
兩步法RT-PCR系統(tǒng)
高靈敏度
一步法或兩步法RT-PCR系統(tǒng)
高特異性
含有適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)
或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)
高保真度
含有Pfx Taq酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)
長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果
通常使用兩步法RT-PCR系統(tǒng)可達(dá)到最佳結(jié)果
含Elongase酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)
二、Generacer
1.如何針對(duì)Generacer試劑盒設(shè)計(jì)基因特異性引物（GSP）？
使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設(shè)計(jì)引物時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)要求：
*50-70％的GC含量，以提高引物熔點(diǎn)（Tm）
*23-28個(gè)堿基長(zhǎng)度，以提高引物特異性
*降低3’端GC含量，將引物非特異性結(jié)合的可能性降至最低
2.為什么得不到RACE產(chǎn)物？
*加入Hela對(duì)照
*低質(zhì)量的RNA模板
*逆轉(zhuǎn)錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長(zhǎng)模板cDNA的合成
*目的基因豐度太低，可以通過(guò)提高PCR的循環(huán)次數(shù)來(lái)解決，建議使用巢式PCR
*目的基因沒(méi)有表達(dá)，可以通過(guò)使用兩條GSPs來(lái)分析cDNA中是否含有目的基因
*目的基因太長(zhǎng)而不適合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來(lái)得到全長(zhǎng)cDNA，使用隨機(jī)引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR。
*cDNA模板屬于困難模板，可以通過(guò)以下方法解決：優(yōu)化PCR反應(yīng)參數(shù)及反應(yīng)體系；降低退火溫度；使用5-10％的DMSO幫助通過(guò)高GC含量區(qū)；使用高保真度和高延伸能力的酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。
3.RACE的PCR結(jié)果有雜帶
RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：
*GSP與其他cDNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致在擴(kuò)增目的產(chǎn)物時(shí)得到無(wú)關(guān)產(chǎn)物。
*GeneRacer引物和cDNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產(chǎn)物。
*RNA降解。
*PCR管或試劑污染。
注意：雜帶一般是因?yàn)闆](méi)有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對(duì)照來(lái)確定。
4.得不到全長(zhǎng)的5’RACE PCR產(chǎn)物
*CIP反應(yīng)后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無(wú)降解。
*CIP脫磷酸不完全，可以增加反應(yīng)中CIP的量或減少RNA的量。
*PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。
三、PCR
在進(jìn)行PCR時(shí)：
*請(qǐng)確保您沒(méi)有使用過(guò)量的起始DNA或者過(guò)高濃度的引物，也沒(méi)有加入過(guò)量的Mg++
*請(qǐng)確保您使用了恰當(dāng)?shù)耐嘶饻囟?/p>
*請(qǐng)確保您沒(méi)有使用過(guò)量的DNA聚合酶
四、引物
1.應(yīng)該選擇哪種純化方法？
取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵锏拈L(zhǎng)度
2.為什么我訂購(gòu)了50nmol，但是收到卻只有40nmol？
50nmol是起始量
3.怎樣制備100μM的儲(chǔ)液？
體積（μl）=質(zhì)檢報(bào)告上的nmol數(shù)目×10
4.怎樣設(shè)計(jì)引物？
*一般長(zhǎng)度20-30bp；
*至少50%的GC含量；
*避免引物二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu)；
*引物對(duì)的Tm值應(yīng)該接近。
5.引物序列有插入或缺失？
*使用上游和下游引物多測(cè)幾個(gè)克隆。
*請(qǐng)選擇正確的純化方法。
6.PCR無(wú)結(jié)果？
*請(qǐng)檢查引物設(shè)計(jì)是否正確；
*請(qǐng)檢測(cè)OD讀數(shù)是否正確；
*做一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照。
第二篇：ICP許可證申請(qǐng)問(wèn)題全解
ICP經(jīng)營(yíng)許可證申請(qǐng)問(wèn)題
什么是ICP經(jīng)營(yíng)許可證
ICP許可證，也稱(chēng)互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)業(yè)務(wù)經(jīng)營(yíng)許可證，或者增值電信業(yè)務(wù)許可證中的互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)業(yè)務(wù)。
為規(guī)范互聯(lián)網(wǎng)秩序，根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院令第291號(hào)《中華人民共和國(guó)電信條例》、第292號(hào)《互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)管理辦法》，國(guó)家對(duì)提供互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)的ICP實(shí)行許可證制度。
ICP許可證由各地通信管理部門(mén)核發(fā)。
ICP經(jīng)營(yíng)許可證申請(qǐng)流程：
ICP許可證，也稱(chēng)互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)業(yè)務(wù)經(jīng)營(yíng)許可證，或者增值電信業(yè)務(wù)許可證中的互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)業(yè)務(wù)。
根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院令第291號(hào)《中華人民共和國(guó)電信條例》、第292號(hào)《互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)管理辦法》，國(guó)家對(duì)提供互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)的ICP實(shí)行許可證制度。
ICP許可證由各地通信管理部門(mén)核發(fā)。ICP證申請(qǐng)過(guò)程是:
貴單位提交材料-----我們整理材料--------提交相關(guān)機(jī)構(gòu)審批(2-3個(gè)工作日)-------提交通信管理局審批發(fā)證(30-60個(gè)工作日內(nèi))
ICP許可證申請(qǐng)條件：
（一）經(jīng)營(yíng)者為依法設(shè)立的公司；
（二）注冊(cè)資本最低限額為100萬(wàn)元人民幣；
（三）有可行性研究報(bào)告和相關(guān)技術(shù)方案；
（四）有與開(kāi)展經(jīng)營(yíng)活動(dòng)相適應(yīng)的資金和專(zhuān)業(yè)人員；
（五）有必要的場(chǎng)地和設(shè)施；
（六）有為用戶(hù)提供長(zhǎng)期服務(wù)的信譽(yù)或者能力；
（七）最近三年內(nèi)未發(fā)生過(guò)重大違法行為。
ICP許可證申請(qǐng)材料：
ICP許可證由各地通信管理部門(mén)核發(fā)。ICP證申請(qǐng)單位應(yīng)準(zhǔn)備的材料：
一、公司法定代表人簽署的經(jīng)營(yíng)增值電信業(yè)務(wù)的書(shū)面申請(qǐng)(尚未獲得企業(yè)法人營(yíng)業(yè)執(zhí)照、擬成立有限責(zé)任公司的，應(yīng)當(dāng)由全體股東簽署;擬成立股份有限公司的，應(yīng)由全體發(fā)起人簽署)。
*內(nèi)容應(yīng)包括：申請(qǐng)電信業(yè)務(wù)的名稱(chēng)、業(yè)務(wù)覆蓋范圍、公司名稱(chēng)、通信地址、郵政編碼、聯(lián)系人、聯(lián)系電話(huà)、電子信箱地址等。
二、公司的企業(yè)法人營(yíng)業(yè)執(zhí)照副本及有效復(fù)印件(尚未獲得企業(yè)法人營(yíng)業(yè)執(zhí)照的申請(qǐng)者，應(yīng)當(dāng)提交公司的企業(yè)名稱(chēng)預(yù)先核準(zhǔn)通知書(shū)或工商預(yù)登記證明)。公司注冊(cè)資金不得少于100萬(wàn)元人民幣。
三、公司概況。包括：公司基本情況，擬從事增值電信業(yè)務(wù)的內(nèi)部機(jī)構(gòu)設(shè)置、技術(shù)力量和經(jīng)營(yíng)管理人員情況(必須具備不少于兩名中級(jí)職稱(chēng)以上的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員或具有兩名以上具有相關(guān)專(zhuān)業(yè)的大學(xué)畢業(yè)生，生產(chǎn)人員按實(shí)際需要配備。申辦時(shí)應(yīng)提供相關(guān)人員的學(xué)歷證明或職稱(chēng)證書(shū)，以及其在公司的任職情況)，與從事經(jīng)營(yíng)活動(dòng)相適應(yīng)的場(chǎng)地(場(chǎng)地平面圖，房屋產(chǎn)權(quán)證明和租賃證明)、設(shè)施(已購(gòu)或欲購(gòu)的設(shè)備清單)等情況。
*人員證明應(yīng)該包括人員在公司的任職情況和技術(shù)專(zhuān)業(yè)的本科畢業(yè)證書(shū)、設(shè)施是指從事相關(guān)電信業(yè)務(wù)須購(gòu)買(mǎi)的設(shè)備。
四、經(jīng)會(huì)計(jì)師事務(wù)所審計(jì)的最近的公司驗(yàn)資報(bào)告(正式件及復(fù)印件)。同時(shí)要提交相關(guān)會(huì)計(jì)師事務(wù)所的資質(zhì)證明。
*驗(yàn)資報(bào)告必須是最近一年內(nèi)的，而且要與公司章程里的股東情況相一致。超過(guò)一年的驗(yàn)資報(bào)告還需提供公司最近的財(cái)務(wù)審計(jì)報(bào)告。會(huì)計(jì)師事務(wù)所的資質(zhì)證明一般是指會(huì)計(jì)師事務(wù)所營(yíng)業(yè)執(zhí)照復(fù)印件。
五、公司章程，公司股權(quán)結(jié)構(gòu)及股東的有關(guān)情況(自然人股東應(yīng)提供股東身份證復(fù)印件，法人股東應(yīng)提供股東公司章程)。
*有效公司章程要求復(fù)印件上應(yīng)當(dāng)有所有股東的簽字(法人股東應(yīng)蓋法人公司章)。
六、項(xiàng)目可行性研究報(bào)告和技術(shù)方案。包括：經(jīng)營(yíng)電信業(yè)務(wù)的業(yè)務(wù)發(fā)展和實(shí)施計(jì)劃、技術(shù)方案、服務(wù)項(xiàng)目、業(yè)務(wù)實(shí)現(xiàn)方式、覆蓋范圍、市場(chǎng)調(diào)研與分析、收費(fèi)方案、預(yù)期服務(wù)質(zhì)量、投資分析、社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益等。
七、為用戶(hù)提供長(zhǎng)期服務(wù)和質(zhì)量保障的措施(經(jīng)營(yíng)者應(yīng)能提供全天24小時(shí)的通信聯(lián)絡(luò)手段。有受理用戶(hù)申告、及時(shí)處理用戶(hù)故障的服務(wù)保障措施和迅速修復(fù)系統(tǒng)故障的能力，并建立必要的工作制度)。
八、信息安全保證措施。包括信息內(nèi)容的安全、網(wǎng)絡(luò)運(yùn)行的安全、安全保障責(zé)任制等安全保障制度(擬從事互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)業(yè)務(wù)的，見(jiàn)相關(guān)附件：從事互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)業(yè)務(wù)網(wǎng)絡(luò)與信息安全保證書(shū))。
九、證明公司信譽(yù)的有關(guān)材料。
*指公司獲得的獎(jiǎng)項(xiàng)(沒(méi)有可不提供)。
十、公司法定代表人簽署的公司依法經(jīng)營(yíng)電信業(yè)務(wù)的承諾書(shū)(尚未獲得企業(yè)法人營(yíng)業(yè)執(zhí)照、擬成立有限責(zé)任公司的，應(yīng)當(dāng)由全體股東簽署;擬成立股份有限公司的，應(yīng)由全體發(fā)起人簽署)。
十一、申請(qǐng)經(jīng)營(yíng)的電信業(yè)務(wù)依照法律、行政法規(guī)及國(guó)家有關(guān)規(guī)定須經(jīng)有關(guān)主管部門(mén)事先審核同意的，應(yīng)當(dāng)提交有關(guān)主管部門(mén)審核同意的文件。(具體咨詢(xún)電話(huà)見(jiàn)此文檔最后)
十二、公司法定代表人對(duì)申請(qǐng)材料真實(shí)性的承諾。
十三、申請(qǐng)業(yè)務(wù)中包含互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)的，須提交擬經(jīng)營(yíng)網(wǎng)站的域名證書(shū)。
*域名證書(shū)的域名所有者必須是公司本身或者公司的股東。域名所有者是公司的股東的，還要提供股東的域名轉(zhuǎn)讓使用授權(quán)書(shū)。
十四、應(yīng)提交的其他材料。
