第一篇：PCR經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

PCR經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

（1）DNA處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高溫高壓處理，常規(guī)消耗用品用后作一次性處理，避免反復(fù)使用造成污染。

（2）PCR操作應(yīng)戴手套并勤于更換，必要時(shí)應(yīng)戴好帽子和口罩，就像做手術(shù)一樣，要有“無(wú)菌觀念”。

（3）成套試劑，小量分裝，專一保存，防止它用。配制試劑用新器具，用后作一次性處理。（4）試劑管用前先瞬時(shí)離心（10s），使液體沉于管底，減少污染手套與加樣器機(jī)會(huì)。（5）最后加模板DNA，馬上蓋好，混勻，瞬時(shí)離心（10s），使水相與有機(jī)相分開(kāi)。加入模板且忌噴霧污染，所有非即用管都應(yīng)蓋嚴(yán)。加模板DNA后應(yīng)更換手套。（6）實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性、陰性對(duì)照。

還有諸如：移液槍用完要放到最大計(jì)量位置，防止久了彈簧失靈；防止RNA酶污染標(biāo)本；低溫下操作，防降解；試劑有致癌致畸作用，做好個(gè)人防護(hù)；頭腦中各操作步驟要清楚，不要加錯(cuò)試劑。

問(wèn)題及解決方案匯總：

一、假陰性，擴(kuò)增無(wú)條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不 夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。

二、假陽(yáng)性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR來(lái)減輕或消除。

三、出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用兩步法。

四、出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

五、出現(xiàn)大量引物二聚體

1.從引物自身著手，重新設(shè)計(jì)引物，這是最根本解決這一問(wèn)題的辦法； 2.可能模板有問(wèn)題；

3.模板濃度過(guò)小，適當(dāng)加大模板量；

4.Taq酶，引物，Mg2+濃度可能過(guò)高，可降低它們的濃度；

5.取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出置于冰上瞬時(shí)冷卻，這時(shí)再加入反應(yīng)體系當(dāng)中，引物二聚體就會(huì)消失的；

6.所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增強(qiáng)特異性；

7.PCR反應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行，最后加Taq酶，PCR結(jié)束后，產(chǎn)物勿放置在室溫下過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，有人認(rèn)為室溫下有些Taq酶會(huì)將多余的引物合成為二聚體。

8.增加循環(huán)數(shù)；

9.降低退火溫度后有條帶，則應(yīng)逐漸提高溫度，若提高溫度的同時(shí)產(chǎn)物量減少，則考慮增加鎂離子濃度（根據(jù)擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度而定，片段長(zhǎng)則相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該高一些）；

10.若降低退火溫度，發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在20-25mM沒(méi)有區(qū)別，則考慮Buffer等試劑沒(méi)有完全融解、混勻，導(dǎo)致吸取的試劑濃度不對(duì)。11.以上次的PCR產(chǎn)物作模板二次PCR，可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時(shí)間間隔短的話，可以把原產(chǎn)物稀釋100－1000倍，如果間隔較長(zhǎng)可以稀釋50－100倍；

六、高GC與復(fù)雜結(jié)構(gòu)的模板處理

將模板置于95℃水浴鍋中處理10分鐘以上，然后置于冰上瞬時(shí)冷卻，可大大降低二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR的影響。

七、長(zhǎng)片段與短片段拼接失?。ǘc(diǎn)突變）

在做定點(diǎn)突變時(shí)，倘若突變位點(diǎn)距離基因的某一側(cè)較近（短片段<200bp）時(shí)，通常拼接困難或者難以通過(guò)電泳結(jié)果直觀判斷是否拼接成功。此時(shí)，可在短片段的上方（突變近5’端）或下方（突變近3’端）選取一條載體通用引物與基因另一條引物PCR（控制產(chǎn)物大小>300bp），然后再做基因拼接。確認(rèn)大小無(wú)誤后，再以此產(chǎn)物為模板，用基因首尾引物PCR即可。

八、Long PCR無(wú)條帶

對(duì)于>5Kb片段擴(kuò)增，常規(guī)PCR很難得到較好的條帶，建議①更換更適合于Long PCR的聚合酶；②添加PCR Enhancer調(diào)整體系；③設(shè)計(jì)多對(duì)引物分段擴(kuò)增。

