第一篇：PCR技術(shù)原理及心得.

PCR技術(shù)原理與心得體會

PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi),有些最好于當(dāng)日電泳檢測,大于48h 后帶型不規(guī)則甚致消失。

一.假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板:①模板中含有雜蛋白質(zhì),②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時,不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴(kuò)增,對策為:①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul,應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。

物理原因:變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計,檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會成功的。

二.假陽性,出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 1.假陽性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。引物設(shè)計不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時,擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:①操作時應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時,在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片

段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。

2.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,或大或小,或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR 循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有:①必要時重新設(shè)計引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸。

3.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有:①減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。

三.PCR污染與對策

PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性,但令人頭痛 的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。污染原因

(一標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,或標(biāo)本放置時,由于密封不嚴(yán)溢于容器外,或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,導(dǎo)致彼此間的污染。

(二PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題,因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染,就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管,開蓋時、吸樣時及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝,因而由 其造成的污染是一個值得特別重視的問題.(四實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗(yàn)室,這個問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力,其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測

一個好的實(shí)驗(yàn)室,要時刻注意污染的監(jiān)測,考慮有無污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。

四.對照試驗(yàn)

1.陽性對照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照,它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標(biāo)志。陽性對照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,如以重組質(zhì)粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100個拷貝以下,但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本,其對檢測或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時,在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對照。

2.陰性對照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對照。它包括①標(biāo)本對照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以監(jiān)測試劑是否污染。

3.重復(fù)性試驗(yàn)

4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 五.防止污染的方法

(一合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用,實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

(二吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取模板

核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免 交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。(三預(yù)混和分裝 PCR 試劑:所有的 PCR 試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR 反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會。另外，PCR 試劑，PCR 反應(yīng)液應(yīng)與樣品及 PCR 產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。(四防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使 用。(五設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最 低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一 管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照。(六減少 PCR 循環(huán)次數(shù)，只要 PCR 產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止。(七選擇質(zhì)量好的 Eppendorf 管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。呵呵 其實(shí) DNA（或 RNA）的提取方法及 DNA 的質(zhì)量也很關(guān)鍵 例如：SDS 法和 CTAB 法提取的 DNA 與 RNA 的 PCR 結(jié)果有很大的差異的。呵呵。

第二篇：熒光PCR檢測原理

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，利用熒光信號來實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板濃度進(jìn)行定量分析。其特點(diǎn)有：

(1)用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，進(jìn)行實(shí)時動態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測，避免終點(diǎn)定量的不準(zhǔn)確性，并且消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。

(2)熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或熒光探針特異結(jié)合木得檢測物等方法獲得，打打提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。Real-time O-PCR可以應(yīng)用于mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測、單核苷酸多態(tài)性的測定、細(xì)胞因子的表達(dá)分析、腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的基本原理

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長。儀器可以自動檢出，利用熒光信號積累，實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，在PCR循環(huán)中，測量的信號將作為熒光閾值的坐標(biāo)。并且引入一個——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測到得熒光信號所需的最小循環(huán)數(shù)，是在PCR循環(huán)過程中熒光信號由本底開始進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。熒光閾值相當(dāng)于基線熒光信號的平均信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般認(rèn)為在熒光閾值以上所測出的熒光信號是一個可信的信號，可以用于定義一個樣本的Ct值。通常用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算相對方程式。

方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析需要存在一個高相關(guān)系數(shù)（R2＞0.99），這樣才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)的過程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個方程式計算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中自動地計算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用 1.基因工程研究領(lǐng)域

① 基因表達(dá)研究：對β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進(jìn)行檢測，其結(jié)果特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確，為了解β地中海貧血的分子病理機(jī)制及其臨床診斷提供了可靠的檢測數(shù)據(jù)。

② 轉(zhuǎn)基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)閾值，擴(kuò)增一個轉(zhuǎn)移后的基因和一個對照基因，以分析轉(zhuǎn)基因老鼠接合性。該方法為45個轉(zhuǎn)基因動物的同型結(jié)合及異質(zhì)結(jié)合提供了明確的鑒定結(jié)果。通過實(shí)時定量PCR檢測，同型結(jié)合的異質(zhì)接合動物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律。這項(xiàng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中將有很大的用途。③ 單核苷酸多態(tài)性（SNP）及突變分析：實(shí)時熒光定量PCR一個誘人的應(yīng)用前景是用于檢測基于兩條探針和基因組的不穩(wěn)定性?；蛲蛔兓趦蓷l探針，一條探針橫跨突變點(diǎn)，另一條為錨定探針，與無突變位點(diǎn)的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對，如有突變，則探針與靶序列不完全配對，會降低雜交體得穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。2.醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域

① 病原體檢測：由于實(shí)時熒光定量PCR方法可靠性和重復(fù)性好，并且操作簡便、快速、結(jié)果判斷客觀，目前，人們用此方法對人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結(jié)核桿菌、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測。熒光定量PCR問世后的幾年中，積累了大量有關(guān)病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后之間關(guān)系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。

② 藥物療效考核：利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測臨床樣品中與抗藥性相關(guān)的基因的表達(dá)。結(jié)果證明，實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)是定量檢測抗藥基因表達(dá)的可靠方法，應(yīng)用這種技術(shù)可以預(yù)測化療將引起的反應(yīng)。

③ 腫瘤基因檢測：腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實(shí)時熒光定量PCR方法都可以檢測出來。

目前用此方法進(jìn)行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤MDRI基因、白血病WTI基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)。熒光定量PCR技術(shù)將會在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。3.其他領(lǐng)域

用實(shí)時熒光定量PCR方法對免疫組分進(jìn)行分析是其應(yīng)用的重要方面。

所謂實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。檢測方法

1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖

PCR產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性）2.TaqMan探針法：

探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。服務(wù)流程

1.客戶認(rèn)真寫好訂單，提供待檢基因相關(guān)信息； 2.簽訂技術(shù)服務(wù)合同，支付預(yù)付款（30-50%)；

3.設(shè)計合成定量PCR引物（或客戶提供文獻(xiàn)引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反轉(zhuǎn)錄；

5.PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)，主要檢測引物的特異性和擴(kuò)增效率； 6.正式定量實(shí)驗(yàn)：對所有樣品上機(jī)檢測； 7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)分析，形成報告。收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)

優(yōu)惠包干價：120元/樣/基因（SYBRgreenI法，相對定量）

（含RNA提取，反轉(zhuǎn)錄，引物合成費(fèi)用，上機(jī)測試費(fèi)用（3個重復(fù)）；一個內(nèi)參免費(fèi)（內(nèi)參3個重復(fù)）Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