ICP許可證需要多長(zhǎng)時(shí)間能下證：
如果材料完善、并將填寫(xiě)正確的ICP申請(qǐng)表送至通信管理局后，ICP證將在60個(gè)工作日內(nèi)頒發(fā)下來(lái)。
注冊(cè)資金不足100萬(wàn)怎么申請(qǐng)ICP：
注冊(cè)資金不足100萬(wàn)怎么申請(qǐng)ICP?申請(qǐng)ICP許可證的條件之一就是要滿(mǎn)足申請(qǐng)資金達(dá)到100萬(wàn)元，如果注冊(cè)資金不足的話(huà)，也可以辦理ICP，下面我們就來(lái)介紹幾種方法，供您參考。
可以去做增資，把公司注冊(cè)資金增資到100萬(wàn)。也可以找ICP代辦公司，讓他們幫你解決問(wèn)題。金三咨詢(xún)是一家很不錯(cuò)的ICP代辦公司，如果需要的話(huà)，可以前來(lái)聯(lián)系，電話(huà)：4006661429
申請(qǐng)ICP經(jīng)營(yíng)許可證注銷(xiāo)應(yīng)報(bào)送的材料：
ICP經(jīng)營(yíng)許可證又稱(chēng)互聯(lián)網(wǎng)經(jīng)營(yíng)許可證，是增值電信業(yè)務(wù)經(jīng)營(yíng)許可證的一種，其業(yè)務(wù)種類(lèi)是互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)業(yè)務(wù)。ICP經(jīng)營(yíng)許可證的有效期為5年，在有效期內(nèi)不想繼續(xù)使用該證書(shū)了，或者到了有效期不想繼續(xù)經(jīng)營(yíng)該項(xiàng)業(yè)務(wù)了，就要到相關(guān)部門(mén)辦理注銷(xiāo)了。注銷(xiāo)這一資質(zhì)時(shí)需要準(zhǔn)備好下列材料。
申請(qǐng)互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)(ICP)經(jīng)營(yíng)許可證項(xiàng)目注銷(xiāo)應(yīng)報(bào)送的材料：
一、單位介紹信。
二、公司企業(yè)法人營(yíng)業(yè)執(zhí)照有效復(fù)印件、公司章程、會(huì)計(jì)師事務(wù)所出具的驗(yàn)資報(bào)告及法人身份證復(fù)印件。(變更前后的營(yíng)業(yè)執(zhí)照都要提供)
三、提供ICP經(jīng)營(yíng)許可證原件。
四、申辦互聯(lián)網(wǎng)信息服務(wù)(ICP)經(jīng)營(yíng)許可證項(xiàng)目注銷(xiāo)申請(qǐng)書(shū)。
第三篇：《散步》全解
七年級(jí)上冊(cè)教材全解 01 散
步 莫懷戚
●學(xué)習(xí)目標(biāo) 1．知識(shí)與能力
整體感悟課文內(nèi)容，通過(guò)比較閱讀提高審美情趣。2．過(guò)程與方法
精讀時(shí)，你將學(xué)會(huì)以小見(jiàn)大、結(jié)尾升華主題的寫(xiě)作方法。3．情感價(jià)值觀
細(xì)讀品味后，你還會(huì)從文中受到尊老愛(ài)幼、珍愛(ài)親情、珍愛(ài)生命的情感熏陶。
●文題全解 1．題目解說(shuō)
散步的意思是隨便走走，是一種休息方式。本文主要寫(xiě)的就是作者一家三代四口人一次典型的散步經(jīng)歷。所以文題就是文章主要內(nèi)容的高度濃縮，也是文章的線(xiàn)索，作者通過(guò)把散步中幾個(gè)相關(guān)的細(xì)節(jié)連綴起來(lái)，從而揭示祖孫三代人互敬互愛(ài)的這個(gè)主題。2．作者簡(jiǎn)介
莫懷戚，當(dāng)代作家。3．背景資料
本文選自1985年8月2日的《中國(guó)青年報(bào)》。作者寫(xiě)此文之前，確實(shí)有一次全家三輩四口人散步的親身經(jīng)歷，里面的真人真景及部分真事也與課文內(nèi)容毫無(wú)二致，但作者并沒(méi)有產(chǎn)生創(chuàng)作動(dòng)機(jī)。1985年，作者從他的好友美國(guó)漢學(xué)家柯?tīng)柼叵壬抢锏弥涸诿绹?guó)人眼里，中國(guó)人尊老愛(ài)幼、贍養(yǎng)父母是全世界做得最好的，而在美國(guó)是不可想像的。作者聽(tīng)后感慨不已：我們自己丟掉的，發(fā)達(dá)國(guó)度的人卻拾起來(lái)。于是作者開(kāi)始重新審視這份看起來(lái)很陳舊已無(wú)什么價(jià)值的民族遺產(chǎn)。寫(xiě)作的念頭就此產(chǎn)生了。
●正文全解
1．句段全解
我們?cè)谔镆吧⒉剑何?，我的母親，我的妻子和兒子?！旧ⅲ簊ǎn散文，松散；sàn散開(kāi)，散步】
【段解：這段交待事件：散步；地點(diǎn)：田野；人物：我、我的母親、我的妻子、我的兒子。屬于“開(kāi)門(mén)見(jiàn)山”開(kāi)頭法?！?/p>
母親本不愿出來(lái)的。她老了，身體不好，走遠(yuǎn)一點(diǎn)就覺(jué)得很累。我說(shuō)，正因?yàn)槿绱耍艖?yīng)該多走走。母親信服地點(diǎn)點(diǎn)頭，便去拿外套?！拘欧合嘈挪⑴宸克F(xiàn)在很聽(tīng)我的話(huà)，就像我小時(shí)候很聽(tīng)她的話(huà)一樣。【句解：這句話(huà)表達(dá)了一個(gè)中年兒子與老年母親所特有的骨肉深情。兒子小時(shí)候聽(tīng)母親的話(huà)，說(shuō)明兒子是好兒子，母親是好母親；母親老了，聽(tīng)成年兒子的話(huà)，說(shuō)明母親懂得尊重兒子，而兒子也懂得關(guān)心老人。母子之間的感情是親切的、和諧的、始終如一的?！?/p>
【段解：這段交待了散步的緣由(原因)。并且為下文背母親埋下了伏筆。】
天氣很好。今年的春天來(lái)得太遲，太遲了，有一些老人挺不住。但是春天總算來(lái)了。我的母親又熬過(guò)了一個(gè)嚴(yán)冬?！景荆酣熬夜；āo熬菜。嚴(yán)冬：寒冷的冬天】
這南方初春的田野，大塊小塊的新綠隨意地鋪著，有的濃，有的淡；樹(shù)上的嫩芽也密了；田里的冬水也咕咕地起著水泡。這一切都使人想著一樣?xùn)|西——生命。
【段解：這兩個(gè)自然段是一個(gè)過(guò)渡。其中第四自然段描繪了新綠、嫩芽、冬水，展現(xiàn)了春天的氣息，生命的呼喚，寫(xiě)得富有詩(shī)意。讀后使人似乎聞到了鄉(xiāng)間田野泥土的芬芳，襯托了作者一家散步時(shí)祥和、歡樂(lè)的情緒。語(yǔ)言清新，文字優(yōu)美。】
我和母親走在前面，我的妻子和兒子走在后面。小家伙突然叫起來(lái)：“前面也是媽媽和兒子，后面也是媽媽和兒子。”【句解：寫(xiě)出了兒子的天真可愛(ài)、聰明智慧，話(huà)里充滿(mǎn)了生活的情趣?！课覀兌夹α?。
【段解：這一段開(kāi)始入題，用兒子的話(huà)為下文所要揭示的深刻思想內(nèi)容做鋪墊?！?/p>
后來(lái)發(fā)生了分歧：【分歧qí：不一致，有差別】母親要走大路，大路平順；我的兒子要走小路，小路有意思。不過(guò)，一切都取決于我。我的母親老了，她早已習(xí)慣聽(tīng)從她強(qiáng)壯的兒子；我的兒子還小，他還習(xí)慣聽(tīng)從他高大的父親；【句解：這兩句話(huà)中前后加點(diǎn)的詞不能互換。她“早已習(xí)慣”寫(xiě)的是上一代母子關(guān)系，他“還習(xí)慣”寫(xiě)的是下一代父子關(guān)系。同是一個(gè)“我”，在母親眼里是“強(qiáng)壯”的，而在兒子的眼里則是“高大”的。用詞符合實(shí)際、準(zhǔn)確恰當(dāng)?！科拮幽兀谕饷?，她總是聽(tīng)我的。一霎時(shí)，【霎（shà）時(shí)：時(shí)間短】我感到了責(zé)任的重大。我想一個(gè)兩全的辦法，找不出；我想拆散一家人，分成兩路，各得其所，【各得其所：每一個(gè)人或事物都得到合適的安頓?！拷K不愿意。我決定委屈兒子，因?yàn)槲野橥臅r(shí)日還長(zhǎng)?！緯r(shí)日：時(shí)間和日期。】我說(shuō)：“走大路?！薄揪浣猓鹤叽舐贩奖憷先?。“我”理所當(dāng)然地照顧母親。反映了對(duì)母親的尊敬和孝順?！?/p>
但是母親摸摸孫兒的小腦瓜，變了主意：“還是走小路吧。”【句解：走小路孩子感興趣。母親慈祥，想讓孫子高興，改變了主意。反映了母親對(duì)孫子的喜歡和愛(ài)護(hù)?！白叽舐贰薄啊弊咝÷贰边@兩處細(xì)節(jié)描寫(xiě)，具體體現(xiàn)了一個(gè)幸福的家庭在散步中互敬互愛(ài)的融洽氣氛?！克难垭S小路望去：那里有金色的菜花，兩行整齊的桑樹(shù)，盡頭一口水波粼粼的魚(yú)塘?！爵贼?1ín)：形容波光。】【句解：敘事中穿插景物描寫(xiě)，展現(xiàn)春天的生機(jī)，春天的活力，透露出一種新的希望?！?“我走不過(guò)去的地方，你就背著我?！蹦赣H對(duì)我說(shuō)。
【段解：這兩個(gè)自然段寫(xiě)“我：愛(ài)幼，更尊老；母親聽(tīng)從兒子，更愛(ài)孫子。展現(xiàn)了一家人相互體諒、生活和諧的畫(huà)面?！?/p>
這樣，我們?cè)陉?yáng)光下，向著那菜花、桑樹(shù)和魚(yú)塘走去。到了一處，我蹲下來(lái)，【蹲：dūn 蹲下；樽zūn：酒樽】背起了母親，妻子也蹲下來(lái)，背起了兒子。我的母親雖然高大，然而很瘦，自然不算重；兒子雖然很胖，畢竟幼小，自然也輕。但我和妻子都是慢慢地，穩(wěn)穩(wěn)地，走得很仔細(xì)，好像我背上的同她背上的加起來(lái)，就是整個(gè)世界?！揪浣猓哼@句話(huà)的含義是：“我”和“妻子”人到中年，站在人生的中點(diǎn)上，肩負(fù)著承前啟后的責(zé)任。對(duì)上，肩負(fù)著贍養(yǎng)老人的義務(wù)；對(duì)下，承擔(dān)著培養(yǎng)教育子女的重任。形象地表明了我對(duì)生活有一種使命感?！?/p>
【段解：這一段主要寫(xiě)散步時(shí)“我”背母親，妻背兒子過(guò)水溝的細(xì)節(jié)。刻畫(huà)了一家人尊老愛(ài)幼的動(dòng)人場(chǎng)面。最后一句是全文的畫(huà)龍點(diǎn)睛之筆，揭示了中年人要對(duì)生活有一種使命感，因?yàn)橹心耆思缲?fù)著承前啟后的責(zé)任，對(duì)繼承和發(fā)揚(yáng)中華民族尊老愛(ài)幼的傳統(tǒng)美德起著橋梁和紐帶作用?！?/p>
●整體把握
1．主題全解
作者通過(guò)選取祖孫三代一家人在田野里散步這個(gè)生活側(cè)面，生動(dòng)地展示了這一家人互敬互愛(ài)、和睦相處的深厚感情和生活情趣，體現(xiàn)了中華民族尊老愛(ài)幼的傳統(tǒng)美德。2．結(jié)構(gòu)全解
略
●問(wèn)題研究
1．寫(xiě)法歸納
(1)按照順敘展開(kāi)，事件一目了然。
本文開(kāi)頭交待了事件發(fā)生的時(shí)間、地點(diǎn)、人物、緣由，屬于“交待要素”開(kāi)頭法。接著作者按照事情發(fā)展順序?qū)懗隽耸虑榈拈_(kāi)始、發(fā)展、高潮和結(jié)尾。記敘的六要素在本文體現(xiàn)得非常清晰，使讀者對(duì)事件一目了然。這種記敘的順序就是順敘。
(2)選取平凡小事，以小見(jiàn)大立意。
采用日常生活中看似平常的題材，來(lái)表現(xiàn)具有深刻社會(huì)意義的主題，這種寫(xiě)法就是以小見(jiàn)大立意法。采用這種方法寫(xiě)文章，要求選取平凡生活中富有典型意義的題材。并非隨意撿來(lái)的一件小事、一個(gè)場(chǎng)景、一個(gè)生活片段便可以表明一個(gè)大道理的，要能從本質(zhì)上把握“小事”與整個(gè)時(shí)代、社會(huì)和生活的內(nèi)在聯(lián)系。
《散步》寫(xiě)祖孫三代人在一起散步的平凡小事，表現(xiàn)出一家人之間的互敬互愛(ài)，體現(xiàn)了中華民族的傳統(tǒng)美德。作者選取“散步”這一生活側(cè)面，表現(xiàn)那種對(duì)人類(lèi)社會(huì)的繁衍、發(fā)展具有重要意義的道德、情感，用的是“以小見(jiàn)大”的寫(xiě)法。文章不長(zhǎng)，但是寫(xiě)得情趣盎然，很有波瀾。兒子“叫起來(lái)”是一波，一波初平，行路分歧又起，最后小路遇水塘阻擋是余波，矛盾的產(chǎn)生和解決進(jìn)一步突出了家人之間的深厚感情，使散步過(guò)程饒有意趣。
2．重點(diǎn)難點(diǎn)
理解通過(guò)細(xì)節(jié)描寫(xiě)，展示人物感情的寫(xiě)法。
細(xì)節(jié)是指人物細(xì)微的舉止行動(dòng)或細(xì)微的情節(jié)。細(xì)節(jié)具有典型意義，如果運(yùn)用恰當(dāng)，會(huì)耐人尋味。在《散步》一文中表現(xiàn)互敬互愛(ài)的細(xì)節(jié)有：母親和兒子發(fā)生分歧，“我”經(jīng)過(guò)思考決定：“走大路”——走大路方便老人。“我”理所當(dāng)然地照顧母親，反映了對(duì)母親的尊敬。母親改變了主意：“還是走小路吧!”——走小路孩子感興趣。母親慈祥，想讓孫子高興，改變了主意，體現(xiàn)了母親對(duì)孫子的喜歡和愛(ài)護(hù)。這兩處細(xì)的情節(jié)，反映了兩代人的具體心態(tài)，表現(xiàn)了一個(gè)幸福的家庭在散步中互敬互愛(ài)，十分融洽的氣氛。又如：“我蹲下來(lái)，背起了母親，妻子也蹲下來(lái)，背起了兒子?！边@個(gè)背母親的細(xì)微動(dòng)作，不只有尊老的含義，也體現(xiàn)出了“我”具有的一種使命感。●練習(xí)全解
一
朗讀全文。題目“散步”是從文章主要事件的角度確定的，你覺(jué)得這個(gè)標(biāo)題好嗎?請(qǐng)你換一個(gè)角度為本文擬一個(gè)標(biāo)題，并說(shuō)說(shuō)你的理由。
本題在標(biāo)題上做文章，意在整體把握課文內(nèi)容，也是揣摩標(biāo)題藝術(shù)。第一問(wèn)，可以回答“好”，也可以回答“不好”，只要言之成理即可。另擬標(biāo)題，可以各顯神通，擬好后交流一下，相互評(píng)判，鼓勵(lì)創(chuàng)意。
二
“我蹲下來(lái)，背起了母親，妻子也蹲下來(lái)，背起了兒子??但我和妻子都是慢慢地，穩(wěn)穩(wěn)地，走得很仔細(xì)，好像我背上的同她背上的加起來(lái)，就是整個(gè)世界?！闭f(shuō)說(shuō)你對(duì)這段話(huà)的理解，并與同學(xué)交流。
本題要求理解語(yǔ)句的深層含義，重點(diǎn)應(yīng)放在“整個(gè)世界”四個(gè)字上，兼及其他。
答案參見(jiàn)“句段全解”中最后一段的“段解”。
三
下面這篇短文也是講三代人的故事。與課文比較，哪個(gè)故事更感動(dòng)你?說(shuō)說(shuō)你的理由。
三
代
林文煌
在交叉路口轉(zhuǎn)彎的時(shí)候，我的腳踏車(chē)把一位陌生先生的右腳踝壓傷了。本來(lái)我是安全避閃的，當(dāng)我看到那位先生一手牽著一個(gè)剛會(huì)走路模樣的小男孩，一手牽著一個(gè)步履蹣跚的年老中風(fēng)病患者時(shí)，我立刻緊急煞車(chē)，把車(chē)頭傾向一邊。豈料就在這時(shí)，他突然急速地跨前一步，自己撞了上來(lái)。
我趕緊跳下車(chē)，不安地說(shuō)：“對(duì)不起!對(duì)不起!”