PCR增強(qiáng)劑（PCR Enhancer）：

常見(jiàn)的添加劑有：DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸銨，甜菜堿，BSA等，它們對(duì)PCR反應(yīng)的影響雖然有所不同，但都可提高PCR的擴(kuò)增效率。

1.DMSO：解除模板DNA局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，增加引物與模板的特異性結(jié)合，使聚合酶更容易在二級(jí)結(jié)構(gòu)處延伸，但是對(duì)酶活有抑制作用，且當(dāng)其濃度大于10％時(shí)還會(huì)降低保真性。

2.甘油：可降低模板溶解溫度（Tm），提高產(chǎn)量，但是對(duì)酶活有抑制作用。3.甲酰胺：促進(jìn)某些“引物－模板”退火，降低帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA的變性溫度。4.硫酸銨：增加反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度，改變DNA的變性及退火溫度，調(diào)節(jié)酶活。5.甜菜堿：有利于DNA雙鏈的解開(kāi)，Polymerase的結(jié)合，提高PCR的效率。

第二篇：PCR個(gè)人經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

PCR經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

1.primers design

這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件

a 足夠長(zhǎng),18-24bp,以保證特異性.當(dāng)然不是說(shuō)越長(zhǎng)越好,太長(zhǎng)的引物同樣會(huì)降低特異性,并且降低產(chǎn)量。

b GC% 40%-60% c 5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性

d 避免3'端GC rich, 最后3個(gè)BASE不要有GC,或者最后5個(gè)有3個(gè)不要是GC e.避免3'端的互補(bǔ), 否則容易造成DIMER f.避免3'端的錯(cuò)配

g.避免內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)

h.附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時(shí)不需要加上這些序列,但在檢測(cè)互補(bǔ) 和二級(jí)結(jié)構(gòu)是要加上它們

i.需要使用兼并引物時(shí), 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM)j.最好學(xué)會(huì)使用一種design software.PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.* 引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度.Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm低5℃。

設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來(lái)源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。

根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會(huì)差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開(kāi)始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。

為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過(guò)5℃，就會(huì)引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。2.stability of primers

定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因?yàn)樗膒H經(jīng)常偏酸，會(huì)引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存 2個(gè)月。3.optimize reactants concentration a.magnesiom ions Mg離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用，并能影響Polymerase的活性。一般 的情況下 Mg的濃度在0.5-5mM之間調(diào)整。同樣要記住的是在調(diào)整了dNTPs的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整Mg離子的濃度。對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR，使用3-5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液。

b.其他的離子

NH4+ K+都會(huì)影響PCR。增加K+的濃度后, 會(huì)因?yàn)橹泻土撕怂峁羌苌狭姿峄鶊F(tuán)的負(fù)電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的 嚴(yán)謹(jǐn)性(stringency).NH4+也有相同的作用.MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH4)2SO4的.當(dāng)然, 過(guò)高的陽(yáng)離子濃度(KCL>0.2M)時(shí), DNA在94度根本不會(huì)發(fā)生變性, 當(dāng)然也就無(wú)從談起PCR了.c.polymerase 不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度。一些高保真酶的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時(shí)間也可以縮短,從而保證polymerase的活性 d.template 50ul PCR SYSTEM human gDNA 0.1ug-1ug E.Coli 10ng-100ng Lamada DNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng 4.temperature a.denaturation 常規(guī)是94度5分鐘, GC Rich的摸板是95度5分鐘，除了GC Rich外, 常規(guī)的APPLICATIONS可以將這部分時(shí)間縮短到1到2分鐘, 或者在CYCLE 1時(shí)給予較長(zhǎng)的時(shí)間,而取消開(kāi)始的denaturation b.annealing 重點(diǎn)到了。一般情況下, 是從55度開(kāi)始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進(jìn)行調(diào)整.有條件的可以做gradient pcr.退火的時(shí)間在30-60S, 時(shí)間短一些可以得到更好的效果.因?yàn)? polymerase 在annealing temp.時(shí)也會(huì)有一些活性.所以在A.T.的時(shí)間過(guò)長(zhǎng), 會(huì)極大的增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn).另外,在對(duì)于一些困難戶, 比如從gDNA里擴(kuò)增大片段, 還可使用two step PCR.5.touchdown PCR

