第一篇：DNA病原—圓環(huán)病毒2型PCR檢測方法專題

豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測方法操作程序

廖榮斌，何啟蓋

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院）

一、原理

豬圓環(huán)病毒2型感染引發(fā)的仔豬斷奶衰竭綜合癥、腎炎與皮炎、增生性腸炎以及母豬繁殖障礙。通過病原檢測和病毒分離是確證本病的重要手段。豬圓環(huán)病毒分為2種，即圓環(huán)病毒1型和圓環(huán)病毒2型。前者不致病，后者可致病。豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的基因組大小為1768 bp或1767bp。其中，PCV2 ORF2基

因與免疫保護和毒力等重要特性有關(guān)，同時，此基因與PCV1的同源性較低，通

過合理設(shè)計引物，擴增ORF2，從而可檢測并區(qū)分PCV2與PCV1。

PCR技術(shù)具有快速、敏感的優(yōu)點，已經(jīng)用于許多動物疾病病原的檢測。本試驗是利用我們設(shè)計的引物，通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，以感染豬組織或血液為模板，擴增PCV2的ORF2基因，從而作出感染的結(jié)論。

二、材料準(zhǔn)備

1、手術(shù)器械：采樣用。根據(jù)樣品數(shù)量來確定。

2、微量移液器（規(guī)格：2.5?l，10?l，100?l，200?l，1000?l）

3、反應(yīng)引物

上游引物：CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT；

下游引物：CGC ACC TTC GGA TAT ACT GTC4、磁珠：用于吸附和分離DNA4、PCR儀：東勝創(chuàng)新

5、電泳儀：北京六一電子設(shè)備

6、紫外檢測儀：Bi0-RAD凝膠成像系統(tǒng)

7．相關(guān)溶液及配方：

1╳TAE buffer（電泳緩沖液）配方：（1）稱量Tris：242g，Na2EDTA.2H2O：

37.2g，置于1L的燒杯中；（2）向燒杯中加入約800ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓?/p>