他一邊彎下腰按摩腳踝，一邊和氣地抬起頭：“我不怪你，是我自己撞上的??也許是我太多慮了，我以為車(chē)子如果不會(huì)撞上我的小孩，便會(huì)撞上我的父親，于是下意識(shí)地上前阻擋?！?/p>
在我驚魂未定、訥訥不知所措的時(shí)候，那位先生已牽著小孩和老者慢慢離去，我愣愣地目送他們，三個(gè)腳步遲緩的背影構(gòu)成一幅感人的畫(huà)面。我有擱下車(chē)子跟上去幫助那位先生的沖動(dòng)。可是，我沒(méi)有那樣做：我發(fā)覺(jué)小孩和老者好像那位先生肩上的一副擔(dān)子的兩頭，再艱苦他也不肯放下任何一頭的。
《三代》與《散步》主題相近，又有差異，情節(jié)則差別較大。本題作比較閱讀，培養(yǎng)鑒賞能力。閱讀是個(gè)性化行為，“感動(dòng)”這種情感更是個(gè)性化的，說(shuō)《散步》更感動(dòng)人，可以；說(shuō)《三代》更感動(dòng)人，也可以，能言之成理就好?！度氛f(shuō)的是，寧可自己受傷，也要保護(hù)一老一?。弧渡⒉健氛f(shuō)的是，孝順第一。衡量作品，也要從社會(huì)價(jià)值上去考慮。
第四篇：不動(dòng)產(chǎn)業(yè)務(wù)整理手冊(cè)(問(wèn)題參考)全解
不動(dòng)產(chǎn)業(yè)務(wù)整理手冊(cè)
不動(dòng)產(chǎn)業(yè)務(wù)與問(wèn)題整理手冊(cè)
（僅供參考）
2016年6月
I
不動(dòng)產(chǎn)業(yè)務(wù)整理手冊(cè)
業(yè)務(wù)案例整理
1.房產(chǎn)、土地均已辦理第一次轉(zhuǎn)移登記，但在房產(chǎn)再次或多次辦理轉(zhuǎn)移過(guò)程中土地未隨之辦理轉(zhuǎn)移登記，要求將土地使用權(quán)直接辦理到現(xiàn)房產(chǎn)權(quán)利人名下的情況。建議：可以辦理。需查清歷次房產(chǎn)登記檔案，理清產(chǎn)權(quán)交易和房產(chǎn)變化脈絡(luò)，脫節(jié)的歷次權(quán)利人全部到場(chǎng)簽字，并作詢(xún)問(wèn)筆錄，審查相關(guān)稅費(fèi)，無(wú)查封、抵押等限制條件的，可以直接辦理到現(xiàn)房產(chǎn)權(quán)利人名下。如有查封情形，需權(quán)利人到法院主張權(quán)利，解封后再辦理。
如缺少中間權(quán)利人的，需在門(mén)戶(hù)網(wǎng)站公告30日后，按上述辦法直接辦理到現(xiàn)房產(chǎn)權(quán)利人名下。
主要依據(jù)：“地隨房走”，“房隨地走”，《物權(quán)法》第一百四十七條“建筑物、構(gòu)筑物及其附屬設(shè)施轉(zhuǎn)讓、互換、出資或者贈(zèng)與的，該建筑物、構(gòu)筑物及其附屬設(shè)施占用范圍內(nèi)的建設(shè)用地使用權(quán)一并處分?！?/p>
2.房產(chǎn)在第一次轉(zhuǎn)移登記后再次或多次轉(zhuǎn)移登記，土地已預(yù)區(qū)分但未辦理轉(zhuǎn)移登記的，要求直接辦理到現(xiàn)房產(chǎn)權(quán)利人名下的情況。
建議：可以辦理。需查清歷次房產(chǎn)登記檔案，理清產(chǎn)權(quán)交易和房產(chǎn)變化脈絡(luò)，歷次權(quán)利人全部到場(chǎng)簽字并作詢(xún)問(wèn)筆錄，審查相關(guān)稅費(fèi)，無(wú)查封、抵押等限制條件的，可以直接辦理到現(xiàn)房產(chǎn)權(quán)利人名下。如有查封情形，需權(quán)利人到法院主張權(quán)利，解封后再辦理。
如缺少中間權(quán)利人的，需在門(mén)戶(hù)網(wǎng)站公告30天后，按上述辦法直接辦理到現(xiàn)房產(chǎn)權(quán)利人名下。
房產(chǎn)屬房改房或集資建房的，需查看出讓金繳納情況，收回協(xié)議和出讓合同。（最好能查到當(dāng)?shù)卣P(guān)于房改房的處置意見(jiàn)，即政策性文件。）
3.房產(chǎn)在第一次轉(zhuǎn)移登記后再次或多次轉(zhuǎn)移登記，土地未辦理預(yù)區(qū)分的，要求直接辦理到現(xiàn)房產(chǎn)權(quán)利人名下的情況。
建議：同時(shí)符合以下條件的可以辦理：出讓土地、土地用途沒(méi)改變，取得規(guī)劃竣工驗(yàn)收合格證且無(wú)查封、抵押等限制條件。
不動(dòng)產(chǎn)業(yè)務(wù)整理手冊(cè)
需查清歷次房產(chǎn)登記檔案，理清產(chǎn)權(quán)交易和房產(chǎn)變化脈絡(luò)，歷次權(quán)利人全部到場(chǎng)簽字，并作詢(xún)問(wèn)筆錄，審查相關(guān)稅費(fèi)，無(wú)查封、抵押等限制條件的，可以直接辦理到現(xiàn)房產(chǎn)權(quán)利人名下。同時(shí)，在網(wǎng)站發(fā)布“土地已轉(zhuǎn)移情況”的公告，如有查封情形，需權(quán)利人到法院主張權(quán)利，解封后再辦理。
如缺少中間權(quán)利人的，需在門(mén)戶(hù)網(wǎng)站公告30日后，按上述辦法直接辦理到現(xiàn)房產(chǎn)權(quán)利人名下。
不動(dòng)產(chǎn)權(quán)證只記錄房產(chǎn)信息。原土地證信息寫(xiě)在“權(quán)利其它狀況”欄中，并注明“土地未分?jǐn)偂弊謽?。受理業(yè)務(wù)部發(fā)函給開(kāi)發(fā)公司，督促盡快辦理預(yù)區(qū)分登記，隨即通過(guò)OA抄報(bào)土地利用處（科）（有的地方叫地租處），由土地利用處（科）審查該宗地批后監(jiān)管情況，15日內(nèi)反饋到不動(dòng)產(chǎn)登記中心。（備注：此辦法需要局內(nèi)部協(xié)調(diào)有關(guān)業(yè)務(wù)[處]科室共同參與）
如土地用途改變，需開(kāi)發(fā)商到土地利用科辦理相關(guān)手續(xù)后方可辦理。如土地利用處（科）發(fā)現(xiàn)該宗地有違反合同、擅自提高容積率等事項(xiàng)的，應(yīng)及時(shí)采取制約措施。
4.房產(chǎn)已辦理第一次轉(zhuǎn)移登記，出讓土地未分?jǐn)偅髥为?dú)作房產(chǎn)抵押的情況。
建議：可以辦理。單獨(dú)房產(chǎn)抵押，房產(chǎn)證“不變不換”，可以只辦理房產(chǎn)抵押。但應(yīng)告知抵押權(quán)人可能存在的隱患。如單方產(chǎn)要轉(zhuǎn)移需要告知權(quán)利人不可轉(zhuǎn)移。
抵押登記時(shí)還需提供大土地證的復(fù)印件，抵押權(quán)人書(shū)面說(shuō)明“已知曉土地未分?jǐn)偂?。并在房產(chǎn)證記事欄中記明不動(dòng)產(chǎn)單元號(hào)。
（備注：此辦法要與事先協(xié)調(diào)告知房產(chǎn)公司以及相關(guān)金融單位）
5.房產(chǎn)已辦理第一次轉(zhuǎn)移登記，劃撥土地未分?jǐn)?，要求單?dú)作房產(chǎn)抵押的情況。
建議：可以辦理。單獨(dú)房產(chǎn)抵押，房產(chǎn)證“不變不換”，可以只辦理房產(chǎn)抵押，但登記人員應(yīng)告知抵押權(quán)人可能存在的隱患。
抵押登記時(shí)需提供大土地證的復(fù)印件，抵押權(quán)人書(shū)面說(shuō)明“已知曉宗地為劃撥土地和土地未分?jǐn)偂保盅簷?quán)人與抵押人書(shū)面承諾“實(shí)現(xiàn)抵押權(quán)時(shí)，首先補(bǔ)交土地價(jià)款”。并在房產(chǎn)證記事欄中記明不動(dòng)產(chǎn)單元號(hào)。
（備注：這是山東的做法，值得商榷，應(yīng)該說(shuō)是存在瑕疵和風(fēng)險(xiǎn)的。）
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6.房產(chǎn)已抵押，要求辦理土地抵押（獨(dú)用宗）的情況。
建議：可以單獨(dú)辦理土地抵押（抵押期限不超過(guò)房產(chǎn)抵押期限)。但房產(chǎn)未抵押的，要求房地一致辦理。
7.土地已抵押，要求辦理房產(chǎn)登記并抵押（獨(dú)用宗）的情況。
建議：需抵押權(quán)人同意，收回并注銷(xiāo)土地證和他項(xiàng)權(quán)利證，辦理不動(dòng)產(chǎn)權(quán)證后再辦理抵押登記。
8.房產(chǎn)、土地以前分開(kāi)抵押的，解押時(shí)分開(kāi)解還是一塊解的問(wèn)題。
建議：以前分開(kāi)做抵押的，解押時(shí)應(yīng)分開(kāi)解。
（但是否應(yīng)該規(guī)定，如果解壓后還需再抵押時(shí)是否必須房地一并抵押？）
9.開(kāi)發(fā)商用多幢房產(chǎn)辦理在建工程抵押，現(xiàn)想解除其中一幢，能否辦理。
建議：這種情況需要看當(dāng)時(shí)抵押是否分幢抵押，如果是分幢抵押可以解除其中一條記錄,沒(méi)有分開(kāi)抵押的話(huà)，需要開(kāi)發(fā)商解除全部的抵押，重新抵押。
不解除抵押的情況下也可以在不動(dòng)產(chǎn)登記證明上注明，不需要先解除抵押再辦理。
10.開(kāi)發(fā)商用幾幢房子中未出售的房產(chǎn)（其中一部分已出售）辦理在建工程抵押的，能否辦理
建議：可以辦理，需要除去其中已經(jīng)出售的一部分
11.宅基地只有房產(chǎn)證，沒(méi)有土地證，能否辦理不動(dòng)產(chǎn)權(quán)證？
建議：不能辦理。必須能找到合法的土地審批手續(xù)才能辦理不動(dòng)產(chǎn)權(quán)證。
12.宅基地沒(méi)有房產(chǎn)證，能否直接辦理土地證轉(zhuǎn)移登記？
建議：不能辦理。只有辦理不動(dòng)產(chǎn)權(quán)證后方可轉(zhuǎn)移。
13.土地大證掛接問(wèn)題
建議：對(duì)于沒(méi)有小土地證的，辦理業(yè)務(wù)前需要進(jìn)行土地分?jǐn)偅_保房產(chǎn)證與土地
不動(dòng)產(chǎn)業(yè)務(wù)整理手冊(cè)
證保持權(quán)利一致，然后辦理業(yè)務(wù)。如果強(qiáng)制掛接大證，會(huì)導(dǎo)致權(quán)利不一致，出現(xiàn)以下問(wèn)題：
1、查封登記、抵押登記，如果掛接大土地證，大土地證會(huì)被查封、抵押，會(huì)影響該宗地上的其它不動(dòng)產(chǎn)辦理業(yè)務(wù)。
2、掛接土地大證，做完第一次轉(zhuǎn)移后土地大證信息會(huì)進(jìn)入歷史，影響后續(xù)業(yè)務(wù)辦理，下次再做業(yè)務(wù)時(shí)需要從歷史表中把原來(lái)的土地大證信息進(jìn)行恢復(fù)。
3、對(duì)于儲(chǔ)藏室、車(chē)庫(kù)等，是否掛接大證？如果主輔都掛土地大證，會(huì)導(dǎo)致證書(shū)的土地面積累加。
按照正常業(yè)務(wù)流程應(yīng)該如下：