原理很簡(jiǎn)單,但的確是一個(gè)很有用的方法。舉個(gè)例子就OK, ANNEALING TEMP.55度 94 5min—（94 30s—60 30s—72 1min）×2—（94 30s—59 30s—72 1min）×2—（94 30s—58 30s—72 1min）×2—........—（94 30s—51 30s—72 1min）×2—（94 30s—50 30s—72 1min）×20—72 5min

6.hot start PCR

熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過(guò)程中，以及在熱循環(huán)剛開(kāi)始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡(jiǎn)單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。

熱啟動(dòng)通過(guò)抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶，在反應(yīng)體系達(dá)到90度時(shí)，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個(gè)方法 過(guò)于煩瑣，尤其是對(duì)高通量應(yīng)用，并容易造成污染。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，加入鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開(kāi)。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。

ampliwax PCR Gems(Perkin Elmer)Taq Bead Hot Start Polymerase(Promega)Magnesium wax beads(Stratagene).象手動(dòng)熱啟動(dòng)方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase.polymerase被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過(guò)70度時(shí)，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。

7.Booster PCR

我們知道1ug human genomic DNA 大約在3X105個(gè)模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合.當(dāng)模板的濃度過(guò)低,比如低于100個(gè)分子時(shí), 引物和模板之間就很難發(fā)生反應(yīng).引物容易自身進(jìn)行反應(yīng)形成二聚體.這樣就有來(lái)了個(gè) booster PCR 我一直找不到合適的詞來(lái)翻譯這個(gè)booster.具體是這樣的.開(kāi)始幾個(gè)cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的 molar ratio在107~ 108.以確保開(kāi)始擴(kuò)增的準(zhǔn)確性.然后booste Primer的濃度到正常的水平8.循環(huán)數(shù)和長(zhǎng)度

確定循環(huán)數(shù)的基本原理是: 產(chǎn)物能夠保證你進(jìn)一步分析操作的最小循環(huán)數(shù).因?yàn)檫^(guò)多的循環(huán)數(shù)容易造 成ERRORS和非特異性產(chǎn)物的積累、產(chǎn)物的量不夠, 優(yōu)化的方法有: 1.增加TEMPLATE 2.增加循環(huán)數(shù)

如何確定循環(huán)數(shù),有一個(gè)方法.做一個(gè)PCR體系,40循環(huán),50ul, 分別在20,25,30,35循環(huán)時(shí)從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環(huán)數(shù)另一個(gè)會(huì)影響PCR特異性的是PCR cycling時(shí)在兩個(gè)溫度間變化的速率(ramping rate).當(dāng)然是越高越好.不過(guò)咱們大部分條件有限,就那么幾臺(tái)PCR儀,也沒(méi)有多少挑選的余地

9.thermal cycler

PCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視.長(zhǎng)時(shí)間的使用后需要調(diào)整PCR儀,以保證其能夠到達(dá)正確的溫度.現(xiàn)在的PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis).10.PCR additives

附加物或者說(shuō)enhancer實(shí)在是多種多樣.基本上包括幾類, 能夠增加反應(yīng)退火效率的化學(xué)因子, DNA結(jié)合蛋白和一些商業(yè)試劑.基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯(cuò)配, 增加產(chǎn)物的長(zhǎng)度和產(chǎn)量.在GC Rich情況中, additive可以造成配對(duì)堿基間的的不穩(wěn)定,從而提高擴(kuò)增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯(cuò)配的primer-template 復(fù)合物的極大的不穩(wěn)定, 而提高了擴(kuò)增的忠實(shí)性.要注意的是,沒(méi)有萬(wàn)能的enhancer全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,最好結(jié)合gradient pcr選擇最優(yōu)條件.====== dimethyl sulfoxide(DMSO)up to 10% formamide at 5% trimethylammonium chloride 10-100uM detergents such as Tween 20 0.1-2.5% polyethylene glycol(PEG)6000 5-15% glycerol 10-15% single stranded DNA binding proteins Gene 32 protein 1nM E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM 7 deaza-dGTP(for GC rich)150uM with 50uM dGTP Taq Extehder(stratagene)Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)Q-solution(Qiagen)====== 要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會(huì)抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度

