第一篇：《動物細胞培養(yǎng)》教學反思

動物細胞培養(yǎng)教學反思

楊建波

賽課已經(jīng)結(jié)束，但我的表現(xiàn)并不好。首先，引入新課不夠精彩，沒有激發(fā)學生的求知欲。我覺得應該以演員SELINA演習時皮膚大面積燒傷,治療通常是取健康皮膚進行自體移植，但對于大面積燒傷病人來講，健康皮膚很有限，如何來治療該病人作為問題引起同學們討論，引出這節(jié)課的主要內(nèi)容——動物細胞培養(yǎng)。在此之前學生已經(jīng)學過了植物組織培養(yǎng)，因此我先回顧植物組織培養(yǎng)的原理并提出了一個問題：動物細胞培養(yǎng)能否像植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？引導同學們思考兩者之間的異同。在講述培養(yǎng)過程時，學生閱讀課本自主總結(jié)和借助課件展示過程，幫助學生理解培養(yǎng)的過程及把握注意事項。本堂課上完后，我發(fā)現(xiàn)了自己有不少缺點和不足，需要在以后的教學中加以改正：1．沒有充分發(fā)揮學生的主體地位。新課程的理念是要轉(zhuǎn)變教師和學生的角色，讓學生成為課堂的主導者，而本節(jié)課仍然以傳統(tǒng)的教學模式為主，仍然是教師為主體。在實際教學過程中，主觀的想引導學生探究問題，思考問題，得出結(jié)論，而事實上學生回答問題答不到點子上，我就匆匆的把答案公布了，沒有真正做好引導工作。2．沒有充分調(diào)動學生的積極性。課堂教學的氣氛對整堂課的教學質(zhì)量是至關(guān)重要的，縱觀整節(jié)課，學生對問題的思考、回答等積極性不高。3．時間安排不夠緊湊。導致最后講動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應用時時間緊，講得比較匆忙。當然本節(jié)課的成功之處是采用了多媒體教學，使課堂的知識容量比較大，對前面學過的內(nèi)容可以比較快的復習，真正做到溫故而知新。

第二篇：動物細胞培養(yǎng)總結(jié)! !!!

動物細胞培養(yǎng)總結(jié) 一．實驗準備

1.實驗器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包裝

離心管(1.5ml，2ml,15ml)若干，凍存管若干放進鋁飯盒，用牛皮紙包裹，系緊棉繩，用筆在飯盒上和牛皮紙上標記盒內(nèi)所裝物品名稱、數(shù)量、日期和所屬人名稱。

藍槍頭兩盒，黃槍頭白槍頭各一盒用牛皮紙包裹，用棉繩扎緊。取適量蒸餾水于4L玻璃瓶，瓶蓋擰松半圈。

過濾器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自來水毛刷洗滌劑刷洗，蒸餾水潤洗，烘干。

過濾器兩部分分別包裹，先將瓶口部位用錫紙包裹后，再罩以牛皮紙，再用棉布密包起來，用棉繩扎緊。

玻璃瓶擰下瓶蓋，瓶身浸酸。浸酸時應注意安全，須穿戴耐酸手套和白大褂，注意保護好面部和身體裸露部分，提前備好一盆水在旁以便浸酸結(jié)束后清洗耐酸手套，防止走動時酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意緩慢降低瓶身，使液體慢慢浸入瓶內(nèi)，以免產(chǎn)生氣泡濺出酸液，發(fā)生危險。浸酸時器皿要充滿酸液，勿留氣泡，浸泡過夜。取出瓶身時，須穿戴耐酸手套和白大褂，注意保護好面部和身體裸露部分，提前備好一盆水在旁，取出后將瓶身放入盆內(nèi)水中在轉(zhuǎn)移至水池邊清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。換水洗幾次，待水澄清后開始沖洗，每瓶都用自來水灌滿，倒掉，重復15次，再用蒸餾水漂洗5次，去離子水漂洗3次，烘干備用。（2）消毒滅菌

1>全自動高壓滅菌鍋：插電源，打開開關(guān)，檢查水位，若水位不足加蒸餾水補足，放入物品，瓶類物體須擰松蓋子后放最上面一筐，蓋上滅菌鍋蓋，擰緊蓋子至溫度顯示欄的左上角有一紅點亮燈，按start開始升溫。若滅有無菌水或玻璃瓶待降溫至常溫再打開，打開后立即擰緊，無菌水瓶口封上封口膜。若沒滅瓶類物品，降溫至80度左右即可打開滅菌鍋，須戴上線手套取出。

2>手提式高壓滅菌鍋：插電源，打開開關(guān)，檢查水位，若水位不足加蒸餾水補足，檢查設定是否為121度20分鐘，放入物品，蓋上滅菌鍋蓋，注意導氣管一定插到鍋底并不能堵塞，用手對稱地擰緊鍋蓋螺栓，再用扳手繼續(xù)擰緊。加溫升壓之前，先打開排氣閥門，加溫約半小時后見排氣閥處開始排殘留在鍋內(nèi)的冷空氣，排氣五分鐘，關(guān)閉排氣閥，繼而開始升壓。滅菌后不要立即打開氣閥放氣以免水汽噴出。待自然降溫至常壓才能打開氣閥。

玻璃瓶須擰緊，飯盒，槍頭滅菌后放入烘箱烘干備用。2.無菌間消毒及設備檢查

用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兌水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔細擦拭CO2培養(yǎng)箱，超凈臺，超凈臺內(nèi)物品，顯微鏡，桌面，若培養(yǎng)箱內(nèi)未培養(yǎng)細胞可以再打開高溫滅菌模式將培養(yǎng)箱滅菌一次。

用蒸餾水擦拭清洗水浴鍋內(nèi)壁，注意底座不要沾水。檢查CO2總壓力表，若讀數(shù)不足四分之一提前預定CO2瓶，換瓶時需要扳手。CO2培養(yǎng)箱最下層的增濕盤須定期觀察加水，將增濕盤內(nèi)注入1/2無菌蒸餾水，并將盤直接放置在培養(yǎng)箱中央。啟動培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱接通電源，增濕盤加水，連接好氣體供給，檢查有無漏氣，輸入系統(tǒng)設置。設置溫度和二氧化碳。

紫外照射無菌間30分鐘，注意屋內(nèi)不要有人以及培養(yǎng)基等試劑。3.細胞培養(yǎng)用液的配置及分裝

RPM1640培養(yǎng)基配制：將干粉型RPM1640培養(yǎng)基溶于總量1/3的去離子水中，再用1/3水沖洗包裝內(nèi)2次，倒入培養(yǎng)基中，以保證所有干粉都溶解成培養(yǎng)液，根據(jù)產(chǎn)品說明的要求和實驗補加谷氨酰胺和NaHCO3 ,傾斜三角瓶輕輕放入轉(zhuǎn)子，用磁力攪拌器攪拌2h。用泵使培養(yǎng)基在超凈臺內(nèi)通過滅菌的過濾器，過濾除菌，分裝后置4度冰箱保存?zhèn)溆?。使用前調(diào)pH至7.0，加雙抗于培養(yǎng)液中濃度為1%，使用時加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的處理：使用前應做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補體，將胎牛血清放入56度水浴中30分鐘，其間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。分裝前提前2天放4度冰箱解凍，溶解完全后于超凈臺內(nèi)分裝為25ml每管，留2管放四度備用，余下放-20度凍存。配制含血清培養(yǎng)基或凍存液前務必提前一天取出分裝后的血清四度溶解備用，血清融化很慢。

5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸餾水，NaHCO3溶于水后，過濾除菌。0.25%胰蛋白酶液200ml在超凈臺內(nèi)分裝成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度備用。

雙抗溶液配制：80萬單位青霉素加4ml滅菌D-Hanks液，即成20萬單位/ml溶液。100萬單位鏈霉素加5ml滅菌的D-Hanks液，即成20萬單位/ml溶液。兩溶液各取0.5ml混合，加入9mlD-Hanks液，則成含青鏈霉素各1萬單位/ml，分裝后置于4度冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

二．操作步驟 注意事項：

1、所有實驗用的器械，儀器滅菌，消毒，烘干。

2、打開溶劑，培養(yǎng)瓶瓶蓋時，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下。

3、用完溶劑，培養(yǎng)瓶時，瓶口及瓶蓋也要在酒精燈上烤一下。

4、所有物品放入超凈臺需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗內(nèi)時需要重新用酒精棉擦拭。開始工作：

1、實驗前換紫外照過的白大褂和拖鞋。

2、戴橡膠手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下臺面，點燃酒精燈。

3、取待用的細胞，旋緊瓶蓋。

4、胰酶消化緩慢時可以將細胞置于5%CO2、37度培養(yǎng)箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促進消化。1.細胞復蘇