日照現(xiàn)在已經(jīng)不做土地的分?jǐn)偅?jīng)與局方協(xié)商，按照以下方法處理：（1）已經(jīng)有小土地證或是分割證明的需要掛接對(duì)應(yīng)的小土地證或分割證明。（2）沒(méi)有小土地證或是分割證明的不要掛接土地證書(shū)，直接掛在宗地上。
（這就是我的觀點(diǎn)之一，也就是原來(lái)有的沿用，沒(méi)有的直接掛大宗地）
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14.自然人之間的擔(dān)保抵押能否辦理的問(wèn)題。
建議：房地可以辦理。單獨(dú)以土地抵押的不辦理。
《中華人民共和國(guó)物權(quán)法》中均未對(duì)抵押權(quán)人的范圍進(jìn)行限制
實(shí)施細(xì)則中第八十一條【抵押登記提交材料】自然人、法人、其他組織為保障其債權(quán)的實(shí)現(xiàn)，依法以不動(dòng)產(chǎn)設(shè)定抵押的，可以由當(dāng)事人持不動(dòng)產(chǎn)權(quán)屬證書(shū)、抵押合同與主債權(quán)合同等必要材料，共同申請(qǐng)辦理抵押登記。
債權(quán)合同中包含有抵押條款的，可以只提供債權(quán)合同。
15.房產(chǎn)已辦理第一次轉(zhuǎn)移登記，土地未預(yù)區(qū)分，需不需要收回原土地證，土地證能不能再做剩余部分抵押的問(wèn)題。
建議：需收回原土地證，在記事欄注明相關(guān)事宜，如不能收回，需在門(mén)戶(hù)網(wǎng)站發(fā)布公告，公告內(nèi)容注明“土地已轉(zhuǎn)移情況”。土地證不能再做抵押登記。
16.房屋權(quán)利性質(zhì)是房改房，走轉(zhuǎn)移登記，那么房屋性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變嗎？
所有房改房的土地使用權(quán)類(lèi)型都是劃撥，而且，土地使用權(quán)類(lèi)型是劃撥的在出售給另一個(gè)人時(shí)，在辦理另一個(gè)人新土地證時(shí)都必須依照當(dāng)?shù)卣?guī)定補(bǔ)交相應(yīng)的土地出讓金，補(bǔ)交后土地的使用權(quán)類(lèi)型自然就變?yōu)榱顺鲎屝再|(zhì)，這是房產(chǎn)的性質(zhì)應(yīng)變?yōu)樯唐贩俊?/p>
17.宅基地土地證已經(jīng)辦理完過(guò)戶(hù)，新土地證還未發(fā)放，能否辦理房產(chǎn)過(guò)戶(hù)？
建議：不能辦理。土地已經(jīng)確權(quán)。不能辦理轉(zhuǎn)移。國(guó)家會(huì)統(tǒng)一確權(quán)房產(chǎn)，直接辦理不動(dòng)產(chǎn)證。
18.房地產(chǎn)開(kāi)發(fā)商委托辦理業(yè)主不動(dòng)產(chǎn)證，土地證房產(chǎn)證都沒(méi)有的情況下做轉(zhuǎn)移登記。小區(qū)比較老，沒(méi)有辦理出土地證和房產(chǎn)證。
建議：可以先做房地產(chǎn)商的首次登記，不出證書(shū)，然后再做轉(zhuǎn)移登記。19.7個(gè)土地證要辦成一個(gè)不動(dòng)產(chǎn)證書(shū)，土地未分?jǐn)偅瑱?quán)利人不變
建議：能辦理。必須材料齊全，先土地注銷(xiāo)，然后進(jìn)行首次登記
土地證的權(quán)利人都是同一人，僅僅是將7個(gè)土地證合起來(lái)，不涉及土地的轉(zhuǎn)移，不動(dòng)產(chǎn)業(yè)務(wù)整理手冊(cè)
抵押，查封等業(yè)務(wù)。
20.7個(gè)土地證，上面有抵押 信息，現(xiàn)局方要求7個(gè)證再有抵押的狀態(tài)下合成一個(gè)土地證，然后再走抵押變更流程，問(wèn)是否可以辦理？（上面還有房產(chǎn)信息）
建議：能辦理。必須材料齊全，先土地注銷(xiāo)，然后進(jìn)行首次登記，確認(rèn)沒(méi)有進(jìn)行任何的土地使用權(quán)與房屋所有權(quán)的登記
土地證的權(quán)利人都是同一人，僅僅是將7個(gè)土地證合起來(lái)，不涉及土地的轉(zhuǎn)移，抵押，查封等業(yè)務(wù)
21.房產(chǎn)做過(guò)預(yù)告登記，現(xiàn)在要做轉(zhuǎn)移登記，買(mǎi)賣(mài)雙方不變，業(yè)務(wù)人員想直接做轉(zhuǎn)移業(yè)務(wù)；
建議：不能辦理。
房產(chǎn)做過(guò)預(yù)告登記，數(shù)據(jù)是有預(yù)告狀態(tài)的，會(huì)有一條實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)和一條預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)，如果不做預(yù)轉(zhuǎn)現(xiàn)業(yè)務(wù)，有可能會(huì)出現(xiàn)一個(gè)房產(chǎn)證可以做兩次業(yè)務(wù)的情況。22.一宗地占多個(gè)地籍子區(qū)，地籍子區(qū)代碼無(wú)法選擇
不動(dòng)產(chǎn)暫行條例有一條說(shuō)明跨子區(qū)相關(guān)業(yè)務(wù)處理，由一個(gè)登記機(jī)構(gòu)進(jìn)行登記，登記結(jié)果通知相關(guān)部門(mén)，子區(qū)代碼定主要子區(qū)區(qū)域（或由局方定）
23.辦理抵押登記或轉(zhuǎn)移登記，土地證跟房屋所有權(quán)證用途不一致如何辦理？
土地存在多用途情況，按實(shí)際的填寫(xiě)即可。
24.只有土地批復(fù)，但未發(fā)土地證，有房產(chǎn)證，如何辦理轉(zhuǎn)移登記或抵押登記業(yè)務(wù)
土地批復(fù)相當(dāng)于土地登記證書(shū)，配號(hào)過(guò)程可以不勾選土地證。辦理登記需要在審批意見(jiàn)中備注說(shuō)明該情況
25.小區(qū)已經(jīng)發(fā)房產(chǎn)證，土地總證被法院查封（查封時(shí)已經(jīng)告知法院部分房產(chǎn)已經(jīng)賣(mài)給有關(guān)業(yè)主）能否辦理不動(dòng)產(chǎn)轉(zhuǎn)移登記？
已查封不能進(jìn)行轉(zhuǎn)移登記，如果進(jìn)行國(guó)有建設(shè)用使用權(quán)及房屋所有權(quán)首次登記是可以的
國(guó)有建設(shè)用地使用權(quán)被查封或者預(yù)查封的，申請(qǐng)人與查封被執(zhí)行人一致的，不影響辦理國(guó)有建設(shè)用使用權(quán)及房屋所有權(quán)首次登記
26.開(kāi)發(fā)商開(kāi)發(fā)的小區(qū)已頒發(fā)總的土地使用證，但業(yè)主只頒發(fā)了房產(chǎn)證，沒(méi)有頒發(fā)分?jǐn)偤蟮耐恋厥褂米C，小區(qū)內(nèi)業(yè)主房屋發(fā)生轉(zhuǎn)移應(yīng)如何辦理？
對(duì)于已建設(shè)完畢的小區(qū)土地總面積不再分?jǐn)偅谛掳l(fā)的不動(dòng)產(chǎn)登記證書(shū)上只標(biāo)注
不動(dòng)產(chǎn)業(yè)務(wù)整理手冊(cè)
好房屋發(fā)生轉(zhuǎn)移業(yè)主的具體位置。原登記在開(kāi)發(fā)商名下的土地證書(shū)由市不動(dòng)產(chǎn)登記中心收回，七日內(nèi)拒不交回的依法公告注銷(xiāo)，公告期15個(gè)工作日，公告所需時(shí)間不計(jì)算在登記辦理期限內(nèi)。公告期滿(mǎn)無(wú)異議或者異議不成立的，應(yīng)當(dāng)及時(shí)記載于不動(dòng)產(chǎn)登記簿。
對(duì)于未完全建成的小區(qū)，土地總證書(shū)暫不收回，等全部竣工后，開(kāi)發(fā)商將土地總證書(shū)連同樓盤(pán)信息表一并交回市不動(dòng)產(chǎn)登記中心,分?jǐn)倳r(shí)按照樓座基地面積分?jǐn)?，基底面積以陽(yáng)臺(tái)外1.5米為界。
27.土地性質(zhì)是劃撥土地的房改房、經(jīng)濟(jì)適用房、部分公房出售（劃撥土地上建住宅）等是否可以出售
對(duì)于土地性質(zhì)是劃撥土地的房改房、經(jīng)濟(jì)適用房、部分公房出售（劃撥土地上建住宅）等，按照成交價(jià)的1%收取土地出讓金后辦理過(guò)戶(hù),對(duì)于上述三種情況以外的劃撥土地協(xié)議出讓方式，但不簽到出讓合同和網(wǎng)上審批，按現(xiàn)行基準(zhǔn)地價(jià)的70%繳納出讓金后予以登記。
28.雙用途的怎么辦理
一宗土地上同時(shí)存在商業(yè)與住宅用途的宗地，對(duì)于兩種用途界限清晰的，按實(shí)際用途進(jìn)行劃分后再進(jìn)行登記；無(wú)法分清界限的，如一層是商鋪，二層以上是住宅的，對(duì)于住宅不再分?jǐn)偅虡I(yè)要進(jìn)行分?jǐn)偂?/p>
29.城中村建房用地（土地為代管?chē)?guó)有土地，屬宅基地），房產(chǎn)證辦理了過(guò)戶(hù)手續(xù)，現(xiàn)申請(qǐng)過(guò)戶(hù)領(lǐng)取不動(dòng)產(chǎn)證書(shū)，如何解決？
雖然城鎮(zhèn)居民與房改房可以按地稅評(píng)估價(jià)的1%收取出讓金后辦理，但是這種土地暫時(shí)不能辦理，因?yàn)閷?duì)于出讓金的繳納方式無(wú)法確定（不符合城市規(guī)劃，沒(méi)法簽訂出讓合同。濰坊也一直沒(méi)辦，辦了幾戶(hù)是按照基準(zhǔn)地價(jià)的40%收取的出讓金，但是利用科認(rèn)為應(yīng)當(dāng)是70%）。
30.不動(dòng)產(chǎn)統(tǒng)一登記后，土地是否還要分?jǐn)?？若分?jǐn)側(cè)绾畏郑?/p>
應(yīng)該進(jìn)行分?jǐn)偅礃腔謹(jǐn)偅ńㄗh是樓體最外端向外1.5米為分?jǐn)偡秶?1.已發(fā)放的房產(chǎn)證占地面積超出土地證上的土地范圍，如何辦理？
這屬于違建，只登記合法部分，如果違建很少（沒(méi)有超過(guò)5%），可以按照實(shí)際建筑面積進(jìn)行登記。
不動(dòng)產(chǎn)業(yè)務(wù)整理手冊(cè)
32.小區(qū)內(nèi)各業(yè)主已經(jīng)取得房產(chǎn)證，土地總證被法院查封，能否辦理不動(dòng)產(chǎn)轉(zhuǎn)移登記？
需要與法院進(jìn)行溝通。
33.辦理登記業(yè)務(wù)時(shí)，是否進(jìn)行婚姻關(guān)系審核，還是誰(shuí)申請(qǐng)登記誰(shuí)？
婚前不用審核，婚后可以約定，也可以審核。
34.單位職工房改房未辦理產(chǎn)權(quán)證，現(xiàn)在原單位已破產(chǎn)，如何辦理不動(dòng)產(chǎn)證書(shū)？
