第一篇：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)限的統(tǒng)計(jì)推斷

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)限的統(tǒng)計(jì)推斷

來源：中國(guó)論文下載中心

作者：王文清，王昌富，袁琳，彭長(zhǎng)華，常武

【摘要】 檢測(cè)限是檢測(cè)方法的重要性能指標(biāo)，用Poisson分布的概率函數(shù)分式計(jì)算一次抽樣檢測(cè)出現(xiàn)的結(jié)果推論總體出現(xiàn)該結(jié)果的概率。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQPCR)檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA結(jié)果為例，計(jì)算可知，一次抽樣反應(yīng)管的檢測(cè)結(jié)果≥4時(shí)，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性(P<0.05)。因而檢測(cè)血清中病原體時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)管中的檢測(cè)限是4拷貝/ul計(jì)算也可知，1拷貝/ul表示一次抽樣的結(jié)果為0的概率可達(dá)0.368，結(jié)果在0拷貝/ul～4拷貝/ul的概率為0.996，而1000拷貝/ml表示一次抽樣結(jié)果為0的概率為0。結(jié)果在905拷貝/ml～1 095拷貝/ml的概率為0.997；而100 000拷貝/L表示一次抽樣結(jié)果在997 000拷貝/L～1 003 000拷貝/L的概率為0.997。抽樣單位ul不能隨意放大為ml甚至L。

【關(guān)鍵詞】 實(shí)時(shí)熒光定量PCR；檢測(cè)限；統(tǒng)計(jì)推斷

Statistical Conclusion of Limit of Quqntitation in Realtime Fluorescence Quantitative PCR

Abstract:Limit of quantiation is a important performance index of assay methods.Results of sample drawing are calculated through possiblity function equation of Poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is deduced.For example,in Realtime Fluorescence quantitaive PCR to assay HBV DNA,only when sample drawing results≥4,significance of difference(P<0.05)could be deduced between population and blank.So limit of quantitation is 4 copies/ul denoting 0 in one sample drawing is 0,and Possibility of results between 905 copies/ml to 1095 copies/ml is 0.997.Possibility of 100 000 copies/L denoting results between 997 000 copies/L to 1 003 000 copies/L in one sample drawing is 0.997.Sample drawing unit ul could not be replace by ml or L.Key words：Realtime Fluorescence quantitative PCR；Limit of quantitation;Statistical conclusion

檢測(cè)限是檢測(cè)方法的重要性能指標(biāo)，只有在檢測(cè)報(bào)告中明確表達(dá)了檢測(cè)方法的檢測(cè)限，該檢測(cè)報(bào)告在各實(shí)驗(yàn)間及同一項(xiàng)目的各種檢測(cè)方法間才可進(jìn)行比較。能檢測(cè)到的最低分析物濃度為檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)限。當(dāng)前，檢測(cè)限術(shù)語(yǔ)混亂，如：靈敏度(sensitivity)、分析靈敏度(analllytical sensitivity)、定量限度(limit of quantitqtion)等［1］。每個(gè)詞語(yǔ)的實(shí)際含義中包含有各自的實(shí)驗(yàn)方式、數(shù)據(jù)處理方式及由數(shù)據(jù)作出的推論等。我們采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，以期得到一致的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQPCR)檢測(cè)限，現(xiàn)介紹如下。

