第一篇：PCR技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

PCR技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

PCR技術(shù)可以從一滴血、一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量 DNA產(chǎn)物供分析檢驗(yàn)。PCR技術(shù)的應(yīng)用解決了許多以往血清學(xué)方法無(wú)能為力的問(wèn)題，而且離體蛋白質(zhì)在自然界中的穩(wěn)定性遠(yuǎn)不如核酸。所以 DNA的PCR檢驗(yàn)具有獨(dú)到的優(yōu)越性。目前，人們已建立了各種生物樣品如血液、血斑、精液、性交混合物、肌肉、單根毛發(fā)、上皮細(xì)胞、牙齒、骨骼中制備 DNA的實(shí)驗(yàn)方法。目前PCR技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用主要有： 1．VNTR多態(tài)性

該方法擴(kuò)增位點(diǎn)靶基因多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)核心序列數(shù)目不同而形成。目前報(bào)道有十幾種，比較成熟的有APOB、PMCT118、P33.6、P33.4、PYNZ22等位點(diǎn)。該方法簡(jiǎn)單，結(jié)

果易分析，缺點(diǎn)是在片段長(zhǎng)度差異較大時(shí)，長(zhǎng)片段可能被漏擴(kuò)增，引起錯(cuò)誤判斷。2．性別鑒定

PCR性別鑒定目前應(yīng)用于各種生物檢材檢驗(yàn)。通過(guò)擴(kuò)增y染色體特異位點(diǎn)鑒定，用Alu序列作對(duì)照，也可以同時(shí)擴(kuò)增x、y染色體特異性片段進(jìn)行鑒定。3．STR分型檢驗(yàn)

STR為短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandom Repeat）,形成多態(tài)性原理與VNTR相似，只是重復(fù)單位數(shù)3-6bp，片段長(zhǎng)度100-400 bp。STR與VNTR分布也不同，VNTR主要分布在染色體端粒，而STR則存在于整個(gè)基因組，估計(jì)人類(lèi)基因組有50萬(wàn)個(gè)STR位點(diǎn)，因此是巨大的遺傳差異研究對(duì)象。

STR位點(diǎn)的突出特點(diǎn)是基因組內(nèi)基因座多，多態(tài)片段短，在生物性檢材個(gè)人識(shí)別鑒定中實(shí)用價(jià)值極高，高度腐敗的檢材只要保存了靶DNA，STR位點(diǎn)就可能擴(kuò)增成功。STR的PCR擴(kuò)增時(shí)間短，變性、退火和延伸每步只需30~60S，可在一個(gè)半小時(shí)左右完成30個(gè)循環(huán)。檢測(cè)方法靈敏度高，甚至<1ng模板DNA都可擴(kuò)增出多態(tài)片段。STR的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)高分辨聚丙烯酰胺凝膠電泳，用等位基因梯階分子量標(biāo)準(zhǔn)物，即可準(zhǔn)確的判斷等位基因長(zhǎng)度?？色@得不連續(xù)的基因頻率分布，便于Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)和偶合概率計(jì)算。

1993年在英國(guó)Colin等報(bào)導(dǎo)用復(fù)合擴(kuò)增對(duì)12個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行研究，總排除率達(dá)1x10-14，表明STR復(fù)合擴(kuò)增可以認(rèn)定同一。STR在法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)操作方便簡(jiǎn)便，通過(guò)多位點(diǎn)累計(jì)，可以同一認(rèn)定；(2)靈敏度高，復(fù)合擴(kuò)增可以節(jié)約檢材；(3)片段較小，適宜部分降解DNA的擴(kuò)增。

4．線(xiàn)粒體測(cè)序技術(shù)