提前預冷離心機，設參數(shù)為4度，1000r/min,5min。

將槍頭，裝有離心管的飯盒，垃圾盒放入超凈臺，酒精棉擦一遍超凈臺臺面和移液器尤其槍口，以防別人用槍時不慎沾染臟污堵塞槍口。超凈臺和房間照15分鐘紫外，照紫外的同時取出無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基37度水浴加熱。

關(guān)閉紫外，打開風機，升高窗高，點燃酒精燈，用鑷子從飯盒中取2個15ml離心管放至試管架，每管加入3ml無血清培養(yǎng)基，提前剪好2條封離心管的封口膜備用。

戴上橡膠手套再套上線手套，用鑷子從液氮中取出塑料凍存管，用手拿凍存管迅速浸入37度水浴中，劇烈急速搖晃凍存管，因為有防水膠布纏裹不用擔心進水染菌，使其急速融化，注意管內(nèi)凍存細胞的融化情況。基本轉(zhuǎn)為液態(tài)時將凍存管取出，摘下線手套，凍存管轉(zhuǎn)移至超凈臺內(nèi)，用酒精擦手，擦拭凍存管尤其管口，撕下膠布和封口膜，再擦拭管口，整個溶解過程盡量在30s至1min內(nèi)完成。(注意：這一步對細胞存活率至關(guān)重要。既要盡快融化以減少融化過程對細胞的損害，又要盡可能減少細胞在較高溫度停留的時間以減少DMSO對細胞的毒害，切不可將凍存管放在燒杯內(nèi)不管。)打開凍存管管蓋，逐滴加入1ml無血清培養(yǎng)基，輕柔地將凍存管內(nèi)的細胞懸液吸取出來，轉(zhuǎn)移至已備好的離心管內(nèi)，輕輕搖混勻，蓋上管蓋，輕輕地上下顛倒混勻。封上封口膜。

低俗離心1000r/min,5min。小心地吸出上清液，要求上清液盡可能吸走，同時又不觸及管底沉淀的細胞。（較高要求時可以用手指輕彈離心管管底，將細胞團分散，加入10ml無血清培養(yǎng)基混勻離心10min棄上清再洗一次，有助于減少DMSO殘留。）加3至5ml培養(yǎng)液至沉淀的細胞，輕輕搖晃使分散成細胞懸液，將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，擰緊蓋子，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中再反旋擰松半圈，以利于瓶口內(nèi)外進行氣體交換，注意取出培養(yǎng)瓶時須先擰緊瓶口。37度恒溫箱中培養(yǎng)。第二天觀察細胞生長情況。培養(yǎng)基瓶蓋過火，擰緊后封上封口膜。收好物品，擦一遍臺子，滅酒精燈。2傳代培養(yǎng)

附著型胞(adherentcell)傳代培養(yǎng)

離心法提前預冷離心機，設置好參數(shù)4度，1000r/min,5min。倒液法不需要。

將滅菌槍頭，裝有離心管的飯盒，新培養(yǎng)皿/瓶,垃圾盒放入超凈臺，酒精棉擦一遍超凈臺臺面和移液器尤其槍口，以防別人用槍時不慎沾染臟污堵塞槍口。超凈臺和房間照15分鐘紫外，照紫外的同時從冰箱取出PBS,胰酶，含血清培養(yǎng)基于37度水浴加熱。關(guān)閉紫外，打開風機和照明，升高窗高，點燃酒精燈，將所需試劑先擦瓶底，放在臺子上再擦側(cè)壁一圈，擦瓶口瓶蓋，撕下封口膜，再仔細擦一遍瓶口。用噴過酒精的塑料筐將細胞培養(yǎng)瓶擰緊蓋子拿到超凈臺旁的椅子上放平放穩(wěn)，每三瓶/皿一摞拿入超凈臺先擦最下面一個的底部，擦好后放在臺面上，擦一摞的側(cè)面一圈，在分別擦底面頂面瓶口，直到所有培養(yǎng)瓶各個面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker標記字跡的部位，酒精會擦掉字跡，若擦到字跡待酒精干后立即補寫上以防事后記不清。

輕輕倒掉舊培養(yǎng)液，注意不要使液體倒流回來沖擊細胞，掛在外壁的殘留液滴用酒精棉擦掉,培養(yǎng)瓶可以輕輕翻轉(zhuǎn)瓶子使細胞生長的面在上，頂面在下，液體留至頂面后直接倒掉液體。加1ml PBS，注意槍沖著不長細胞的培養(yǎng)皿側(cè)壁或翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶朝瓶的頂壁或側(cè)壁打入PBS，盡量不碰到瓶口或培養(yǎng)皿，若懷疑碰壁，棄掉槍頭。輕輕搖晃培養(yǎng)皿或瓶，使PBS沾到所有細胞，洗滌細胞一遍，輕輕倒掉PBS。

加入0.25%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀釋（0.25%為1X胰酶），37℃作用數(shù)分鐘。等待消化期間準備好新的培養(yǎng)皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培養(yǎng)基。消化中的皿蓋好蓋子或瓶擰緊蓋子，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀，有10%細胞漂動時，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鮮培養(yǎng)基終止胰酶作用。(若細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀且80%細胞漂動，則不移去胰酶，在胰酶作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止胰酶作用，吹打成細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，封上封口膜，離心后再吸掉上清液。）

輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，以吸管上下輕輕吸放數(shù)次以打散細胞團塊，注意吹打時有系統(tǒng)性的將所有面積都打到不要集中只吹打一處而一些地方?jīng)]吹打到，吸和吹時槍頭都不要離開液面以減少氣泡，氣泡多破裂時對細胞有沖擊且會增加體積不利于操作，培養(yǎng)瓶吹打時操作角度小不方便，用倒液法（10%細胞漂動即倒掉胰酶加含血清培養(yǎng)基終止消化）時吹打細胞要用二檔多吹打幾次，用皿或離心法（80%細胞飄動不棄胰酶直接加含血清培養(yǎng)基再離心棄上清）時細胞很容易脫落，可以用一檔輕輕吹打，保證所有面積都吹打到即可?；旌途鶆蚝?，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，擰緊瓶蓋，鏡下觀察細胞數(shù)量多，培養(yǎng)液澄清，若細胞密度過低將影響生長可適當補充細胞懸液，若細胞密度過大將影響迅速生長一天后即需傳代，可根據(jù)實驗適當添加培養(yǎng)基或細胞懸液使生長速度符合預期，轉(zhuǎn)移至CO2培養(yǎng)箱，擰松半圈瓶蓋，37度培養(yǎng)。試劑瓶瓶蓋過火，擰緊后封上封口膜。密封收好物品。擦一遍臺子，滅酒精燈。

3細胞換液

取待用的細胞，旋緊瓶蓋。

棄去舊的培養(yǎng)液，把培養(yǎng)瓶放回原處。

用微量槍加入適量的PBS緩沖液，緩慢蕩洗一下細胞，然后將PBS緩沖液棄掉。

用微量槍加入適量的細胞培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中。旋緊瓶蓋。將細胞置于5%CO2、37度培養(yǎng)箱，反旋擰松瓶蓋半圈，培養(yǎng)。

4細胞凍存 1>準備工作：

提前一天將血清FBS從-20度取出放在4度冰箱解凍。選取對生增生期細胞（鏡下密密麻麻，胞體突觸明顯），在收集細胞24h前換液一次。

進入細胞室前，首先用75%酒精擦試工作臺，接著紫外滅菌30，過后，關(guān)閉紫外燈，通風10min。從冰箱中取出胰酶、PBS緩沖液、培養(yǎng)基，血清37度水浴。取出室溫放置的DMSO。找到防水的醫(yī)用膠布，濾菌膜，針管和所需槍頭飯盒等物品，噴一遍酒精，放入臺子照紫外。2>開始工作：

實驗前在更衣間換上紫外照過的白大褂和拖鞋。戴上橡膠手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下臺面，點燃酒精燈。酒精擦拭胰酶、PBS緩沖液、培養(yǎng)基放入超凈臺。過火鑷子取出離心管于試管架，剪好封口膜備用。用濾菌膜和針管過濾DMSO以除菌。

75%無血清培養(yǎng)基，20%的血清，5%過濾除菌的DMSO，混勻配制成所需的凍存液。

取待用的細胞，旋緊瓶蓋。

棄去舊的培養(yǎng)液，掛壁殘液注意用酒精棉擦去，用微量槍朝不長細胞的側(cè)壁或頂部打槍，加入適量的PBS緩沖液，緩慢蕩洗一下細胞，然后將PBS緩沖液棄掉。用微量槍朝不長細胞的側(cè)壁或頂部打槍，加入適量胰酶約2ml，棄掉槍頭。消化數(shù)分鐘，等待期間，用過火鑷子從飯盒中取出凍存管和管蓋標記好細胞名稱和凍存日期，直立于臺面?zhèn)溆谩?/p>