文獻(xiàn)中FQPCR檢測(cè)限的描述

檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA的文獻(xiàn)中檢測(cè)限使用了“最低檢出量”［2，3］、靈敏度［5～7］等術(shù)語(yǔ)，它等于已知的高拷貝HBV DNA血清10倍系列稀釋后能檢測(cè)到擴(kuò)增曲線的最大稀釋倍數(shù)管濃度。表述有：陰性HBV DNA≤106拷貝/升［4］；熒光定量PCR法檢測(cè)靈敏度102拷貝/ml［5］、104拷貝/ml［6］、8.6×102拷貝/ml［7］；HCⅡ法檢測(cè)靈敏度1.4×105拷貝/ml［7］；103 Eq/ml理論值時(shí)到達(dá)檢測(cè)極限［3］；PCRFP檢測(cè)HBV DNA的最低檢測(cè)出量1×101拷貝［2］；bDNA在105 Eq/ml時(shí)到達(dá)檢測(cè)極限［3］。以上檢測(cè)限術(shù)語(yǔ)各不相同，且同一方法檢測(cè)HBV DNA在上述各實(shí)驗(yàn)室發(fā)出同樣的“HBV DNA低于檢測(cè)下限”的報(bào)告時(shí)其實(shí)際HBV DNA拷貝數(shù)相差可達(dá)100倍。

FQPCR檢測(cè)過程簡(jiǎn)介

以測(cè)定血清乙型肝炎病毒DNA為例：將40 μl血清樣本加40 μl DNA提取液處理后，將其中2 μl（相當(dāng)于1 μl血清）加入主反應(yīng)液（含DNA引物、酶、DNA構(gòu)件分子dNTP等）管中，在自動(dòng)熱循環(huán)上進(jìn)行溫度循環(huán)，自動(dòng)熱循環(huán)儀記錄每一反應(yīng)管在每一次溫度循環(huán)的熒光強(qiáng)度，記30次溫度循環(huán)后結(jié)束。在PCR循環(huán)過程中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（Cyclethreshold),它與反應(yīng)管中DNA起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值（lgN)呈非常顯著的直線相關(guān)關(guān)系。自動(dòng)熱循環(huán)儀對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品自動(dòng)生成一條Ct值對(duì)于起始拷貝數(shù)值（lgN)的工作曲線，并通過該工作曲線來確定待測(cè)未知樣品反應(yīng)管的起始拷貝數(shù)（N）。當(dāng)30次循環(huán)后某一待測(cè)管仍檢測(cè)不到高于基線水平的熒光信號(hào)時(shí)，儀器默認(rèn)Ct值為30，不計(jì)算起始拷貝。確定FQPCR檢測(cè)限的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理

如果被檢物的含量和檢測(cè)方法的空白響應(yīng)量的波動(dòng)服從正態(tài)分布規(guī)律，則檢測(cè)限可用多次檢測(cè)空白的方法來確定?？尚畔逓?5%時(shí)檢測(cè)限＝x空白+2.s空白；可信限為99.7%時(shí)檢測(cè)限=x空白+3.s空白。這是目前多數(shù)檢測(cè)限的確定方法。對(duì)核酸檢測(cè)方法的檢測(cè)限的理解可能與此有差別，但是原理應(yīng)是一致的［1］，F(xiàn)QPCR檢測(cè)限也應(yīng)是推論總體與空白有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的最小抽樣結(jié)果。

FQPCR檢測(cè)限的統(tǒng)計(jì)推斷

假設(shè)病原體在血液等體液中的分布是隨機(jī)的，則單位體積中(如1.0 μl)病原顆粒數(shù)的分布服從Poisson分布。以Poisson分布的概率函數(shù)公式計(jì)算一次抽樣檢測(cè)出現(xiàn)的結(jié)果推論總體概率。從理論上來說，使用PCR測(cè)定技術(shù)測(cè)定病原體核酸序列的量可低至1個(gè)拷貝［2］。例如：血清標(biāo)本中加入等量的DNA提取液，于離心管中煮沸，4 ℃放置，離心，吸取上清液2 μl作模板 進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)(2 μl上清液相當(dāng)于抽樣1 μl血清)［2］，其中至少有1個(gè)拷貝的HBV DNA才能有典型擴(kuò)增反應(yīng)，這時(shí)檢測(cè)結(jié)果是1拷貝/μl。由Poisson分布的概率函數(shù)公式可計(jì)算出1次抽樣檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)0時(shí)，推斷總體為1～9的概率見表1。

