第一篇：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)個(gè)人總結(jié)

單克隆抗體技術(shù)個(gè)人總結(jié)

制備單克隆抗體

1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無(wú)限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開(kāi)創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。

制備單克隆抗體包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測(cè)抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過(guò)幾個(gè)月的一系列實(shí)驗(yàn)步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實(shí)驗(yàn)方法。

一、細(xì)胞融合前準(zhǔn)備

(一)免疫方案

選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個(gè)月左右確立免疫方案開(kāi)始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。

1.顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:

初次免疫1×10７／0.5ml ip(腹腔內(nèi)注射)

↓ 2～3周后

第二次免疫1×10７／0.5ml ip

↓ 3周后

加強(qiáng)免疫(融合前三天)1×10７／0.5ml ip或iv(靜脈內(nèi)注射)↓

取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。

初次免疫Ag

～50μg 加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射

│(一般0.8～1ml 0.2ml／點(diǎn))

↓3周后

第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip

│(ip劑量不宜超過(guò)0.5ml)

↓3周后

第三次免疫 劑量同上，不加佐劑，ip

│(5～7天后采血測(cè)其效價(jià)，檢測(cè)免疫效果)

↓2～3周后

加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg

宜，ip或iv

↓3天后

取脾融合目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的 1

免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)抗原反應(yīng)性。

(二)飼養(yǎng)細(xì)胞

在制備單克隆抗體過(guò)程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(較為常用)、小鼠脾臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞，也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長(zhǎng)期保存，隨用隨復(fù)蘇。

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備

小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周齡

↓

拉頸處死 浸泡于75％酒精，消毒3～5分鐘

↓

用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)皮膚，暴露腹膜

↓

用無(wú)菌注射器注入6～8ml培養(yǎng)液

↓

反復(fù)沖洗，吸出沖洗液

↓

放入10ml離心管，1200轉(zhuǎn)／分離心5～6分鐘

↓

用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1× 0５／ml

↓

加入96孔板，100μl／孔

↓

放入37℃ CO2孵箱培養(yǎng)

一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5～8×106腹腔巨噬細(xì)胞，若用小鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞濃度為5×106／ml，小鼠脾細(xì)胞為1×106／ml，小鼠的成纖維細(xì)胞(3T3)1×105／ml，均為100μl／孔。

(三)骨髓瘤細(xì)胞

骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量 McAb

常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。

骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10～20％，細(xì)胞的最大密度不得超10６／ml，一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1∶10稀釋傳代，每3～5天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為16～20小時(shí)，上述三株骨髓瘤細(xì)胞系均為懸浮或輕微貼壁生長(zhǎng)，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。

一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開(kāi)始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，為確保該細(xì)胞對(duì)HAT的敏感性，每3～6月應(yīng)用8～AG(8氮雜鳥(niǎo)嘌呤)篩選一次，以防止細(xì)胞的突變。

保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95％，也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵。

(四)免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞棗漿母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時(shí)B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合的成功率較高。

脾細(xì)胞懸液的制備：在無(wú)菌條件下取出脾臟，用不完全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的２倍，細(xì)胞數(shù)為２×10８左右。

二、細(xì)胞融合，選擇雜交瘤

(一)細(xì)胞融合流程

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞SP2／0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。

(2)同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。

(3)將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml

料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。

(4)棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。

(5)輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。

(6)在室溫下融合:

① 30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，邊加邊攪拌。② 作用90秒鐘，若冬天室溫較低時(shí)可延長(zhǎng)至120秒鐘。

③ 加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔２分鐘分別加入

1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

(7)離心，800rpm，6分鐘。

(8)棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開(kāi)。

(9)根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。

(10)將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。

一般一塊96孔板含有1×

107脾細(xì)胞。

(二)HAT選擇雜交瘤

應(yīng)用HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細(xì)胞的原理已在研究生專(zhuān)題講座第六專(zhuān)題中已經(jīng)提到，這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時(shí)間和濃度。

一般在融合24小時(shí)后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時(shí)1ml加入50ml20％小牛血清完全培養(yǎng)液中。

因?yàn)樵谂囵B(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)胞、融合后的細(xì)胞，200μl／孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)加3倍量的HAT。我們認(rèn)為，融合后最初補(bǔ)加的量可用全量的2／3進(jìn)行選擇，可得到滿(mǎn)意的篩選結(jié)果。

50×HAT

H: 5×10-3M

A: 2×10-5M

T: 8×10-4M

一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。

三、抗體的檢測(cè)

篩選雜交瘤細(xì)胞通過(guò)選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對(duì)免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿(mǎn)孔底1／10面積時(shí)，即可開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。

檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類(lèi)型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快

速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則。

常用的方法有:

1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測(cè)。

2.RIA用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測(cè)。

FACS(熒光激活細(xì)胞分類(lèi)儀)用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測(cè)。

4.IFA用于細(xì)胞和病毒McAb的檢測(cè)。

上述方法均為一般實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，故在此不介紹具體的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。

可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤整個(gè)篩選時(shí)機(jī)。

四、雜交瘤的克隆化和凍存

克隆化一般是指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。犚r為經(jīng)過(guò)HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞；所需要的抗體(特異性抗體)分泌細(xì)胞和其它無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開(kāi)，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過(guò)的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

(一)克隆化方案

用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。

1.有限稀釋法的程序

① 制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液(同融合前準(zhǔn)備)