11.Template DNA preparation

提取DNA時(shí)的試劑會(huì)抑制PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行.因此需要對(duì)TEMPLATE DNA進(jìn)行純化.特別是SDS(<0.01%)的情況下就能強(qiáng)烈抑制PCR的進(jìn)行.可以加入一些nonionic試劑,如Tween, Nonid, Trition之類的反過(guò)來(lái)抑制SDS.還有proteinase K也要除干凈, 不然會(huì)降解polymerase.12.Nested PCR

簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō) 設(shè)計(jì)兩對(duì)引物, 一對(duì)是長(zhǎng)的, 一對(duì)是包含在長(zhǎng)引物內(nèi)的, 用長(zhǎng)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第二次擴(kuò)增的模板,這樣可以增加產(chǎn)物的量.而且可以減少非特異性帶和錯(cuò)配的情況.增加PCR的保真性 高保真酶

高溫DNA POLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和一些陽(yáng)離子的存在情況下，在特定的引物指導(dǎo)下按3'-5'方向合成DNA.包括3種類型：

a.5'-3'方向的DNA合成能力,沒(méi)有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突變體.這類酶的合成能力強(qiáng),因?yàn)樗患m正合成中出現(xiàn)的突變

b.與a類似,有合成活性,沒(méi)有3-5的外切活性.但他們能以RNA為模板,合成DNA.如Tth DNA Polymerase c.有DNA聚合活性,沒(méi)有逆轉(zhuǎn)錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠實(shí)性。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比Taq DNA聚合酶低。酶的混合物

將Taq DNA聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨(dú)Taq DNA聚合酶高的忠實(shí)性，并可以得到高產(chǎn)量及擴(kuò)增長(zhǎng)模板。其他因素

除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會(huì)降低忠實(shí)性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實(shí)性會(huì)受影響。進(jìn)行較少的PCR循環(huán)也會(huì)有助于增加忠實(shí)性，因?yàn)樵黾友h(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長(zhǎng)度就會(huì)增加突變可能性。

第三篇：PCR實(shí)驗(yàn)室

簡(jiǎn)介

Pcr實(shí)驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡(jiǎn)稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過(guò)DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達(dá)納米級(jí)別，精確檢測(cè)乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復(fù)制、是否傳染、傳染性有多強(qiáng)、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時(shí)判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗(yàn)依據(jù)

條件

1、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實(shí)驗(yàn)室;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出 由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它 有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣 泛應(yīng)用。本文試就其定量原理、方法及參照問(wèn)題作一介紹

2、檢測(cè)設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)PCR熒光實(shí)驗(yàn)室設(shè)置要求;熒光定量PCR儀+實(shí)時(shí)熒光定量試劑+通用電腦+自動(dòng)分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)。

3、必須通過(guò)國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心的驗(yàn)收和認(rèn)證;

4、檢測(cè)人員必須通過(guò)國(guó)家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書(shū);PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)工作人員必須參加由國(guó)家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗(yàn)中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增培訓(xùn)班，并持證上崗。PCR實(shí)驗(yàn)室通過(guò)驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)室至少必須應(yīng)有兩個(gè)以上持有“臨床基因檢測(cè)上崗證”。PCR實(shí)驗(yàn)室必須建立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)行符合國(guó)家衛(wèi)生部的要求，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、確保實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生安全，確保實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行

5、必須在無(wú)菌無(wú)塵環(huán)境下進(jìn)行操作

功能

能夠?qū)颊卟∏檫M(jìn)行科學(xué)、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)的掌控，并結(jié)合抗HBV與T細(xì)胞免疫來(lái)打破免疫耐受，阻斷肝病病毒復(fù)制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒復(fù)制模板難以治療，人體免疫耐受狀態(tài)不易打破等醫(yī)學(xué)難題，能迅速消除臨床癥狀，而且有效抑制乙肝病毒復(fù)制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉(zhuǎn)換速度，殺滅血液及肝細(xì)胞內(nèi)的病毒，為防止再感染提供了長(zhǎng)期保護(hù)，有效阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化、肝硬化進(jìn)程。