表1 總體為1～9時(shí)抽樣為0的概率及總體（略）

在FQPCR檢測(cè)HBV DNA中，當(dāng)30次循環(huán)后某一待測(cè)管仍檢測(cè)不到高于基線水平的熒光信號(hào)(即當(dāng)Ct≥30)，反應(yīng)管檢測(cè)結(jié)果為0時(shí)，推論總體拷貝數(shù)為1～9的概率之和>0.581 92，總體為其他的概率之和<0.5(此時(shí)報(bào)告0拷貝的可信限度低于50%)?？傮w為1時(shí)一次抽樣結(jié)果分別為1～9時(shí)的概率見表1。當(dāng)一次抽樣結(jié)果≥4時(shí)，推論總體為1的概率≤0.015 33，所以對(duì)于病原體的檢測(cè)，一次抽樣反應(yīng)管檢測(cè)結(jié)果≥4拷貝時(shí)，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性(P<0.05)。因而上述檢測(cè)血清中病原體時(shí)一次抽樣反應(yīng)管的檢測(cè)限是4拷貝/μl。當(dāng)總體為1、2、3時(shí)一次抽樣結(jié)果為0的概率分別是0.367 88、0.135 34、0.049 79。如室間質(zhì)量評(píng)價(jià)樣本靶值選擇1拷貝/μl、2拷貝/μl、3拷貝/μl時(shí)，無論實(shí)驗(yàn)室實(shí)際檢測(cè)質(zhì)量如何高，都將有36.79%、13.53%、4.98%的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果為0而被判為不符合［按靶值的對(duì)數(shù)值GM±0.5 log(10)［9］作為可接受的定量范圍］。2005年衛(wèi)生部室間質(zhì)量評(píng)價(jià)中靶值為1.51拷貝數(shù)/μl的樣本符合率僅35.2%；Mancini C 等［9］報(bào)道一些實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測(cè)下限附近的樣本(3.00 log IU/ml)準(zhǔn)確定量有困難；Raggi CC等［10］也報(bào)道28.6%的實(shí)驗(yàn)室(12/42)對(duì)最低濃度的樣本不能定量。這些都是因?yàn)闄z測(cè)下限附近的樣本一次抽樣結(jié)果為0的概率太大所致，對(duì)此我們將另文詳細(xì)討論。造成上述文獻(xiàn)中檢測(cè)限差異較大的可能原因如下：用于10倍系列稀釋的已知高拷貝HBV DNA血清本身拷貝數(shù)的差異；對(duì)檢測(cè)限的理解差異，由一次抽樣沒能檢測(cè)到典型擴(kuò)增的稀釋血清管推論總體濃度為0的可信度太低(<50%)；抽樣單位的任意放大：在上述HBV DNA檢測(cè)中，抽樣單位是1 μl血清［如血清前處理過程中有抽提(濃縮)過程，取2 μl上清液相當(dāng)于實(shí)際含12.5 μl血清，則抽樣單位也只是12.5 μl］，而報(bào)告結(jié)果的單位是ml甚至L。當(dāng)總體為1拷貝/μl時(shí)表示一次抽樣結(jié)果為0的概率達(dá)0.368，結(jié)果在0拷貝/μl～4拷貝/μl的概率為0.996；而總體為1 000拷貝/ml時(shí)表示一次抽樣結(jié)果為0的概率為0，結(jié)果在905拷貝/ml～1 095拷貝/ml的概率為0.997(Poisson分布總體>50時(shí)近似正態(tài)分布，范圍是X±uα*√X，可信限為99.7%時(shí)uα=3);總體為100 000拷貝/L時(shí)表示一次抽樣結(jié)果在997 000拷貝/L～1 003 000拷貝/L的概率為0.997。文中推理以HBVDNA的FQPCR檢測(cè)為例，其他病源體核酸的FQPCR檢測(cè)也與其相同，檢測(cè)限是抽樣反應(yīng)管的檢測(cè)限4拷貝/反應(yīng)管；如反應(yīng)管中加入模板量相當(dāng)于12.5 μl血清則檢測(cè)限相當(dāng)于0.32拷貝/ μl。此推斷僅是針對(duì)FQPCR技術(shù)本身的檢測(cè)限度，未就臨床上有意義的最小病源體核酸的拷貝數(shù)進(jìn)行討論。【參考文獻(xiàn)】