到房管部門(mén)找房改資料，如果房改資料齊全，可以辦理。資料不齊則補(bǔ)上對(duì)應(yīng)的材料。
35.同一宗地在多個(gè)金融部門(mén)進(jìn)行抵押
由不動(dòng)產(chǎn)登記中心負(fù)責(zé)給除首次辦理抵押登記之外的相關(guān)金融部門(mén)出具抵押貸款告知書(shū)，履行告知責(zé)任。同時(shí)在不動(dòng)產(chǎn)登記證明上標(biāo)注清楚抵押貸款的順序。36.同一宗地用土地使用證或房產(chǎn)證辦理抵押登記或轉(zhuǎn)移登記的，原土地使用證與房產(chǎn)證用途不一致
可以辦理抵押登記，用途按照原用途填寫(xiě)；如發(fā)生轉(zhuǎn)移需辦理登記，必須先辦理房或地用途變更手續(xù)，使其一致后再進(jìn)行不動(dòng)產(chǎn)登記。37.土地使用年限即將到期辦理抵押登記，分兩種情況處理：
1、用途是住宅的，根據(jù)《中華人民共和國(guó)物權(quán)法》第一百四十九條“住宅建設(shè)用地使用權(quán)期間屆滿(mǎn)的，自動(dòng)續(xù)期”的規(guī)定，無(wú)論土地是否到期均可辦理抵押登記。
2、用途是住宅以外其他用途的，抵押期限在土地剩余使用年限以?xún)?nèi)的，可辦理抵押登記，否則不能辦理。
38.有土地批復(fù)文件，未進(jìn)行土地確權(quán)登記，但已辦理房產(chǎn)證，能否辦理房產(chǎn)轉(zhuǎn)移或抵押業(yè)務(wù)？
抵押業(yè)務(wù)可以辦理，轉(zhuǎn)移的話(huà)需要稅費(fèi)齊全（土地房產(chǎn)均齊全，主要是出讓金和契稅），就可辦理。
39.房產(chǎn)坐落在兩宗土地上，開(kāi)發(fā)商用房產(chǎn)總證作抵押，能否辦理？
先由開(kāi)發(fā)商提出書(shū)面申請(qǐng)，再合宗。合宗時(shí)開(kāi)發(fā)商寫(xiě)出承諾，承諾放棄土地使用年限長(zhǎng)的年限（需要審核合宗后是否符合建設(shè)用地規(guī)劃許可，是否符合建設(shè)條件，是否調(diào)整了容積率。）。
40.民間借貸的個(gè)人對(duì)個(gè)人，個(gè)人對(duì)公司或是公司對(duì)公司的，能否辦理不動(dòng)產(chǎn)抵押？
自然人、個(gè)人之間可以辦理抵押登記，典當(dāng)行的抵押也可以辦理，但是非金融的不動(dòng)產(chǎn)業(yè)務(wù)整理手冊(cè)
法人之間要小心并依法辦理，特別是法人之間不可以走款 41.開(kāi)發(fā)商用房產(chǎn)總證作抵押，土地未分割的，能否辦理？
可以辦理，先公告，再辦理。
42.開(kāi)發(fā)商用其中一棟房產(chǎn)辦理在建工程抵押，同時(shí)土地也已經(jīng)辦理抵押，現(xiàn)在想用另一棟房產(chǎn)辦理在建工程抵押的，能否辦理？
可以辦理，辦理時(shí)需要注明土地的抵押順位（在不動(dòng)產(chǎn)登記證明上注明即可，告知金融機(jī)構(gòu)）。
43.土地已辦理抵押，現(xiàn)在申請(qǐng)辦理房產(chǎn)抵押，能否辦理？
可以，抵押額不能超過(guò)總的房地價(jià)值。
44.農(nóng)村宅基地抵押登記能否辦理？有房產(chǎn)證，土地不符合一戶(hù)一宅規(guī)定的，能否辦理轉(zhuǎn)移、抵押、更名等手續(xù)？
因?yàn)橄嚓P(guān)法律沒(méi)有出臺(tái)，所以不能辦理抵押登記。對(duì)于轉(zhuǎn)移的，可以依法收回后再審批給他人。
45.土地抵押未到期，已有業(yè)主辦理預(yù)告登記，現(xiàn)其他業(yè)主申請(qǐng)辦理預(yù)告抵押登記，是否應(yīng)解除土地抵押登記？
不需要解除土地抵押，但是需經(jīng)第一家金融機(jī)構(gòu)同意后再辦理。
第五篇：橋梁工程總結(jié)全解
名詞解釋
1.橋梁全長(zhǎng)：橋梁兩端兩個(gè)橋臺(tái)的側(cè)墻或八字墻后端點(diǎn)之間的距離。對(duì)于無(wú)橋臺(tái)的橋梁為橋面行車(chē)道的全長(zhǎng)
2.多孔跨徑總長(zhǎng)：梁式橋、板式橋涵的多孔跨徑總長(zhǎng)為多孔標(biāo)準(zhǔn)跨徑的總長(zhǎng)；拱式橋涵為兩岸橋臺(tái)內(nèi)起拱線(xiàn)的距離，其他形式橋梁為橋面系車(chē)道長(zhǎng)度。
3.跨徑：結(jié)構(gòu)或構(gòu)件支承間的距離。對(duì)于梁式橋、斜拉橋和懸索橋，它是指相鄰兩橋墩中線(xiàn)之間的距離，或墩中線(xiàn)至橋臺(tái)臺(tái)背前緣之間的距離；對(duì)于拱橋，則是指凈跨徑。
4.計(jì)算跨徑：對(duì)于具有支座的橋梁，是指橋跨結(jié)構(gòu)所支承的相鄰墩臺(tái)上的支座中心之間的距離；不設(shè)支座的橋梁為上、下部結(jié)構(gòu)相交面中心間的水平距離
5.凈跨徑：指設(shè)計(jì)洪水位上相鄰兩個(gè)橋墩之間的凈距。
6.橋面凈空：橋梁行車(chē)道、人行道上方應(yīng)保持的空間界限。
7.五點(diǎn)重合法：求懸鏈線(xiàn)拱的拱軸系數(shù)時(shí)，要求拱圈的五個(gè)關(guān)鍵控制截面，即拱頂，兩拱腳和兩個(gè)四分點(diǎn)達(dá)到壓力線(xiàn)和拱軸線(xiàn)必須重合，從而使各拱圈截面不產(chǎn)生過(guò)大的彎矩峰值，這種設(shè)計(jì)方法稱(chēng)為五點(diǎn)重合法。
8.矢跨比：指拱橋中拱圈（或拱肋）的計(jì)算矢高與計(jì)算跨徑之比。9.純壓拱：在某種荷載作用下任意截面彎矩等于零
10.合理拱軸線(xiàn)：一些特殊的分布荷載，和荷載分布規(guī)律有關(guān)的拱軸線(xiàn)。
11.拱橋按結(jié)構(gòu)體系分類(lèi)：簡(jiǎn)單體系拱橋、組合體系拱橋、剛架體系拱橋
1.簡(jiǎn)單體系拱橋：橋面系是局部承力和傳力結(jié)構(gòu)，不考慮與主拱聯(lián)合受力。是有推力拱，水平推力由墩臺(tái)和基礎(chǔ)直接承受。
2.組合體系拱橋：可以是有推力拱，也可以是無(wú)推力拱。
3.剛架系桿拱橋：剛架系桿拱中拱肋與橋墩固結(jié)，不設(shè)支座，采用預(yù)應(yīng)力鋼絞線(xiàn)作為拉桿來(lái)平衡拱的推力，拉桿獨(dú)立于橋面系之外，不參與橋面系受力，而橋面系為局部受力構(gòu)件。
12.斜拉橋塔梁之間的組合方式：漂浮體系、支承體系（包括半漂浮體系）、塔梁固結(jié)體系、剛構(gòu)體系。1漂浮體系：主梁在順橋方向變形不受索塔約束，主梁水平荷載不直接傳遞到索塔。
優(yōu)點(diǎn)：順橋向負(fù)擔(dān)小和主梁彎矩分布均勻，縱橋向周期長(zhǎng)，減輕地震作用。
缺點(diǎn)：結(jié)構(gòu)剛度小，順橋向變形大，施工期間穩(wěn)定性差。
2支承體系：塔梁之間有豎向支承、在順橋向有一定水平約束的結(jié)構(gòu)形式，其中半漂浮體系在順橋向無(wú)約束。優(yōu)點(diǎn)：索塔對(duì)主梁懂得縱向水平約束剛度越小，結(jié)構(gòu)受到的水平地震作用越小，順橋向水平變形增大。缺點(diǎn)：剛度較大的支點(diǎn)使得主梁出現(xiàn)比較大得負(fù)彎矩。
3塔梁固結(jié)體系：塔梁之間固結(jié)，但塔與墩之間用支座傳遞荷載的結(jié)構(gòu)形式。
優(yōu)點(diǎn)：索塔彎矩小、主梁受力均勻，整體升溫引起溫度應(yīng)力小。缺點(diǎn)：結(jié)構(gòu)剛度小，變形較大，支座承受反力大。
4剛構(gòu)體系：塔、梁、墩三者之間固結(jié)的結(jié)構(gòu)形式。
優(yōu)點(diǎn)：剛度大，變形小，索塔部位不要設(shè)置支座，結(jié)構(gòu)維護(hù)容易，施工過(guò)程穩(wěn)定性好。缺點(diǎn)：支點(diǎn)處主梁彎矩大，索塔要承受很大的溫度應(yīng)力和水平地震作用。
13.鞍座：設(shè)在塔頂及橋臺(tái)上直接支承主纜并將主纜荷載傳遞給塔及橋臺(tái)的裝置。
14.錨碇：錨塊基礎(chǔ)、錨塊、主纜錨固系統(tǒng)及防護(hù)結(jié)構(gòu)等的總稱(chēng)。
問(wèn)答題
一．橋梁的組成？
橋梁結(jié)構(gòu)一般分為上部結(jié)構(gòu)與下部結(jié)構(gòu)。上部結(jié)構(gòu)包括橋面鋪裝、橋面系、承重結(jié)構(gòu)，以及連接部件；下部結(jié)構(gòu)為橋墩、橋臺(tái)和基礎(chǔ)，有時(shí)下部結(jié)構(gòu)僅含橋墩與橋臺(tái)，將橋梁基礎(chǔ)單列。橋梁上、下部結(jié)構(gòu)之間常采用連接。上部結(jié)構(gòu)是在線(xiàn)路遇到障礙而中斷時(shí)，跨越這類(lèi)障礙的主要承載結(jié)構(gòu)。下部結(jié)構(gòu)的主要作用是承受上部結(jié)構(gòu)傳來(lái)的荷載，并將它及本身自重傳給地基。
二．橋梁有哪些基本類(lèi)型？按照結(jié)構(gòu)體系分類(lèi)，各種類(lèi)型的受力特點(diǎn)是什么？
答:梁橋、拱橋、斜拉橋、懸索橋。按結(jié)構(gòu)體系劃分，有梁式橋、拱橋、鋼架橋、纜索承重橋（即懸索橋、斜拉橋）等四種基本體系。梁式橋：梁作為承重結(jié)構(gòu)是以它的抗彎能力來(lái)承受荷載的。拱橋：主要承重結(jié)構(gòu)是拱肋或拱圈，以承壓為主。剛架橋：由于梁與柱的剛性連接，梁因柱的抗彎剛度而得到卸載作用，整個(gè)體系是壓彎構(gòu)件，也是有推力的結(jié)構(gòu)。纜索橋：它是以承壓的塔、受拉的索與承彎的梁體組合起來(lái)的一種結(jié)構(gòu)體系。
三．公路橋面的構(gòu)造？橋梁上有哪些基本的附屬設(shè)施？
公路橋面構(gòu)造包括行車(chē)道鋪裝、排水防水系統(tǒng)、人行道（或安全帶）、緣石、欄桿、照明燈具和伸縮縫等。附屬設(shè)施包括橋面系、伸縮縫、橋梁與路堤銜接處的橋頭搭板和錐形護(hù)坡等。
四．預(yù)應(yīng)力鋼筋的布置：縱向力筋、橫向力筋和豎向力筋 縱向力筋的布置：
1.連續(xù)配筋：對(duì)小跨度的等截面連續(xù)梁橋，采用就地灌注施工的，其縱向力筋可按照結(jié)構(gòu)各部位的受力要求進(jìn)行連續(xù)配筋。
2.分段配筋：大跨度變截面預(yù)應(yīng)力梁橋通常采用懸臂施工方法。懸臂伸出施工時(shí)，對(duì)梁體施加負(fù)彎矩筋；在兩梁段合龍后（稱(chēng)為體系轉(zhuǎn)換），再?gòu)埨龔澗亟詈推渌睢?/p>
3.逐段加長(zhǎng)力筋：由于力筋供料長(zhǎng)度、施工方法和結(jié)構(gòu)受力等方面的原因，有時(shí)需要采用連接器把主筋對(duì)接或逐段加長(zhǎng)。逐孔施工、頂推法施工的連續(xù)梁常用。
4.體外布筋：力筋布置在主梁截面以外的箱內(nèi)，配以橫隔板、轉(zhuǎn)向塊等構(gòu)造，對(duì)梁體施加預(yù)應(yīng)力。