用微量槍加入適量的完全培養(yǎng)液沖洗（吹散細胞）細胞，將瓶底粘著的細胞吹散下來，再將細胞懸液移入的離心管中，封口，標簽。離心5min，1000轉(zhuǎn)/min。

細胞離心畢，拆封，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下，棄去上清液。用微量槍將凍存液平均加入離心管中，混勻離心管中細胞凍存液。用微量槍將含細胞的凍存液移入凍存管中，封口膜封口，防水醫(yī)用膠布再纏一圈，標簽時間，細胞名稱。

凍存，需緩慢凍存，先放置4度冰箱20min，然后放置-20度冰箱30min，再置于-80度冰箱過夜，最后置于液氮灌-196度中保存。5 鋪板和細胞計數(shù)

用傳代方法制成細胞懸液。倒掉培養(yǎng)基，用PBS液洗滌后，0.25%的胰蛋白酶液消化，加入培養(yǎng)液吹打制成待測細胞懸液轉(zhuǎn)至離心管，封上封口膜，離心1000r/min,5min。

等待離心其間，取細胞計數(shù)板，蓋玻片酒精擦拭，均在酒精燈上烤一下，將蓋玻片蓋在細胞計數(shù)槽上，使覆蓋細胞計數(shù)板上的上下兩個“十字”區(qū)域。取一只新的15ml離心管，做好標記，擺放好。離心畢，拆封，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下，棄去上清液，加入全培養(yǎng)液吹散沉淀細胞成細胞懸液，擰緊管蓋，上下顛倒混勻。用槍吹打混勻離心管中含完全培養(yǎng)液的細胞，再從離心管中取1ml細胞懸液移入新的15ml離心管，加入4ml完全培養(yǎng)液，即稀釋五倍，吹打混勻細胞懸液，上下顛倒混勻細胞懸液。

上下顛倒混勻新15ml離心管內(nèi)細胞懸液，計數(shù)前將待測液吹打均勻，用微量槍從新15ml離心管中取出細胞懸液（約10μl），滴入計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)縫隙旁，虹吸作用液體會吸入蓋玻片下（不能有氣泡，不然會影響細胞計數(shù)，注意滴入懸液量不能太大致使細胞懸液流入旁邊的槽中），鏡下觀察細胞，數(shù)出計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)（16個小格×4個大格），用計數(shù)器計數(shù)（約200個）

細胞數(shù) 萬個/mL原液=（4大方格細胞數(shù)之和/4）×稀釋倍數(shù)（常稀釋5倍，若細胞過多不能數(shù)清則加大稀釋倍數(shù)，不斷調(diào)整新離心管中細胞懸液的細胞濃度，直至鏡下觀察細胞數(shù)目符合要求。）每皿/瓶需鋪板50-100萬個細胞，根據(jù)細胞計數(shù)算出每皿所細胞懸液需毫升數(shù)，加入懸液時注意混勻，不得有氣泡，吸時注意每次槍尖是否都吸滿液體。每皿加入細胞懸液后，用含血清培養(yǎng)基補足至2ml/皿/瓶。24h后觀察細胞長至八成滿時即可加藥處理。

6檢驗判斷細胞狀態(tài)與加藥處理

細胞復蘇或傳代后24內(nèi)不可傳代，傳代4小時后開始貼壁。1>培養(yǎng)基顏色澄清度：

正常生長的細胞培養(yǎng)基澄清透明，傾斜使培養(yǎng)基聚集，對著燈看可透光，若出現(xiàn)絲狀沉淀或傾斜培養(yǎng)基對著燈看出現(xiàn)渾濁不透光且鏡下細胞之外的部分有密密麻麻的小黑點，很可能是染菌，應棄掉。若鏡檢在細胞之外部分有一些渾濁，可能因為細胞代謝旺盛分泌物堆積，或者因為消化時間不夠以至于過度強硬吹打細胞，造成細胞損傷產(chǎn)生大量細胞碎片，應換液。

新鮮培養(yǎng)基呈粉紅色，代謝代謝旺盛的細胞的培養(yǎng)基會變黃，此時若細胞貼壁應換液，若此時細胞已長滿，應傳代。2>密度：

細胞密度過低，鏡下觀察稀稀疏疏，則生長緩慢，甚至死亡。較大的細胞密度可促進細胞之間相互作用，促進細胞增殖生長。密度過大，密密麻麻，部分細胞不能伸展成圓形，必須傳代，此時不傳代，一兩天后細胞狀態(tài)持續(xù)不好，開始死亡，鏡檢漂浮細胞增多。3>狀態(tài)：

鏡下觀察細胞，當左右上下移動鏡頭時漂動的是未貼壁細胞或死細胞，固定不動的是貼壁細胞，貼壁細胞是活細胞。

狀態(tài)良好的貼壁SY5Y細胞有圓形的胞體和細細分支的突觸，突觸分明。狀態(tài)不好的SY5Y細胞，突觸不明顯，看不到什么細細的分支，甚至成圓形。

消化時快離壁的細胞呈亮亮的圓形。

加藥前應提前計算好藥品濃度體積，根據(jù)實驗處理要求的濃度換算出每皿應加藥品稀釋液體積和無血清培養(yǎng)基體積，列成表格以備加藥時明確操作。將藥品儲備液稀釋成稀釋液，再與相應體積的無血清培養(yǎng)基在離心管中混合好。加COS時，倒掉含血清培養(yǎng)基，PBS蕩洗一遍，加以混合好的藥品。加COS 3小時后加Ab，Ab須提前37度水浴5小時，加藥時采用半數(shù)放液法，棄去1ml原培養(yǎng)基，加入1ml已混合好的藥品。

第三篇：2.2. 動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)教學設計

專題二 細胞工程

3.2.2.1動物細胞培養(yǎng)與核移植技術(shù)

【內(nèi)容與解析】

內(nèi)容: 本節(jié)課要學的內(nèi)容動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)指的是動物細胞培養(yǎng)的原理過程條件和體細胞核移植克隆動物的過程，其核心是動物細胞培養(yǎng)過程和核移植技術(shù)克隆動物的過程理解它關(guān)鍵就是要從大膽的想法到理論的可行再到實踐的過程。解析:學生已經(jīng)學過植物組織培養(yǎng)技術(shù)，本節(jié)課的內(nèi)容動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)就是在此基礎上的發(fā)展。是本專題的重要內(nèi)容。教學的重點是動物細胞培養(yǎng)過程和核移植技術(shù)克隆動物的過程，解決重點的關(guān)鍵是從理論的分析遷移到具體的實施過程。【教學目標與解析】 1．教學目標

（1）簡述動物細胞培養(yǎng)的過程和條件。

（2）簡述通過動物體細胞核移植技術(shù)克隆動物的過程和前景。2．目標解析（1）簡述動物細胞培養(yǎng)的過程和條件及簡述通過動物體細胞核移植技術(shù)克隆動物的過程和前景就是指了解兩個過程的基礎上通過理解來記住相應技術(shù)的條件或前景?！締栴}診斷分析】

在本節(jié)課的教學中，學生可能遇到的問題是無法分析出動物細胞培養(yǎng)的條件，產(chǎn)生這一問題的原因是前面所學內(nèi)環(huán)境的知識不能很好的遷移和運用。要解決這一問題，就要通過復習回顧內(nèi)環(huán)境的相關(guān)成分和穩(wěn)態(tài)的意義，其中關(guān)鍵是對內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)意義的理解?！窘虒W支持條件分析】

在本節(jié)課的兩個過程的教學中，準備使用幻燈片，有利于更形象的以圖文并茂形式板書出來。

【教學過程】

問題1：動物細胞工程的常用技術(shù)手段有哪些？最基礎的技術(shù)手段是什么？

設計意圖：（1）、對預習的檢測并引入新課.師生活動：（1）什么是動物細胞培養(yǎng)?(2)什么是細胞貼壁？什么是接觸抑制？(3)如何打破接觸抑制？

(4)細胞傳代培養(yǎng)代數(shù)有什么特點？動物細胞培養(yǎng)技術(shù)能應用于那些方面?(5)動物細胞培養(yǎng)需要什么條件?(6)如何保證無菌、無毒環(huán)境？

[例題]1.為了使用于培養(yǎng)的動物組織細胞分散開以便配制成一定濃度的細胞懸浮液，選取來的動物組織應選用下列哪種物質(zhì)處理

A.胃蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.鹽酸

D.胰脂肪酶

[例題]2.下列屬于動物細胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)主要區(qū)別的是

A.培養(yǎng)基成分不同

B.動物細胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進行 C.動物細胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細胞不能

D.動物細胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細胞只能培養(yǎng)成植株

專題二 細胞工程

問題2：克隆動物采用的是什么技術(shù)? 為什么不能直接利用動物細胞培育動物體？

設計意圖：（1）、讓學生理解為什么要進行動物核移植.師生活動：（1）什么是動物體細胞核移植技術(shù)?(2)受體細胞為什么選用卵母細胞？？(3)細胞核移植技術(shù)的意義是什么？(4)體細胞核移植技術(shù)存在的問題？(5)體細胞核移植技術(shù)有那些應用?