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第二篇：熒光定量PCR的應(yīng)用

熒光定量PCR 的原理及應(yīng)用

熒光定量PCR 是一種新的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)特定核酸技術(shù),它是核酸探針技術(shù)、熒光共振能量傳遞技術(shù)和PCR 技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等特點(diǎn),是對(duì)原有PCR 技術(shù)的革新,擴(kuò)大了PCR 的應(yīng)用范圍。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（FQ-PCR）作為熒光定量PCR技術(shù)的一種，是基于熒光能量傳遞技術(shù),通過受體發(fā)色團(tuán)之間偶極-偶極相互作用,能量從供體發(fā)色基團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色基團(tuán),受體熒光染料發(fā)射出的熒光信號(hào)強(qiáng)度與DNA產(chǎn)量成正比,檢測(cè)PCR 過程的熒光信號(hào)便可得知靶序列的初始濃度。它融匯PCR 技術(shù)的核酸高效擴(kuò)增、探針技術(shù)的高特異性、光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn),直接探測(cè)PCR 過程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量的結(jié)果。目前已在眾多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

1、FQ-PCR 在預(yù)防獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

PCR 技術(shù)的應(yīng)用有許多局限,不能準(zhǔn)確定量,假陽(yáng)性率太高,只要有微量病原體存在就可以得到陽(yáng)性結(jié)果,這不能完全作為診斷依據(jù),只有當(dāng)一定數(shù)量的病原體存在時(shí)才有臨床意義。FQ-PCR實(shí)現(xiàn)了PCR 從定性到定量的飛躍,有效解決PCR 污染和對(duì)模板定量不準(zhǔn)確等問題。

1.1在動(dòng)物病原菌檢測(cè)和鑒定中的應(yīng)用

炭疽桿菌作為人獸共患病的病原,尤其炭疽桿菌的芽胞可作為生物武器的病原。科學(xué)家在100 L 純化空氣中加入炭疽桿菌芽孢,進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè),1 h 內(nèi)炭疽桿菌的單個(gè)芽孢就被檢測(cè)到。

1.2在動(dòng)物病毒檢測(cè)和鑒定上的應(yīng)用

FQ-PCR已應(yīng)用于許多病原體的檢測(cè),如對(duì)艾滋病病毒、乙型肝炎病毒DNA、尖銳濕疣皮損中HPVD-NA、與鼻咽癌關(guān)系密切的EB 病毒、結(jié)核分支桿菌、巨細(xì)胞病毒、A 型和B 型流感病毒等病原體的檢測(cè)。

3.3在動(dòng)物寄生蟲檢測(cè)和鑒定中的應(yīng)用

常用TaqMan 探針。如在被感染豬和鼠組織、全血、羊水以及腦脊髓液中的弓形蟲定量,其檢測(cè)極限相當(dāng)于套式PCR , 但準(zhǔn)確率大大提高。

2、FQ-PCR在畜牧業(yè)中的應(yīng)用

科學(xué)家采用TaqMan 探針檢測(cè)雞γ干擾素、采用RT-FQ-PCR 證明中國(guó)黃牛背最長(zhǎng)肌中cap nl mRNA 表達(dá)量與宰后3 d 的牛肉嫩度高度相關(guān)等。

3、FQ-PCR在其他方面的應(yīng)用

3.1在動(dòng)物檢疫領(lǐng)域的應(yīng)用

FQ-PCR 可對(duì)動(dòng)物源性飼料、食品或其他日用品中牛羊源性成分的定量檢測(cè)。

3.2細(xì)胞因子表達(dá)定量檢測(cè)