② 陽(yáng)性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1～5×10３／ml

③ 取130個(gè)細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，即20個(gè)細(xì)胞／ml，100μl／孔加

A、B、C三排為每孔2個(gè)細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為10個(gè)／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為每孔1個(gè)細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)5個(gè)／ml，100μl／孔，加G、H

排，為每孔0.5個(gè)細(xì)胞。

④ 培養(yǎng)4～5天后，在倒置顯微鏡上可見(jiàn)到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液200μl／孔。

⑤ 第8～9天時(shí)，肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆，及時(shí)進(jìn)行抗體檢測(cè)。

注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。

2.軟瓊脂法

① 軟瓊脂的配制

含20％FCS(小牛血清)的2倍濃縮的RPMI1640

1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。

0.5％瓊脂：由

份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

② 用上述0.5％瓊脂液(含有飼養(yǎng)細(xì)胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。

④ 1ml 0.5％瓊脂液(42℃預(yù)熱)在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。⑤ 混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于 37℃，5％CO2孵箱中。

⑥ 4～5天后即可見(jiàn)針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔

板中進(jìn)行培養(yǎng)。

⑦ 檢測(cè)抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要時(shí)再克隆化。

(二)雜交瘤細(xì)胞的凍存

及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊](méi)有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒(méi)有原始細(xì)胞的凍存，則因?yàn)樯鲜龅囊馔舛ΡM棄。

雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)滿(mǎn)孔底時(shí)，一孔就可以?xún)鲆恢О碴场?/p>

細(xì)胞凍存液:

50％小牛血清

40％不完全培養(yǎng)液

10％ DMSO(二甲亞砜)

凍存液最好預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降到0℃，再降溫時(shí)一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中?；蚣?xì)胞管降至0℃ 后放-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。

五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)

大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：

1.體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg／ml，如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。

2.體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。

① 實(shí)體瘤法 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射

.2 ml, 共2～4點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般10～20天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mg／ml。但采血量有限。

② 腹水的制備 常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石臘于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來(lái)，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。

六、單克隆抗體的鑒定

對(duì)制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對(duì)其做如下方面的鑒定:

.抗體特異性的鑒定：除用免疫原(抗原)進(jìn)行抗體的檢測(cè)外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用ELISA、IFA法。例如①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。② 制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無(wú)交叉。

2.McAb的Ig類(lèi)與亞類(lèi)的鑒定：一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類(lèi)型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測(cè)出來(lái)的抗體一般是IgG類(lèi)或IgM類(lèi)。至于亞類(lèi)則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類(lèi)血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來(lái)確定McAb的亞類(lèi)。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí)，如加入適量的PEG(3％)，將有利于沉

淀線的形成。

3.McAb中和活性的鑒定：用動(dòng)物的或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定McAb的生物學(xué)活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來(lái)觀察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。

4.McAb識(shí)別抗原表位的鑒定：用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、測(cè)相加指數(shù)的方法，測(cè)定McAb所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來(lái)確定McAb

識(shí)別的表位是否相同。

5.McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來(lái)確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。

七、影響因素、失敗原因分析

由于制備McAb的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會(huì)造成失敗。

其主要失敗原因和影響因素有:

1.污染：包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問(wèn)題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來(lái)源于牛血清，此外，其它添加劑、實(shí)驗(yàn)室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實(shí)驗(yàn)室，要對(duì)每一批小牛血清和長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時(shí)采取措施處理。對(duì)于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過(guò)濾方法，將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長(zhǎng)出腹水或?qū)嶓w瘤時(shí)，犖^菌取出分離雜交瘤細(xì)胞，一般可除去支原體污染。

2.融合后雜交瘤不生長(zhǎng)：在保證融合技術(shù)沒(méi)有問(wèn)題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。②牛血清的質(zhì)量太差，用前沒(méi)有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。③骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。④HAT有問(wèn)題，主要是A含量過(guò)高或HT含量不足。

3.雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體

① 融合后有細(xì)胞生長(zhǎng)，但無(wú)抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞所致。

② 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

③ 對(duì)于原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮裕赡苁羌?xì)胞支原體污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，從而抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

三要:

要大量保持和補(bǔ)充液氮凍存的細(xì)胞原管。

要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。

要定期進(jìn)行再克隆。

三不要:

不要讓細(xì)胞“過(guò)度生長(zhǎng)”。因?yàn)榉欠置诘碾s交瘤細(xì)胞將成為優(yōu)勢(shì)，壓倒分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。

不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個(gè)月。

不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機(jī)體內(nèi)以腫瘤生長(zhǎng)形式連續(xù)傳好幾代。

.雜交瘤細(xì)胞難以克隆化

可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細(xì)胞的活性狀態(tài)有關(guān)，或由于細(xì)胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應(yīng)在培養(yǎng)液加HT。

第二篇：?jiǎn)慰寺】贵w生產(chǎn)的雜交瘤技術(shù)

Hybridoma Technology for the Generation of Monoclonal Antibodies(mAbs)單克隆抗體生成的雜交瘤技術(shù) Abstract 1 Introduction 2 Materials