（如圖1所示）。

1.熒光閾值（threshold）的設(shè)定

PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺?。J(rèn)）設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15 2.Ct值與起始模板的關(guān)系

每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下。Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率，N為熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時擴(kuò)增產(chǎn)物的量。

起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實(shí)時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下： 1.TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。

2.SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3.分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。1．傳統(tǒng)定量PCR方法簡介

1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。2．內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用

由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測，即PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．內(nèi)標(biāo)對定量PCR的影響

若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的： 1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。各級各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。

由于qPCR是實(shí)時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨(dú)到優(yōu)勢。

第三篇：pcr檢測技術(shù)

《食品安全學(xué)》綜述

PCR快速檢測技術(shù)綜述

1．前言

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，是肉眼能直接觀察和判斷；可從一根頭發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾個星期才能做到的事情，用PCR幾個小時便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。

該酶促反應(yīng)最基本的3個環(huán)節(jié)是：[1]模板DNA的變性，即在94℃下模板雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA；[2]引物與模板鏈的特異性復(fù)性；[3]引物鏈的延伸。

2.研究的目的與意義

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)建立以來，定性技術(shù)不斷改進(jìn)和完善，可以達(dá)到檢測單個靶序列的水平、但實(shí)際工作中常需要定量檢測標(biāo)本中核酸，而不是某一特定序列存在與否，借助PCR對基因快速、敏感、特異而準(zhǔn)確定量成為目前分子生物學(xué)技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。定量PCR旨在評估樣品中靶分子數(shù)，此測定可以是絕對的，如每微克樣本中靶DNA的分子數(shù)；也可以是相對定量，即與設(shè)定的內(nèi)參照或外參照比較而言。鑒于PCR方法主要有5個，即對PCR產(chǎn)物的直接定量、極限稀釋法、靶基因與參照基因的同步擴(kuò)增、競爭性PCR和熒光定量PCR[1]。這幾種放啊各有利弊，對其選擇取決于靶基因的特性、對PCR產(chǎn)量的期望值、對準(zhǔn)確度的要求、需要相對還是絕對定量。

人類對于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。20世紀(jì)60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)。但是，由于核酸的含量較少，一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想。但是，當(dāng)時的基因序列分析方法尚未成熟，對熱具有較強(qiáng)穩(wěn)定性的DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動合成階段，這種想法似乎沒有任何實(shí)際意義。

1985年，美國科學(xué)家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過兩年的努力，發(fā)明了PCR技術(shù)，并在Science雜志上發(fā)表了關(guān)于PCR技術(shù)的第一篇學(xué)術(shù)論文。從此，PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎。

但是，最初的PCR技術(shù)相當(dāng)不成熟，在當(dāng)時是一種操作復(fù)雜、成本高昂、“中看不中用”的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。1988年初，Keohanog通過對所使用的酶的改進(jìn)，提高了擴(kuò)增的真實(shí)性。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高。也正是由于此酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR技術(shù)得到了廣泛地應(yīng)用，使該技術(shù)成為遺傳與分子生物學(xué) 分析的根本性基石。在以后的幾十年里，PCR方法被不斷改進(jìn)：它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測定；從原先只能擴(kuò)增幾個kb的基因到目前已能擴(kuò)增長達(dá)幾十個kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。3.國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

3.1.基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用

目前從事分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說幾乎沒有一個分子生物學(xué)家沒有使用過PCR。因此，PCR與分子克隆一樣是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，可用于達(dá)到以下目的：

[1] 擴(kuò)增目的基因和鑒定重組子； [2]克隆基因；

[3]基因功能和表達(dá)調(diào)控的研究； [4]基因組測序； [5]制備單鏈模板； [6]致突變；

3.2.PCR在臨床上的應(yīng)用[2]

[1]在遺傳學(xué)上的應(yīng)用：人類的遺傳性疾病是因?yàn)槟骋粔A基序列發(fā)生了突變，使之缺失或形成某一限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，通過PCR結(jié)合限制片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP），就可以從基因的水平對遺傳性疾病進(jìn)行分析。例如，血友病甲是一種常見的遺傳性出血性疾病，患者體內(nèi)缺乏凝血因子FVIII這是由于基因第14個外顯子的第336位氨基酸的編碼基因發(fā)生了突變，產(chǎn)生了一個新的PstI酶切點(diǎn)，因此可以使用PCR-RFLP對血友病進(jìn)行診斷。PCR還可以用來檢測遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病。

[2]在腫瘤研究中的應(yīng)用：PCR已日益廣泛應(yīng)用于腫瘤的病因與發(fā)病機(jī)理研究以及腫瘤診斷與治療的研究中。例如，差異顯示PCR技術(shù)能針對不同腫瘤尋找其特異而敏感的標(biāo)志物，并用于腫瘤早期診斷、判斷預(yù)后及療效評估。另一方面，在使用普通放療、化療的同時可結(jié)合定量PCR技術(shù)檢測微小殘留病灶，以進(jìn)一步改進(jìn)治療方案。此外，由于癌癥的發(fā)生在一定意義上是單個細(xì)胞分子發(fā)生變化，因而可以使用單細(xì)胞PCR技術(shù)對癌癥的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究。[3]在基因分型中的應(yīng)用：當(dāng)進(jìn)行器官移植時并須先組織配型工作，此時常應(yīng)用序列特異性寡核苷酸多態(tài)性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）對人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）進(jìn)行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段長度多態(tài)性也可以用于對HLA的分型。3．3.在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[3]

例如：最早應(yīng)用DNA限制性片段長度多態(tài)性結(jié)合PCR-RFLP來進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個體識別和親子鑒定。目前發(fā)現(xiàn)在真核生物基因組編碼和非編碼序列中的短串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在個體間存在著差異，因此可以使用短串聯(lián)重復(fù)PCR技術(shù)對其進(jìn)行分析。使用PCR技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)鑒定的優(yōu)點(diǎn)是樣品用量小并且適于對高度降解材料的檢測。除剛才提到的之外，可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法醫(yī)學(xué)個體識別和親子鑒定。所以，綜上所述，PCR的確是一種分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)。在它30多年的發(fā)展中衍生出了諸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突變PCR和定量PCR等十幾種不同的技術(shù)方法。PCR技術(shù)可以為基因工程提供目的基因，并廣泛地應(yīng)用于個體識別、親子鑒定、免疫配型、疾病診斷等方面?？梢哉f，PCR已經(jīng)滲透到了生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。21世紀(jì)是生物工程的世紀(jì)。我相信，在今后的發(fā)展中PCR技術(shù)會不斷地得到擴(kuò)充和完善，PCR技術(shù)也將4.相關(guān)檢測技術(shù) 4.1.技術(shù)原理

DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫下也能發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。4.2.工作原理

類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR 擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍 4.3.工作步驟

標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度 5.研究方案

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會，具有極高的使用價值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進(jìn)都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用價值。5.1研究方法

① 早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

② 對低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。

③ 療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過程中通過監(jiān)測血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時血清中抗體的出現(xiàn)及動態(tài)變化與病人病情無線性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動態(tài)狀況。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進(jìn)行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實(shí)現(xiàn)單管單酶單人份的擴(kuò)增要求，這樣就在不降低擴(kuò)增敏感性的條件下，一步完成擴(kuò)增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準(zhǔn)確性。國內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國胃炎發(fā)病率之高估計比乙型肝炎更嚴(yán)重，對HP的檢測應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，5.2.技術(shù)路線

PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法。具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速、簡便、可擴(kuò)增RNA或cDNA、對起始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)。5.3.所用儀器與材料

引物: PCR產(chǎn)物的特異性主要取決于引物鏈的特異性。由于存在同源序列，隨意設(shè)計的引物鏈，其PCR產(chǎn)物在電泳分析時可能出現(xiàn)多條鏈，因此在設(shè)計引物鏈時應(yīng)充分考慮引物特異性。引物長度一般為15-30個堿基,G+C含量為40-60%,濃度0.1-1umol/L。TaqDNA聚合酶：濃度為1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶單位用量增長可能導(dǎo)致非特異DNA擴(kuò)增。模板DNA：應(yīng)避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結(jié)合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制備方法有加熱法、凍溶法、超聲波粉碎法、堿變性法、SDS裂解法等多種。

4×dNTPs ： dNTP儲存液pH應(yīng)為7.0，在反應(yīng)體系中，4種dNTP的濃度應(yīng)相同，每種dNTP的濃度以50-200 umol/L為宜。緩沖液及其他成份：PCR反應(yīng)體系中，一般采用Tris-HCl緩沖液。適宜的Mg2+濃度為高于dNTP總濃度0.2-2.5 mmol/L。

6．研究內(nèi)容

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠(yuǎn)比血清學(xué)或等方法確實(shí)可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個人識別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時或DAN嚴(yán)重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護(hù)措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進(jìn)行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點(diǎn)特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。6．1.檢測對象

常見的傳染性疾病有細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。[4]乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細(xì)胞中增殖，也可以長期存留在骨髓細(xì)胞或外周血白細(xì)胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。有報道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細(xì)胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能 6．2檢測內(nèi)容

PCR反應(yīng)混合物經(jīng)過循環(huán)擴(kuò)增后，所需做的工作就是檢測反應(yīng)液中是否存在預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物及產(chǎn)物的特異性。目前已經(jīng)發(fā)展了許多檢測分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。包括凝膠電泳、高壓液相色譜、核酸探針雜交、探針捕獲酶免疫分析、酶切圖譜分析、單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析、核酸序列分析。

PCR技術(shù)類型[5]

免疫PCR技術(shù) 原位PCR技術(shù) 不對稱PCR技術(shù) 巢式PCR技術(shù) 反向PCR技術(shù) 逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

復(fù)合PCR技術(shù)

彩色PCR技術(shù)

抗原捕獲PCR技術(shù) 增敏PCR技術(shù)

酶標(biāo)PCR技術(shù)

二溫式PCR技術(shù)

錨定PCR技術(shù)

定量PCR技術(shù)

毛細(xì)管PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)

巢式或套式PCR技術(shù) 7.預(yù)期目標(biāo)PCR 技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測中

（1)簡單PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段為基礎(chǔ)設(shè)計了一對引物,擴(kuò)增產(chǎn)物為633bp的DNA片段。其退火溫度為60℃－63℃, 應(yīng)用煮沸法與基因釋放法,大腸桿菌O157: H7檢出限分別為25與38CFU/ml,檢測時間為3h。Thomas等用PCR擴(kuò)增了slt基因片段。引物： 正鏈5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反鏈5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’

其PCR產(chǎn)物由凝膠電泳測定,檢測時間為ld。

徐建國等根據(jù)O157: H7 特有的hlyA、B基因序列設(shè)計了PCR引物,產(chǎn)物為338bp。

PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測中（2）多重PCR:由于鑒定O157: H7血清型不能僅僅依靠簡單PCR,近年來國外學(xué)者對多重PCR方法在大腸桿菌O157: H7的診斷價值方面進(jìn)行了研究。Meng等同時擴(kuò)增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其長度分別為633、210、484bp。此引物設(shè)計可有效區(qū)別O157: H7血清型與O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一個單一反應(yīng)中同時擴(kuò)增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa質(zhì)粒保守序列,其產(chǎn)物分別為1087、227、224、166bp。嚴(yán)笠選用針對大腸桿菌O157: H7志賀樣毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三對引物,在同一擴(kuò)增體系中進(jìn)行PCR,檢測12株不同來源的O157: H7大腸桿菌及其它致病性大腸桿菌及沙門菌、志賀菌15株。結(jié)果復(fù)合PCR方法較單一PCR方法具有較高的特異性，12株O157: H7取得了穩(wěn)定、可靠的陽性結(jié)果。能迅速、有效地與其它致病性大腸桿菌及沙門氏菌、志賀菌相鑒別。

PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測中的應(yīng)用（3）原位PCR: kurokawa等不用培養(yǎng)過程,直接用原位PCR技術(shù)結(jié)合落射顯微鏡,在單細(xì)胞水平快速檢測O157: H7。

4.23SrRNA在大腸桿菌O157: H7分型、檢測中

傳統(tǒng)的細(xì)菌分類方法主要依賴于細(xì)菌的形態(tài)學(xué)、代謝產(chǎn)物、酶活性和表面抗原等特征。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展，微生物檢測進(jìn)入了基因時代，以核糖體核糖核酸序列為基礎(chǔ)的分類方法為微生物的鑒別提供了新的分子生物學(xué)方法。[6]如16srRNA、23srRNA、16-23srRNA區(qū)間序列分析等等，它完全不同于傳統(tǒng)方法，具有快速、簡便、敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] 葛忠源;熒光定量PCR檢測DPV弱毒免疫鴨消化道和呼吸道大腸桿菌、葡萄球菌、乳酸桿菌及其數(shù)量變化規(guī)律的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