常用FQ-PCR 測(cè)定細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)情況,分析機(jī)體免疫狀態(tài)。利用FQ-PCR 測(cè)定雞、豬在注射疫苗、免疫增強(qiáng)劑以及在感染某種疾病情況下體內(nèi)細(xì)胞因子的mRNA 表達(dá)水平。

3.3環(huán)境監(jiān)測(cè)

應(yīng)用FQ-PCR 對(duì)水資源及居家、辦公環(huán)境中的大腸埃希菌、藻青菌和一些寄生蟲進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

3.4轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用

用一個(gè)已知拷貝數(shù)的內(nèi)源基因作為參照,同時(shí)對(duì)樣品作內(nèi)源基因和外源基因的FQ-PCR。兩者達(dá)到熒光閾值時(shí)的Ct 值可得到外源基因的拷貝數(shù);FQ-PCR 還可用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的純合性鑒定及對(duì)轉(zhuǎn)基因后外源基因表達(dá)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

第三篇：關(guān)于購(gòu)買實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀申請(qǐng)報(bào)告

關(guān)于購(gòu)買實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀申請(qǐng)報(bào)告

尊敬的校領(lǐng)導(dǎo)：

自我校2012年提出“五大工程”以來，人才隊(duì)伍實(shí)力與水平得到顯著提升，同時(shí)我們也清醒地認(rèn)識(shí)到現(xiàn)在高校所面臨的生存危機(jī)，應(yīng)對(duì)危機(jī)唯有發(fā)展壯大我校的軟實(shí)力：大力發(fā)展特色學(xué)科、特色專業(yè)；大力開發(fā)研究秦巴山區(qū)優(yōu)勢(shì)生物資源，立足于秦巴山區(qū)，服務(wù)于全國(guó)。然而，我校在科研儀器設(shè)備配置方面還有待提高，我學(xué)科現(xiàn)需購(gòu)置實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，申購(gòu)理由如下：

高通量的檢測(cè)和定量核酸序列的實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光集團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。廣泛應(yīng)用于腫瘤的分子診斷，新藥篩選，基因表達(dá)研究，轉(zhuǎn)基因研究，單核苷酸多態(tài)性（SNP）及突變分析，病原體的分子檢測(cè)，遺傳分析等。

關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀功能介紹：我校位于秦巴山區(qū)，秦巴山區(qū)素有“天然藥庫(kù)”之稱，有著豐富的生物資源。隨著世界科研水平的發(fā)展，目前我校的儀器設(shè)備已不能滿足科研工作的要求。在對(duì)秦巴山區(qū)優(yōu)勢(shì)中藥材功能基因的研究中：（1）對(duì)功能基因的發(fā)育階段表達(dá)、組織表達(dá)情況分析；（2）檢測(cè)功能基因RNAi干擾效率：功能基因的作用研究中，要對(duì)功能基因沉默表達(dá)（RNAi）分析，檢測(cè)RNAi的干擾效率要用到實(shí)時(shí)熒光定量。（3）對(duì)功能基因相關(guān)基因表達(dá)模式分析。

作為一所

院校，擁有一臺(tái)性能良好的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，是學(xué)校發(fā)展和從業(yè)教師的需求?？尚行路治觯?/p>

（1）研究功能基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是必不可少的儀器設(shè)備；（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀操作簡(jiǎn)單，經(jīng)過簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可學(xué)會(huì)；（3）試劑耗材費(fèi)

（4）應(yīng)用廣泛

科研領(lǐng)域都在用 主要技術(shù)指標(biāo)：

熱循環(huán)系統(tǒng)

新型半導(dǎo)體

96/384孔

可升級(jí)選配低密度芯片 光學(xué)系統(tǒng)

氬離子激光器 全波長(zhǎng)光柵 冷CCD 掃描模式

全程掃描

軟件系統(tǒng)