2.1 Preparation of splenocytes 2.1 脾細(xì)胞制備 spleens from immunized mice 免疫小鼠的脾臟 RPMI-1640 medium(Serum-free cell freezing medium)無(wú)血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基 無(wú)血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基 3 Petri dishes 有蓋培養(yǎng)皿 Sterile surgical instruments,including microdissecting scissors and forceps,for collecting animal samples 用于收集動(dòng)物樣品的無(wú)菌手術(shù)器械，包括顯微解剖剪和鉗子，5 sterile microscope glass slide with frosted ends 磨砂的的無(wú)菌顯微玻片 6 15-ml conical tubes 15-ml 錐形瓶

2.2 Preparation of myeloma cells as the fusion partner 作為融合頭（融合標(biāo)簽）的骨髓瘤細(xì)胞的制備 2.3 cell fusion 細(xì)胞融合

2.4 hybridoma screening by FACS 2.5 hybridoma screening by ELISA 通過(guò)ELISA進(jìn)行雜交瘤篩選 2.6 hybridoma screening by IHC 2.7 hybridoma subcloning 2.8 hybridoma cryopreservation 低溫保存雜交瘤細(xì)胞 2.9 antibody isotyping 抗體同型

2.10 thawing and growth of hybridoma cells 雜交瘤細(xì)胞的融化和生長(zhǎng)methods 3.1 preparation of splenocytes from the immunized mouse 來(lái)自免疫鼠的脾細(xì)胞的制備 3.2 preparation of myeloma cells 骨髓瘤細(xì)胞的制備 3.3 cell fusion 細(xì)胞融合

3.4 hybridoma screening using flow cytometry 通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行雜交瘤篩選 3.5 hybridoma screening by ELISA 通過(guò)ELISA進(jìn)行雜交瘤篩選 3.6 hybridoma screening by IHC 通過(guò)免疫組化進(jìn)行雜交瘤篩選 3.7 hybridoma subcloning 雜交瘤亞克隆

3.8 hybridoma cryopreservation 雜交瘤低溫保存 3.9 antibody isotyping 抗體同型

3.10 Thawing and growth of hybridoma cells 雜交瘤細(xì)胞的融化和生長(zhǎng) 4 小記 參考文獻(xiàn)

第三篇：個(gè)人技術(shù)總結(jié)

2005年個(gè)人技術(shù)總結(jié)

繁忙的一年就要結(jié)束了，總結(jié)這一年工作感覺(jué)收獲頗豐，學(xué)到了很多新知識(shí)并且在實(shí)際工作中都得以應(yīng)用。

今年上半年1~6月份在牡綏線負(fù)責(zé)初測(cè)和定測(cè)的深孔鉆探技術(shù)管理工作，說(shuō)實(shí)話(huà)對(duì)于深孔鉆探管理還是第一次，有很多東西也不太明白，甚至不懂。在高級(jí)鉆探技師的幫助和指導(dǎo)下，虛心學(xué)習(xí)，認(rèn)真請(qǐng)教，不懂的地方及時(shí)請(qǐng)教很快掌握基礎(chǔ)知識(shí)和要領(lǐng)，很快就進(jìn)入了角色，對(duì)深孔鉆探進(jìn)行管理。在管理過(guò)程中遇到問(wèn)題及時(shí)請(qǐng)教及時(shí)總結(jié)，避免走彎路使鉆探工作順利進(jìn)行。代馬溝（磨刀石）隧道共計(jì)有30個(gè)鉆孔，最深的288.0米，最淺的孔只有30.0米。為了保證在工期內(nèi)完成，我根據(jù)各單位鉆機(jī)情況和鉆探技術(shù)水平合理安排鉆孔，盡最大能力的發(fā)揮出各自的優(yōu)勢(shì)，以最快的速度和質(zhì)量完成任務(wù)。通過(guò)這半年的學(xué)習(xí)和實(shí)踐使我又學(xué)到了許多書(shū)本上學(xué)不到的知識(shí)，更加完善了自己，為今后的工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

下半年受分院的指派被借調(diào)到地路處參加滬昆線地質(zhì)勘察管理工作，主要負(fù)責(zé)深孔鉆探的管理和指導(dǎo)工作。這些鉆孔地處高山峻嶺之中，最大孔深達(dá)765米，一般孔身在150~200米，分布在全段150千米范圍之內(nèi)，地層主要以板巖 花崗巖為主，板巖的產(chǎn)狀比較陡立，在鉆探過(guò)程中很容易跑偏造成孔斜，也容易發(fā)生孔內(nèi)事故，甚至影響工期。根據(jù)這些情況和特性，及時(shí)與鉆探負(fù)責(zé)人及鉆探技術(shù)人員溝通共同研究預(yù)防措施，提出建議，完善施工預(yù)案，使鉆探工作得以順利進(jìn)行。

工作中嚴(yán)格要求認(rèn)真檢查發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)糾正，不放過(guò)任何不符合規(guī)程 規(guī)范的死角。每天翻山越嶺奔波在各工點(diǎn)之間檢查與指導(dǎo)，深受各單位的歡迎。

這半年來(lái)將上半年所學(xué)到和掌握的深孔知識(shí)得到了充分應(yīng)用和發(fā)揮，為今后的工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