[2] 徐煥賓,賁昆龍,曾濤,李勁光;檢測HIV-1載量的熒光實(shí)時定量PCR技術(shù)的建立及其應(yīng)用[J];中國病毒學(xué);2001年02期

[3] 顧鳴，韓偉.復(fù)合PCR鑒定沙門菌的方法.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志[J]，2003，13(2):154-157 [4] 冉陸.腸出血性大腸埃希菌(EHEC)流行趨勢.中國食品衛(wèi)生雜志[J]，1999，3:31-35 [5] 石嵐;實(shí)時定量PCR檢測IgH基因重排的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2004年 [6] 王穎.食品安全學(xué)技能訓(xùn)練.2010.10

第四篇：PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)總結(jié)

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)總結(jié)點(diǎn)擊次數(shù)：422 作者：佚名 發(fā)表于：2008-06-15 20:53 轉(zhuǎn)載請注明來自丁香園

來源：互聯(lián)網(wǎng)

PCR技術(shù)簡史

一、PCR的最早設(shè)想

核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。

二、PCR的實(shí)現(xiàn)

1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間。

三、PCR的改進(jìn)與完善

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時，會導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。

PCR技術(shù)的基本原理

類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

（一）模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

（二）模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；

（三）引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。(Plateau)。到達(dá)平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

PCR的反應(yīng)動力學(xué)

PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” 這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR 擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。

PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

一、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

10×擴(kuò)增緩沖液10ul 4種dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA0.1～2ug Taq DNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加雙或三蒸水至100ul

二、PCR反應(yīng)五要素

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

（一）引物

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：

1、引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。

3、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

4、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

5、引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

6、引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

7、引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。

（二）酶及其濃度

目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2。5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

（三）dNTP的質(zhì)量與濃度

dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

（四）模板(靶基因)核酸

模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

（五）Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

三、PCR反應(yīng)條件的選擇

PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。

（一）溫度與時間的設(shè)置

基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

1、變性溫度與時間

變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。

2、退火(復(fù)性)溫度與時間

退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。

3、延伸溫度與時間

Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時間要稍長些。

（二）循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。

PCR反應(yīng)特點(diǎn)

一、特異性強(qiáng)

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

（一）引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

（二）堿基配對原則；

（三）Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

（四）靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能

保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

二、靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(ug=-6)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個細(xì)菌。

三、簡便、快速 PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

四、對標(biāo)本的純度要求低

不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5'端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的，3' 端則沒有固定的止點(diǎn)，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)時，由于新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。

一、凝膠電泳分析 PCR產(chǎn)物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計的一致，特別是多重PCR，應(yīng)用多對引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小，這是起碼條件。

（一）瓊脂糖凝膠電泳： 通常應(yīng)用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。

（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測分析。

二、酶切分析： 根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。

三、分子雜交： 分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。

（一）Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。

（二）斑點(diǎn)雜交： 將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點(diǎn)，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。

四、核酸序列分析： 是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。

PCR產(chǎn)物克隆方法

一、平端連接

通常情況下，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進(jìn)行連接，但其連接效率效低。因?yàn)門aqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產(chǎn)物成為3'突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產(chǎn)物的效率通過較高。在采用大量T4DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產(chǎn)物，用PUS19的HincⅡ位點(diǎn)進(jìn)行克隆，以X－gal和IPTG篩選，常可得到足量重組子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產(chǎn)物。

二、粘端連接

（一）引物中設(shè)計入限制酶位點(diǎn)

由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互補(bǔ)堿基，因此可以在兩引物的5'末端設(shè)計單限制酶或雙限制酶切位點(diǎn)。這樣得到的PCR產(chǎn)物用限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與有互補(bǔ)粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當(dāng)兩引物中設(shè)計不同酶切位點(diǎn)時，可有效地定向克隆PCR產(chǎn)物。其缺點(diǎn)是需要加長PCR引物，除限制酶識別序列外，還需要在其5'端多合成3-4個堿基以利于限制性內(nèi)切酶與PCR產(chǎn)物末端的穩(wěn)定結(jié)合。即使如此，其酶切效率也不夠高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等較為難切。采用突變PCR方法可克服上述缺點(diǎn)。該方法是通過在兩PCR引物序列中改變1至數(shù)個核苷酸創(chuàng)造出一個限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。鑒于PCR引物的3'末端序列的互補(bǔ)性是PCR成功的關(guān)鍵，在PCR引物的中部或近5'端改變1個或幾個堿基對PCR擴(kuò)增效果影響不大。這種方法不需要增加PCR引物的長度，而且酶切效果優(yōu)于5'加端法。對于特定DNA片段的克隆，此方法較為經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。但對于基因診斷PCR產(chǎn)物的克隆，似乎5'加端法更為適宜。

（二）T4DNA聚合回切產(chǎn)生粘端

如PCR兩引物的5'末端是A或T，則可在其5'端分別加上CG和CCGG。用此二引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在dATP和dTTP存在的情況下，用T4DNA聚合酶進(jìn)行處理，則T4DNA聚合酶因具有3'→5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，產(chǎn)生AccI和XmaI粘性末端。此DNA片段直接與用AccI和XmaI切開的載體進(jìn)行連接。這種方法只需在PCR引物的5'端加2-4個堿基，但其可選擇的限制酶類有限。

三、T－vector法

TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3'末端加一個堿基，所加堿基幾乎全是腺苷。據(jù)此，Marchuk等人采用3'端突出一個胸苷的質(zhì)粒DNA來克隆PCR產(chǎn)物，其克隆效率比平端的連接至少高出100倍。他們用EcoRV將pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的兩個3'末端各加一處胸苷。因?yàn)樵?種dNTP都存在時，Taq聚合酶選擇性參入dATP，而當(dāng)僅一種dNTP存在時，它只能參入該種堿基。因此，在只加入ddTTP時，用TaqDNA聚合酶可使平端載體DNA轉(zhuǎn)變成3'末端突出一個胸苷的T尾載體，稱為T－vector。用這種T－vectorsk可以較有效地直接克隆PCR產(chǎn)物。Hotton等人也報道了另一種制備T－vector的方法。他們使用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶在切成平端的載體DNA的3'末端加上一個胸苷。由于末端轉(zhuǎn)移酶可以催化多個堿基（ddTTP）作為底物，使平端載體DNA分子的兩個3'末端各加上一個T。用這種方法制備的T－vector的不同之處在于前者3'末端不能與待克隆PCR產(chǎn)物的5'末端連接，僅5'末端可與PCR產(chǎn)物的3'末端形成磷酸二脂鍵。