（3）加入57.1ml的醋酸，充分?jǐn)嚢瑁唬?）加去離子水將溶液定容至1L后，室 1

溫保存；（5）使用時將室溫保存的該溶液稀釋50倍即可使用。

擴增產(chǎn)物的樣品緩沖液：全式金生物6╳Loading buffer。

三．樣品采集

感染豬或流產(chǎn)的胎兒的肺臟、淋巴結(jié)、脾臟和腎臟；發(fā)熱期豬的抗凝血或血

清；每個樣品用單獨的剪刀或刀片，避免交叉污染。

樣品置冷藏條件下送檢。也可放冷凍保存。

四、模板的制備（DNA提?。?/p>

*（注：所用DNA提取試劑盒為日本TOYOBO產(chǎn)品）

1、取組織100mg（或血液100ml）以下放入1.5ml離心管中，然后加入850?l的溶解吸附液，再使用勻漿器充分勻漿。

2、離心分離（10000rpm，5分鐘)后，將上清液吸入新的1.5ml的離心管內(nèi)。

3、加入40?l磁珠，然后使用渦旋振蕩器劇烈混合10分鐘（注意：加入磁珠前，要把磁珠混勻）。

4、將離心管置于磁性臺架上，放置30秒使磁珠聚集，然后去除上清液。

5、離心管中添加900?l 洗凈液，然后渦旋振蕩劇烈混合5秒。

6、將離心管置于磁性臺架上，放置30秒使磁珠聚集，然后去除上清液。

7、重復(fù)步驟5和6.8、離心管中添加900?l 70﹪的乙醇溶液，然后渦旋振蕩劇烈混合5秒。

9、將離心管置于磁性臺架上，放置30秒使磁珠聚集，然后去除上清液。

10、重復(fù)步驟8和9.11、添加100?l滅菌水后，劇烈震蕩10分鐘，使DNA溶出。

12、將試管置于磁性臺架上，通過放置30秒使磁珠聚集，然后將含有DNA的上

清液回收至新的1.5ml離心管內(nèi)，上清液即為DNA模板！

13、陰陽性對照的設(shè)立：利用滅菌三蒸水和PCV2陽性病毒液（或者所保存的臨

床PCV2陽性病料）與臨床送檢病料同步提取DNA，分別作為PCV2臨床檢測的陰性

對照和陽性對照。

五、配置PCV2-PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系（單重擴增）：

10×擴增緩沖液2.5ul

dNTP混合物2ul引物（10mM）各1ul

模板DNA4ul

Taq DNA聚合酶0.15ul

加滅菌三蒸水14.35ul

即總反應(yīng)體系25ul.六、擴增

將配好樣品的PCR管放入PCR儀中選擇適合反應(yīng)條件的程序進行擴增。退

火溫度54°C。

反應(yīng)條件：按如下程序進行擴增: 94℃變性5 min后,進入循環(huán)94℃

30sec,54℃ 40sec, 72℃ 45sec,35個循環(huán)后,72℃延伸10 min。

七、配置瓊脂糖凝膠塊

1、材料：廣口瓶、瓊脂糖、電泳液

2、制作步驟：

（1）、稱取瓊脂糖1克放入廣口瓶內(nèi)。

（2）、取電泳液100ml加入廣口瓶，即為1﹪的瓊脂糖混合液。

（3）、然后放入微波爐中加熱2分鐘，取出后冷卻約56℃。

（4）、倒入容器中，混合液約占容器容積的1/2—2/3。

八、電泳

1、擴增結(jié)束后，每只PCR管中都加入約2.5ul的6╳Loading buffer（電泳樣品

緩沖液）

2、將制備好的凝膠塊放入DNA電泳儀內(nèi)的電泳液中，膠塊有孔的一側(cè)靠近負極。

3、從滴加有電泳樣品緩沖液的樣品中分別取7ul注入膠塊相對應(yīng)的孔內(nèi)。

4、注入5ul的分子量（DL Mark 2000）對照。

5、電泳到凝膠塊的1/2—2/3處。

九、圖片觀察

1、電泳結(jié)束的凝膠塊放入溴乙錠（熒光物質(zhì)）中浸泡10min。

2、放入成像系統(tǒng)中照膠。

3、結(jié)果判定（目的片段大小是494bp）如圖1.******8M bp

圖1.臨床病豬圓環(huán)病毒PCR檢測的凝膠成像圖片

1：陰性對照；2：陽性對照；3—18：湖北某規(guī)?；i場送檢病料；其中3—6，8，11—12，15—16為PCV2感染陽性。其余被檢病料為PCV2感染陰性，M(分子標(biāo)記): DL Mark 2000。

4．結(jié)果分析

（1）感染的判定：PCR結(jié)果為陽性，表明為PCV2感染；陰性表明無PCV2感染。

（2）疾病的判定：由于本病毒感染較廣，PCR陽性結(jié)果需要與豬群的流行病學(xué)以及臨床表現(xiàn)（斷奶消瘦、咳嗽、體溫升高、腹股溝淋巴結(jié)腫大）等結(jié)合考慮。

第二篇：豬細小病毒論文：豬細小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

豬細小病毒論文：豬細小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

【中文摘要】豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是當(dāng)前影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的3種重要的病原。由于PPV、PRV、PCV-2單獨感染或混合感染均能引起豬發(fā)病,造成母豬的繁殖障礙或(和)感染豬的免疫抑制,為其他病原的繼發(fā)感染提供了便利,甚至?xí)斐韶i群中疫病的流行,使養(yǎng)殖效益蒙受損失。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)具有快速、敏感、特異等優(yōu)點,自發(fā)明以來在病原的特異性檢測方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢,在動物疫病診斷和病原檢測上也得到廣泛地應(yīng)用,對疫病防控起到了重要的作用。由于當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)中豬群中多種病原混合感染病例的增多,單一病原PCR檢測方法也表現(xiàn)出自身的不足,需要對一種病料進行多次PCR檢測,使得檢測時間延長,耗費人力,成本也高。多重PCR不僅保持了普通PCR敏感性高和特異性強的優(yōu)點,而且還具有一個PCR反應(yīng)就同時檢測多種病原,具有簡便、快捷、靈敏等優(yōu)點,能滿足生產(chǎn)上同時對多種疾病進行快速診斷的要求。本研究基于前期對陜西省部分養(yǎng)殖企業(yè)豬群中病毒性病原的調(diào)查檢測,發(fā)現(xiàn)常有PPV、PRV和PCV-2的單純或混合感染,為此我們擬建立PPV、PRV和PCV-2檢測的多重PCR方法,以期為生產(chǎn)中這3種病原的快速檢測提供可用方法。本研究獲得了以下結(jié)果:(1)根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的PPV、PRV和PCV-