在管理深孔鉆探的同時(shí)還負(fù)責(zé)淺孔鉆探的巡視工作，這些鉆孔的地層分別以石灰?guī)r和花崗巖為主，石灰?guī)r地區(qū)溶洞很發(fā)育，直徑也較大，對(duì)工程的影響很大，如果在鉆探時(shí)不能提供準(zhǔn)確的地質(zhì)資料就會(huì)埋下禍根，造成很大的損失。所以在巡視中認(rèn)真檢查嚴(yán)格把關(guān)堅(jiān)持原則不放過(guò)任何不符合要求的鉆孔，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)有質(zhì)量問(wèn)題絕不放過(guò)，及時(shí)采取補(bǔ)救措施或重干。

通過(guò)這一段時(shí)間的工作又學(xué)到了很多知識(shí)進(jìn)一步豐富了自我，同時(shí)也得到了認(rèn)可。受到了項(xiàng)目部及各委外單位的好評(píng)。

今后，還需要加強(qiáng)學(xué)習(xí)不斷完善自我，發(fā)揮出更大的作用。

XXX地質(zhì)隊(duì)

XX

2005年12月20日

第四篇：個(gè)人技術(shù)總結(jié)

個(gè)人技術(shù)工作總結(jié)

本人從事工程項(xiàng)目施工管理16年，現(xiàn)結(jié)合工作實(shí)際，總結(jié)下園林植物種植工程質(zhì)量控制要點(diǎn) ：

1、植物種植點(diǎn)放樣必須符合設(shè)計(jì)要求，并標(biāo)明定點(diǎn)位置，樹(shù)種名稱(chēng)、規(guī)格；

2、喬木土球挖掘規(guī)格

土球直徑（cm）按胸高直徑的8倍，土球厚度按胸高直徑7倍；

3、灌木土球挖掘規(guī)格

土球直徑（cm）按冠徑的80%，土球厚度按冠徑60%；

4、竹類(lèi)土臺(tái)挖掘規(guī)格

（1）必須選擇2年生的邊緣竹子為竹母；

（2）近距離移植必須多帶宿土，來(lái)去鞭可適當(dāng)放小，但地下鞭必須帶有隱芽，否則就不發(fā)筍，延誤竹林的滿(mǎn)園；

5、樹(shù)木種植穴（或槽—指散生竹）規(guī)格，必須符合設(shè)計(jì)要求

坑（穴）的直徑大于土球或裸根苗根系約40CM，深度同土球或裸根系的直徑，但必須松翻底土10CM以上，坑（穴）上下垂直，另外高燥砂性土地樹(shù)穴宜稍深，低洼粘土地可稍淺，樹(shù)穴提前2-3天開(kāi)挖，以日光曬穴；

6、樹(shù)木土球的包扎

土球的包扎常用草繩包扎，采用橘子瓣、五角形、銅線形皆可；但必須做到牢固、不露根、不掉土、確保土球不破碎、不脫綁；對(duì)名貴大樹(shù)的包扎，除了用草纏繞，還必

須用細(xì)麻繩子等加固包扎；

7、樹(shù)木挖掘

（1）挖掘裸根樹(shù)木一定要用銳器，直徑3CM以上的根要用鋸鋸斷；傷口務(wù)必齊整；細(xì)根可用剪枝剪剪斷，不得強(qiáng)拉或劈斷，盡量保護(hù)毛細(xì)根；

（2）挖掘帶土球樹(shù)木，用銳利鐵鍬，保證不使土球松散，在整修土球時(shí)必須先扎腰箍；

8、樹(shù)木運(yùn)輸前的修剪

（1）修剪可在樹(shù)木挖掘前或后進(jìn)行皆可，但大樹(shù)必須在挖掘前修去一部分非留枝；

（2）修剪強(qiáng)度要根據(jù)樹(shù)木的生物學(xué)特性、不同季節(jié)而定，以保證良好的姿態(tài)為前提來(lái)確定修剪量；（3）樹(shù)木修剪要符合設(shè)計(jì)要求；

9、樹(shù)木的裝運(yùn)

裝運(yùn)時(shí)應(yīng)做到：輕抬、輕卸、輕裝、輕放嚴(yán)禁拖拉，保證土球不破碎根盤(pán)無(wú)擦傷、無(wú)撕裂、不傷干、不折冠，嚴(yán)禁提拉主干裝卸帶土球樹(shù)木；不得損傷竹竿和竹鞭之間的鞭芽；

10、樹(shù)木種植時(shí)的修剪

（1）種植前應(yīng)對(duì)苗木根系、樹(shù)冠進(jìn)行修剪，必須將劈裂、病蟲(chóng)、過(guò)長(zhǎng)的根系以及徒長(zhǎng)、過(guò)密、平行的枝條剪除，確保樹(shù)木良好的自然姿態(tài)；

（2）剪口（或鋸口）大于2CM的，必須進(jìn)行消毒防腐處理；

（3）行道樹(shù)定干高度宜在3M，香樟可定在2.5M以上，第一分枝點(diǎn)以下側(cè)枝全部剪除，分枝點(diǎn)以上枝條酌情疏剪或短截；

（4）高大落葉喬木應(yīng)保留原有樹(shù)形，適當(dāng)疏剪，保留的主側(cè)枝應(yīng)在健壯芽上短截，剪去1/5—1/3枝條；

（5）常綠針葉樹(shù)不宜修剪，只剪去病蟲(chóng)枝、枯死枝、衰弱枝、過(guò)密枝與輪生枝、下垂枝和機(jī)械磨損枝；

（6）常綠闊葉樹(shù)基本保證樹(shù)形，收縮樹(shù)冠，正常季節(jié)種植疏剪樹(shù)冠總量1/3—3/5，保留主骨架，截去外圍枝條，疏稀樹(shù)冠內(nèi)膛枝，摘除大部分樹(shù)葉；