四、共環(huán)消解法

最近，Jung等人報道了一種有效的PCR產(chǎn)物克隆方法。用磷酸化的PCR引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，先用T4DNA連接酶催化連接反應(yīng)，使5'端帶有限制酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增DNA片段連接成共環(huán)結(jié)構(gòu)。然后再用相應(yīng)的限制酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生粘端DNA片段。對于對稱性限制酶位點(diǎn)，只需在引蛾的5'末端加上一關(guān)識別序列，因?yàn)樵诖映晒箔h(huán)后能恢復(fù)限制酶切位點(diǎn)難于切開的缺點(diǎn)，且可用于雙限制酶切位點(diǎn)的設(shè)計，只不過有PCR產(chǎn)物共環(huán)化后，僅約1/4的限制酶切點(diǎn)得以恢復(fù)。故此法較適用于單限制酶位點(diǎn)的克隆。

五、無連接酶亞克隆法

無連接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物5'末端附加堿基修飾法，修飾堿基不是酶切位點(diǎn)，而是與某一質(zhì)粒兩端分別互補(bǔ)的堿基。兩引物的3'端約20-25個核苷酸分別與待擴(kuò)增DNA兩翼互補(bǔ)，5'端各有約24個核苷酸分別與線性化質(zhì)粒的3'端相同的附加序列。由于線性化質(zhì)粒的3'端序列各不相同，PCR片段可以通過選擇各引物的合適5'附加序列與引物3'端定向雜交。由此物a和b產(chǎn)生的兩端有附加序列的PCR產(chǎn)物與未反應(yīng)引物分離后，分別加入兩只含有線性化質(zhì)粒的反應(yīng)管中進(jìn)行第二次PCR。第1管中用引物a和c，引物a即為第一PCR擴(kuò)增的上游引物a，引物c為下游引物，與緊鄰5'端附加序列內(nèi)測的質(zhì)粒（+）鏈互補(bǔ)。同樣，第2管的引物為b和d，引物b與第一次PCR擴(kuò)增的下游引物b相同，引物d為上游引物，與緊鄰5'附加序列內(nèi)側(cè)的質(zhì)粒（-）鏈互補(bǔ)。

第二次PCR的第一循環(huán)中，PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒均變性與復(fù)性。除自身復(fù)性產(chǎn)物（這種復(fù)性產(chǎn)物不被擴(kuò)增）外，PCR產(chǎn)物與質(zhì)?？赏ㄟ^各自3'端互補(bǔ)序列雜交成部分異源雙鏈，延伸時，重疊的3'端互為此物沿各自互補(bǔ)鏈延伸，結(jié)果可產(chǎn)生PCR片段與線性質(zhì)粒的“連接”。然后兩管中PCR擴(kuò)增各進(jìn)行15-20個循環(huán)。這便可產(chǎn)生大量一端管1）或另一端連接有PCR插入片段的質(zhì)粒。第二次PCR后將第1管與第2管反應(yīng)液混合，用堿變性雙鏈，中和后稀釋變性的DNA。反應(yīng)管中的單鏈DNA可以復(fù)性或幾種不同的產(chǎn)物，除各自本身復(fù)性產(chǎn)物外，管1產(chǎn)物ssDNA與管2中ssDNA可形成部分異源雙鏈DNA，并各自有一較長的5'或3'懸端，這種長的5'或3'懸端相互互補(bǔ)，在低DNA濃度時可復(fù)性產(chǎn)生環(huán)化DNA。

盡管這種環(huán)化的DNA有兩個缺口，但它們可以直接用來轉(zhuǎn)化受體大腸直桿菌。一旦進(jìn)入體內(nèi)，兩個缺口便共價連接，修復(fù)的質(zhì)粒即可復(fù)制，下面以從λ噬菌體DNA中擴(kuò)增-500bp片段，并克隆入pGem4Z載體中為例說明LFS法。

這種方法同樣適于復(fù)雜基因組中基因片段的克隆。需注意的是第一次PCR時兩引物的5'附加序列不應(yīng)太短以免影響第二次PCR時異源雙鏈的形成，以24個核苷酸較為合適。擴(kuò)增時若形成，引物二聚體，一定要去除，否則會嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化率。用LFS法已成功地克隆了長達(dá)1.7kb的基因片段。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是：①可用于常規(guī)方法無法進(jìn)行亞克隆的片段；②適于任何PCR產(chǎn)物和任何質(zhì)粒；③可亞克隆特殊目的（如含點(diǎn)突變、缺失或插入等）片段；④在某些情況下，對已構(gòu)建了啟動子或增強(qiáng)子等序列的載體，可使待表達(dá)片段插入定向合適位置；⑤較快，可在1d內(nèi)完成，較常規(guī)方法可靠，不需DNA連接酶。

DNA克隆是分子生物學(xué)的重要內(nèi)容。特定基因的克隆常因兩端缺乏合適限制酶切點(diǎn)而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、篩選因難。采用PCR技術(shù)行DNA和cDNA的克隆，則可大大縮短克隆時間，比之全基因合成更為經(jīng)濟(jì)和方便，因而愈來愈受重視。用PCR方法進(jìn)行傳染性疾病和遺傳性疾病的診斷常遇到產(chǎn)物的異性問題和分型問題，采用產(chǎn)物克隆和測序方法，比之寡核苷酸探針雜交方法更為準(zhǔn)確。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展和推廣，新的PCR產(chǎn)物的克隆方法也將不斷出現(xiàn)。

PCR基礎(chǔ)的檢測工具的優(yōu)缺點(diǎn)

首先，PCR反應(yīng)是快速的。整個DNA提取，擴(kuò)增和檢測的過程通常少于6小時，如果反應(yīng)利用嵌套的引物，過程可能長些。對于一些樣本來說，比如來自糞便和表皮，就需要在DNA提取中增加步驟。這樣就延長了整個檢測的時間到14小時。

用購買的核苷酸提取工具就能縮短檢測時間，機(jī)械進(jìn)行提取，使PCR方案最優(yōu)化或使用加快熱循環(huán)技術(shù)。有了優(yōu)化的樣本，快速提取和光循環(huán)熱循環(huán)，整個檢測時間能縮短到2小時。但通常是6-8小時。

于培養(yǎng)基基礎(chǔ)的方法2-5天的時間相比較，這是巨大的進(jìn)展了。這也比一些需要有精確計算結(jié)果的培養(yǎng)基濃縮的抗體檢測實(shí)驗(yàn)要快。當(dāng)購買的實(shí)用抗體基礎(chǔ)的檢測工具比PCR基礎(chǔ)的方法快時，大部分這樣的化驗(yàn)只能用于非常有限的生物體上。