建立方法

1、建立樣品準(zhǔn)備區(qū)

這個(gè)區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)該采取預(yù)防措施：⑴PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作。⑵組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無(wú)菌一次性移液管吸取。⑹管子打開(kāi)前都要簡(jiǎn)短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開(kāi)，這樣會(huì)產(chǎn)生氣溶膠。⑺任何時(shí)候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過(guò)程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。

2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會(huì)。為了避免這一問(wèn)題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報(bào)道。

3、建立前PCR區(qū)。

該去專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)，這個(gè)區(qū)域必須保持干凈，而且沒(méi)有來(lái)自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。

4、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作。

⑴所用的所有溶液都應(yīng)該沒(méi)有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過(guò)濾的，并且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。⑷所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。⑸所有試劑和樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。⑺樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時(shí)都應(yīng)該小心保存。

5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實(shí)驗(yàn)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時(shí)這樣做很有用。⑵如果你的實(shí)驗(yàn)室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。⑶作為一個(gè)規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照樣品來(lái)分析樣品配制和PCR前過(guò)程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過(guò)使用一個(gè)已知的弱陽(yáng)性樣品來(lái)驗(yàn)證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對(duì)照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。⑸當(dāng)做陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，有兩個(gè)理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。⑹由于必須有對(duì)照反應(yīng)，對(duì)照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮。

6、控制污染的方法。

已設(shè)計(jì)出很有力的酶學(xué)方法用來(lái)消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問(wèn)題，但可以將污染降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。

7、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個(gè)專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)

第四篇：PCR實(shí)驗(yàn)室

高端PCR實(shí)驗(yàn)室控制設(shè)計(jì)說(shuō)明

PCR實(shí)驗(yàn)室即分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，在醫(yī)療、科研、生物技術(shù)方面得到廣泛的應(yīng)用。因其在不同行業(yè)的應(yīng)用各有區(qū)別，在具體設(shè)計(jì)時(shí)也有不同之處，就醫(yī)療機(jī)構(gòu)的應(yīng)用而言，主要使用三區(qū)或四區(qū)設(shè)計(jì)，即試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品提取區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)；此類三區(qū)設(shè)計(jì)時(shí)候應(yīng)用于類似熒光定量型或同類PCR分析設(shè)備，及擴(kuò)增與分析過(guò)程在設(shè)備內(nèi)一次完成。而四區(qū)設(shè)計(jì)在三區(qū)的基礎(chǔ)上講擴(kuò)增分析區(qū)拆分為擴(kuò)增區(qū)與分析區(qū)適用于其他類型的pcr設(shè)備及手工處理。

在PCR實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)上，經(jīng)過(guò)多年的經(jīng)驗(yàn)累積，已經(jīng)在一些關(guān)鍵技術(shù)上達(dá)成了共識(shí)。因?yàn)镻CR實(shí)驗(yàn)中所產(chǎn)生的DNA與RNA片段過(guò)于微小，以至于可以穿透高效過(guò)濾器，所以在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)上已經(jīng)不在強(qiáng)制要求設(shè)計(jì)高效凈化系統(tǒng)，但是為了提高實(shí)驗(yàn)環(huán)境水平及保護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的敖貴設(shè)備方面，如果在具備條件的情況下可考慮追加高效空氣凈化系統(tǒng)；建議凈化級(jí)別萬(wàn)級(jí)。在PCR實(shí)驗(yàn)中所產(chǎn)生的DNA與RNA片段污染是一直以來(lái)PCR實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)問(wèn)題。此類污染主要至上次試驗(yàn)中所產(chǎn)生的基因片段對(duì)下次試驗(yàn)產(chǎn)生的污染，而且一旦試驗(yàn)環(huán)境中的污染形成后很難處理。因?yàn)橄镜葌鹘y(tǒng)方式對(duì)于基因污染沒(méi)有很良好的效果。所以在PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)中一般將整套實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)為全新風(fēng)型實(shí)驗(yàn)室，這樣而已通過(guò)有效的換氣次數(shù)來(lái)達(dá)到凈化室內(nèi)污染的作用。而在控制方面也有很多不同之處，因?yàn)楦鲉挝粚?duì)PCR實(shí)驗(yàn)的重視程度各有不同，所以在設(shè)計(jì)上也有不同，主要的控制設(shè)計(jì)有定送定排式壓力控制系統(tǒng)、變送定排式壓力控制系統(tǒng)變送變排式壓力控制系統(tǒng)。在控制設(shè)備方面也有很多區(qū)分如壓力無(wú)關(guān)型控制系統(tǒng)、壓力有關(guān)型控制系統(tǒng)。