[例題]3.在克隆多利羊的過程中，下列哪項技術(shù)沒有運用到

A.細胞培養(yǎng)技術(shù) B.細胞核移植 C.胚胎移植技術(shù) D.基因工程技術(shù)

【課堂小結(jié)】

動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù) 1）動物細胞培養(yǎng):

1、概念：

2、過程：

3、條件：

2）動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物

1、概念：

2、過程：

3、細胞核移植技術(shù)的應用前景：

4、體細胞核移植技術(shù)存在的問題： 【目標檢測】

1．下列與動物細胞培養(yǎng)有關(guān)的表述中，不正確的是

（）

A．培養(yǎng)液通常含有葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清

B．原代培養(yǎng)的細胞一般傳至10代左右便會出現(xiàn)生長停滯

C．動物細胞培養(yǎng)一般能夠傳到40～50代，但其遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變

D．動物細胞培養(yǎng)可用于檢測有毒物質(zhì)和獲得大量自身健康細胞

2．一只羊的卵細胞核被另一只羊的體細胞核置換后，這個卵細胞經(jīng)過多次分裂，再植入第三只羊的子宮內(nèi)發(fā)育，結(jié)果產(chǎn)下一只羊羔。這種克隆技術(shù)具有多種用途，但是不能

（）

A．有選擇地繁殖某一性別的家畜

B．繁殖家畜中的優(yōu)秀個體

C．用于保存物種

D．改變動物的基因型 3．下列哪—項屬于克隆

（）

A．將雞的某個DNA片段整合到小鼠的DNA分子中

B．將抗藥菌的某基因引入草履蟲的細胞內(nèi)

C．將鼠骨髓瘤細胞與經(jīng)過免疫的脾細胞融合成雜交瘤細胞

D．將某腫瘤細胞在體外培養(yǎng)繁殖成一個細胞系 4．下列屬于組織培養(yǎng)但不是克隆的是

（）

A．將花粉離體培養(yǎng)成單倍體植株

B．芽發(fā)育成枝條

C．根尖分生區(qū)發(fā)育成成熟區(qū)

D．上皮細胞無性繁殖產(chǎn)生的細胞群 5．動物細胞培養(yǎng)液和植物組織培養(yǎng)液的共有成分是

（）

A．葡萄糖

B．蔗糖

C．動物血清

D．維生素

6．單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和B淋巴細胞誘導融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞。

專題二 細胞工程

在這種培養(yǎng)基上不能存活、增殖的細胞是

（）

①B淋巴細胞②小鼠骨髓瘤細胞③B淋巴細胞自身融合細胞④小鼠骨髓瘤細胞自身融合細胞⑤雜交瘤細胞

A．①②③④

B．①③⑤

C．②④

D．①③ 7．動物細胞培養(yǎng)的細胞來自于

（）

A．任何個體的細胞

B．只能取自動物胚胎細胞 C．只能取自幼齡動物的組織細胞

D．胚胎或幼齡動物的器官和組織細胞 8．動物細胞工程常用的技術(shù)手段中，最基礎的是

（）

A.動物細胞培養(yǎng) B．動物細胞融合 C．單克隆杭體 D．胚胎、核移植 9．細胞株的特點是

（）

A．遺傳物質(zhì)沒有改變，可以無限傳代

B．遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，不可無限傳代

C．遺傳物質(zhì)沒有改變，不可無限傳代

D．遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，且有癌變特點，可以無限傳代 10．關(guān)于雜交瘤細胞的不正確敘述是

（）

A．有雙親細胞的遺傳物質(zhì)

B．不能無限增殖

C.可分泌特異性抗體

D．體外培養(yǎng)條件下可大量增殖 11.動物細胞融合技術(shù)最重要的用途是

（）

A.克服遠源雜交不親和 B.制各單克隆抗體C.培育新品種

D.生產(chǎn)雜種細胞 12.“生物導彈”是指

（）

A.單克隆抗體

B.雜交瘤細胞

C.產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞

D.在單抗上連接抗癌藥物

13.在動物細胞培養(yǎng)中有部分細胞可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去，這種傳代細胞稱之為: A．原代培養(yǎng)

B．傳代培養(yǎng)

C．細胞株

D．細胞系

二、非選擇題

1.美國科學家斯提瓦用胡蘿卜根的懸浮培養(yǎng)細胞進行人工培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)單個細胞能像受精卵發(fā)育成胚一樣的途徑，發(fā)育成完整植株。1997年英國維爾穆特等人從白面母綿羊體內(nèi)取出乳腺上皮細胞靜息培養(yǎng)，然后把它的核移入黑面母綿羊去核的卵細胞中形成重組細胞，并將重組細胞培養(yǎng)成胚胎，將胚胎植入另一母羊的子宮內(nèi)后獲得了克隆羊多利。

閱讀這段材料后，回答下列問題：

（1）文中的懸浮培養(yǎng)細胞和乳腺上皮細胞均為____________。

（2）斯提瓦的實驗證明了____________。維爾穆特的實驗證明了_____________。從細胞結(jié)構(gòu)和遺傳角度分析，兩位科學家實驗結(jié)論的得出，根本原因在于____________。（3）斯提瓦和維爾穆特實驗的差別在于____________。（4）維爾穆特的實驗技術(shù)又稱為_____________________技術(shù)。該技術(shù)的經(jīng)濟意義在于：①_____________；②____________。

第四篇：第八章 動物細胞培養(yǎng)和生長過程

第八章

動物細胞生產(chǎn)和培養(yǎng)過程

8.1背景

盡管先前有許多調(diào)查者研究了動物細胞在試管中的習性。但是。1949年，這種能產(chǎn)生有用物質(zhì)的動物細胞首次被利用。在當時，J.F Enders 證明了脊髓灰質(zhì)炎病毒在培養(yǎng)的動物細胞中可以生長，而這種細胞源于靈長類動物的神經(jīng)和非神經(jīng)組織中。

簡潔的總接一下這一偉大的探索工作，開始與19世紀80年代早期。根據(jù)論證白細胞能在軀體外分裂。這種細胞是通過觀察注入在血清、淋巴或腹水中以切成片狀的動物組織所得。（1907年）Ｒ．Hａｒｒｉｓｏｎ的懸在下面的淋巴當中的（蝌蚪骨髓）組織方法。而這種蓋玻片密封在一個中間挖空的載玻片上。這項偉績（１９１３年）由Ｃａｒｒｅｌ所繼承和發(fā)展。他研發(fā)了一種維持外來物質(zhì)特別是細菌培養(yǎng)的復雜方法，其他人很少有這種能力，然而，截至１９２８年，培養(yǎng)基的發(fā)展促進動物細胞的增長以至于Ｍａｉｔｌａｎｄｓ能夠在裝有切碎的老鼠或小雞胚胎的試管中培養(yǎng)病毒。ｅｎｄｅｒｓ在脊髓灰質(zhì)炎的工作中運用此方法。脊髓灰質(zhì)炎的作用是有他和他的同事通過使用抗生素獲得相當多的幫助，這些抗生素在十年前是非常流行的，２０世紀５０年代早期Salk發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎疫苗是由猴子的腎和睪丸細胞在試管培養(yǎng)中生產(chǎn)的。一旦這種技術(shù)被確立，培養(yǎng)中生長的小雞或其他原始的胚胎細胞生產(chǎn)其他疫苗?！韭檎畈《荆ǎ保梗担改辏?。流行性腮腺炎病毒（１９５１年）、腺病毒（１９５８年）】