第二，PCR不需要培養(yǎng)。這是與PCR基礎(chǔ)的檢測的速度密切相關(guān)的。既然PCR是十分靈敏的（少到10 cfus的樣本就能被檢測），培養(yǎng)通常是沒必要的。大多數(shù)最新的實(shí)用PCR檢測工具需要有選擇性的濃縮，特別是當(dāng)樣本包括大量的PCR抑制劑時。用核苷酸提取方法能夠避免培養(yǎng)，核苷酸提取方法產(chǎn)生了PCR質(zhì)量的DNA并且優(yōu)化了PCR反應(yīng)。如果在大量樣本中檢測少量的病原體或者病源有機(jī)體在PCR靈敏度的極限以下的情況下，將需要使用培養(yǎng)。在一般情況下，使用培養(yǎng)的情況是很少的，去除了培養(yǎng)的步驟，時間將被節(jié)省下來。

比節(jié)省時間更重要的是，去除了培養(yǎng)，那些難以或不能培養(yǎng)的生物體就可以進(jìn)行檢測。這些生物體包括某種病毒、真菌、厭氧性生物和支原體。

第三，PCR的花費(fèi)合理。與培養(yǎng)或抗體基礎(chǔ)的化驗(yàn)相比，PCR基礎(chǔ)的診斷是十分經(jīng)濟(jì)的?？紤]到細(xì)菌的培養(yǎng)，有較昂貴的花費(fèi)。大多數(shù)樣本為了正確的鑒定需要培養(yǎng)和重復(fù)培養(yǎng)。這需要大量的手工時間（加上化驗(yàn)的花費(fèi)），也增加了污染的危險。

作為比較，大多數(shù)抗體化驗(yàn)所需的手工時間很少但化驗(yàn)本身很昂貴。

PCR反應(yīng)的成分（引物，酶，dNTPs和緩沖液）的花費(fèi)比每次化驗(yàn)的花費(fèi)少40%，而反應(yīng)的時間包括核苷酸分離，通常在一小時以內(nèi)。當(dāng)然這依賴于樣本、技術(shù)員和用于分離核苷酸的技術(shù)。既然PCR所用的時間少，它的花費(fèi)也少。

但是，PCR需要熱循環(huán)，UV來源和一些類型的圖象捕獲裝置，因此PCR實(shí)驗(yàn)室的最初花費(fèi)是很高的。

這里討論另外一些在臨床領(lǐng)域的PCR使用的基本原理

第一，PCR不是抗原基礎(chǔ)的。

抗體基礎(chǔ)的檢測工具（ELISA和其他）不僅檢測直接抗病原體的人類抗體，而且能檢測病原體上的表面抗原。人類抗體檢測工具因此需要免疫反應(yīng)的存在，以及在正確檢測抗原存在之前抗體濃度的測定。在新近感染的情況下，這種測試不能檢測針對病原體的人類抗體，可能不能正確反映是否有感染。事實(shí)上，被感染的病人，沒有充足的時間來提高用于檢測的濃度。這是HIV抗體基礎(chǔ)檢測的通常的問題。由于相同的原因，這種類型的測試對檢測無免疫應(yīng)答患者的病原體存在困難。反過來講，抗體基礎(chǔ)的測試也會給出錯誤相反的結(jié)果。

然而抗體基礎(chǔ)的檢測最大的問題是它不能檢測新的病原體亞型，由于表面抗原發(fā)生改變，而導(dǎo)致了錯誤的陰性結(jié)果。（PCR基礎(chǔ)的檢驗(yàn)也可能由于DNA的變化、突變而遇到相似的問題。但PCR基礎(chǔ)的檢驗(yàn)?zāi)軌蜻M(jìn)行設(shè)計，使這些錯誤的陰性結(jié)果最小化。）盡管有這些缺點(diǎn)，抗原基礎(chǔ)的檢測工具是十分重要的檢測方法，在大多數(shù)情況下比PCR檢測要迅速。

第二，檢驗(yàn)易按客戶的要求設(shè)置，以適合特殊的需要

通過簡單使用不同的特殊目標(biāo)引物，工具能迅速設(shè)計，用于許多檢測。

第三，PCR容易使用，是由時間證實(shí)的技術(shù)

通過使用有商業(yè)價值的核苷酸提取產(chǎn)物，用于病原體檢測的樣本能在少于十分鐘的時間內(nèi)被例行操作。一旦進(jìn)行操作，樣本被加入反應(yīng)體系中，進(jìn)入熱循環(huán)。反應(yīng)完成后，樣本能被自動系統(tǒng)或凝膠電泳所分析。

少數(shù)的PCR檢測將能完全自動化。儀器將進(jìn)行所有操作，從樣品的準(zhǔn)備到分析結(jié)果。這樣的系統(tǒng)將十分昂貴，可能只能適應(yīng)制造商的平臺。這對大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室無吸引力，但當(dāng)價格下降后，將最終使PCR診斷自動化。

第五篇：關(guān)于PCR技術(shù)及其應(yīng)用實(shí)例和前景

PCR技術(shù)及其應(yīng)用實(shí)例和前景

檢驗(yàn)0905郭媛媛

PCR是我們研究 分子生物學(xué)的重要方法和工具，隨著醫(yī)學(xué)科技的不斷發(fā)展，這種技術(shù)越來越被人們看重，越來越多的應(yīng)用到我們的科技研究之中，作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作者，這種技術(shù)也是我們必須掌握的從這篇文章中讓我們了解一下它在實(shí)踐之中的前景。

摘要：PCR(ploymerse chain reaction)技術(shù)[1]，即聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，又稱基因體外擴(kuò)增技術(shù)或和核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，利用兩種與相反鏈雜交并利用附著于目標(biāo)DNA兩端的寡核苷酸引物在高溫(95°C)使目標(biāo)DNA片斷的DNA雙鏈變性，分解為單鏈，在較低溫度(37-63°C)與引物退火，然后變溫到72°C左右。在耐高溫DNA聚合物酶的作用下引物被沿樣板DNA單鏈延伸合成互補(bǔ)鏈，然后有變性→退火→延伸反復(fù)進(jìn)行。引物大大過量，dNTP過量，酶在高溫中是較穩(wěn)定的，這樣經(jīng)過幾十個循環(huán)，目標(biāo)DNA片斷就按2的n次方遞增，用此法可以從mRNA中，cDNA庫中擴(kuò)出目標(biāo)基因?？傊?，生物體內(nèi)核酸的復(fù)制是半保留復(fù)制，PCR技術(shù)就是在體外對此進(jìn)行復(fù)制模擬。