5.后連續(xù)力筋：對(duì)于采用先簡(jiǎn)支后連續(xù)方法施工的預(yù)應(yīng)力混凝土連續(xù)梁橋，后連續(xù)采用預(yù)應(yīng)力筋布置，必須先預(yù)留張拉槽孔和預(yù)埋管道，待連續(xù)部分的混凝土澆筑完畢后，穿束張拉后連續(xù)的力筋，實(shí)現(xiàn)整體梁的連續(xù)。
五．箱梁的受力特點(diǎn)和簡(jiǎn)化計(jì)算？ 箱梁橋上的恒載一般是對(duì)稱(chēng)作用的，它使箱梁發(fā)生彎曲，而車(chē)輛活載一般是偏心作用，使箱梁發(fā)生扭轉(zhuǎn)。另外，風(fēng)力，列車(chē)橫向搖擺力，支座高程的誤差以及基礎(chǔ)不均勻沉降等也會(huì)使箱梁發(fā)生扭轉(zhuǎn)。對(duì)曲線(xiàn)橋，即便是對(duì)稱(chēng)作用的荷載，也會(huì)導(dǎo)致箱梁扭轉(zhuǎn)，因此，結(jié)構(gòu)所受到的外力可綜合表示一偏心作用的荷載.簡(jiǎn)化計(jì)算1 經(jīng)驗(yàn)估值法 2用修正偏心壓力法求活載內(nèi)力增加系數(shù) 經(jīng)驗(yàn)估值法：對(duì)于箱型具有一定厚度且有橫隔板加勁的箱型梁，忽略歪扭變形的畸變應(yīng)力：將活載偏心作用引起的約束扭轉(zhuǎn)正應(yīng)力和扭轉(zhuǎn)堅(jiān)應(yīng)力分別估計(jì)為活載對(duì)稱(chēng)作用下平面彎曲正應(yīng)力的15%和剪應(yīng)力的5% 用修正偏心壓力法求活載內(nèi)力增大系數(shù)：鑒于箱梁截面橫向剛度和抗扭剛度大，則荷載作用下梁發(fā)生變形時(shí)可以認(rèn)為橫截面保持原來(lái)形狀不變，即箱梁各個(gè)腹板的擾度也呈線(xiàn)性規(guī)律。因此通?？梢詫⑾淞焊拱褰瓶醋龅冉孛娴牧?，先按修正偏壓法求活載偏心作用下邊腹板的荷載分配系數(shù)，再乘以腹板總數(shù)，這樣就可以得到箱梁截面活載內(nèi)力的增大系數(shù)。六．拱橋的分類(lèi)
1、按行車(chē)道位置分：上乘式、中乘式、下乘式
2、按結(jié)構(gòu)體系分（承重結(jié)構(gòu)受力圖式分）：簡(jiǎn)單體系拱橋、組合體系拱橋、剛架系桿拱橋
受力特點(diǎn)：簡(jiǎn)單體系拱橋：橋面系是局部受力與傳力結(jié)構(gòu)，不考慮與主拱聯(lián)合受力
組合體系拱橋：主拱與梁等構(gòu)件共同受力，對(duì)主拱的受力要求相對(duì)降低
剛架系桿拱橋：采用預(yù)應(yīng)力鋼絞線(xiàn)作為拉桿來(lái)平衡拱的推力，拉桿不參與橋面系受力，橋面系為局部受力構(gòu)件
3、按主拱的截面形式分：板拱、肋拱、雙曲拱、箱拱
七．拱橋高程：橋面高程、拱頂?shù)孛娓叱獭⑵鸸熬€(xiàn)高程和基礎(chǔ)底面高程。
拱橋橋面的高程的確定：一方面由兩岸線(xiàn)路的縱斷面來(lái)控制，另一方面還要保證橋下凈空能滿(mǎn)足泄洪或同行的要求。
起拱線(xiàn)高程：為了盡量較小橋墩基礎(chǔ)底面的彎矩，節(jié)省墩臺(tái)圬工數(shù)量，選擇低拱腳設(shè)計(jì)方案。八．為什么說(shuō)拱橋的主拱的矢跨比是拱軸設(shè)計(jì)中的主要參數(shù)之一？ 拱橋的水平推力與垂直反力之比值，隨矢跨比的減小而增大；當(dāng)矢跨比減小時(shí)，拱的推力增大，反之則水平推力減??；無(wú)鉸拱隨矢跨比減小其彈性壓縮、溫度變化、混凝土收縮及墩臺(tái)位移產(chǎn)生的附加內(nèi)力越大；拱的矢跨比過(guò)大使拱腳段施工困難；矢跨比對(duì)拱橋的外形及周?chē)坝^的協(xié)調(diào)產(chǎn)生影響
九．矢跨比對(duì)拱橋受力的影響？ 計(jì)算表明，恒載的水平推力與垂直反力之比值，隨矢跨比的減小而增大。當(dāng)矢跨比減小時(shí)，拱的推力增大，反之則水平推力減小。推力大，相應(yīng)地在拱圈內(nèi)產(chǎn)生的軸向力也大，對(duì)拱圈本身的受力狀況是有利的，但是對(duì)墩臺(tái)基礎(chǔ)不利。同時(shí)，當(dāng)拱圈受力后因其彈性壓縮，或因溫度變化、混凝土收縮，或因墩臺(tái)位移等原因，都會(huì)在無(wú)鉸拱的拱圈內(nèi)產(chǎn)生附加內(nèi)力，而拱愈坦即矢跨比越小，附加內(nèi)力越大。十．拉索布置形式：
1.索面數(shù)量：?jiǎn)嗡髅?、雙鎖面和多索面。雙索面分為雙平行索面和雙斜索面。
2.拉索在順橋向布置有輻射形、扇形和豎琴形。
輻射形：拉索傾角大，傳遞豎向荷載效率高，張力水平分立小，減輕主梁軸向壓力。
扇形：索力傳遞接近于最合理，構(gòu)造能滿(mǎn)足施工要求。
豎琴形：優(yōu)點(diǎn)：避免拉索之間相互交叉的視覺(jué)效應(yīng)，景觀效果好，且對(duì)主梁的軸向變形約束剛度大。缺點(diǎn)：豎向傳力效果比較差。
3.拉索布置按間距分類(lèi)：密索和稀索。
密索體系：拉索布置密集，可以改善主梁受力條件，索力較小，錨固方便。
稀索體系：主梁無(wú)索跨度大，彎矩大，要求主梁截面大，自重也大，索的拉力大，錨固困難。
十一．斜拉索的組成：鋼索、兩端的錨具、減震裝置和保護(hù)措施。十二．懸索橋：由主纜、加勁梁、塔柱和錨定組成。懸索橋的結(jié)構(gòu)體系根據(jù)加勁肋的構(gòu)造分為：?jiǎn)慰纭⑷绾?jiǎn)支和三跨連續(xù)。
懸索橋的分類(lèi)：自錨式懸索橋、帶斜拉索的懸索橋、斜拉-懸索混合的懸索橋。
懸索橋與其他橋式相比，為什么跨度大，優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在哪里？
1材料用量和截面設(shè)計(jì)方面。其他橋型的承重構(gòu)件的截面面積，隨著跨度增加而增加，致使材料用量大。而大跨度懸索橋加勁梁不是主要承重構(gòu)件，面積不需要隨跨度增大而增大。
2構(gòu)件設(shè)計(jì)方面：許多構(gòu)件截面積的增大時(shí)容易受到客觀制約的，但懸索橋的主纜、錨定和塔這三項(xiàng)主要承重構(gòu)件在擴(kuò)充其截面積或承載能力方面遇到的困難比較小。3主纜具有非常合理的受力形式。對(duì)于拉壓構(gòu)件，應(yīng)力在截面上得分布比較均勻，對(duì)受彎桿件，在彈性范圍內(nèi)應(yīng)力分布呈三角形。就充分發(fā)揮材料的承載能力來(lái)說(shuō)，拉壓的受力方式較受彎合理，而受壓構(gòu)件需要考慮穩(wěn)定性問(wèn)題。由于主纜瘦啦，截面設(shè)計(jì)較容易，因此懸索橋跨度是最大的。（為什么懸索橋的跨度最大？）
4在施工方面。主纜先架好，而主纜可以有細(xì)小鋼絲集合而成，使得建造大跨度橋梁使用的大直徑纜索能夠通過(guò)小型安裝完成。主纜完成后就是一個(gè)現(xiàn)成的懸吊式腳手架。雖然要采取措施防御大風(fēng)，但同其他橋比起來(lái)風(fēng)險(xiǎn)也較小。凈跨徑: 對(duì)于梁橋是指設(shè)計(jì)洪水位上相鄰兩個(gè)橋墩或橋墩與橋臺(tái)之間的凈距離；對(duì)于拱橋是指兩拱腳截面最低點(diǎn)之間的水平距離。計(jì)算跨徑: 對(duì)于有支座的橋梁，是指橋跨結(jié)構(gòu)相鄰兩個(gè)支座中心的距離，用表示;對(duì)于拱橋,是指相鄰兩拱腳截面形心點(diǎn)之間的水平距離 3 橋梁全長(zhǎng): 指橋梁兩端兩個(gè)橋臺(tái)的側(cè)墻或八字墻后端點(diǎn)之間的距離，對(duì)于無(wú)橋臺(tái)的橋梁為橋面系行車(chē)道的全長(zhǎng).4 設(shè)計(jì)洪水位: 橋梁設(shè)計(jì)中按規(guī)定的設(shè)計(jì)洪水頻率計(jì)算所得的高水位 5 荷載折減系數(shù)：計(jì)算結(jié)構(gòu)受力時(shí)，考慮活荷載標(biāo)準(zhǔn)值不可能全部布滿(mǎn)和各構(gòu)件受載后的傳遞效果不同，對(duì)荷載進(jìn)行折減的系數(shù)。分為橫向折減系數(shù)和縱向折減系數(shù)。6 偶然作用：是指在結(jié)構(gòu)使用期間出現(xiàn)的概率很小，一旦出現(xiàn)，其值很大且持續(xù)時(shí)間很短的作用。永久作用：是指在結(jié)構(gòu)使用期間，其量值不隨時(shí)間而變化或其變化值與平均值比較可忽略不計(jì)的作用?？勺冏饔茫菏侵冈诮Y(jié)構(gòu)使用期間，其量值隨時(shí)間變化，且其變化值與平均值比較不可忽略的作用。9 荷載橫向分布影響線(xiàn)：指表徑橋路上車(chē)輛、人群荷載沿橫橋上對(duì)主梁分配的荷載程度的系數(shù) 矢跨比：指拱橋中拱圈（或拱肋）的計(jì)算矢高與計(jì)算跨徑之比（），亦稱(chēng)拱矢度，它是反映拱橋受力特性的一個(gè)重要指標(biāo) 合理拱軸線(xiàn)：能使拱的各個(gè)截面彎矩為零的拱軸線(xiàn)。五點(diǎn)重合法：求懸鏈線(xiàn)拱的拱軸系數(shù)時(shí)，要求拱圈的五個(gè)關(guān)鍵控制截面，即拱頂，兩拱腳和兩個(gè)四分點(diǎn)達(dá)到壓力線(xiàn)和拱軸線(xiàn)必須重合，從而使各拱圈截面不產(chǎn)生過(guò)大的彎矩峰值，這種設(shè)計(jì)方法稱(chēng)為五點(diǎn)重合法。凈矢高：指從拱頂截面下緣至相鄰兩拱腳截面下緣最低點(diǎn)連線(xiàn)的垂直距離，以表示。標(biāo)準(zhǔn)跨徑: 對(duì)于梁橋，是指兩相鄰橋墩中心線(xiàn)之間的距離，或橋墩中心線(xiàn)至橋臺(tái)臺(tái)背前緣之間的距離；對(duì)于拱橋，則是指凈跨徑，用表示 連拱作用 ：支承在有限剛度橋墩上德連續(xù)多孔拱橋，在拱圈受力時(shí)，各孔拱圈橋墩變形相互影響的作用 預(yù)拱度：為了平衡橋梁使用時(shí)的上部結(jié)構(gòu)和施工時(shí)支架的各變形值，在橋梁澆筑時(shí)預(yù)先施加的一個(gè)上拱值。17 簡(jiǎn)單體系拱橋是有推力拱，拱的水平推力直接由墩臺(tái)或基礎(chǔ)承受，主拱圈是橋跨結(jié)構(gòu)的主要承重構(gòu)件 拱橋的聯(lián)合作用是指當(dāng)活載作用于橋跨結(jié)構(gòu)時(shí)，拱上建筑參與主拱圈共同承受活載的作用 橋梁的建筑高度是指橋面與橋跨結(jié)構(gòu)最低邊緣的高差
20總跨徑是計(jì)算跨徑之和 作用效應(yīng)是指永久作用、可變作用、偶然作用等橋梁作用于橋梁上引起其結(jié)構(gòu)外加變形或約束變形 22 建筑高度：指橋上行車(chē)路面（或軌頂）標(biāo)高至橋跨結(jié)構(gòu)最下緣之間的距離。橋下凈空高度：指設(shè)計(jì)洪水位或通航水位至橋跨結(jié)構(gòu)最下緣之間的距離。橋梁高度：指橋面與低水位之間的高差或?yàn)闃蛎媾c橋下線(xiàn)路路面之間的高差 容許建筑高度：公路（或鐵路）定線(xiàn)中所確定的橋面（或軌頂）標(biāo)高，對(duì)通航凈空頂部標(biāo)高之差，又稱(chēng)為容許建筑高度。最不利荷載組合：對(duì)于橋梁結(jié)構(gòu)可能同時(shí)存在的荷載，使其產(chǎn)生最不利效應(yīng)時(shí)的荷載組合。拱軸系數(shù)：是指拱腳的恒載集度和拱頂恒載集度的比值 作用效應(yīng)組合：對(duì)結(jié)構(gòu)上可能同時(shí)出現(xiàn)的作用，按照產(chǎn)生最不利效應(yīng)時(shí)進(jìn)行的組合。