線(xiàn)粒體是真核細(xì)胞中與 能量代謝有關(guān)的細(xì)胞器，一個(gè)細(xì)胞中線(xiàn)粒體數(shù)的范圍約為1000~10000個(gè)，所以線(xiàn)粒體DNA分析比細(xì)胞核DNA分析要靈敏得多，線(xiàn)粒體測(cè)序分析另一特點(diǎn)是可以對(duì)無(wú)核細(xì)胞檢材，如毛干、紅細(xì)胞骨頭、指甲等進(jìn)行分析，而且細(xì)胞核DNA進(jìn)行測(cè)序分析必須用克隆的方法純化出單一的DNA分子才能進(jìn)行測(cè)序分析，而線(xiàn)粒體DNA可直接經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序。進(jìn)一步研究表明，線(xiàn)粒體是母系遺傳方式遺傳的，所以一母所生子女應(yīng)有相同的線(xiàn)粒體DNA序列。線(xiàn)粒體多變區(qū)在D區(qū)。擴(kuò)增D區(qū)多態(tài)片段測(cè)序，就可以進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。

目前，世界上絕大多數(shù)法醫(yī) DNA鑒定實(shí)驗(yàn)室主要工作就是應(yīng)用STR-PCR分型檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定等工作。

第二篇：PCR技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用

姓名

專(zhuān)業(yè)

翟揚(yáng)威 學(xué)號(hào) 11042106

食品科學(xué)與工程 班級(jí) 11-1

[摘要]: 如今食品營(yíng)養(yǎng)、安全問(wèn)題備受關(guān)注，是關(guān)系到人們健康和國(guó)家發(fā)展的重大課題，有關(guān)食品安全檢測(cè)的技術(shù)受到重視,其中 PCR技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)以及快速準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)在食品檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛的認(rèn)可.現(xiàn)主要介紹一下PCR技術(shù)檢測(cè)食品微生物的優(yōu)點(diǎn)，且分析了PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用及一些新的PCR檢測(cè)技術(shù)，并說(shuō)明了這些技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]: 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR 食品檢測(cè) 微生物

近年來(lái)，PCR技術(shù)在食品工業(yè)中倍受重視，例如：基因克隆、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)、微生物檢測(cè)、食品成分及產(chǎn)地的檢測(cè)等，推進(jìn)了基因工程在食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

首先，我們得了解PCR技術(shù)是什么？作用原理是什么？

PCR即聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)，是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究 的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研 究和檢測(cè)鑒定。過(guò)去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時(shí)便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。

PCR技術(shù)的基本原理：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴(lài)于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)合成，通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此為起始點(diǎn)，沿模板5′→3′方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。

參加pcr反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、D-NTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： ①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

PCR 技術(shù)檢測(cè)微生物的基本原理是在被檢測(cè)微生物核酸序列, 在PCR 體系下經(jīng)高溫變性、低溫退火、適溫延伸三步循環(huán)將單個(gè)核酸分子序列以2的指數(shù)進(jìn)行大量復(fù)制擴(kuò)增的過(guò)程。即在檢測(cè)時(shí), 被檢測(cè)微生物雙鏈DNA 序列在94℃變性解鏈成雙鏈, 55℃特異性引物與單鏈DNA 結(jié)合, 72℃在引物的引導(dǎo)延伸復(fù)制檢測(cè)微生物DNA 序列。以上三步進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增得到大量的被檢測(cè)微生物DNA 序列, 最后一般在凝膠電泳下檢測(cè)目的DNA。理論上只要樣品中有一個(gè)分子的微生物就可以在短時(shí)間內(nèi)用PCR 技術(shù)檢測(cè)到。食品中污染微生物種類(lèi)很多, 即使是同一種食品中微生物種類(lèi)也有很多, 用傳統(tǒng)的方法檢測(cè)食品中微生物要分離出所有的微生物很困難。特別是在檢測(cè)食品中的弱勢(shì)菌時(shí), 可能很難用傳統(tǒng)的方法檢測(cè)出來(lái), 特別是有些微生物很難培養(yǎng), 而用PCR 技術(shù)檢測(cè)這些微生物可以避免這些問(wèn)題, 因此, 利用PCR 技術(shù)能夠比較準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中微生物。