2的全基因序列,利用DNAStar和Oligo6.0軟件,針對病毒的保守性基因序列,分別設(shè)計了檢測引物,通過對引物濃度、退火溫度、PCR組分等條件的優(yōu)化建立起鑒別PPV、PRV和PCV-2多重PCR方法,方法敏感性試驗表明,PRV、PCV-2在多重PCR反應(yīng)中的敏感性到達pg級,而PRV在多重PCR反應(yīng)中的敏感性少了一個數(shù)量級,其最低檢測量也達到了10pg級。以PCV-

1、牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、大腸埃希菌、PPV、PRV、PCV-2為模板分別進行多重PCR檢測,結(jié)果表明只有PPV、PRV和PCV-2多重PCR及單個病毒的PCR均擴增出各自的特異性條帶。(2)用建立的方法對采自陜西省部分豬場的286份病料及血樣進行病毒檢測,從臨床健康豬全血樣品中PPV、PRV和PCV-2的檢測結(jié)果來看,PCV-2在正常豬群中有一定比例的存在,同時在個別豬場也存在PRV和PCV-2雙重感染的現(xiàn)象;從臨床患病豬病料中進行檢測發(fā)現(xiàn),PRV和PCV-2混合感染較嚴(yán)重,并有PPV+PRV+PCV-2三重感染發(fā)生;多重PCR檢測結(jié)果與單項PCR檢測結(jié)果的符合率達99%以上,說明建立的多重PCR檢測方法可用于臨床樣品的檢測,為這3種疫病的診斷提供依據(jù)。

【英文摘要】Porcine parvovirus , porcine pseudorabies and porcine circovirus are three main threat to the development of swine-breeding industry.Beacause sigle or mixed infection of the three virus both can cause diseases which can give rise to reproductive failure or(and)immunosuppression, it provides a convenient chance for secondary infection by other pathogens

and enven causes epidemic diseases in pigs wich can lead to tremendous economic losses ,and may arise public health problems.PCR with rapid,specific and sensitive advantages exhibits obvious preponderance in specificit detection of infectious agents in animals since it was invent.And it is applied widely in animal disease diagnosis and pathogen detection which has made important contributions to disease prevention and control.At present,the cases of mixed infection of pathogen are increasing,and common分子molecular detection of pathogen has show its own shortage of time consuming ,high cost and labour power when we need detect one specimen repeatedly.Mutiplex PCR not only preserve advantages of routine PCR,but also owns advantages of convenience shortcut and sensitiveness which meet the need of fast diagonosis for multiple diseases in production.We found that sigle or mixed infection of PPV、PRV and PCV-2 is common in the course for the survey of viral pathogen in some breeding enterprises in this research.So we plan to establish the mutiplex PCR for detection of PPV、PRV and PCV-2,in purpose for providing fast detection of the three pathogens an available method.(1)Specific primers for DNA viruses, namely, porcine parvovirus(PPV), pseudorabies virus(PRV), porcine circovirus type 2

(PCV-2),were synthesized according to the published virus conserved gene sequence of PPV, PRV and PCV-2 in GenBank and used by DNAStar and Oligo 6.0 software.We establish a mutiplex PCR method for the detection of PPV, PRV and PCV-2 by optimizing concentration of primers,annealing temperature and component of PCR.Sensibility test shows that the susceptibility of PRV and PCV-2 reach the level of pg.With PCV-1, bovine viral diarrhea virus, classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine transmissible gastroenteritis virus, Escherichia coli, PPV, PRV, PCV-2 as a template for multiple PCR were detected,the results show that the only PPV, PRV and PCV-2 virus in a single or multiplex PCR were amplified by their specific band.(2)The blood samples collected from 286 pig farms in Shaanxi Province were viral detection by this method.Clinically healthy pigs from a blood sample PPV, PRV and PCV-2 test results indict that PCV-2 in normal pigs have a certain percentage of presence, meanwhile several farms also exist the phenomenon of the PRV and PCV-2 dual infection.Swine from the clinical illness were detected compound, It was serous of PRV+PCV-2 combined infection in diseased pigs,and PPV+PRV+PCV-2 combined infection also were detected in diseased pigs.The coincidence