根據(jù)業(yè)主要求，本PCR實(shí)驗(yàn)室為三區(qū)設(shè)計(jì)，各區(qū)可獨(dú)立使用，不設(shè)置高效過(guò)濾系統(tǒng)等相關(guān)要求，根據(jù)業(yè)主以上要求，我方給出的設(shè)計(jì)方案為壓力無(wú)關(guān)型變送變排壓力控制系統(tǒng)。本系統(tǒng)的特點(diǎn)是，設(shè)備啟動(dòng)后可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用節(jié)點(diǎn)調(diào)節(jié)送風(fēng)量及排風(fēng)量來(lái)控制各房間狀態(tài)，系統(tǒng)說(shuō)明見(jiàn)下圖

? 每個(gè)房間可分別控制，使用時(shí)通過(guò)房間開(kāi)關(guān)輸出啟動(dòng)信號(hào)，當(dāng)設(shè)備接到啟動(dòng)信號(hào)時(shí)設(shè)備運(yùn)行，運(yùn)行中根據(jù)管道壓力反饋決定變頻器大小，房間內(nèi)送排風(fēng)量由壓力無(wú)關(guān)型風(fēng)量調(diào)節(jié)閥控制。? 當(dāng)有多個(gè)房間開(kāi)啟或關(guān)閉時(shí)，設(shè)備更加管道壓力反饋，調(diào)節(jié)設(shè)備變頻器增加或減少送排風(fēng)量來(lái)穩(wěn)定管道壓力。各房間內(nèi)壓力又房間內(nèi)的壓力無(wú)關(guān)型定風(fēng)量閥進(jìn)行控制。

? 當(dāng)BSC（生物安全柜，B2全排）開(kāi)啟時(shí)BSC專用供風(fēng)機(jī)組運(yùn)行，BSC-供風(fēng)機(jī)-排風(fēng)機(jī)連鎖運(yùn)轉(zhuǎn)。

? 當(dāng)BSC做變風(fēng)量調(diào)節(jié)時(shí)，根據(jù)房間內(nèi)壓力變化，BSC專用供風(fēng)機(jī)組前安裝的壓力無(wú)關(guān)型變風(fēng)量調(diào)節(jié)閥根據(jù)壓力變化增減送風(fēng)量，確保房間壓力執(zhí)行在可控范圍內(nèi)。

? 當(dāng)房間不適用時(shí)，房間與緩沖間均關(guān)閉電動(dòng)密閉閥，確保房間處在密閉狀態(tài)避免布朗運(yùn)動(dòng)造成的可能污染風(fēng)險(xiǎn)。

? 房間換氣次數(shù)均按照一定凈化標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，當(dāng)室內(nèi)污染發(fā)生時(shí)，通過(guò)一定時(shí)間的換氣處理后，污染問(wèn)題可以基本解決。? 本系統(tǒng)如果業(yè)主需要，可在室內(nèi)送風(fēng)口末端加裝高效過(guò)濾設(shè)備，房間可升級(jí)為凈化型實(shí)驗(yàn)室。