Primer Express 3.0探針引物設(shè)計(jì)軟件 SDS 軟件 絕對(duì)定量 相對(duì)定量 等位基因分析 陰陽(yáng)性結(jié)果自動(dòng)判斷

反應(yīng)系統(tǒng)

最低可在35分鐘內(nèi)完成PCR實(shí)驗(yàn)

5ul反應(yīng)體積（選配低密度芯片可至1ul）

配套試劑盒

30萬基因表達(dá)試劑盒 200萬SNP試劑盒 可代客定做引物模板 專業(yè)轉(zhuǎn)基因 致病菌篩選試劑盒 主要性能：

全波長(zhǎng)光柵分光，添加新染料無需更換濾光片，同時(shí)檢測(cè)8種以上熒光染料，最大限度實(shí)現(xiàn)多重定量，SNP分析等應(yīng)用。

完備，多樣，專用的軟件，無需人工計(jì)算，完成定量實(shí)驗(yàn)

多組份熒光校正軟件，一體化硬件設(shè)計(jì)，輔助ROX熒光，保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和高分辨率（裝機(jī)指標(biāo)，5000和10000達(dá)到2倍的拷貝數(shù)）

齊備的試劑盒 幫助客戶完成高要求的實(shí)驗(yàn)

9、可為客戶提供安裝操作鑒定（IQ/OQ）驗(yàn)證文件服務(wù)，以符合GLP/GMP對(duì)生產(chǎn)設(shè)備的要求。

技術(shù)參數(shù)：

（1）色熒光，可用于多重PCR檢測(cè)（2）激發(fā)光源壽命

（3）檢測(cè)器：

成像系統(tǒng)，無時(shí)間差，保證結(jié)果的準(zhǔn)確（4）溫度控制系統(tǒng)：半導(dǎo)體控溫（5）溫度準(zhǔn)確性≤±0.05℃（6）溫度控制范圍：

（7）動(dòng)力學(xué)線性范圍：

個(gè)數(shù)量級(jí)，區(qū)分

拷貝兩倍差異濃度的樣本，其致信度高達(dá)多少99.7%（8）支持ROX或其它染料用做參比熒光，同時(shí)，軟件支持無參比染料設(shè)置（9）試劑開放，耗材開放，（10）儀器性能有原廠裝機(jī)試劑盒驗(yàn)證（11）靈敏度：

（12）激發(fā)/發(fā)射濾光片：是否支持客戶自行添加染料。（13）可檢測(cè)450～750nm連續(xù)波長(zhǎng)

（14）數(shù)據(jù)分析：可同時(shí)分析

色熒光PCR數(shù)據(jù)；有無絕對(duì)定量、相對(duì)定量功能；可否選擇多個(gè)看家基因進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；可否自動(dòng)根據(jù)擴(kuò)增效率對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步處理，得到更加準(zhǔn)確可靠的結(jié)果；軟件支持分析無限制數(shù)量的數(shù)據(jù)文件，增大反應(yīng)通量；具有等位基因、熔解曲線分析功能；軟件支持進(jìn)行加樣重復(fù)及生物學(xué)重復(fù)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)。

（15）配置專業(yè)引物探針設(shè)計(jì)軟件，用于基因引物探針設(shè)計(jì)，并且保證退火溫度一致性。

第四篇：熒光PCR檢測(cè)原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板濃度進(jìn)行定量分析。其特點(diǎn)有：

(1)用產(chǎn)生熒光信號(hào)的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測(cè)，避免終點(diǎn)定量的不準(zhǔn)確性，并且消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。