rate of multiplex PCR test and single PCR test is more than 99%, illutstrating that The developed novel multiplex PCR will be a tool used for the detection of clinical samples for diagnosis reference.【關(guān)鍵詞】豬細小病毒 偽狂犬病病毒 豬圓環(huán)病毒2型 多重PCR 【英文關(guān)鍵詞】Porcine parvovirus(PPV)Pseudorabies virus(PRV)Porcine circovirus type 2 multiplex PCR(mPCR)【目錄】豬細小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用綜述12-

31摘要6-8

ABSTRACT8-9

文獻

第一章 豬細小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒

12-26

1.1 豬細小病毒

1.1.2 豬細小病毒的特性

1.1.4 PPV

1.2.1 2型檢測方法研究進展12-1913-141.1.1 概述12-131.1.3 豬細小病毒病流行情況14-1

51.2 偽狂犬病病毒19-22的檢測方法研究15-19概述191.2.2 偽狂犬病病毒的特性19-20

1.2.4 偽狂犬病病毒檢測方法

1.3.1 概述

1.2.3 偽狂犬病流行情況2020-2222-231.3 豬圓環(huán)病毒22-261.3.2 豬圓環(huán)病毒的特性231.3.3 豬圓環(huán)病毒檢測方法23-26檢測上的應(yīng)用26-31PCR 技術(shù)26

第二章 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在動物病原

2.1 PCR 技術(shù)概述26-27

2.1.1 2.2 主要的2.1.2 PCR 技術(shù)的發(fā)展26-27

PCR 技術(shù)27-31PCR(nested PCR)

2.2.1 常規(guī)PCR272.2.2 套式

2.2.4 反

2.2.3 二溫式PCR27-28轉(zhuǎn)錄PCR(RT PCR)2828

2.2.5 反轉(zhuǎn)錄一復(fù)合套式聚合酶鏈反應(yīng)

2.2.7 競爭PCR(compete

2.2.9 定量2.2.11 多

第三章 2.2.6 反向PCR28PCR)28-29PCR29

2.2.8 標(biāo)記PCR(LP-PCR)292.2.10 玻片PCR(Slide-PCR29-30

31試驗研究31-45重PCR(Multiplex PCR)豬細小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2 型 PCR 檢測方法的建立31-38313232-333.1 材料與方法31-3

33.1.1 主要試劑

3.1.3 引物設(shè)計3.1.5 PCR 反應(yīng)33

3.1.7 PCR 產(chǎn)物3.1.2 毒株、菌株和細胞31-323.1.4 病毒DNA 的提取323.1.6 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化的測序分析333333-343434-3636

3.1.8 PCR 反應(yīng)的敏感性和特異性分析

3.2.1 最佳PCR 退火溫度的確定3.2 結(jié)果33-363.2.2 PCR 反應(yīng)最佳引物體濃度的確定3.2.3 PCR 產(chǎn)物的鑒定3

43.2.4 PCR 反應(yīng)的敏感性3.2.5 PCR 反應(yīng)的特異性試驗和重復(fù)性試驗3.3 討論36-38

第四章 PPV , PRV和PCV 2多重PCR

38-4

54.1 材料與方法檢測方法的建立與臨床樣品檢測分析38-39384.1.1 主要試劑38

4.1.2 毒株、菌株、細胞38

4.1.4 多重PCR

4.2 結(jié)果4.1.3 臨床樣品及病料的采集反應(yīng)條件的優(yōu)化384.1.5 樣品檢測38-39

39-424.2.1 兩重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化39-40

4.2.3 樣品檢測41-42

參考文獻46-56

4.2.2 4.3 討致謝多重PCR 的建立40-41論42-4556-57結(jié)論

45-46作者簡介57

第三篇：豬場圓環(huán)病毒與其它病原混合感染情況

圓環(huán)病毒病相對于“歷史悠久”的豬瘟是一個新病，1997年Clark等才首次分離到豬圓環(huán)病毒2型（PCV2），我國更是到2000年才有豬群中存在PCV2感染的血清學(xué)證據(jù)的報道，但該病給養(yǎng)豬業(yè)帶來的損失則越來越大。