８．２從動物細胞培養(yǎng)中獲得的不同產(chǎn)物

動物細胞過去是現(xiàn)在仍然是從培養(yǎng)動物細胞中獲得最具有商業(yè)性的產(chǎn)物，目前，每年生產(chǎn)大約１．５＊１０９劑量的口啼疾疫苗，近似于紐卡斯爾病和馬立克氏病的家禽疫苗。人類病毒疫苗以每年１０８劑或者較低一點的速度在運用。干擾素生產(chǎn)的過程也是一大規(guī)模，接近或超過這些運用于獸醫(yī)疫苗的情況下，然而有利于具體的合成雜交瘤細胞相對于免疫學方面是毫無疑問的，在未來的十年里是舉足輕重的。表８。１中列出已經(jīng)或者可能在培養(yǎng)動物細胞過程中獲得的主要產(chǎn)物，這并不是唯一的產(chǎn)物，而是表現(xiàn)著主要產(chǎn)物以及能在這些區(qū)域內(nèi)獲得的物質(zhì)的類型。

８．３產(chǎn)物生產(chǎn)方法的綜述

圖８。１到８。３概括的描述了對于動物細胞培養(yǎng)體系中產(chǎn)物的發(fā)展。它包括三個階段，第一個階段是準備階段，第二階段是動物細胞培養(yǎng)階段，第三階段是產(chǎn)物的產(chǎn)生階段。早某種體系上（荷爾蒙和免疫生物產(chǎn)物）最后一階段是區(qū)別于單元細胞的生產(chǎn)方式。然而在其它方面，最后一階段跟病毒細胞培養(yǎng)的傳染有關(guān)或與誘生劑有關(guān)。（如干擾素，見表８。３）

對生產(chǎn)經(jīng)營的很多努力涉及到質(zhì)量控制系統(tǒng)，與此同時，在線和離線檢測在生物技術(shù)領域中隨處可見。質(zhì)量控制測試的設計不僅能夠確保使用的物質(zhì)能夠促進細胞或產(chǎn)物的發(fā)展，還能確保他們擺脫外來的生體，例如，污染物

圖表８。２清楚的表明生長培養(yǎng)基的準備工作是一項艱難而又需要專門的技術(shù)的過程，當培養(yǎng)基所確定的組份容易控制時，最有困難的兩種組份是水和血清。

水可以從多種資源中獲得，甚至蒸餾和去離子作用后，水也可能包含著對細胞生長不利的物質(zhì)。對此，格陵蘭冰島底部所融化的病是一種很有用的參考物質(zhì)，貯備水的缺乏帶來一些困難。細菌能在室溫蒸餾水中達到１０５單元的含量，同時遠離組成的變量，這種細菌的產(chǎn)物少部分可能是有毒的，在８０C貯藏的水通常被攻克，在這個溫度下表面將無菌。

也可以制備沒有血清的培養(yǎng)基，但并非所有的細胞可以再生。然而這種細胞培養(yǎng)基的結(jié)合對密封材料的產(chǎn)生沒有多大用處。

以去除免疫球蛋白成分的血清在病毒生產(chǎn)體系方面最有用這種病毒生產(chǎn)體系是通過當?shù)厣a(chǎn)的血清包含的對生產(chǎn)病毒的抗體的一種體系，雖然買的和做實驗的血清的價格不菲，但是室內(nèi)生產(chǎn)是有可能的，血清質(zhì)量的控制的徹底性對可靠的重復運轉(zhuǎn)是很有必要的。在零下２０C貯存預先測試的血清是經(jīng)?？扇〉?，因為他能夠代替新鮮血清質(zhì)量減退的這些時光，（通常夏天較容易）。牛胎血清經(jīng)常被應用于細胞生長發(fā)面，但是牛胎血清既貴又罕見。帶有噬菌體支原體這樣的物質(zhì)也是最可靠的。也能成批成批的管擦牛胎血清的生長特性，由于來自幼地鼠地腎的細胞，９０％利潤從成年牛的血清也可以得到。動物細胞能生長在兩種不同類型的培養(yǎng)基上，如果多數(shù)動物細胞首次被運用到表層或者固體基質(zhì)。那么他們可以被誘導分裂，正好相反，一些可能在懸浮液中被誘導自由生長，前者被稱為單層細胞，應為他們在基質(zhì)上形成一層厚壁細胞，即使在連續(xù)培養(yǎng)的添加組織也能形成，依賴基質(zhì)生長的細胞被稱為是懸浮細胞或非貼壁依賴性細胞。

我們認為只是生長的單層細胞比懸浮細胞有特別少的致癌基因（能使細胞致癌的基因序列），因此對于人類的消耗，這種細胞被用于生產(chǎn)物質(zhì)，多種也證明此種 細胞比在懸浮液中的生長的細胞有能力生成更多的病毒毒性。但是如病毒或是產(chǎn)物從懸浮生長的細胞生產(chǎn)制造，那么多數(shù)過程會相對容易些，獸醫(yī)所使用的產(chǎn)物按這種方法所得（腳嘴病毒），同時也包括a-干擾素以及有關(guān)雜交瘤細胞的免疫學生物特性。盡管在選擇測試體系方面，后兩種產(chǎn)物所使用的細胞被證明是可以致癌的，但是在生產(chǎn)階段不會有什么危害，或者是優(yōu)先使用單位細胞的產(chǎn)物。在表8.2中，有一個對于單層細胞使用有利和不利條件的總結(jié)。我們可以得出結(jié)論，在細胞類型方面能夠生產(chǎn)商業(yè)性細胞是很有必要的。并且也需要兩種必要的但不同的技術(shù)，下面將陳述兩種不同的技術(shù)。

8.4單層細胞培養(yǎng)系統(tǒng)

獲取基質(zhì)的生產(chǎn)細胞系統(tǒng)可以被劃分為兩種類型，一種是增加設備單元的數(shù)量以擴大進程；另一種是多重和過程。通過增加設備的尺寸來實現(xiàn)擴大

8.4.1單層細胞生長的多重過程

傳統(tǒng)的來講，固定的玻璃瓶或者是培養(yǎng)皿內(nèi)已經(jīng)生成了單層細胞，這種瓶子有許多結(jié)構(gòu)，被命名為brockway，roux ,Carrel,Baxter或Medical Flats，鈉玻璃可能被使用，但是硼硅酸鹽會更受歡迎，因為他盡管越復雜，但越堅硬越容易修理。那玻璃瓶也許會單獨使用，但是經(jīng)常固定在擱架上便于運輸。能夠使細胞生長在瓶的內(nèi)表面而不是瓶底的系統(tǒng)，它的發(fā)展同樣是滾瓶系統(tǒng)的發(fā)展。盡管所使用的矩形瓶和十字型瓶也能夠轉(zhuǎn)動，但是對于這個系統(tǒng)，圓柱型瓶被廣泛使用，有許多瓶子能夠達到180cm長，滾筒上邊放著瓶子，而這樣的滾筒放在機械支架上。一套標準的設備可以轉(zhuǎn)動12個瓶子，6~10套支架可以組成一個生產(chǎn)單元，在意大利布雷西亞的Zooprofilattico Sperimentale大學學院有7000個瓶子在每四個培養(yǎng)箱里可同時轉(zhuǎn)動。再次，滾動瓶系統(tǒng)被發(fā)展到了極限，對于已大量瓶子為媒介的細胞和病毒的生長同時還要保持無菌培養(yǎng)，所以這種增長是很難克服的，布雷西亞單元高度的自動化裝置提高了這種方法的經(jīng)濟可行性。

8.4.2單層細胞生長的單元程序

20世紀60年代中期，關(guān)于單層細胞的培養(yǎng)單元程序得到發(fā)展，同時單元程序的發(fā)展現(xiàn)在已變成一項易于接受的首選的實用技術(shù)。最近，其他方面的創(chuàng)始人重新檢查了這一系統(tǒng)的許多細節(jié)，結(jié)果跟隨最近的發(fā)展，不同的系統(tǒng)將在下邊描述

根據(jù)可靠的成功的多重過程的運轉(zhuǎn)，被設計取代他們的單元模式跟隨多重系統(tǒng)的基本模式，這樣，在器皿中的一套彈簧片單元程序得到發(fā)展，同時使人聯(lián)想到一架子的瓶子，這樣的系統(tǒng)有一次性的聚苯乙烯、聚碳酸酯和鈉玻璃組成。后期的發(fā)展是采用一疊盤子同時以直接構(gòu)造的形式轉(zhuǎn)動他們，要么以水平的形式轉(zhuǎn)動他們，后期系統(tǒng)正在擴大密集利用的情況下，目前作為B或纖維素細胞干擾素的一種方式，在清理與細胞培養(yǎng)運行期間，這種系統(tǒng)的擴大反映著一系列工程技術(shù)困難與操作問題，按照這種方式裝入容器的表層數(shù)量很有限，卻有兩種結(jié)果：