關(guān)鍵詞：PCR技術(shù)；DNA；應(yīng)用；工程效益擴(kuò)大 1 引言

人類利用微生物的實(shí)踐具有悠久的歷史，公元前，人類就已經(jīng)利用天然的微生物（酶）生產(chǎn)奶酪和酒。進(jìn)入工業(yè)革命時代，人們開始對天然微生物進(jìn)行篩選和誘變，生產(chǎn)某些簡單的代謝產(chǎn)物，氨基酸，維生素和抗生素。

20世紀(jì)60年代至今，隨著人類雖微生物認(rèn)識的加深，DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)，發(fā)酵技術(shù)的提高：更多的微生物可產(chǎn)生各種各樣的抗生素，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物學(xué)(Medical Microbiology)中；更多微生物被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生促生物質(zhì)，有利于人和動植物的生長，對農(nóng)業(yè)科學(xué)(Agriculture)有著極重要的支持；還有些微生物的代謝產(chǎn)物是重要的化工原料，加速了化工產(chǎn)業(yè)(Chemical Industry)的完善；再有些微生物被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)鑒定(Forenic)、醫(yī)學(xué)(Medical Science)、環(huán)境監(jiān)測(Environment Supervise)分子克隆(Member Clone)、序列分析(Alignment Analysis)、考古研究(Archaeology Search)等重要學(xué)科，具有廣泛的應(yīng)用前景，這就是我要介紹的PCR技術(shù)。2 PCR技術(shù)原理

下面我通過摘錄了一個實(shí)驗(yàn)[2]，來介紹一下PCR技術(shù)的過程及其原理(至于它詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)過程和方法詳見參考文獻(xiàn))。.在94°C高溫下雙鏈變性，分離出DNA單鏈的模板，然后降溫(55°C)，然添加的與DNA單鏈配對，緊接著溫度升高(72°C)，在DNA聚合酶的作用下，脫氧核苷三磷酸開始滲入，并從引物的結(jié)合端開始，按5ˊ-3ˊ方向延伸，合成出新生的DNA互補(bǔ)鏈，這一過程稱為一循環(huán)，然后重復(fù)該循環(huán)，模板DNA被大量復(fù)制。

在此，我要特別強(qiáng)調(diào)幾點(diǎn)注意事項(xiàng)，這也是這個實(shí)驗(yàn)設(shè)計者提醒我們需要注意的地方：

(1)在配置PCR反映體系的過程中，Taq酶應(yīng)在加入dNTP混合物后加入，因?yàn)橛行┟傅?ˊ-5ˊ的外切酶反應(yīng)較強(qiáng)，反映體系如果不含dNTP，反應(yīng)體系中的引物可能被分解。

(2)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，可能是模板有與引物同源性高的其他位點(diǎn)，其次是復(fù)性溫度太低，適當(dāng)提高復(fù)性溫度就可以解決這些問題。

以上實(shí)驗(yàn)可清楚明了地向我們展示PCR技術(shù)的原理。3 PCR技術(shù)分類

PCR技術(shù)自從1985年由Millus創(chuàng)立后，經(jīng)歷了20年的飛速發(fā)展，是傳統(tǒng)微生物學(xué)與現(xiàn)代基因?qū)W之間的完美結(jié)晶，已成為當(dāng)今世界上不可或缺的一項(xiàng)重要的微生物應(yīng)用技術(shù)，下面我將介紹幾種常用的PCR技術(shù)[3] 3.1反轉(zhuǎn)錄PCR 反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)即以RNA分子為模板的擴(kuò)增技術(shù)，主要用于克隆cDNA、檢測RNA病毒、合成cDNA探針機(jī)構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。3.2定量PCR 定量PCR(quantitative PCR)的基本原理是。假定其反應(yīng)產(chǎn)物的數(shù)量同反映混合物中起始模板的mRNA或DNA的量成正比，因此通過瓊脂糖電泳樣品條帶得比較，便可以確定兩種PCR產(chǎn)物之間的數(shù)量關(guān)系。另外定量PCR還有廣義和狹義之分[4]，在此就不詳細(xì)介紹了。3.3實(shí)時熒光定量PCR 所謂實(shí)時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用映光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過校正曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，還具有特異性更強(qiáng)、有效解決了PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。3.4重組PCR 重組PCR(recombinant PCR RP-PCR)是指用PCR法在DNA片段上進(jìn)行點(diǎn)突變，即擴(kuò)增產(chǎn)物中含有域模板序列不同的堿基。利用重組PCR可造成DNA片段的堿基插入或缺失，從而研究目的基因片段的功能。3.5反向PCR 反向PCR(inverse PCR IP-CR)是對一個已知的DNA片斷序列兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究的技術(shù)。3.6多重PCR 多重PCR(multiplex PCR)即在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，擴(kuò)增同一模板的幾個區(qū)域。多重PCR可同時檢測多個突變位點(diǎn)或病原生物，有利于遺傳病和感染性疾病的診斷。3.7不對稱PCR 不對稱PCR(asymmetric PCR)即在擴(kuò)增體系中加入不同濃度的引物，而得到單鏈DNA產(chǎn)物。

另外還有幾種新型的、最近興起的PCR技術(shù)[5]，雖不十分成熟，但發(fā)展前景十分廣闊。它們包括： 3.8原位PCR 原位PCR是指對組織細(xì)胞中特異DNA或RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后再用原位PCR進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用原位雜交對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析的一種方法。目前有報道[6]用這種方法可檢測出組織細(xì)胞中的人乳頭瘤病毒、艾滋病毒、結(jié)核桿菌等。3.9巢式PCR 巢式PCR比常規(guī)PCR靈敏度大大提高，同時第二次擴(kuò)增又可鑒定第一次擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。所以這種方法用于臨床檢驗(yàn)，目前血清中丙型肝炎的監(jiān)測多用這種方法。

4.PCR技術(shù)應(yīng)用實(shí)例

PCR技術(shù)自從建立以來，由于其敏感、高效、操作簡便，在分子生物學(xué)研究、臨床醫(yī)學(xué)和其他很多領(lǐng)域中得到4.1分子生物學(xué)理論研究[7] 如：制備cDNA文庫與篩選，要較多的組織。但如果用PCR技甚至幾個細(xì)胞就可以構(gòu)建cDNA高了工作效率。