圓環(huán)病毒病會引起斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（PMWS）及豬皮炎腎病綜合征，同時還能引起母豬繁殖障礙、新生仔豬先天性震顫、增生性壞死性肺炎和腸炎等疾病，同時也是豬呼吸道病綜合征的原發(fā)病原之一。

近年越來越被豬病專家重視的免疫抑制病中，圓環(huán)病毒病和豬瘟、藍耳病相提并論。楊漢春老師2009年在學(xué)術(shù)年會上指出目前國內(nèi)PVC2呈高感染率，在病死豬組織樣本中檢出率幾乎達100%。

在實際生產(chǎn)中，PCV2單獨感染的情況較為少見，通常為混合感染。Eng等對美國101個豬場中PMWS相關(guān)因素進行研究發(fā)現(xiàn)，PMWS陽性樣本中最普遍的混合感染為藍耳病病毒（72%）、豬肺炎支原體（69%）、豬鏈球菌（69%）和豬流感病毒（55%）。

我國學(xué)者陳義祥等調(diào)查顯示，圓環(huán)病毒2型與藍耳病病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬流感病毒混合感染的病料占57.73%，其中與藍耳病病毒混合感染比例最高，約51.85%。近年我國有關(guān)PCV2混合感染的調(diào)查多限于病毒病，本文主要針對病毒病的混合感染情況做了統(tǒng)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCV2與藍耳病毒的二重感染最為嚴(yán)重，約50.27%，該結(jié)果與國內(nèi)外報道趨勢相一致。截至目前，流行病學(xué)和試驗數(shù)據(jù)表明，單獨的PCV2感染并不能足以引起疾病的臨床表現(xiàn)，但并發(fā)或繼發(fā)細菌或病毒感染卻可使死亡率大大增加。

混合感染的普遍性可能與PCV2感染導(dǎo)致免疫抑制有關(guān)，感染豬血液中單核細胞增加，T細胞（主要是CD4+）和B細胞數(shù)量減少，并出現(xiàn)低密度的未成熟粒細胞，導(dǎo)致免疫抑制。由于圓環(huán)病毒發(fā)病豬細胞免疫功能顯著降低，缺乏有效的免疫應(yīng)答能力，必然出現(xiàn)嚴(yán)重的繼發(fā)感染，如副豬嗜血桿菌、鏈球菌、巴氏桿菌等的侵襲。

需要說明的是，目前可導(dǎo)致豬群發(fā)生免疫抑制的病原主要包括豬瘟病毒、藍耳病病毒、圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒及豬肺炎支原體等。最近研究表明，PCV2常見于肺炎支原體感染的支氣管周圍淋巴組織區(qū)域，且肺炎支原體可促進圓環(huán)病毒的感染。

另有研究發(fā)現(xiàn)，在呼吸道綜合征的臨床病例中常見肺炎支原體與PCV2混合感染，而不一定有藍耳病毒或流感病毒的存在。雖未對我國PCV2和肺炎支原體混合感染調(diào)查，但該現(xiàn)象可能是臨床上最為常見的，需要加以重視，同時針對支原體肺炎做好預(yù)防免疫。另外，在選擇支原體肺炎疫苗過程中也要注意油佐劑激發(fā)PCV2復(fù)制的現(xiàn)象。更多請訪問http:///

第四篇：豬圓環(huán)病毒2型疫苗最新研究進展

豬圓環(huán)病毒2型疫苗最新研究進展

豬圓環(huán)病毒病是公認的免疫抑制病之一，造成豬場損失慘重，疫苗免疫成了救命的稻草。從2011年豬圓環(huán)疫苗上市至今，已有17家圓環(huán)產(chǎn)品先后上市，目前，出現(xiàn)嚴(yán)重供大于求的現(xiàn)象，同時，養(yǎng)殖場也面臨著幸福的煩惱，大量產(chǎn)品的上市，產(chǎn)品價格可能下降，但是，面對玲瑯滿目的產(chǎn)品，如何選擇疫苗成了養(yǎng)殖場一個重要的課題，針對這些煩惱，本文希望能夠為養(yǎng)殖場選擇疫苗帶來幫助，避免走彎路，為養(yǎng)殖場服務(wù)。