（a）磁盤雙方都被使用，（b）以稀釋形式生產(chǎn)產(chǎn)物正如生長培養(yǎng)基沖洗過后，而培養(yǎng)基要么達到飽和程度，要么至少半飽和程度，總共達到外面容器的容積。從已經(jīng)發(fā)展的大范圍多試管細胞的繁殖，我們看到了滾瓶系統(tǒng)的發(fā)展，系統(tǒng)達到2001量的大規(guī)模發(fā)展，近期的一套細胞大量生長的設備，Gyrogen有一排平行的試管組成，這種試管是從1001的量結(jié)合外界圓柱形殼在外部力量的驅(qū)動下轉(zhuǎn)動。這套昂貴的設備可用來生產(chǎn)，但是是否合理的利用能得到經(jīng)濟上有力的價值好沒有被證實。半空纖維中的試管收縮是唯一導致生物量的發(fā)展。對小規(guī)模來講，在外界纖維以細胞生長的方式刺激動物組織結(jié)構(gòu)或者通過纖維腔來促使營養(yǎng)培養(yǎng)基的滲漏。這是非常有可能實現(xiàn)的，在兩種意義上，這種系統(tǒng)有些優(yōu)勢，正如廢棄物質(zhì)（含有細胞毒素），和產(chǎn)物能夠從細胞當中分開，這種細胞是通過纖維的半透膜產(chǎn)生的。最近，這種自然系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展到了0.21，同時在良好的發(fā)展計算機控制和檢測系統(tǒng)得到了商業(yè)化的應用和發(fā)展。

目前，為了細胞和產(chǎn)物的生產(chǎn)，許多項目組利用填充層，例如B干擾素，口蹄疫病毒和豬水皰病病毒。經(jīng)過玻璃球瓶內(nèi)的聚苯乙烯小白球隨著彈簧不銹鋼帶的變化而變化，然而，伴隨著大多數(shù)便利的集中在輔助培養(yǎng)基貯藏中控制活性（PH和二氧化碳），通過循環(huán)流動的培養(yǎng)基，最基本的填充曾在多數(shù)系統(tǒng)中是很普通的，他們相對容易和擴展，這是由于處理圓柱形填充的機械故障很容易得到排除處理，正如玻璃作為一種基質(zhì)。操作的可靠性得到提高，同時實驗室研究的 在玻璃表層和細胞之間的關(guān)系也沒有改變，更愿意不來說，當在一個熟悉的基質(zhì)中形成產(chǎn)品時，控制新的生物產(chǎn)品的生產(chǎn)者幾乎沒有多大問題。

很顯然，靜態(tài)填充床沒有他們自己的問題?？鐚拥男倍仁窍嗤?，檢測培養(yǎng)細胞有一些難度，但不能放在顯微鏡下觀察。通過檢測循環(huán)的培養(yǎng)基的成分，（細胞生長的葡萄糖濃度，細胞分裂的乳酸脫氫酶活性好最終病毒解體），盡管后邊的問題容易處理，但是不均一的多項系統(tǒng)問題仍然存在。

A．J.van Wezel發(fā)展了對于單層動物細胞生長的同種系統(tǒng)。1967年它表明細胞以火膠棉鍍膜能生長在0.2mm的葡聚糖纖維素A50顆粒上，憑借微小的攪動，這種顆?？梢猿蓱腋顟B(tài)，相對密度為1.05，同時當系統(tǒng)從它本身的方式攪拌時，細胞可以吸附在這種為載體上，由于這些最初的觀察，眾多的觀察者已經(jīng)表明可以達到5001的量。生長在為載體上的細胞產(chǎn)生物質(zhì)是有可能的。最新報告表明，來自非洲的猿猴腎細胞脊髓灰質(zhì)炎病毒的產(chǎn)量是存在一個現(xiàn)代的為載體表面。其他為載體有聚苯乙烯、聚丙烯甚至是玻璃微球體。然而，在大多數(shù)情況下似乎葡聚糖為載體提供了最合適的基質(zhì)。

眾多研究者已經(jīng)能夠成功可靠的用為載體系統(tǒng)來操作，然而，有些研究人員的實驗還有很大的困難，涉及到研究者所希望生成的特殊細胞任然有些困難。特殊細胞本身是集體組成的產(chǎn)物，以及他生成次生產(chǎn)物的方法問題。源于其他合適設備與不合適設備的不當使用以及培養(yǎng)基選擇的不恰當問題上。這些選擇階段或者是細胞與玻璃粉。首次關(guān)鍵性的聯(lián)合或者時候起貼壁細胞的可重復性。

總之，對于基質(zhì)有要求的細胞的生產(chǎn)，在此環(huán)境下，微載體成為首選方法。而且操作良好并且可靠，但是玻璃球的填充層能夠提供一個可靠的后補系統(tǒng)。其他系統(tǒng)也會有一定的位置，為準備一種獨特的細胞類型能夠生長和生產(chǎn)產(chǎn)物提供的特殊的環(huán)境。

8.4.3懸浮細胞的生產(chǎn)過程

懸浮動物細胞的培養(yǎng)過程不同于細菌的培養(yǎng)，一條近期的評論描述了許多需要檢測和控制的參數(shù)，所使用的設備是一個有較低的攪拌和通風度相當標準的發(fā)酵器。把傳統(tǒng)方法當作一個系統(tǒng)，并且此系統(tǒng)已經(jīng)增大到8000L。來自于幼地鼠腎細胞貨真不同細胞的用于口啼疫病毒的商業(yè)產(chǎn)物，如此規(guī)模得益于倉鼠，也就是所謂的2FFA-3.同樣，有Nsmalwa淋巴細胞所產(chǎn)生的a-干擾素，目前以同樣的規(guī)模的相似設備來生產(chǎn)。攪拌驅(qū)使系統(tǒng)的最基本的修改等同于氣升式發(fā)酵罐的運用。通過在發(fā)酵罐底部引進氣泡來提供三料的混合。因為這些在移動也提上是非常有效的而且不會破壞細胞。傳統(tǒng)的噴射會對動物細胞引起嚴重的破壞，這種噴射通過產(chǎn)生一些小的氣泡試圖增加氣泡的表層區(qū)域的面積。溶氧水平在標準狀況下本身下降15%一下或者上升到溶氧量以上才會有害。但在氣液接口處的相互作用的細胞可能會導致細胞活性的損失。令人驚奇的是，起因于葉輪的飛快的速度造成的物理攪拌似乎沒有多大傷害，然而，對于相關(guān)參數(shù)的效應和數(shù)量的研究中需要被保留著。

當傳統(tǒng)的的不銹鋼槽作為科技的主導時?？萍疾话l(fā)達的國家可能會修改一些系統(tǒng)。對此通過外磁條力量來驅(qū)動，101攪拌瓶可以制造出許多有用的疫苗，（每年均有5*106劑）。印度尼西亞的泗水市安裝了此系統(tǒng)。在此地，每個月將產(chǎn)生250000劑疫苗。同樣Polgolla和斯里蘭卡基本設備的安裝也很到位。

生產(chǎn)細胞還是為這些細胞收集信息，動物細胞的連續(xù)培養(yǎng)是可行并且有用的方式。最近研究已經(jīng)表明了在系統(tǒng)的計算機在線監(jiān)測和控制的優(yōu)勢。購買相應的計算機硬件設備也比較容易。

然而動物細胞的連續(xù)型生產(chǎn)利用以及具有商業(yè)吸引力的細胞產(chǎn)物還，沒有實現(xiàn)。

8.5后期過程

當動物細胞應用于原材料生產(chǎn)時，許多后期過程等同于蛋白質(zhì)化學技術(shù)的其他領域。仍然考慮到存在些更多的獨特細節(jié)的操作系統(tǒng)。例如，過濾、篩選操作，離心分離操作（適速），沉降操作，包析發(fā)的層析操作以及濃縮干燥（反滲透法），這些普通的加工技術(shù)很難應對，生物病毒物質(zhì)的鈍化，整個病毒顆?；钚宰訂卧漠a(chǎn)生以及用于有用物質(zhì)的形成具有劃時代意義。而這種劃時代是以動物細胞為根據(jù)的獨特的處理工程。

8.5.1鈍化作用

盡管許多疫苗是由易感染的病毒粒子形成，但是一些被殺死或鈍化。鈍化在確保接受著沒有沒有危險是非常重要的，鈍化藥物通常使用甲醛，然而用B—丙醇酸內(nèi)酯來鈍化狂犬病毒。進來。用亞胺（乙炔和吖丙叮）來鈍化腳口疾病病毒。然而亞胺會使腳口疾病病毒的結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微的變化。甲醛與衣殼體交聯(lián)形成更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。其他鈍化法的紫外線輻射和縮水甘油醛，在所有鈍化方法中，確保鈍化的病毒具有單分散性是非常重要的，以至于失活劑不能阻止病毒在中型團塊中有效的鈍化。