簡(jiǎn)答題 梁式橋按承重結(jié)構(gòu)的靜力體系的分類(lèi)和特點(diǎn)？
分為簡(jiǎn)支梁橋、懸臂梁橋、、連續(xù)梁橋、T形鋼構(gòu)橋及連續(xù)-鋼構(gòu)橋。簡(jiǎn)支梁橋受力簡(jiǎn)單梁中只有正彎矩，體系溫變、張拉預(yù)應(yīng)力等均不會(huì)在梁中產(chǎn)生附加內(nèi)力，設(shè)計(jì)計(jì)算方便，最易設(shè)計(jì)成各種標(biāo)準(zhǔn)跨徑的裝配式結(jié)構(gòu)。將簡(jiǎn)支梁橋梁體加長(zhǎng)，并越過(guò)支點(diǎn)就成為懸臂梁橋。將簡(jiǎn)支梁梁體在支點(diǎn)上連接形成連續(xù)梁，連續(xù)梁受溫度變化及混凝土收縮等影響產(chǎn)生的縱向位移也就較大，使伸縮縫及活動(dòng)支座的構(gòu)造復(fù)雜化。T形剛構(gòu)是一種墩梁固結(jié)、具有懸臂受力特點(diǎn)的梁式橋。連續(xù)鋼構(gòu)橋是預(yù)應(yīng)力混凝土大跨梁式橋的主要橋型之一，它綜合了連續(xù)梁和T形鋼構(gòu)橋的受力特點(diǎn)，將主梁做成連續(xù)梁體，與薄壁橋墩固結(jié)而成。主拱圈高度如何擬定？
答：根據(jù)跨徑大小、荷載等級(jí)、主拱圈材料規(guī)格等條件決定 選擇拱軸線(xiàn)的原則？常用的拱軸線(xiàn)型有哪些？什么是合理拱軸線(xiàn)？ 答：選擇拱軸線(xiàn)的原則是盡可能降低由于荷載產(chǎn)生的彎矩值，充分利用圬工材料抗壓性能。常用的拱軸線(xiàn)型有圓弧線(xiàn)、拋物線(xiàn)和懸鏈線(xiàn)。合理拱軸線(xiàn)是拱橋上拱圈截面只受軸向壓力而無(wú)彎矩作用的拱軸線(xiàn)。“五點(diǎn)重合法”如何確定空腹式懸鏈線(xiàn)拱的拱軸線(xiàn)和拱軸系數(shù)？
答：五點(diǎn)重合法：使懸鏈線(xiàn)拱軸線(xiàn)接近其恒載壓力線(xiàn)，即要求拱軸線(xiàn)在全拱有5點(diǎn)（拱頂、拱腳和1/4點(diǎn)）與其三鉸拱恒載壓力線(xiàn)重合。6 簡(jiǎn)支梁橋的設(shè)計(jì)計(jì)算應(yīng)包括哪些內(nèi)容？
答：有受彎構(gòu)件正截面承載力計(jì)算、受彎構(gòu)件斜截面承載力計(jì)算、裂縫寬度計(jì)算、撓度計(jì)算。簡(jiǎn)述“全預(yù)應(yīng)力混凝土梁”和“部分預(yù)應(yīng)力混凝土梁”各自的優(yōu)缺點(diǎn)？ 答：全預(yù)應(yīng)力是在全部荷載最不利組合作用下，正截面上混凝土不出現(xiàn)拉應(yīng)力。部分預(yù)應(yīng)力是在全部荷載最不利組合作用下構(gòu)，構(gòu)件正截面上混凝土允許出現(xiàn)裂縫，但裂縫寬度不超過(guò)規(guī)定容許值。懸臂梁橋和連續(xù)梁橋?yàn)槭裁幢群?jiǎn)支梁橋具有更大的跨越能力？它們的主要配筋特點(diǎn)是什么？
答：這主要是由于懸臂體系梁橋和連續(xù)體系梁橋存在支點(diǎn)負(fù)彎矩，所以，其跨中彎矩比相同跨徑相同荷載的簡(jiǎn)支梁橋的跨中彎矩顯著減小。同時(shí)，由于跨中彎矩的減小可以減小跨度內(nèi)主梁的高度，從而降低鋼筋混凝土用量和結(jié)構(gòu)自重，而這本身又導(dǎo)致了恒載內(nèi)力的減小，所以它們具有更大的跨越能力。由于負(fù)彎矩的存在，它們主要的配筋特點(diǎn)是在支點(diǎn)附近需要配置承受負(fù)彎矩的力筋，在跨中附近需要配置承受正彎矩的力筋。懸索橋的基本組成、構(gòu)造類(lèi)型、結(jié)構(gòu)體系和受力特點(diǎn)？
答：其主要結(jié)構(gòu)由主纜、橋塔、錨碇、吊索、加勁梁等組成，構(gòu)造類(lèi)型組合體系橋型，結(jié)構(gòu)體系為利用主纜和吊索作為加勁梁的懸掛體系，受力特點(diǎn)是在吊索的懸吊下，加勁梁相當(dāng)于多個(gè)彈性支承連續(xù)梁，彎矩顯著減?。粦宜鳂虻幕钶d和恒載通過(guò)吊索和索夾傳遞至主纜，再通過(guò)鞍座傳至橋塔頂，經(jīng)橋塔傳遞到下部的橋墩和基礎(chǔ)；主纜除承受活載和加勁梁的恒載外，還分擔(dān)一部分橫向風(fēng)荷載并將它直接傳到塔頂。什么叫矮塔部分斜拉橋，它有什么特點(diǎn)？
答：1，埃塔部分斜拉橋由于拉索不能提供，足夠的支承剛度，故要求主梁的剛度較大。因拉索只提供部分剛度，所以命名其為部分斜拉橋。
2，特點(diǎn)：塔較矮；梁的無(wú)索區(qū)較長(zhǎng)，沒(méi)有端錨索；邊跨與主跨比值較大，一般大于0.5；梁高較大；受力一梁為主，索為輔；斜拉鎖的應(yīng)力變幅較小，可按體外預(yù)應(yīng)力索布置。連續(xù)梁橋中通常布置三向預(yù)應(yīng)力筋，他們分別和什么內(nèi)力相對(duì)應(yīng)？
答：縱向預(yù)應(yīng)力抵抗縱向受彎和部分受剪，豎向預(yù)應(yīng)力抵抗受剪，橫向預(yù)應(yīng)力抵抗橫向受彎 斜拉橋的基本組成、構(gòu)造類(lèi)型、結(jié)構(gòu)體系和受力特點(diǎn)？
答：斜拉橋由斜索、塔柱、主梁三部分組成，是一種橋面體系受壓，支承體系受拉的多次超靜定結(jié)構(gòu)。從塔柱上伸出并懸吊起主梁的高強(qiáng)度鋼索起著主梁彈性支承的作用，從而大大減小梁內(nèi)彎矩，使梁截面尺寸減小，減輕了主梁的重量，加大了橋的跨越能力。在這三者中，塔柱以承壓為主有時(shí)還要承受較大彎矩，主梁受彎也受軸向壓力或拉力。為什么大跨度連續(xù)梁橋沿縱向一般設(shè)計(jì)成變高度的形式？
答：
1、大跨度連續(xù)梁橋恒載內(nèi)力占得比重比較大，選用變高度梁可以大大減少跨中區(qū)段因恒載產(chǎn)生的內(nèi)力；
2、變高度梁符合內(nèi)力分布規(guī)律；
3、采用懸臂法施工時(shí)，變高度梁又與施工的內(nèi)力狀態(tài)相吻合；
4、從美學(xué)觀點(diǎn)出發(fā)，變高度梁比較有韻律感，特別是位于城市中的橋梁 變高度連續(xù)體系梁橋箱梁的梁高應(yīng)如何擬定？
答：在不受截面設(shè)計(jì)中建筑高度限制的影響的前提下，連續(xù)箱梁的梁高宜采用變高度的，其底曲線(xiàn)可采用二次拋物線(xiàn)、折線(xiàn)和介于兩者之間的1.5-1.8次拋物線(xiàn)形式，具體的選用形式應(yīng)按照各截面上下緣受力均勻、容易布束確定。根據(jù)已建成橋梁資料分析，支點(diǎn)截面的梁高H支約為（1/16—1/20）L(L為中間跨跨長(zhǎng))，跨中梁高H中約為（1/1.6—
1、2.5）H支。在具體設(shè)計(jì)中，還要根據(jù)邊跨與中跨比例、荷載等因素通過(guò)幾個(gè)方案的比較確定。什么是拱上建筑？實(shí)腹式和空腹式拱上建筑的組成？
答：由于主拱圈是曲線(xiàn)型，一般情況下車(chē)輛無(wú)法直接在弧面上行駛，所以在行車(chē)道系與主拱圈之間需要有傳遞荷載的構(gòu)件和填充物。這些主拱圈以上的行車(chē)道系和傳載構(gòu)件或填充物統(tǒng)稱(chēng)為拱上建筑。
實(shí)腹式拱上建筑由拱腔填料、側(cè)墻、護(hù)拱和橋面系等部分組成，一般適用于小跨徑拱橋?？崭故焦吧辖ㄖ畲蟮奶攸c(diǎn)在于具有腹孔和腹孔墩。腹孔有拱式腹孔、梁(板)式腹孔兩種形式。腹孔跨徑不宜過(guò)大，腹孔的構(gòu)造應(yīng)統(tǒng)一。
橋梁縱斷面的設(shè)計(jì)的主要內(nèi)容有哪些項(xiàng)？
答:橋梁縱斷面設(shè)計(jì)包括確定橋梁的總跨徑,橋梁的分孔,橋道的標(biāo)高,橋上和橋頭引道的縱坡以及基礎(chǔ)的埋置深度等?；炷翗蛎媸怯赡男┎糠纸M成的？各部分的作用是什么？
答：
1、道床：減弱對(duì)橋的沖擊；緩和列車(chē)的震動(dòng)；防治枕木移位；將車(chē)輪集中荷載分布到梁頂面；調(diào)整軌底標(biāo)高。
2：橋面鋪裝：防治車(chē)道板磨耗；保護(hù)主梁免受雨水侵蝕；減緩沖擊；分散汽車(chē)荷載。
3：防排水系統(tǒng)：使橋面快速排水，防治橋面水滲透到主梁內(nèi)部；增加結(jié)構(gòu)的耐久性。
4：伸縮縫：使橋面自由伸縮，橋面連續(xù)，車(chē)輛駛過(guò)時(shí)平順，防止雨水和雜物滲入。
5：防撞墻：防治汽車(chē)重裝橋面護(hù)欄，同時(shí)作為機(jī)動(dòng)車(chē)道和人行道或非機(jī)動(dòng)車(chē)道的分隔帶 17 橋面的防排水系統(tǒng)有何作用？常用的構(gòu)造措施和施作方法有哪些？
答：應(yīng)迅速排除橋面上積水，并使?jié)B水的可能性降至最小限度。城市橋梁排水系統(tǒng)應(yīng)保證橋下無(wú)滴水和結(jié)構(gòu)上無(wú)漏水現(xiàn)象 設(shè)置橋梁縱坡的原因和目的是什么？
答:為使雨水迅速排除，防止或減少雨水對(duì)鋪裝層的滲透，從而保護(hù)了行車(chē)道板，延長(zhǎng)橋梁使用壽命。橋面鋪裝、伸縮縫的作用、要求和類(lèi)型？
答：橋面鋪裝作用是保護(hù)橋梁主體結(jié)構(gòu)，承受車(chē)輪的直接磨損，防止主梁遭受雨水的侵蝕，并能對(duì)車(chē)輛集中荷載起一定的分布作用。因此，橋面鋪裝應(yīng)有一定的強(qiáng)度，防止開(kāi)裂，并耐磨損。主要類(lèi)型有普通水泥混凝土、防水混凝土、瀝青混凝土。伸縮縫為了保證橋跨結(jié)構(gòu)在氣溫變化、活載作用、混凝土收縮與徐變等影響下按靜力圖示自由變形，要求1.能保證結(jié)構(gòu)溫度變化所引起的伸縮變形2.車(chē)輛駛過(guò)時(shí)應(yīng)能平順、不打滑、無(wú)突跳、過(guò)大的噪聲與振動(dòng)3.具有安全排水防水的構(gòu)造防止雨水侵蝕、垃圾及泥土的阻塞對(duì)伸縮縫本身以及對(duì)橋面以下支座和其他結(jié)構(gòu)的損壞、對(duì)功能正常發(fā)揮作用。類(lèi)型有充填式伸縮縫、鋼板伸縮縫、橡膠伸縮縫、組合伸縮縫。行車(chē)道板的定義是什么？其作用是什么？
答：定義：行車(chē)道板是直接承受輪壓的混凝土板，它與主梁梁肋和橫隔梁聯(lián)結(jié)在一起的結(jié)構(gòu)板。作用：承力、傳力、連接。畫(huà)圖表示出溫度降低時(shí)拱彈性中心處的水平力。P302 23 畫(huà)出系桿拱橋簡(jiǎn)圖，指明系桿位置所在，簡(jiǎn)述其作用。拱橋如何處理不等跨分孔問(wèn)題 ?