(2)熒光信號(hào)通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或熒光探針特異結(jié)合木得檢測(cè)物等方法獲得，打打提高了檢測(cè)的靈敏度、特異性和精確性。Real-time O-PCR可以應(yīng)用于mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性的測(cè)定、細(xì)胞因子的表達(dá)分析、腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長(zhǎng)。儀器可以自動(dòng)檢出，利用熒光信號(hào)積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，在PCR循環(huán)中，測(cè)量的信號(hào)將作為熒光閾值的坐標(biāo)。并且引入一個(gè)——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測(cè)到得熒光信號(hào)所需的最小循環(huán)數(shù)，是在PCR循環(huán)過程中熒光信號(hào)由本底開始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。熒光閾值相當(dāng)于基線熒光信號(hào)的平均信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般認(rèn)為在熒光閾值以上所測(cè)出的熒光信號(hào)是一個(gè)可信的信號(hào)，可以用于定義一個(gè)樣本的Ct值。通常用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算相對(duì)方程式。

方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析需要存在一個(gè)高相關(guān)系數(shù)（R2＞0.99），這樣才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)的過程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個(gè)方程式計(jì)算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中自動(dòng)地計(jì)算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用 1.基因工程研究領(lǐng)域

① 基因表達(dá)研究：對(duì)β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確，為了解β地中海貧血的分子病理機(jī)制及其臨床診斷提供了可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

② 轉(zhuǎn)基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)閾值，擴(kuò)增一個(gè)轉(zhuǎn)移后的基因和一個(gè)對(duì)照基因，以分析轉(zhuǎn)基因老鼠接合性。該方法為45個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的同型結(jié)合及異質(zhì)結(jié)合提供了明確的鑒定結(jié)果。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，同型結(jié)合的異質(zhì)接合動(dòng)物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律。這項(xiàng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中將有很大的用途。③ 單核苷酸多態(tài)性（SNP）及突變分析：實(shí)時(shí)熒光定量PCR一個(gè)誘人的應(yīng)用前景是用于檢測(cè)基于兩條探針和基因組的不穩(wěn)定性?；蛲蛔兓趦蓷l探針，一條探針橫跨突變點(diǎn)，另一條為錨定探針，與無突變位點(diǎn)的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對(duì)，如有突變，則探針與靶序列不完全配對(duì)，會(huì)降低雜交體得穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對(duì)突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。2.醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域

① 病原體檢測(cè)：由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可靠性和重復(fù)性好，并且操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果判斷客觀，目前，人們用此方法對(duì)人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結(jié)核桿菌、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測(cè)。熒光定量PCR問世后的幾年中，積累了大量有關(guān)病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后之間關(guān)系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。

② 藥物療效考核：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)臨床樣品中與抗藥性相關(guān)的基因的表達(dá)。結(jié)果證明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)是定量檢測(cè)抗藥基因表達(dá)的可靠方法，應(yīng)用這種技術(shù)可以預(yù)測(cè)化療將引起的反應(yīng)。

③ 腫瘤基因檢測(cè)：腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法都可以檢測(cè)出來。

目前用此方法進(jìn)行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤MDRI基因、白血病WTI基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測(cè)。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)。熒光定量PCR技術(shù)將會(huì)在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。3.其他領(lǐng)域

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)免疫組分進(jìn)行分析是其應(yīng)用的重要方面。

所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。檢測(cè)方法

1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖

PCR產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性）2.TaqMan探針法：

探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。服務(wù)流程

1.客戶認(rèn)真寫好訂單，提供待檢基因相關(guān)信息； 2.簽訂技術(shù)服務(wù)合同，支付預(yù)付款（30-50%)；

3.設(shè)計(jì)合成定量PCR引物（或客戶提供文獻(xiàn)引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反轉(zhuǎn)錄；

5.PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)，主要檢測(cè)引物的特異性和擴(kuò)增效率； 6.正式定量實(shí)驗(yàn)：對(duì)所有樣品上機(jī)檢測(cè)； 7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)分析，形成報(bào)告。收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)

優(yōu)惠包干價(jià)：120元/樣/基因（SYBRgreenI法，相對(duì)定量）

（含RNA提取，反轉(zhuǎn)錄，引物合成費(fèi)用，上機(jī)測(cè)試費(fèi)用（3個(gè)重復(fù)）；一個(gè)內(nèi)參免費(fèi)（內(nèi)參3個(gè)重復(fù)）Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