? 壓力無(wú)關(guān)型風(fēng)閥簡(jiǎn)介：壓力無(wú)關(guān)型風(fēng)閥的特點(diǎn)是不會(huì)根據(jù)管道壓力的變化而影響風(fēng)閥內(nèi)部的送風(fēng)量，在一定管道壓力區(qū)間內(nèi)能夠自行調(diào)節(jié)閥體阻力，來(lái)穩(wěn)定送風(fēng)量，是高端實(shí)驗(yàn)室必備的關(guān)鍵部件，目前此類閥體技術(shù)均有國(guó)外生產(chǎn)廠家控制，目前國(guó)內(nèi)主用使用的產(chǎn)品有妥思、文丘里、西門子等品牌。

第五篇：PCR學(xué)習(xí)心得

參加《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員上崗培訓(xùn)

班》心得

本人于2015年3月10至15日參加了廣東省臨檢中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員上崗培訓(xùn)班。通過(guò)學(xué)習(xí)，除了取得廣東省臨檢中心頒發(fā)的培訓(xùn)證書(shū)外，還極大的提高了理論和實(shí)驗(yàn)操作水平，現(xiàn)總結(jié)如下。

此次培訓(xùn)包括理論培訓(xùn)和實(shí)驗(yàn)操作。在理論培訓(xùn)課程當(dāng)中，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的李金明教授為我們?cè)敿?xì)講解了《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)及質(zhì)量管理體系的建立》、《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的質(zhì)量保證》等內(nèi)容。通過(guò)學(xué)習(xí)，了解到臨床PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)必須遵循各區(qū)獨(dú)立、注意風(fēng)向、因地制宜，方便工作的原則。質(zhì)量管理的內(nèi)涵：寫(xiě)你所做的，做你所寫(xiě)的，記錄你已做的，分析你已做的。認(rèn)識(shí)到臨床標(biāo)本的正確采集、運(yùn)送、保存的重要性，是臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量保證的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，是解決涉及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的醫(yī)患糾紛的方法之一。同時(shí)通過(guò)病例分析，對(duì)于臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的檢驗(yàn)前，檢驗(yàn)中，檢驗(yàn)后的質(zhì)量控制，還有實(shí)驗(yàn)的結(jié)果處理和分析有了重新認(rèn)識(shí)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室是否出現(xiàn)污染的鑒別，以及出現(xiàn)污染的處理措施有了深刻了解。

臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展現(xiàn)在經(jīng)歷了三個(gè)時(shí)代，分別是生化診斷時(shí)代，免疫診斷時(shí)代，和和現(xiàn)在的分子（基因）診斷時(shí)代，而現(xiàn)今時(shí)代的標(biāo)志性技術(shù)正是PCR技術(shù)，是反映疾病本質(zhì)的實(shí)驗(yàn)。正是有臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)在癌癥等疾病的診斷方面有了多方應(yīng)用，通過(guò)驅(qū)動(dòng)基因的選擇，為靶向治療患者延長(zhǎng)了生存期。為個(gè)體化診療中對(duì)疾病的鑒別診斷，診治方案的設(shè)定提供重要的參考依據(jù)，同時(shí)也為治療過(guò)程中臨床對(duì)于治療方案的調(diào)整提供依據(jù)。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)在個(gè)體化診療中是不可或缺的一部分，是其重要的組成部分，具有強(qiáng)大的發(fā)展?jié)摿颓熬啊?/p>

實(shí)驗(yàn)操作內(nèi)容為EGFR突變基因檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，通過(guò)認(rèn)真學(xué)習(xí)和細(xì)致聽(tīng)講帶教老師的規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作，了解到了實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵操作，糾正了平常在臨床實(shí)際工作操作上的一些不良習(xí)慣，為日后規(guī)范檢驗(yàn)操作提供了基礎(chǔ)。通過(guò)分組親自操做實(shí)驗(yàn)，分析和判斷自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，做實(shí)驗(yàn)記錄筆記，基本掌握EGFR突變基因檢測(cè)。

通過(guò)為期六天的理論和實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)，從中學(xué)習(xí)到了很多知識(shí)，掌握了嚴(yán)格的防污染以及污染的處理措施，了解到實(shí)驗(yàn)室設(shè)置的人流、物流、氣流的走向設(shè)計(jì)原則，解決了日常工作中的實(shí)際問(wèn)題，為日后臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作的開(kāi)展打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。了解到臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展方向，受益匪淺。