PCR技術(shù)在食品成分測(cè)定方面的應(yīng)用也倍受關(guān)注，如動(dòng)物源性成分的測(cè)定等。

近年來(lái)，瘋牛病、羊癢病及禽流感等疾病通過(guò)食品的傳播，由于食品安全性與質(zhì)量監(jiān)督的需要及宗教信仰等問(wèn)題，有必要對(duì)食品中的動(dòng)物源成分進(jìn)行檢測(cè)，僅靠傳統(tǒng)的外觀鑒別，無(wú)法準(zhǔn)確判定其實(shí)際成分。PCR 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物肉類(lèi)的物種檢測(cè)與飼料中的動(dòng)物成分檢測(cè)。陳文炳[20]等，應(yīng)用了PCR技術(shù)檢測(cè)12種加工食品中豬、牛、羊、雞等動(dòng)物源性成分，并開(kāi)發(fā)了真核生物所共有的18S核糖體DNA(18S R-DNA)與食品中多種動(dòng)物物種特異性基因片段之間的二重PCR檢測(cè)方法，以提高檢測(cè)效率與準(zhǔn)確性，節(jié)約檢測(cè)成本。王麗媛[21]等，利用單重PCR和多重PCR對(duì)部分市售肉制品進(jìn)行檢測(cè)，以確定食品中是否含有動(dòng)物源性成分及其含量。此方法操作簡(jiǎn)便，快速準(zhǔn)確，節(jié)省費(fèi)用。植物源性成分的測(cè)定

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)產(chǎn)品出口大國(guó)，加入WTO后，隨著農(nóng)產(chǎn)品出口量的增加，國(guó)外對(duì)出口食品質(zhì)量的要求也隨之提高。為確保食品的品質(zhì)和安全，為我國(guó)食品的進(jìn)出口貿(mào)易嚴(yán)格把關(guān)，保證我國(guó)人民日常生活的食品安全和生命健康。因此，開(kāi)發(fā)出準(zhǔn)確方便的鑒定食品有效成分的方法，具有重大意義。陳文炳[22]等本研究以豆粉與豆奶粉中的大豆成分(內(nèi)源Lectin基因)、食品中的玉米(IVR 基因)、馬鈴薯(PATA基因)、番茄(PG基因)等成分以及真核生物中普遍存在的核糖體DNA(18S R-DNA)片段為研究對(duì)象，進(jìn)行單一與二重PCR擴(kuò)增，以擴(kuò)增產(chǎn)物作為分子標(biāo)記，建立加工食品中植物源性有效成分的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)，為食品質(zhì)量與安全管理提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1]張玉霞，黃鳴.食品檢驗(yàn)中多重PCR技術(shù)的應(yīng)用.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2008年5月第18卷第5期 P958-960 [2]陳師勇、莫照蘭、徐永立.水產(chǎn)養(yǎng)殖病原微生物檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展.海洋科學(xué),2002.26(9)P31-35 [3]楊衛(wèi)軍,張小軍,張坤朋,張光杰.PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用.安陽(yáng)工學(xué)院學(xué)報(bào),2004(4)p16-18 [4]張玉霞，黃鳴.食品檢驗(yàn)中多重PCR技術(shù)的應(yīng)用.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2008年5月第18卷第5期 P958-960 [5]陳師勇、莫照蘭、徐永立.水產(chǎn)養(yǎng)殖病原微生物檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展.海洋科學(xué),2002.26(9)P31-35 [6]楊衛(wèi)軍,張小軍,張坤朋,張光杰.PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用.安陽(yáng)工學(xué)院學(xué)報(bào),2004(4)p16-18

第三篇：pcr檢測(cè)技術(shù)

《食品安全學(xué)》綜述

PCR快速檢測(cè)技術(shù)綜述

1．前言

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍，是肉眼能直接觀察和判斷；可從一根頭發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。過(guò)去幾天幾個(gè)星期才能做到的事情，用PCR幾個(gè)小時(shí)便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。

該酶促反應(yīng)最基本的3個(gè)環(huán)節(jié)是：[1]模板DNA的變性，即在94℃下模板雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA；[2]引物與模板鏈的特異性復(fù)性；[3]引物鏈的延伸。