再如：DNA測序、檢測突變堿基、基因重組與融合、用簡并引物法擴(kuò)增未知序列，無不是PCR技術(shù)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用。4.2臨床醫(yī)學(xué)[8]

如：病原體診斷，利用PCR技術(shù)可以檢測標(biāo)本中的病毒、細(xì)菌、支原體，直至寄生蟲等病原生物，標(biāo)本可以是組織、血液、細(xì)胞、分泌物、排泄物等。以后還發(fā)展了遺傳病基因的診斷、組織器官移植的配型選擇、腫瘤的診斷轉(zhuǎn)移和確定、法醫(yī)學(xué)和其他臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。4.3考古學(xué)[9]

由于PCR技術(shù)對基因組的完整性要求不高，因而對分子考古學(xué)極為有幫助，科判定生物種類間的親緣關(guān)系、進(jìn)化途徑等。

如：1997年德國慕尼黑大學(xué)動物研究所科學(xué)家宣稱[10]，他們對歐洲原始人——?dú)W洲尼安德特人化石中的基因殘余物進(jìn)行分析，結(jié)果表示著名的歐洲原始人尼安德特人不是歐洲現(xiàn)代人的祖先，這一結(jié)果又得到了英國、俄羅斯和瑞典科學(xué)家的進(jìn)一步證實(shí)，為現(xiàn)代人的起源提供了新的論據(jù)。4.4 其他領(lǐng)域

PCR技術(shù)還在動植物研究領(lǐng)域、組織和群體生物學(xué)等領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用[11]。5.前景與總結(jié)

結(jié)合對以上PCR技術(shù)的了解，我認(rèn)為PCR技術(shù)可以加快實(shí)現(xiàn)它的工程化，效

既費(fèi)錢費(fèi)時，又需術(shù)，只要很少組織文庫，并且大大提了廣泛應(yīng)用。益化，如：應(yīng)用在現(xiàn)代環(huán)境工程污水處理工程的微生物載體研究上[12]，PCR技術(shù)暫時只是致力于理論方面和研究方面，它并沒有像其他微生物技術(shù)那樣給人類社會帶來大規(guī)模的經(jīng)濟(jì)效益，假如可以實(shí)現(xiàn)這一設(shè)想，那么不但PCR技術(shù)本身可以得到更加快速的發(fā)展，而且我們還可以促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

比如說：在傳統(tǒng)的生物發(fā)酵技術(shù)上可以結(jié)合PCR技術(shù)，利用DNA在體外的復(fù)制和雜交，并實(shí)現(xiàn)表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)基因工程的超遠(yuǎn)緣雜交的物種突破難進(jìn)行的問題；再比如：可以通過PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)核酸雜交技術(shù)，核酸雜交法比抗原捕獲特異、敏感，但半衰期短，放射性污染不易處理，顯影時間長等缺點(diǎn)，目前國內(nèi)外常用的生物素檢測標(biāo)本中致癌物質(zhì)[13]。

另外，還有很多微生物的PCR技術(shù)在工程上的應(yīng)用，這里就不一一列舉了。關(guān)鍵是怎樣擴(kuò)大在工程上的應(yīng)用，以擴(kuò)大經(jīng)濟(jì)效益。這是PCR技術(shù)的關(guān)鍵。

PCR技術(shù)運(yùn)用傳統(tǒng)生物技術(shù)結(jié)合近代基因工程原理，包含反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)、定量PCR技術(shù)、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)、重組PCR技術(shù)、反向PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)、不對稱PCR技術(shù)等多種傳統(tǒng)PCR技術(shù)和原位PCR技術(shù)、巢式PCR技術(shù)等一系列新興PCR技術(shù)。最新的進(jìn)展如[14]：結(jié)核桿菌診斷PCR；病毒學(xué)PCR技術(shù)；HIV感染PCR；檢測人COX??；DMS/BMD基因；地中海貧血PCR；血友病A基因?

在工業(yè)在分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等眾多領(lǐng)域取得了巨大成就，不但只是局限于研究領(lǐng)域，而且還從實(shí)用角度證明了PCR技術(shù)是一項(xiàng)令人類值得自傲的技術(shù)。自從1985年由Millus創(chuàng)立之后，又得到了近二十年的發(fā)展，所以PCR技術(shù)的發(fā)展前景是不可估量的。它絕對是現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)中一項(xiàng)值得發(fā)展的技術(shù)，在當(dāng)今社會乃至未來社會都會有它的立足之地，充分運(yùn)用它，人類會在文明發(fā)展的進(jìn)程中，發(fā)出更耀眼的光芒。參考文獻(xiàn)：

[1] 歐陽平凱,《》生物科技辭典,化學(xué)工業(yè)出版社,北京,2003.10:342 [2] 趙斌,何怡紅,《微生物實(shí)驗(yàn)》,科學(xué)出版社,北京,2002,23(5):11-15 [3] 孫汶生,黃英才,馬曹紅等,《基因工程學(xué)》,科學(xué)出版社,北京,2004.8:131-136 [4] 魏平著,《關(guān)于定量PCR技術(shù)》,科學(xué)教育出版社,北京,2001.815:59 [5] 賀淹才,《簡明基因工程原理(第二版)),科學(xué)出版社,北京,2005,8:175-197 [6] 俞華,《PCR技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用前景》,人民日報,2003.12(5),第7版 [7] 馬中聲等,《分子生物學(xué)》,教育出版社,北京,2004,7:135 [8] 陸德如等,《現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)》,化學(xué)工業(yè)出版社,北京,2002,7:50-52 [9] 李立家,《PCR技術(shù)的應(yīng)用及前景》,東北大學(xué)學(xué)報,2002,11:10-15 [10] Geoger White,《 Prospective of PCR Technology》, Science,2000,5(7):29-32

[11] Michael Brand, Methods in Molecular Medicine, Vol.26“《Quantitative PCR Protocols》” Edited by: B.kochanowski and V.Reischi, Humana press Inc.Totowa, NJ, 1999

[12] 李彥春,《關(guān)于廢水處理的現(xiàn)代技術(shù)應(yīng)用》,環(huán)境技術(shù)通報,2005,5(4):25-30 [13] 二雄吉平,吳濤譯,《關(guān)于PCR技術(shù)的一些看法》,東京大學(xué)學(xué)報現(xiàn)代基因技術(shù)譯叢, 2004,11(4):10-15

[14] Tess.M.Jission etc.《Toward routine diagnosis of hepatitis B virus desoxyribonucleic acid》.Clinical Biochemistry, 1993, 26:289.