8.5.2亞基的形成

病毒疫苗必須考慮接受疫苗者的危險，如果不適當?shù)拟g化可能會形成亞基。依靠亞基的裂解最終將會形成一小部分致疾病的病毒。能夠形成亞基的病毒有狂犬病毒，肝炎病毒、單純性皰疹、巨細胞病毒和流感病毒。近來，嘗試從流感病毒中分離血凝素糖蛋白免疫原表明疫苗的有效性了、，盡管有效性和天然病毒不同，到目前為止，研究表明從病毒中分離出的糖蛋白的競爭性比原始病毒低。但當足夠的材料管理可以得到足夠的保護反應。8.5.3產(chǎn)品配方

活的病毒疫苗通常包含1~4種不同類型的病毒。每劑有10活性病毒，有些材料需要冷凍干燥保存再生物保護劑中像流感病毒，人或牛的牛痘病毒或血清蛋白谷氨酸鹽和磷酸鹽離子。另一方面，殺死的病毒疫苗大約10為一劑.這些混合物被稱為佐劑，佐劑有強效的生物免疫原特性。佐劑的化學組成是不均等的，像強心苷、皂素、各種鋁鹽（氫氧化物，硫酸鹽。磷酸鹽）和一些確定的油脂，與水中懸浮的病毒均勻的發(fā)生生物交聯(lián)結(jié)合形成水油乳狀混合物。油水乳狀物在含有去垢劑的無機鹽水溶液中經(jīng)過第二次乳化作用。這些物質(zhì)的作用許多是一致的，他們促使身體和化學免疫系統(tǒng)最大速率合成大量的有用抗原。

8.6 基因工程動物細胞和細菌

在原核細胞和真核細胞中插入確定的核酸序列的能力對于細菌和動物細胞具有很廣泛的意義。作為一種產(chǎn)物，蛋白質(zhì)能夠插入特定的核酸。而基于動物細胞的活的病毒疫苗形成過程不可能取代基于基因工程細菌的過程。這是清楚的，一些動物細胞生產(chǎn)的胰島素和一些α-干擾素商業(yè)上用原核生物生產(chǎn)。另外一些像用于口蹄疫病毒

3的死的病毒疫苗，骨髓灰質(zhì)炎和各種干擾素商業(yè)上可以在細胞類型生產(chǎn)。然而，基因工程動物細胞能夠使蛋白質(zhì)糖基化成為更受歡迎的基質(zhì)用于人生長激素，馬血溶性酶誘導物，組織血纖維蛋白溶原激活劑的生產(chǎn)。我們目前看到了備受爭議的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)新時代的開端?，F(xiàn)在自信的預測未來的發(fā)展前景還很難，但是這些多潛力的方法必將給我們將來制造生物產(chǎn)品帶來很大的沖擊。

第五篇：動物細胞培養(yǎng)、計數(shù)、冷凍與復蘇實驗

動物細胞培養(yǎng)、計數(shù)、冷凍和復蘇

實驗報告

由于本次實驗分三天進行，日期分別為10月31日（周一）、11月2日（周三）、11月4日（周五），實驗內(nèi)容分別為動物細胞培養(yǎng)、結(jié)束，動物細胞冷凍以及最后的動物細胞的復蘇，又因為冷凍和復蘇可視為連續(xù)環(huán)節(jié)，故本報告分成兩個部分來記錄本次實驗，具體內(nèi)容如下：

I.動物細胞的培養(yǎng)和計數(shù)

一、實驗目的由動物細胞表達和合成的蛋白質(zhì)除了具有正確的氨基酸序列之外，在加工過程中還能以正確的方式進行折疊和修飾，且大多能以天然形式分泌到培養(yǎng)基中，從而確保了所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)具有與天然產(chǎn)物一致的生物活性、免疫原性和體內(nèi)壽命，這些特點使得動物細胞成為工業(yè)化生產(chǎn)診斷和治療用生物產(chǎn)品的理想宿主，如各類重組蛋白質(zhì)和單克隆抗體等。另外，目前方興未艾的組織工程、干細胞工程等也是和細胞培養(yǎng)技術(shù)密切相關(guān)的，因此，可以說細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞工程、組織工程等研究領域的基礎。

本實驗的目的是讓學生學習和了解動物細胞培養(yǎng)的基本操作，以及相關(guān)的細胞培養(yǎng)前準備工作、細胞培養(yǎng)的環(huán)境條件和其他有關(guān)注意事項；用血球計數(shù)板對培養(yǎng)瓶中的細胞進行計數(shù)以及用臺盼藍計細胞的存活率。

二、基本原理

動物細胞與組織培養(yǎng)是從動物體內(nèi)取出細胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體的細胞或組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)，是動物細胞工程的基礎。

體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，原代培養(yǎng)是指將機體取出的細胞或組織進行實效培養(yǎng)的過程，這樣的細胞稱為原代細胞，原代細胞通常只能培養(yǎng)10－50代左右即退化死亡；由原代細胞通過變異、分化等手段篩選出來具有無限次代培養(yǎng)能力的細胞群稱為細胞系，這類細胞的培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。

體外培養(yǎng)的細胞根據(jù)其生長方式，主要可分為貼附型細胞和非貼附型細胞兩類，貼附型細胞必須貼附在某一固相表面才能生存和生長，非貼附型細胞可在培養(yǎng)液中懸浮生長，因而也叫懸浮型細胞。

動物細胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)有很大不同，這主要是因為動物細胞無細胞壁，且大多數(shù)哺乳動物細胞只有附著在固體或半固體表面才能生長。雖然動物細胞培養(yǎng)的基本原理和微生物類似，但動物細胞對于營養(yǎng)的要求更加苛刻，除氨基酸、維生素鹽類、葡萄糖外，通常還需要血清；對于培養(yǎng)環(huán)境的適應性也比微生物差，其對環(huán)境極其敏感，包括pH、溶解氧、溫度、剪切力等都比微生物有更高的要求，培養(yǎng)過程中一般需嚴格監(jiān)控；動物細胞生長緩慢，因此培養(yǎng)時間較長，它們對環(huán)境的影響又比微生物大，因此常用空氣、氧氣、二氧化碳和氮氣的混合氣體進行供氧和調(diào)節(jié)pH。

動物細胞培養(yǎng)還需要防治污染問題，細菌、真菌、病毒或細胞均可導致動物細胞培養(yǎng)的污染，而生物的組織材料、操作者自身、培養(yǎng)基、各種器皿以及環(huán)境都有可能含有污染物。因為動

物細胞的培養(yǎng)周期通常為數(shù)天到數(shù)周，培養(yǎng)時間較長，因此防治污染問題則更加顯得重要。細胞培養(yǎng)過程中需要對細胞生長狀態(tài)進行監(jiān)測，這就必須在培養(yǎng)過程中隨時取樣進行細胞計數(shù)。最簡單、直接和最經(jīng)濟的方法是用血球計數(shù)板計數(shù)。計數(shù)時取血球計數(shù)板四角的四個大方格，每個方格面積為1.0mm2，點樣后其厚度為0.1mm，這樣每個方格的體積即為1.0×10-4ml，細胞數(shù)的計算公式為：

四個大方格總細胞數(shù)×稀釋倍數(shù)×104÷4，單位是細胞數(shù)/mL。

細胞存活率或稱細胞活性的檢測是用臺盼藍染色方法，其原理是活細胞的細胞膜完整，染色劑不能滲入，因而不能被染色，而死細胞的細胞膜不完整，細胞被染上藍色，存活率為： 活細胞數(shù)÷總細胞數(shù)×100％。

三、儀器、材料和試劑

1.超凈工作臺

2.倒置顯微鏡

3.二氧化碳培養(yǎng)箱：設定二氧化碳濃度為5％。

4.培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基，除菌過濾；自制無血清培養(yǎng)基，0.22μm濾膜除

菌過濾。

5.血清：Hyclone新生小牛血清。

6.PBS緩沖液，0.22μm濾膜除菌過濾。

7.胰酶：溶于PBS緩沖液，濃度0.25％，0.22μm濾膜除菌過濾。

8.玻璃方瓶、5ml和10ml移液管，121℃濕熱滅菌，30分鐘。

9.血球計數(shù)板

10.移液槍

11.臺盼藍染色液：0.4克臺盼藍溶于100ml PBS緩沖液，過濾待用。

四、實驗步驟

1.貼附型細胞傳代培養(yǎng)