（7）花灌木以疏剪老枝為主，短截為輔；綠籬、球類(lèi)修剪必須整齊一致，線條挺拔，造型美觀，切口平整，園藝效果好；

11、樹(shù)木的種植

樹(shù)木種植要做到：“四隨”即“隨挖、隨運(yùn)、隨種、隨管”，如遇惡劣天氣，必須采取措施保護(hù)樹(shù)木土球；

（1）進(jìn)場(chǎng)苗木必須當(dāng)天種植完畢，否則必須做好假植處理；

（2）樹(shù)木定向及排列；

樹(shù)木種植時(shí)應(yīng)選擇樹(shù)冠豐滿(mǎn)完整、生長(zhǎng)好、姿態(tài)美，面朝向主要視線；孤植樹(shù)木的冠幅應(yīng)完整；叢植樹(shù)木將冠幅飽滿(mǎn)的一面朝外，并做到前低后高；藤本植物應(yīng)栽在建筑物或棚架基部，并將枝蔓固定在墻面或支架上；

（3）種植深度

種植深度應(yīng)保證在土壤下沉后，根莖和地面等高或略高；竹類(lèi)應(yīng)較原來(lái)的深度加深5—10CM，四周?chē)o，培土搗實(shí)，勿傷鞭芽；

（4）土球包裝物、培土、澆水

1）土球包裝物，必須自下而上取下包裝物，泥球如松散，底下包裝物可剪斷不取出；

2）填土達(dá)到土球深度2/3時(shí)，初步覆土夯實(shí)，澆足第一次水，待水份滲透后繼續(xù)填土至地面平行，再澆第二次水，然后再填好種植土；

（5）樹(shù)木垂直度、支撐、和繞桿

1）種植時(shí)應(yīng)注意樹(shù)干垂直不彎斜，注意樹(shù)體重心的穩(wěn)定；

2）支撐應(yīng)因樹(shù)設(shè)樁，（十字架撐、扁擔(dān)撐、三角撐、單柱撐皆可）；

3）支撐時(shí)嚴(yán)禁將竹木樁打穿土球或損傷根盤(pán)；

4）支撐高度，必須控制在樹(shù)主干高的1/2；

5）單支撐必須立于盛行風(fēng)向一面，扎縛必須用軟性物墊襯，還必須做到牢固、整齊、美觀；

6）喬木干徑在5CM以上的主干和一、二級(jí)主枝，必須進(jìn)行繞桿，繞干的高度視樹(shù)種不同而不同，必須用草繩或麻片等軟性材料密密纏繞，必須做到牢固、整齊、美觀；

（6）喬灌木定植數(shù)量

喬木、大灌木的種植數(shù)量必須符合設(shè)計(jì)要求。

二○一二年九月

第五篇：個(gè)人技術(shù)總結(jié)

個(gè)人專(zhuān)業(yè)技術(shù)總結(jié)

工作單位：中交二公局第四工程有限公司作者：陽(yáng)曉明

2017年5月

個(gè)人工作技術(shù)總結(jié)

本人陽(yáng)曉明，于2007年7月進(jìn)入中交二公局四公司工作，2011年11月受聘工程師職稱(chēng)。期間先后在四川成綿樂(lè)鐵路6標(biāo)二分部、青?；ň?0標(biāo)、西藏林拉5標(biāo)，河南機(jī)西高速二期1標(biāo)等項(xiàng)目擔(dān)任工程部部長(zhǎng)、副總工，工區(qū)長(zhǎng)等職務(wù)，從事項(xiàng)目現(xiàn)場(chǎng)施工管理、工程變更管理、安全質(zhì)量技術(shù)管理等工作。目前擔(dān)任鄭州機(jī)西高速二期1標(biāo)的項(xiàng)目副總工，主要在分管項(xiàng)目大型交叉施工以及特殊結(jié)構(gòu)的技術(shù)方案制定，工程技術(shù)質(zhì)量管理以及變更等工作。在擔(dān)任工程師期間，我認(rèn)真履行自己的職責(zé)，突出技術(shù)管理的重要性，以提高技術(shù)干部隊(duì)伍素質(zhì)為重點(diǎn)，以強(qiáng)化管理為手段，抓好項(xiàng)目技術(shù)質(zhì)量管理工作，同時(shí)不斷加強(qiáng)學(xué)習(xí)，在過(guò)程中不斷提高自己的業(yè)務(wù)水平，努力創(chuàng)新，積極應(yīng)用四新技術(shù)提高生產(chǎn)效率，降低成本，取得了良好的效果。

一、總結(jié)經(jīng)驗(yàn)、開(kāi)拓創(chuàng)新

擔(dān)任工程師這6年來(lái)，我先后參加過(guò)高速鐵路、高原高速公路、平原高速公路的建設(shè)，期間主持過(guò)高鐵大跨徑跨河道的現(xiàn)澆梁施工，跨越既有線施工；參與了高海拔高寒地區(qū)凍土層防治施工，高橫向落差的路基抗滑移施工；參加了下穿鄭徐高鐵采用新型材料穿越的變更設(shè)計(jì)，黃泛區(qū)軟弱土層處理的變更設(shè)計(jì)；主導(dǎo)了40米箱梁整體式液壓模板的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，平原區(qū)涵洞墻身采用液壓模板的創(chuàng)新，并在實(shí)體上施工取得了成功；編制了跨連霍高速施工的安全技術(shù)方案，鋼箱梁施工的安全技術(shù)方案等。在這幾年從事一線生產(chǎn)過(guò)程中，我不斷的實(shí)踐學(xué)習(xí)，同時(shí)也通過(guò)過(guò)程中的歷練在不斷的自我提升。