（如圖1所示）。

1.熒光閾值（threshold）的設(shè)定

PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺?。J(rèn)）設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15 2.Ct值與起始模板的關(guān)系

每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下。Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率，N為熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。

起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下： 1.TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺(tái)。

2.SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3.分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。1．傳統(tǒng)定量PCR方法簡(jiǎn)介

1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。2）競(jìng)爭(zhēng)法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。2．內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用

由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測(cè)，即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而PCR經(jīng)過對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．內(nèi)標(biāo)對(duì)定量PCR的影響

若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的： 1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。

由于qPCR是實(shí)時(shí)定量檢測(cè)致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨(dú)到優(yōu)勢(shì)。

第五篇：乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒(PCR熒光探針法)

乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒

樣本要求

1.適用標(biāo)本類型：血清或血漿 2.標(biāo)本采集

1）血清：用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入無菌的干燥玻璃管，室溫放置30—60min，血標(biāo)本可自發(fā)完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機(jī)，1500 rpm離心5分鐘，吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管

2）血漿：用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入含EDTA-2K或枸櫞酸鈉的玻璃管，立即顛倒玻璃管混合5—10次，使抗凝劑和靜脈血充分混勻，5—10分鐘后即可分離血漿，轉(zhuǎn)移至1.5 ml滅菌離心管

3.標(biāo)本保存與運(yùn)送：所采集的標(biāo)本可立即用于測(cè)試，也可以保存在—20℃待測(cè)，保存期為6個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送采用0℃冰壺。檢驗(yàn)方法

1.DNA提取（樣品制備區(qū)）

將待測(cè)樣本、陽(yáng)性定量參考品、陰性質(zhì)控品、HBV 強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、HBV臨界陽(yáng)性質(zhì)控品進(jìn)行同步處理。1）取200μl樣品，加入450μlDNA提取液I和4μl的內(nèi)標(biāo)溶液，用振蕩器劇烈混勻15秒，瞬時(shí)離心數(shù)秒。100℃恒溫處理10±1分鐘 2）12000rpm離心5分鐘，備用 2.PCR試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）直接使用HBV-PCR反應(yīng)管 3.加樣（樣品制備區(qū)）

往上述HBV反應(yīng)管中用帶濾芯吸嘴分別加入待測(cè)樣本、陰性質(zhì)控品、HBV 強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、HBV臨界陽(yáng)性質(zhì)控品和陽(yáng)性定量參考品的上清液各20μl。蓋緊管蓋，8000rpm離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。

4.PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)）5.結(jié)果分析

反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果，根據(jù)分析后的圖像調(diào)節(jié)baseline值得Start值、End值以及Threshold值，點(diǎn)擊Analysis自動(dòng)獲取分析結(jié)果，在Repoet界面查看結(jié)果，記錄未知樣本數(shù)值（C）6.質(zhì)量控制

(1)陰性質(zhì)控品：FAM通道無對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期或Ct值等于30，VIC檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線為明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期

(2)HBV陽(yáng)性質(zhì)控品：FAM通道有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期且Ct值小于30(3)HBV陽(yáng)性定量參考品：FAM通道有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，呈典型S形曲線。CT<29且R2>0.98 7.結(jié)果判斷（1）如果在FAM通道無明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期或Ct值等于30，在VIC檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，則判定樣本的HBV DNA濃度小于檢測(cè)靈敏度。（2）如果在FAM通道有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期或Ct值小于30 則1）若樣本的C<100，則樣本的HBV DNA濃度<100IU/ml 2）若樣本的100《C《5.00E+008，則樣本的HBV DNA濃度= C IU/ml 3）若樣本的C>5.00E+008，則樣本的HBV DNA濃度>5×10 ? IU/ml