2.研究的目的與意義

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)建立以來(lái)，定性技術(shù)不斷改進(jìn)和完善，可以達(dá)到檢測(cè)單個(gè)靶序列的水平、但實(shí)際工作中常需要定量檢測(cè)標(biāo)本中核酸，而不是某一特定序列存在與否，借助PCR對(duì)基因快速、敏感、特異而準(zhǔn)確定量成為目前分子生物學(xué)技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。定量PCR旨在評(píng)估樣品中靶分子數(shù)，此測(cè)定可以是絕對(duì)的，如每微克樣本中靶DNA的分子數(shù)；也可以是相對(duì)定量，即與設(shè)定的內(nèi)參照或外參照比較而言。鑒于PCR方法主要有5個(gè)，即對(duì)PCR產(chǎn)物的直接定量、極限稀釋法、靶基因與參照基因的同步擴(kuò)增、競(jìng)爭(zhēng)性PCR和熒光定量PCR[1]。這幾種放啊各有利弊，對(duì)其選擇取決于靶基因的特性、對(duì)PCR產(chǎn)量的期望值、對(duì)準(zhǔn)確度的要求、需要相對(duì)還是絕對(duì)定量。

人類(lèi)對(duì)于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。20世紀(jì)60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)。但是，由于核酸的含量較少，一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想。但是，當(dāng)時(shí)的基因序列分析方法尚未成熟，對(duì)熱具有較強(qiáng)穩(wěn)定性的DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動(dòng)合成階段，這種想法似乎沒(méi)有任何實(shí)際意義。

1985年，美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過(guò)兩年的努力，發(fā)明了PCR技術(shù)，并在Science雜志上發(fā)表了關(guān)于PCR技術(shù)的第一篇學(xué)術(shù)論文。從此，PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

但是，最初的PCR技術(shù)相當(dāng)不成熟，在當(dāng)時(shí)是一種操作復(fù)雜、成本高昂、“中看不中用”的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。1988年初，Keohanog通過(guò)對(duì)所使用的酶的改進(jìn)，提高了擴(kuò)增的真實(shí)性。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高。也正是由于此酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR技術(shù)得到了廣泛地應(yīng)用，使該技術(shù)成為遺傳與分子生物學(xué) 分析的根本性基石。在以后的幾十年里，PCR方法被不斷改進(jìn)：它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測(cè)定；從原先只能擴(kuò)增幾個(gè)kb的基因到目前已能擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。3.國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

3.1.基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用

目前從事分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說(shuō)幾乎沒(méi)有一個(gè)分子生物學(xué)家沒(méi)有使用過(guò)PCR。因此，PCR與分子克隆一樣是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，可用于達(dá)到以下目的：

[1] 擴(kuò)增目的基因和鑒定重組子； [2]克隆基因；

[3]基因功能和表達(dá)調(diào)控的研究； [4]基因組測(cè)序； [5]制備單鏈模板； [6]致突變；

3.2.PCR在臨床上的應(yīng)用[2]

[1]在遺傳學(xué)上的應(yīng)用：人類(lèi)的遺傳性疾病是因?yàn)槟骋粔A基序列發(fā)生了突變，使之缺失或形成某一限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，通過(guò)PCR結(jié)合限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP），就可以從基因的水平對(duì)遺傳性疾病進(jìn)行分析。例如，血友病甲是一種常見(jiàn)的遺傳性出血性疾病，患者體內(nèi)缺乏凝血因子FVIII這是由于基因第14個(gè)外顯子的第336位氨基酸的編碼基因發(fā)生了突變，產(chǎn)生了一個(gè)新的PstI酶切點(diǎn)，因此可以使用PCR-RFLP對(duì)血友病進(jìn)行診斷。PCR還可以用來(lái)檢測(cè)遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病。

[2]在腫瘤研究中的應(yīng)用：PCR已日益廣泛應(yīng)用于腫瘤的病因與發(fā)病機(jī)理研究以及腫瘤診斷與治療的研究中。例如，差異顯示PCR技術(shù)能針對(duì)不同腫瘤尋找其特異而敏感的標(biāo)志物，并用于腫瘤早期診斷、判斷預(yù)后及療效評(píng)估。另一方面，在使用普通放療、化療的同時(shí)可結(jié)合定量PCR技術(shù)檢測(cè)微小殘留病灶，以進(jìn)一步改進(jìn)治療方案。此外，由于癌癥的發(fā)生在一定意義上是單個(gè)細(xì)胞分子發(fā)生變化，因而可以使用單細(xì)胞PCR技術(shù)對(duì)癌癥的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究。[3]在基因分型中的應(yīng)用：當(dāng)進(jìn)行器官移植時(shí)并須先組織配型工作，此時(shí)常應(yīng)用序列特異性寡核苷酸多態(tài)性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）對(duì)人類(lèi)白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）進(jìn)行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性也可以用于對(duì)HLA的分型。3．3.在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[3]