1.PCV-2國內(nèi)外最新流行動態(tài)

由PCV-2引發(fā)的疾病已成全球流行之勢，在加拿大首次報道該病原引起PMWS后[1]，學(xué)者通過調(diào)查本國包括SPF豬、部分散養(yǎng)豬以及育肥豬發(fā)現(xiàn)，豬群中PCV-2血清中抗體普遍存在，但目前該病在加拿大仍然只是散發(fā)。在英國和北愛爾蘭，豬群血清中PCV-2抗體陽性率分別為86％和92％。美國、法國、丹麥、意大利、西班牙、荷蘭、新西蘭、日本、韓國、墨西哥等國家也相繼報道豬群中存在PMWS。在我國豬群中PCV-2感染情況也不容樂觀。2000年郎洪武等[2]在北京、河北、山東、天津、江西、吉林、河南等7省(市)的22個豬群采集了559份血清，用ELISA方法檢測PCV-2抗體，其陽性率高達5l％，表明我國豬群中存在PCV-2的感染。王忠田等[3]用PCR方法對我國北京、山東、河北、深圳、山西、天津、廣東等省(市)的12個規(guī)?；i場發(fā)病豬群進行豬圓環(huán)病毒2型感染的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明豬圓環(huán)病毒2型感染情況在我國豬群中相當(dāng)嚴(yán)重。李超等[4]在2010年對安徽省PCV-2流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明安徽省14個市(縣)的PCV-2抗體陽性率平均為74.36％，表明安徽省豬群中普遍存在著PCV-2的感染。從上述報道表明PCV-2在我國豬群中廣泛存在。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，雖然豬群中PCV-2抗體陽性率較高，但很大比例的抗體陽性豬群并不表現(xiàn)出臨床癥狀。PCV-2與其他多種病原混合感染較為嚴(yán)重，調(diào)查發(fā)現(xiàn)沙門氏菌、大腸桿菌等細菌性病原與PCV-2混合感染率達到了20％[5]。陜西省PCV-2與PRV混合感染率是21.7％[6]。2005年陳義祥等對廣西地區(qū)197份組織病料檢測發(fā)現(xiàn)，PCV-2與PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染占總病料數(shù)量的57.73％。2003年王文軍等[7]對黑龍江地區(qū)PCV-2陽性豬群的病料調(diào)查發(fā)現(xiàn)，藍耳病和豬瘟的陽性率也較高。

哈爾濱獸醫(yī)研究所劉長明[8]在2007年采用免疫過氧化物酶單層細胞染色試驗（IPMA）對來自與黑龍江、吉林、河北、上海、內(nèi)蒙古、云南、江西等地的健康豬群480份血清和發(fā)病豬群424份血清，抗體陽性率分別為79.2%和91.7%，表明PCV-2在豬群中感染率非常高。山東農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所吳家強博士檢測結(jié)果也證實PCV-2防控比較糟糕，PCV-2，2010年檢出率為34.66%（124/357），2011年檢出率為25.59%(174/588)；2012年檢出率為2

1.38%(147/683)，圓環(huán)病毒病依然嚴(yán)重，但有下降趨勢，這個和使用圓環(huán)疫苗免疫有關(guān)系。

第五篇：豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)衣殼蛋白表達綜述

PCV2是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬成員，為單股環(huán)狀負鏈無囊膜的DNA病毒, 為已知的最小動物病毒之一，約17~ 20nm, 二十面體對稱。根據(jù)病毒的抗原性和基因組成不同，可分為2種基因型或稱血清型, 即PCV1型和PCV2型。PCV1無致病性。PCV2具有致病性，基因組全長1767bp或1768bp，包括11個讀碼框，其中ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白)核衣殼蛋白(Cap)，其N端包含一個由41個氨基酸殘基組成的的核定位信號(Nuclear location signal，NLS)，與PCV2在細胞核內(nèi)定位有關(guān)。Mahe和Liu等分別在sf 9真核細胞及大腸桿菌中進行了PCV2Cap蛋白的表達, 但Cap蛋白的表達量較低。為了提高Cap蛋白的表達量, 本實驗成功構(gòu)建去除NLS的重組質(zhì)粒, 并對其進行表達、純化、鑒定。