做為一名技術(shù)質(zhì)量管理的工作者，在工作中必須要不斷的總結(jié)新的施工工藝與技術(shù)。在項(xiàng)目施工一線隨時(shí)面臨各種技術(shù)問(wèn)題。在解決問(wèn)題的同時(shí)更 應(yīng)該想到的是是否有更好的解決方案，更便捷的方法與技術(shù)，要多探索與研究。在成綿樂(lè)高鐵項(xiàng)目建設(shè)期間，我做為項(xiàng)目的副總工，主持了跨彭溪河特大橋的施工，其中跨越彭溪河的3跨一聯(lián)32m+48m+32m的現(xiàn)澆梁為本橋的控制性工程，原設(shè)計(jì)為掛籃施工，但根據(jù)業(yè)主工期要求，按原設(shè)計(jì)施工工藝實(shí)施，工期無(wú)法保證。通過(guò)與業(yè)主和設(shè)計(jì)單位的溝通，變更施工工藝和設(shè)計(jì)圖，采用滿(mǎn)堂支架法施工。由于跨越河道，需采取特殊的支架跨越型式，工期緊，難度大，風(fēng)險(xiǎn)高。從施工進(jìn)場(chǎng)，就對(duì)河道寬度，汛期，常年水位，最近十年的最大洪水水位和流量等進(jìn)行摸排，參考以往項(xiàng)目的施工經(jīng)驗(yàn)以及高鐵項(xiàng)目的要求，通過(guò)大量的模擬方案組合和經(jīng)濟(jì)性分析比較，最終確定了跨河道采用臨時(shí)樁基礎(chǔ)、鋼管樁加貝雷梁的跨越型式，并邀請(qǐng)局技術(shù)部進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)算，通過(guò)了專(zhuān)家評(píng)審會(huì)審核。本方案的順利實(shí)施保證了工期，得到了業(yè)主單位的一致認(rèn)可，同時(shí)給項(xiàng)目帶來(lái)了可觀的收益以及良好的榮譽(yù)。彭溪河特大橋施工現(xiàn)場(chǎng)代表二局作為鐵路總公司（鐵道部）檢查的觀摩點(diǎn)接受了上級(jí)的觀摩。個(gè)人也獲得多次項(xiàng)目先進(jìn)個(gè)人稱(chēng)號(hào)。

在青藏地區(qū)施工期間，對(duì)高原高寒地區(qū)凍土層施工，通過(guò)查閱資料以及現(xiàn)場(chǎng)查看和大量的實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)土在凍結(jié)過(guò)程中不是都能產(chǎn)生凍脹的，產(chǎn)生凍脹是有條件的。如果條件充分則其凍脹量大，反之則其凍脹量小或不凍脹。因此土的凍脹，一般應(yīng)當(dāng)具有土、水、溫及力四個(gè)條件。通常產(chǎn)生原因主要有：路床頂面不平整,易積水，被浸濕；路基填料不合格不均勻；路基填土的壓實(shí)不均勻(固結(jié)的不均勻);冬季凍結(jié)時(shí)水分向上遷移，在春季時(shí)引起了土結(jié)構(gòu)的變化；路基填筑厚度不足；路基受動(dòng)荷載沖擊與振動(dòng)的影響，使得具有適當(dāng)含水量的粉性土發(fā)生觸變性的液化；路基排水不暢等。針對(duì)問(wèn)題，分析了原因，制定實(shí)施方案，通過(guò)路基試驗(yàn)段總結(jié)如下：一是消除不均勻凍脹。主要是指消除路基病害地段與相鄰地段的凍脹差值，或使這一差值在規(guī) 定距離內(nèi)逐步消失，使線路達(dá)到合乎要求的標(biāo)準(zhǔn)；二是強(qiáng)調(diào)綜合整治的整體效果。各種整治凍害措施的目的、作用和效果不盡相同，各有針對(duì)性和適用范圍。因此要根據(jù)凍害的具體情況分析研究不同措施的互相搭配，注重它們的整體效果，以爭(zhēng)取達(dá)到根除凍害的目的。在此期間，路基施工從多方面嚴(yán)格控制，凍土層防治取得了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。

2015年擔(dān)任河南機(jī)西高速二期1標(biāo)副總工期間，我一直堅(jiān)持實(shí)事求是、求真務(wù)實(shí)的工作作風(fēng)，在工作中嚴(yán)格執(zhí)行公司的規(guī)章制度，按照設(shè)計(jì)文件及規(guī)范結(jié)合自己工作經(jīng)驗(yàn)對(duì)施工技術(shù)人員及現(xiàn)場(chǎng)工人每一個(gè)分項(xiàng)開(kāi)工都進(jìn)行了技術(shù)交底。在每一分項(xiàng)執(zhí)行過(guò)程中嚴(yán)格執(zhí)行首件工程制。多交流、想辦法、多總結(jié)、出成果。在施工過(guò)程中的一些細(xì)節(jié)也總結(jié)出方便、提高工作效率又能保證施工質(zhì)量的好方法，好技術(shù)。