例如：最早應(yīng)用DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性結(jié)合PCR-RFLP來(lái)進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。目前發(fā)現(xiàn)在真核生物基因組編碼和非編碼序列中的短串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間存在著差異，因此可以使用短串聯(lián)重復(fù)PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。使用PCR技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)鑒定的優(yōu)點(diǎn)是樣品用量小并且適于對(duì)高度降解材料的檢測(cè)。除剛才提到的之外，可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。所以，綜上所述，PCR的確是一種分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)。在它30多年的發(fā)展中衍生出了諸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突變PCR和定量PCR等十幾種不同的技術(shù)方法。PCR技術(shù)可以為基因工程提供目的基因，并廣泛地應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、免疫配型、疾病診斷等方面?？梢哉f(shuō)，PCR已經(jīng)滲透到了生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。21世紀(jì)是生物工程的世紀(jì)。我相信，在今后的發(fā)展中PCR技術(shù)會(huì)不斷地得到擴(kuò)充和完善，PCR技術(shù)也將4.相關(guān)檢測(cè)技術(shù) 4.1.技術(shù)原理

DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫下也能發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。

但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。4.2.工作原理

類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR 擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍 4.3.工作步驟

標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度 5.研究方案

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類(lèi)，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對(duì)DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會(huì)，具有極高的使用價(jià)值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開(kāi)創(chuàng)性意義。這些改進(jìn)都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡(jiǎn)便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見(jiàn)傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲(chóng)病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。5.1研究方法

① 早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

② 對(duì)低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長(zhǎng)期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無(wú)法檢出，可以用PCR法檢出。

③ 療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測(cè)乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過(guò)程中通過(guò)監(jiān)測(cè)血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動(dòng)態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測(cè)定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無(wú)法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽(yáng)性或假陰性。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動(dòng)態(tài)變化與病人病情無(wú)線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱(chēng)之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測(cè)出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動(dòng)態(tài)狀況。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對(duì)樣本中的RNA進(jìn)行分離純化，使這一問(wèn)題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類(lèi)，即低溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線(xiàn)性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實(shí)現(xiàn)單管單酶單人份的擴(kuò)增要求，這樣就在不降低擴(kuò)增敏感性的條件下，一步完成擴(kuò)增，不僅簡(jiǎn)化操作，而且又減少污染，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長(zhǎng)期存在于血清中。在PCR檢測(cè)時(shí)，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類(lèi)最重要的感染性疾病是幽門(mén)螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國(guó)胃炎發(fā)病率之高估計(jì)比乙型肝炎更嚴(yán)重，對(duì)HP的檢測(cè)應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對(duì)HP的檢測(cè)可以用生化法測(cè)試尿素酶或用免疫法測(cè)試血清中對(duì)HP特異性抗體，也可對(duì)胃液、胃粘膜樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測(cè)HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，5.2.技術(shù)路線(xiàn)

PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法。具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速、簡(jiǎn)便、可擴(kuò)增RNA或cDNA、對(duì)起始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)。5.3.所用儀器與材料

引物: PCR產(chǎn)物的特異性主要取決于引物鏈的特異性。由于存在同源序列，隨意設(shè)計(jì)的引物鏈，其PCR產(chǎn)物在電泳分析時(shí)可能出現(xiàn)多條鏈，因此在設(shè)計(jì)引物鏈時(shí)應(yīng)充分考慮引物特異性。引物長(zhǎng)度一般為15-30個(gè)堿基,G+C含量為40-60%,濃度0.1-1umol/L。TaqDNA聚合酶：濃度為1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶單位用量增長(zhǎng)可能導(dǎo)致非特異DNA擴(kuò)增。模板DNA：應(yīng)避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結(jié)合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制備方法有加熱法、凍溶法、超聲波粉碎法、堿變性法、SDS裂解法等多種。