1材料和方法

1.1pcv-581重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.1.1PCR擴增去除NLS基因的pcv-581

1.1.1.1引物的設(shè)計與合成: 根據(jù)本實驗室保存毒株的測序結(jié)果, 用Oligo6.0設(shè)計刪除核定位信號特異引物(由大連寶生物工程公司合成), 并引入限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII(加下劃線表示)。上游引物: ACAGGATCCATGGCATCTTCAACAC;下游引物: GAAAGCTTT TCATTAAGGGTTAAGT;產(chǎn)物長度581bp。

1.1.1.2PCV2核酸的提取: 取接種PCV2病毒的PK-15細胞懸液500uL, 常規(guī)方法提取, 最后加20uL滅菌去離子水溶解,-20度保存。

1.1.1.3PCR擴增: PCR的反應(yīng)體系總體積25uL: 上、下游引物(10uLmol/L)各1.0uL，10×RCR Buffer2.5uL、dNTP3.0uL(2.5mM each)，提取的DNA2.0LL,Taq酶0.25LL(5U/ LL, TaKaRa), 去離

子水補到25LL。反應(yīng)參數(shù)為: 95e , 5min;94e, 45

s;55.9e, 45s;72e, 45s;30個循環(huán);72e , 7min。

取5LLPCR產(chǎn)物進行電泳分析(見圖1)。

1.1.1.4PCR擴增產(chǎn)物的酶切、回收: 醇沉淀PCR

擴增產(chǎn)物、酶切、回收。具體操作方法如下: PCR

產(chǎn)物補到100LL, 加入等體積異丙醇, 置-20e 靜

止過夜, 13 000r/ min離心15min棄上清, 加入

600LL75%乙醇, 7000r/min離心5min, 倒掉上清,晾干, 加入10LL滅菌去離子水溶解。將醇沉產(chǎn)物

進行BamHI酶切, 體系為20LL: 10@buffer K2LL,BamHI 1LL(15U/ LL , TaKaRa), 醇沉產(chǎn)物10LL,H2O7LL, 37e 酶切1h。將酶切產(chǎn)物繼續(xù)醇沉淀

(方法步驟同上)后進行HindIII(15U/ LL, TaKaRa)

單酶切, 酶切體系同上, 回收目的片段。

1.2pQE-pcv581重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定: 將載

體pQE-32(QIAGEN)質(zhì)粒用BamHI 和HindIII雙

酶切, 做100LL 酶切體系: 10@ buffer K10LL,BamHI2LL, HindIII 2LL, pQE-32質(zhì)粒70LL, H2O

16LL。37e 酶切2h15min, 用膠回收試劑盒回收

(TIANGEN, 操作按照說明書進行), 目的片段和載

體常規(guī)方法連接、轉(zhuǎn)化M15、篩選陽性重組質(zhì)粒

pQE-pcv581。酶切鑒定(見圖2)。

1.3重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

從含有氨芐抗性的瓊脂平板上挑取單個陽性

菌落接種到5mL氨芐抗性(100Lg/ mL)的LB液體 培養(yǎng)基中, 37e 過夜振蕩培養(yǎng)、活化, 取過夜活化 的培養(yǎng)物按照的比例接種到5mL含氨芐抗性的液 體LB培養(yǎng)基, 37e 振蕩培養(yǎng), 培養(yǎng)至OD600nm達 0.4-0.6, 然后加入IPTG(TaKaRa)至終濃度為0.2mmol/ L、0.4mmol/ L、0.6mmol/ L、0.8mmol/ L、1.0mmol/L、1.2mmol/L繼續(xù)培養(yǎng), 分別在誘導(dǎo)前、誘 導(dǎo)1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h取樣, 取1mL菌液離心