項(xiàng)目剛開(kāi)始進(jìn)場(chǎng)后，對(duì)項(xiàng)目梁場(chǎng)進(jìn)行了精心的策劃，將梁場(chǎng)各個(gè)施工區(qū)進(jìn)行了明確的劃分，項(xiàng)目進(jìn)場(chǎng)就將梁場(chǎng)定位高標(biāo)準(zhǔn)、高起點(diǎn)。在實(shí)施過(guò)程中更是嚴(yán)要求，而且我們也想了好多好的辦法改進(jìn)施工工藝，比如將預(yù)制箱梁鋼筋籠底腹板鋼筋整體綁扎吊運(yùn)，節(jié)約了時(shí)間。比如將錨下加強(qiáng)筋由綁扎改為焊接，節(jié)約了鋼筋。在箱梁噴淋養(yǎng)生方面我們通過(guò)研究制定了整體式移動(dòng)養(yǎng)生棚，改進(jìn)了噴頭，安裝了視頻終端系統(tǒng)，通過(guò)遙控器自動(dòng)控制箱梁養(yǎng)生。

第二預(yù)制梁場(chǎng)參考大岳項(xiàng)目梁場(chǎng)籌建方案打造高標(biāo)準(zhǔn)梁場(chǎng)，從模板的選擇，場(chǎng)地的選用都提前進(jìn)行規(guī)劃。對(duì)傳統(tǒng)的施工工藝進(jìn)行改進(jìn)創(chuàng)新，預(yù)制箱梁外模采用可行走式整體液壓模板，通過(guò)軌道行走系統(tǒng)、液壓升降與平移系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)模板的拆裝。40米外模分為20米兩節(jié)，每節(jié)兩個(gè)液壓行走臺(tái)車(chē)保持平穩(wěn)，模板置于兩個(gè)縱移小車(chē)上沿軌道可以縱向移動(dòng)，每個(gè)小車(chē)設(shè)置水平和垂直兩類(lèi)千斤頂，水平千斤頂能使模板做水平移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)模板的開(kāi)模與合 模，垂直千斤頂使模板上下升降運(yùn)動(dòng)，能調(diào)節(jié)模板高低，可實(shí)現(xiàn)模板安裝的精準(zhǔn)定位，消除漏漿錯(cuò)縫現(xiàn)象。每節(jié)20米外模采用整塊鋼板加工而成，沒(méi)有中間拼縫。有效保證了箱梁外觀質(zhì)量。保證模板的整體拆裝。該套液壓整體式外模有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

1、預(yù)制梁液壓整體式模板消除拼縫，避免了模板反復(fù)拼拆，保證外觀質(zhì)量同時(shí)節(jié)省了勞動(dòng)力成本一半以上。

2、外模板拆裝不需要龍門(mén)吊配合，節(jié)省了2臺(tái)15t龍門(mén)吊，節(jié)約設(shè)備費(fèi)用約70萬(wàn)。

3、施工過(guò)程中外模板拆裝效率大幅提高，拆裝模板3個(gè)工人在30分鐘內(nèi)即可完成。

4、預(yù)制梁液壓整體式模板機(jī)械化水平高，定位精準(zhǔn)，誤差小，大大的提高了箱梁施工水平。

5、通過(guò)液壓系統(tǒng)調(diào)整運(yùn)輸模板，大大降低了安全風(fēng)險(xiǎn)，減少了安全隱患。箱梁內(nèi)模同樣采用整體液壓式模板，內(nèi)模系統(tǒng)包括可收縮式內(nèi)模、拆裝臺(tái)車(chē)、卷?yè)P(yáng)機(jī)3部分。40米箱梁內(nèi)模整體分為兩節(jié)20米內(nèi)模，模板在橫隔板處分為兩節(jié)，整體內(nèi)模板采用合頁(yè)形式連接，上下合頁(yè)之間采用聯(lián)動(dòng)桿的鉸接形式，在聯(lián)動(dòng)桿上設(shè)置液壓千斤頂，利用液壓千斤頂水平頂升上下連桿鉸鏈，使內(nèi)模在斷開(kāi)處可以實(shí)現(xiàn)彎曲，縮小斷面尺寸，實(shí)現(xiàn)內(nèi)模的收縮，使內(nèi)模與混凝土分離。利用卷?yè)P(yáng)機(jī)將縮小的模板抽拔水平拉出在拆裝臺(tái)車(chē)上。在拆裝臺(tái)車(chē)上通過(guò)液壓千斤頂?shù)幕乜s，實(shí)現(xiàn)模板伸開(kāi)復(fù)位。該抽拔式內(nèi)模優(yōu)點(diǎn)如下：

1、大幅提高了內(nèi)模拆拼模板效率，一個(gè)人完成了十個(gè)人的工作量，3個(gè) 工人在30分鐘內(nèi)即可完成模板的拆裝和拼裝。

2、采用液壓整體抽拔內(nèi)模拆除時(shí)工人不需要進(jìn)入箱室內(nèi)，在箱室外操作液壓油泵與卷?yè)P(yáng)機(jī)即可完成，改善了工人勞動(dòng)環(huán)境，降低了工人勞動(dòng)強(qiáng)度。