4×dNTPs ： dNTP儲(chǔ)存液pH應(yīng)為7.0，在反應(yīng)體系中，4種dNTP的濃度應(yīng)相同，每種dNTP的濃度以50-200 umol/L為宜。緩沖液及其他成份：PCR反應(yīng)體系中，一般采用Tris-HCl緩沖液。適宜的Mg2+濃度為高于dNTP總濃度0.2-2.5 mmol/L。

6．研究?jī)?nèi)容

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠(yuǎn)比血清學(xué)或等方法確實(shí)可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個(gè)內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫(kù)中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時(shí)或DAN嚴(yán)重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護(hù)措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對(duì)極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進(jìn)行分析。在人類(lèi)基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點(diǎn)特征的稱(chēng)為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。6．1.檢測(cè)對(duì)象

常見(jiàn)的傳染性疾病有細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國(guó)具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。[4]乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細(xì)胞中增殖，也可以長(zhǎng)期存留在骨髓細(xì)胞或外周血白細(xì)胞中。通常用PCR法檢測(cè)血清中的乙肝病毒。有報(bào)道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細(xì)胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能 6．2檢測(cè)內(nèi)容

PCR反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)循環(huán)擴(kuò)增后，所需做的工作就是檢測(cè)反應(yīng)液中是否存在預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物及產(chǎn)物的特異性。目前已經(jīng)發(fā)展了許多檢測(cè)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。包括凝膠電泳、高壓液相色譜、核酸探針雜交、探針捕獲酶免疫分析、酶切圖譜分析、單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析、核酸序列分析。

PCR技術(shù)類(lèi)型[5]

免疫PCR技術(shù) 原位PCR技術(shù) 不對(duì)稱(chēng)PCR技術(shù) 巢式PCR技術(shù) 反向PCR技術(shù) 逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

復(fù)合PCR技術(shù)

彩色PCR技術(shù)

抗原捕獲PCR技術(shù) 增敏PCR技術(shù)

酶標(biāo)PCR技術(shù)

二溫式PCR技術(shù)

錨定PCR技術(shù)

定量PCR技術(shù)

毛細(xì)管PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)

巢式或套式PCR技術(shù) 7.預(yù)期目標(biāo)PCR 技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中

（1)簡(jiǎn)單PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物為633bp的DNA片段。其退火溫度為60℃－63℃, 應(yīng)用煮沸法與基因釋放法,大腸桿菌O157: H7檢出限分別為25與38CFU/ml,檢測(cè)時(shí)間為3h。Thomas等用PCR擴(kuò)增了slt基因片段。引物： 正鏈5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反鏈5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’

其PCR產(chǎn)物由凝膠電泳測(cè)定,檢測(cè)時(shí)間為ld。

徐建國(guó)等根據(jù)O157: H7 特有的hlyA、B基因序列設(shè)計(jì)了PCR引物,產(chǎn)物為338bp。

PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中（2）多重PCR:由于鑒定O157: H7血清型不能僅僅依靠簡(jiǎn)單PCR,近年來(lái)國(guó)外學(xué)者對(duì)多重PCR方法在大腸桿菌O157: H7的診斷價(jià)值方面進(jìn)行了研究。Meng等同時(shí)擴(kuò)增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其長(zhǎng)度分別為633、210、484bp。此引物設(shè)計(jì)可有效區(qū)別O157: H7血清型與O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一個(gè)單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa質(zhì)粒保守序列,其產(chǎn)物分別為1087、227、224、166bp。嚴(yán)笠選用針對(duì)大腸桿菌O157: H7志賀樣毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三對(duì)引物,在同一擴(kuò)增體系中進(jìn)行PCR,檢測(cè)12株不同來(lái)源的O157: H7大腸桿菌及其它致病性大腸桿菌及沙門(mén)菌、志賀菌15株。結(jié)果復(fù)合PCR方法較單一PCR方法具有較高的特異性，12株O157: H7取得了穩(wěn)定、可靠的陽(yáng)性結(jié)果。能迅速、有效地與其它致病性大腸桿菌及沙門(mén)氏菌、志賀菌相鑒別。

PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中的應(yīng)用（3）原位PCR: kurokawa等不用培養(yǎng)過(guò)程,直接用原位PCR技術(shù)結(jié)合落射顯微鏡,在單細(xì)胞水平快速檢測(cè)O157: H7。

4.23SrRNA在大腸桿菌O157: H7分型、檢測(cè)中

傳統(tǒng)的細(xì)菌分類(lèi)方法主要依賴(lài)于細(xì)菌的形態(tài)學(xué)、代謝產(chǎn)物、酶活性和表面抗原等特征。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展，微生物檢測(cè)進(jìn)入了基因時(shí)代，以核糖體核糖核酸序列為基礎(chǔ)的分類(lèi)方法為微生物的鑒別提供了新的分子生物學(xué)方法。[6]如16srRNA、23srRNA、16-23srRNA區(qū)間序列分析等等，它完全不同于傳統(tǒng)方法，具有快速、簡(jiǎn)便、敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

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第四篇：PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

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醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類(lèi)，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對(duì)DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會(huì)，具有極高的使用價(jià)值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開(kāi)創(chuàng)性意義。這些改進(jìn)都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡(jiǎn)便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見(jiàn)傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲(chóng)病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

常見(jiàn)的傳染性疾病有細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國(guó)具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細(xì)胞中增殖，也可以長(zhǎng)期存留在骨髓細(xì)胞或外周血白細(xì)胞中。通常用PCR法檢測(cè)血清中的乙肝病毒。有報(bào)道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細(xì)胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能。PCR法檢測(cè)乙肝的優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在：①早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。②對(duì)低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長(zhǎng)期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無(wú)法檢出，可以用PCR法檢出。③療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測(cè)乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過(guò)程中通過(guò)監(jiān)測(cè)血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動(dòng)態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測(cè)定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無(wú)法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽(yáng)性或假陰性。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動(dòng)態(tài)變化與病人病情無(wú)線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱(chēng)之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測(cè)出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動(dòng)態(tài)狀況。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對(duì)樣本中的RNA進(jìn)行分離純化，使這一問(wèn)題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類(lèi)，即低溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線(xiàn)性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實(shí)現(xiàn)單管單酶單人份的擴(kuò)增要求，這樣就在不降低擴(kuò)增敏感性的條件下，一步完成擴(kuò)增，不僅簡(jiǎn)化操作，而且又減少污染，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長(zhǎng)期存在于血清中。在PCR檢測(cè)時(shí)，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類(lèi)最重要的感染性疾病是幽門(mén)螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國(guó)胃炎發(fā)病率之高估計(jì)比乙型肝炎更嚴(yán)重，對(duì)HP的檢測(cè)應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對(duì)HP的檢測(cè)可以用生化法測(cè)試尿素酶或用免疫法測(cè)試血清中對(duì)HP特異性抗體，也可對(duì)胃液、胃粘膜樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測(cè)HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系統(tǒng)感染性疾病主要的有肺結(jié)核、非典型性肺炎等。結(jié)核桿菌感染曾給人類(lèi)健康帶來(lái)很大威脅，一度是較嚴(yán)重的致死性疾病之一。解放以后由于對(duì)結(jié)核病的預(yù)防的重視，特別是特效抗癆藥物的出現(xiàn)，使結(jié)核病流行基本被控制。近來(lái)結(jié)核病有抬頭的趨勢(shì)，基原因可能有兩方面，其一是耐藥株的不斷出現(xiàn)，其二是對(duì)結(jié)核預(yù)防重視不足。結(jié)核菌痰涂片鏡檢陽(yáng)性率太低，酶標(biāo)法又因抗原交叉反應(yīng)易出現(xiàn)假陽(yáng)性，結(jié)核檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是結(jié)核菌培養(yǎng)法。但培養(yǎng)法費(fèi)時(shí)昂貴并且受到用藥的影響，在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。PCR在結(jié)核菌檢測(cè)方面有簡(jiǎn)便、敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)。一般認(rèn)為樣本中內(nèi)要有100個(gè)左右的結(jié)核菌即可被檢出。目前用于結(jié)核菌PCR診斷的試劑，其引物主要來(lái)源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色體重復(fù)插入序列IS986、IS960、IS6110、染色體質(zhì)粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色體重復(fù)插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介紹并使用了IS986基因設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物為245BP，研究表明這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌有特異性。而后Thierry又介紹了插入序列IS6110基因，并認(rèn)為這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌具有比IS986更高的特異性及敏感性，最適合M.TB的檢測(cè)。結(jié)核菌痰標(biāo)本的PCR檢測(cè)應(yīng)注意以下幾種常見(jiàn)的問(wèn)題。其一，多條帶。即擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后有三條或三條以上的螢光除最前面的引物以外有兩條產(chǎn)物帶，這與插入序列本身各片段長(zhǎng)度有差異、結(jié)核菌在治療過(guò)程中染色體畸變、斷裂、缺欠及不等位交換有關(guān)。這種擴(kuò)增結(jié)果的判斷應(yīng)特別注意，凡在陽(yáng)性對(duì)照相應(yīng)位置有明顯條帶的判陽(yáng)性，否則應(yīng)為陰性，或建議病人過(guò)一些時(shí)間后再?gòu)?fù)檢一次；其二，結(jié)核痰樣本PCR檢測(cè)時(shí)，要使樣本充分液化，否則痰液中的粘液成份將影響擴(kuò)增效果，甚至?xí)?dǎo)致嚴(yán)重非特異性擴(kuò)增，電泳結(jié)果呈霧狀；基三，結(jié)核痰樣本PCR檢測(cè)結(jié)果可能表現(xiàn)為陽(yáng)性、陰性交替出現(xiàn)，這與結(jié)核病灶的不規(guī)律排菌有關(guān)。