1、采用不同的矢跨比：矢跨比與推力大小成反比
2、采用不同的拱腳標(biāo)高
3、調(diào)整拱上建筑的重力
4、采用不同類(lèi)型的拱跨結(jié)構(gòu)：小跨采用板拱，大跨采用肋拱或中承式拱 拱橋的優(yōu)缺點(diǎn)（P19和P229）優(yōu)點(diǎn)：
（1）在豎直荷載的作用下所產(chǎn)生的水平反力，使得與同跨徑、同截面的梁相比，拱的彎矩和撓度及剪力要小得多
（2）拱橋的跨越能力很大，外形美觀 缺點(diǎn)
(1)
主拱在合攏之前不是拱結(jié)構(gòu)，需要借助其他輔助措施，施工難度大
(2)
拱腳水平推力較大，下部結(jié)構(gòu)的工程數(shù)量也相應(yīng)增加，對(duì)地基條件要求較高(3)
拱以受壓為主，穩(wěn)定性能問(wèn)題突出 拱橋與梁橋相比在受力性能上有哪三點(diǎn)差異？
豎向荷載作用下，支承處存在水平推力，且全拱均勻相等
由于水平推力使拱橋截面彎矩比同截面的梁橋小
主拱主要承受彎壓內(nèi)力 拱橋的主要設(shè)計(jì)標(biāo)高有哪四個(gè)？
拱橋的設(shè)計(jì)標(biāo)高主要有四個(gè)：橋面標(biāo)高、拱頂?shù)酌鏄?biāo)高、起拱線(xiàn)標(biāo)高和基礎(chǔ)底面標(biāo)高 29 拱軸線(xiàn)的型式與拱上建筑的布置一般有哪四點(diǎn)關(guān)系？ 小跨徑實(shí)腹式拱橋采用圓弧線(xiàn)拱軸線(xiàn)
小跨徑空腹式拱橋采用懸鏈線(xiàn)拱軸線(xiàn)
大、中跨徑可采用空腹式近似懸鏈線(xiàn)拱軸線(xiàn)
輕型拱橋或全透空的大跨徑拱橋可采用拋物線(xiàn)拱軸線(xiàn)
拱橋如何處理不等跨分孔問(wèn)題？
1、采用不同的矢跨比：矢跨比與推力大小成反比
2、采用不同的拱腳標(biāo)高
3、調(diào)整拱上建筑的重力
4、采用不同類(lèi)型的拱跨結(jié)構(gòu)：小跨采用板拱，大跨采用肋拱或中承式拱 分析題
一
預(yù)應(yīng)力混凝土連續(xù)梁梁橋活載內(nèi)力計(jì)算的方法？
答：1.按空間結(jié)構(gòu)計(jì)算活載內(nèi)力 按空間結(jié)構(gòu)計(jì)算連續(xù)梁橋活載內(nèi)力的方法有：
(1)按最不利布載計(jì)算各主梁(肋)的荷載橫向分布系數(shù)，按平面桿系結(jié)構(gòu)計(jì)算繪制該主梁(肋)的縱橋向內(nèi)力影響線(xiàn)；
(2)將荷載乘以荷載橫向分布系數(shù)，沿橋梁縱向按最不利位置分別將荷載加至影響線(xiàn)正負(fù)效應(yīng)區(qū)，即可求得絕對(duì)值最大的正負(fù)活載內(nèi)力。2.按平面桿系結(jié)構(gòu)計(jì)算活載內(nèi)力 計(jì)算方法與空間結(jié)構(gòu)類(lèi)同，只是無(wú)需計(jì)算橫向分布系數(shù)。二 預(yù)應(yīng)力混凝土連續(xù)剛構(gòu)梁橋的主梁截面和預(yù)應(yīng)力筋布置特點(diǎn)？ 答：
1、由于剛構(gòu)橋的主梁除了在跨中部分承受正彎矩外，在支點(diǎn)附近還要抵抗較大的負(fù)彎矩，因此在進(jìn)行截面設(shè)計(jì)時(shí)往往要加強(qiáng)截面底部的混凝土受壓區(qū)。常用形式有帶馬蹄形的T形截面，箱型截面，適用于中等跨徑及大跨徑的橋梁。為了適應(yīng)向支點(diǎn)處逐漸增大的負(fù)彎矩，梁高及梁底均可相應(yīng)地加大。
2、帶掛梁剛構(gòu)橋的懸臂部分只承受負(fù)彎矩，因此將預(yù)應(yīng)力筋布置在梁肋頂部和橋面板內(nèi)，以獲得最大的作用力臂，預(yù)應(yīng)力筋分直筋和彎筋兩類(lèi)，直筋的一部分在接縫處端面上錨固，一部分直通至懸臂端部錨固在牛腿端面上。肋內(nèi)的彎筋則隨著施工的推進(jìn)逐漸下彎而傾斜錨固在各安裝塊件(或現(xiàn)澆段)上。為了使位于梁肋外承托內(nèi)的力筋也能下彎錨固，通常還要使它們?cè)谄矫鎯?nèi)也作適當(dāng)彎曲。下彎的力筋能增加梁體的抗剪能力。在大跨徑橋梁中還可在肋內(nèi)設(shè)置專(zhuān)門(mén)的豎向預(yù)應(yīng)力筋來(lái)增強(qiáng)梁肋的抗剪作用。
對(duì)于帶鉸剛構(gòu)橋，懸臂部分也可能出現(xiàn)正負(fù)異號(hào)的彎矩，在此情況下梁的底部也應(yīng)布置適當(dāng)?shù)目v向預(yù)應(yīng)力筋。
三
如何用等代荷載、內(nèi)力影響線(xiàn)計(jì)算拱橋的活載內(nèi)力？ 答：
1、計(jì)算集中力荷載：
①首先畫(huà)出計(jì)算截面的彎矩影響線(xiàn)、水平推力和支座豎向反力影響線(xiàn)；
②根據(jù)彎矩影響線(xiàn)確定集中力荷載最不利（最大、最?。┑募虞d位置；
③以荷載值乘以相應(yīng)位置的影響線(xiàn)坐標(biāo)，求得最大彎矩（最小彎矩）及相應(yīng)的水平推力和支座豎向反力。
2、計(jì)算均布力：
①下圖是某等截面懸鏈線(xiàn)無(wú)鉸拱橋左拱腳處的彎矩及水平推力和支座豎向反力影響線(xiàn)，首先將均布荷載布置在影響線(xiàn)的正彎矩區(qū)段。
②根據(jù)設(shè)計(jì)荷載和正彎矩區(qū)影響線(xiàn)的長(zhǎng)度，可由《拱橋》手冊(cè)的均布荷載表查得最大正彎矩的等代荷載及相應(yīng)水平推力和豎向反力的均布荷載和，及相應(yīng)的面積。
③再以分別乘以最大正彎矩及相應(yīng)水平推力和豎向反力的面積，即可求得拱腳截面的內(nèi)力。最大正彎矩：
與相應(yīng)水平推力：
與相應(yīng)豎向反力：
式中：─—為荷載橫向分布系數(shù)；—為車(chē)道折減系數(shù)；
則與相應(yīng)的拱腳截面的軸向力為：
同理，再將荷載布置在影響線(xiàn)的負(fù)彎矩區(qū)段，可求得最大負(fù)彎矩及相應(yīng)水平推力﹑豎向反力和拱腳截面的軸向力。
④其它相應(yīng)截面的軸向力和剪力分別按式下兩式計(jì)算。
拱頂：
軸向力：
拱腳：
其它截面：
拱頂：
數(shù)值很小，一般不計(jì)算
剪 力：
拱腳：
其它截面：
數(shù)值較小，一般不計(jì)算
《公路圬工橋涵設(shè)計(jì)規(guī)范》(JTG D61-2005)第5.1.1條中規(guī)定，計(jì)算由汽車(chē)荷載產(chǎn)生的拱的各截面正彎矩時(shí)，拱頂至拱跨1/4點(diǎn)應(yīng)乘以折減系數(shù)0.7，拱腳應(yīng)乘0.9，拱跨1/4點(diǎn)至拱腳，用直線(xiàn)插入法確定。
四
實(shí)腹式懸鏈線(xiàn)拱的拱軸線(xiàn)和拱軸系數(shù)如何確定（含拱軸系數(shù)公式推導(dǎo)）？
答：定拱軸線(xiàn)一般采用無(wú)矩法，即認(rèn)為主拱圈截面僅承受軸向壓力而無(wú)彎矩。
拱軸系數(shù)的確定：拱軸系數(shù)：，拱頂恒載分布集度為 ：
（4-20）
拱腳恒載分布集度為：
（4-21）
式中： ─—分別為拱頂填料、拱圈材料及拱腹填料的容重；
─—為拱頂填料厚度，一般為300～500mm；
─—為主拱圈厚度；
─—為拱腳處拱軸線(xiàn)的水平傾角； 由幾何關(guān)系有
（4-22）
由以上各式可以看出，盡管只有
為未知數(shù)，其余均為已知，但仍不能直接算出。所以，在具體計(jì)算值時(shí)可采用試算法確定。具體做法如下：
①先根據(jù)拱的跨徑和矢高假設(shè)，再由《拱橋》附錄表（Ⅲ）-20查得拱腳處的值；
②將值代入式（4-21）計(jì)算出后，再與一同代入式（4-11），即可求得值。
③再與假設(shè)的值比較，如兩者相
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