3、采用液壓整體抽拔內(nèi)模在拼裝臺(tái)車(chē)上用液壓油缸即可復(fù)原，完成內(nèi)模拼裝，安裝施工效率實(shí)現(xiàn)質(zhì)的突破。

4、內(nèi)模采用大塊鋼模板加工而成，接縫少，整體性好，避免內(nèi)模上浮，有效的提高了箱室內(nèi)混凝土的外觀質(zhì)量。

采用技術(shù)創(chuàng)新對(duì)施工工藝以及機(jī)具進(jìn)行了改進(jìn)，消除了人為因素對(duì)梁體質(zhì)量的影響，改善工人勞動(dòng)環(huán)境，斜角度40米箱梁整體式液壓模板屬于國(guó)內(nèi)首創(chuàng)。迎來(lái)了河南省全省觀摩，獲得了一致好評(píng)，同時(shí)第二預(yù)制場(chǎng)的箱梁預(yù)制今年也通過(guò)了質(zhì)監(jiān)站的驗(yàn)收，被評(píng)為河南省樣板工程，為公司站穩(wěn)河南市場(chǎng)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

二、技術(shù)、質(zhì)量管理進(jìn)一步認(rèn)識(shí)

這幾年以來(lái)不論是從技術(shù)層面還是管理層面雖然我也取得了一些成績(jī)，但是還存在很多的不足，要面對(duì)各方各面的檢查與事務(wù)，有的時(shí)候變得急躁，沒(méi)有耐心，總是以自己經(jīng)驗(yàn)來(lái)判斷問(wèn)題，沒(méi)有更加深入分析原因。作為技術(shù)質(zhì)量的管理者，經(jīng)驗(yàn)確實(shí)很重要，但是具體問(wèn)題更應(yīng)該具體分析，更應(yīng)該時(shí)刻去學(xué)習(xí)，提高自己的業(yè)務(wù)水平與工作能力，過(guò)程當(dāng)中更應(yīng)該以嚴(yán)謹(jǐn)、細(xì)致的心態(tài)去面對(duì)問(wèn)題。這幾年隨著高速公路的發(fā)展，業(yè)主、監(jiān)理對(duì)我們的工作要求更細(xì)致，標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越高，注重的更多的是結(jié)果，雖然過(guò)程中我們付出了心血與汗水，但是我覺(jué)得還是做得不夠，我覺(jué)得更應(yīng)該要有超前意識(shí)，想到別人之上，做到別人之前。隨著技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)提高，社會(huì)監(jiān)管力度加大，質(zhì)量要 求越來(lái)越嚴(yán)，我們的成本在逐年增加，效益在逐年減少，顯然對(duì)項(xiàng)目管理來(lái)說(shuō)應(yīng)該越來(lái)越細(xì)，越來(lái)越規(guī)范化。通過(guò)每一道工序起始的技術(shù)交底，施工工藝和設(shè)備機(jī)具的小創(chuàng)新活動(dòng)以及工序完成的總結(jié)，全面推進(jìn)樣板工程建設(shè)，并以樣板工程為指導(dǎo)，全面提高總體施工技術(shù)、質(zhì)量水平。

三、存在的不足與進(jìn)一步的提高

在工作的過(guò)程中，隨著接觸的工作內(nèi)容的不斷更新，越來(lái)越能感覺(jué)到自己的不足。隨著行業(yè)不斷發(fā)展，施工工藝要求更加精湛，施工水平要求不斷提高，標(biāo)準(zhǔn)化施工演變?yōu)槌B(tài)。對(duì)工程成品的滿(mǎn)意度也在逐年提升。對(duì)于我來(lái)說(shuō)，壓力也越來(lái)越大，技術(shù)儲(chǔ)備還沒(méi)有達(dá)到更高要求，精力分散較多，需要進(jìn)一步提升自身業(yè)務(wù)能力，進(jìn)一步提升標(biāo)準(zhǔn)化、精細(xì)化施工管理水平，進(jìn)一步對(duì)管理創(chuàng)新、設(shè)計(jì)創(chuàng)新、技術(shù)創(chuàng)新、工藝創(chuàng)新、材料創(chuàng)新、設(shè)備創(chuàng)新的探索與應(yīng)用。改進(jìn)工作方式方法，把工作中的得失和每次出現(xiàn)的問(wèn)題記下來(lái)以便吸取經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，遇到疑難問(wèn)題要及時(shí)查閱相關(guān)資料并與他人溝通，耐心的聽(tīng)取他人提出的建議。在進(jìn)行每一項(xiàng)施工任務(wù)前，先擺正自己態(tài)度，樹(shù)立工作目標(biāo)，不急不躁，然后再投入到生產(chǎn)活動(dòng)中去，在施工過(guò)程中要經(jīng)常提醒自己那些是不能觸碰的紅線。

隨著行業(yè)發(fā)展，技術(shù)質(zhì)量管理既是鋪路石又是敲門(mén)磚。做為一名技術(shù)質(zhì)量管理者要開(kāi)拓思路，不斷的學(xué)習(xí)，不斷的總結(jié)，才能不斷的提高，不斷的進(jìn)步。要以技術(shù)創(chuàng)新為動(dòng)力，通過(guò)創(chuàng)新來(lái)提高施工水平，提高生產(chǎn)效率，從而實(shí)現(xiàn)個(gè)人和企業(yè)更大的發(fā)展。