（1）倒掉將要傳代的細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；

（2）用10ml無菌PBS洗滌，倒掉；

（3）加入2ml胰酶溶液（0.25％），進行消化；

（4）顯微鏡下觀察，直至所有細胞由鋪展狀態(tài)收縮為圓球形；

（5）倒掉胰酶；

（6）按稀釋要求加入新鮮培養(yǎng)基，吹打分散，分裝入玻璃方瓶，置于二氧化碳培養(yǎng)

箱。

2.懸浮細胞傳代培養(yǎng)

按貼附型細胞傳代培養(yǎng)步驟（6）操作即可。

3.細胞計數(shù)

（1）將干凈的蓋玻片覆蓋在血球計數(shù)板正中央，壓緊使它們之間不留空隙；

（2）待計數(shù)樣品如果需要，用PBS進行稀釋；

（3）取0.5ml稀釋后的樣品，加入0.5ml臺盼藍染色液（0.4％），用滴管輕輕吹打混

合；

（4）用滴管將細胞懸浮液沿蓋玻片兩側(cè)緩緩滴入血球計數(shù)板的兩個平臺上，直至平

臺上完全充滿細胞懸浮液，（5）顯微鏡下計數(shù)，并按上述公式計算細胞密度；

五、實驗結(jié)果

通過倒置顯微鏡的觀察計數(shù)，得出的結(jié)果是，在平臺1上四個大方格得到的活細胞總數(shù)為206個，死細胞總數(shù)為0個，在平臺2上四個大方格得到的活細胞總數(shù)為210個，死細胞總數(shù)為1個。

根據(jù)細胞數(shù)的計算公式：

四個大方格總細胞數(shù)×稀釋倍數(shù)×104÷4，單位是細胞數(shù)/mL。

可得到細胞總數(shù)為：

平臺1:（206+0）×1×104÷4=5.15×105 細胞數(shù)/mL

平臺2:（210+1）×1×104÷4=5.275×105 細胞數(shù)/mL

所以平臺1上活細胞比率即細胞存活率為100%，平臺2上活細胞比率即細胞存活率為1÷211=0.474%

六、討論與分析

本次實驗根據(jù)老師提供的講義可明顯發(fā)現(xiàn)幾處需要注意的地方：

1.胰酶消化的程度必須掌握好，消化不足則細胞結(jié)團，無法分散，這將嚴重影響傳代后細胞的生長，消化過量則會使細胞嚴重受損；

2.在將細胞懸浮液滴加到血球計數(shù)板上時注意不能過量以至于細胞懸浮液溢出平臺，同時不能出現(xiàn)氣泡；

3.對于稀釋比例，應掌握在每個大方格內(nèi)含25－50個細胞為合適；

4.對于每個大方格中剛好壓在邊線上的細胞，應當只計入兩條邊線上的細胞而忽略另兩條邊線上的細胞，例如將上側(cè)和左側(cè)邊線上的細胞計入，那么下邊和右邊邊線上的細胞則不能計入，不論細胞是大半在方格內(nèi)還是小半在方格內(nèi)。

稀釋實驗時，存在不少問題，老師也在事后指出了，因為是垂直式超凈工作臺，所以在其中進行實驗時，要時刻注意需要保持無菌的試劑瓶瓶口位置，不能有遮住瓶口的操作，否則就會有導致染菌的危險，另外，從注意事項2也同時可看出事先沒有做好量的粗略估計也可能在實驗過程當中造成意外的失誤。

計數(shù)實驗時可能由于對倒置顯微鏡不太熟練的原因，在計數(shù)上花費了不少的時間，這需要在以后的操作實驗中不斷練習，也同時可能是因為這個原因，計數(shù)可能存在一定的偏差，這也必須在今后的實驗中注意。另外，從注意事項1和4中，可以看出消化的程度還有計數(shù)的方法都將影響到最后的實驗結(jié)果與準確性，消化的程度更會直接影響細胞的存活率。

II.細胞的冷凍和復蘇

一、實驗目的細胞在體外長期傳代中并不是穩(wěn)定不變的，它們常常會發(fā)生各種變異，表現(xiàn)在形態(tài)、生長特性、細胞的結(jié)構(gòu)甚至細胞核型也會發(fā)生變異，這些變異往往會導致目標產(chǎn)物的丟失，細胞功能的喪失以及生物安全性方面的問題。因此，在構(gòu)建好細胞株后需要建立一個細胞庫，用低溫冷凍的方法將細胞保存起來，以便隨時有新鮮的細胞可供使用，確保研究或生產(chǎn)所用的細胞在一定的時間內(nèi)具有結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性和一致性。

本實驗的目的是讓學生學習和了解細胞凍存、復蘇的目的和基本操作方法。

二、基本原理

在動物細胞的組成成分中90％以上是水，而水在冷凍過程中會形成冰晶，由于動物細胞沒有細胞壁，冰晶會使細胞膜發(fā)生破裂而導致細胞死亡，因此要維持冷凍和復蘇過程中細胞的存活率，必須在冷凍液中加入冷凍保護劑。常用的冷凍保護劑有二甲基亞砜（DMSO）和甘油，其中二甲基亞砜因為其對細胞具有良好的保護性和較低的毒副作用二成為首選。

在冷凍和復蘇過程中影響細胞存活率的因素主要是保護劑濃度和溫度下降速率，實際操作中二甲基亞砜的濃度通常為5－10％，一般來說，冷凍過程中溫度必須緩慢下降，盡可能減少細胞內(nèi)冰晶的形成；在復蘇過程中對細胞產(chǎn)生傷害的原因主要是解凍過程所形成的局部滲透壓波動，通常采用的方法是快速解凍。

三、儀器、材料和試劑

1.程序降溫儀

2.超凈工作臺

3.離心機

4.液氮罐

5.凍存液：10％DMSO＋10％小牛血清＋80％培養(yǎng)液

6.凍存管（無菌）

7.離心管

8.細胞培養(yǎng)操作用具包括方瓶、移液管、培養(yǎng)基等，無菌。

四、實驗步驟

1.冷凍過程

（1）準備好分散良好的細胞懸浮液并用臺盼藍染色計數(shù)；

（2）離心并將細胞重新懸浮在凍存液中，使細胞密度達到6×106活細胞/ml；

（3）將細胞分裝在凍存管中，每支1ml，旋緊凍存管蓋子；

（4）靜置30分鐘，使凍存液和細胞內(nèi)的DMSO濃度達到平衡；

（5）將凍存管置于程序降溫儀內(nèi)，設置降溫速率1℃/min，－40℃后5℃/min，降溫至－

100℃停止；

（6）將凍存管置于液氮罐（－196℃），長期保存。

2.復蘇過程

（1）準備好玻璃方瓶、移液管、離心管等（無菌），新鮮培養(yǎng)基；

（2）將凍存管從液氮罐中取出，立即置于40℃水浴中，直至凍存管內(nèi)細胞懸浮液完全融

解，此過程約1－2分鐘；

（3）在超凈工作臺內(nèi)將凍存管內(nèi)細胞懸浮液移至離心管，加入10ml新鮮培養(yǎng)基，離心

（5min，1500rpm）；

倒掉上清液，將細胞重新懸浮于10ml新鮮培養(yǎng)基中，移至玻璃方瓶，置于二氧化碳培養(yǎng)箱。

五、實驗討論

因為冷凍和復蘇的實驗沒有相關(guān)需要記錄的數(shù)據(jù)，所以本部分跳過了實驗結(jié)果這一節(jié)，直接進行討論。這兩次實驗的注意事項為：

1.涉及和液氮相關(guān)的操作，應戴好防護手套以防凍傷；

2.凍存管蓋子必須旋緊，否則液氮容易滲入凍存管內(nèi)，這樣不僅可能導致污染，而且

將嚴重損傷細胞。

可能由于老師考慮到實驗過程中的危險性，并沒有讓我們進行有關(guān)于液氮的實驗操作步驟，但這兩項注意還是值得我思考和借鑒的。這兩次實驗的重點是冷凍過程中溫度必須緩慢下降，盡可能減少細胞內(nèi)冰晶的形成；在復蘇過程中采用快速解凍，減少解凍過程所形成的局部滲透壓波動對細胞產(chǎn)生傷害。如不注意這兩點，會對細胞凍存和復蘇后細胞的存活率帶來影響。

其實這兩次實驗的主要內(nèi)容基本都與垂直超凈工作臺有關(guān)，個人認為老師的用意也是在此，讓我們了解實驗室中動物細胞不論用在何處，無菌首先是第一位的，因為要考慮到動物細胞的生長周期較長，所以保持無菌操作的必要性就變得尤為重要。

最后，感謝老師提供的講義，讓我們省下不少尋找資料和預習實驗的時間，也同時感謝老師一個星期的指導。