循環(huán)系統(tǒng)以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經(jīng)腸道粘膜、淋巴結(jié)進(jìn)入血液，最終可定位于心肌細(xì)胞中導(dǎo)致心肌炎。目前對(duì)這些病毒的血液樣本檢測(cè)往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測(cè)時(shí)因其是RNA病毒所以應(yīng)注意樣本的保存。外在環(huán)境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測(cè)的血清常溫下不應(yīng)超過(guò)24小時(shí)，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR檢測(cè)在性傳播性疾病(STD)的診斷中有較廣泛的應(yīng)用。經(jīng)典的性傳播疾病有梅毒、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現(xiàn)代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意義。梅毒是由梅毒螺旋體感染布致，首先在局部形成硬軟下疳，布后經(jīng)血行播散到全身，最嚴(yán)重的是波及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。感染早期，梅毒螺旋體大量存在于硬下疳中，可以用生理鹽水濕棉簽擦去皮疹表面污物再用鈍刀片輕輕刮去上皮及結(jié)痂，用潔凈棉簽取滲出液樣本作PCR檢測(cè)，其敏感性及特異性極高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺體其取樣方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般無(wú)螺旋體存在，因此III病人及部分無(wú)皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血檢測(cè)。淋病是目前發(fā)病率最高的性傳播性疾病之一，由淋病雙球菌引起。淋病雙球菌一般為胞內(nèi)寄生，常見(jiàn)的感染部位為外生殖器、尿道粘膜最常見(jiàn)。在尿道及外生殖器分泌物中有許多非致病的雙菌存在，對(duì)分泌物拭子進(jìn)行涂片鏡檢時(shí)，常導(dǎo)致誤診。另外目前非淋球菌性尿道炎的發(fā)病率不斷增加，鑒別診斷特要，培養(yǎng)法準(zhǔn)確但費(fèi)時(shí)且費(fèi)用高，受用藥的影響。PCR法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隱性質(zhì)粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因設(shè)計(jì)的引物特異性高但其敏感性低；隱性質(zhì)粒設(shè)計(jì)的引物敏感性高但偶爾出現(xiàn)多條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷結(jié)果時(shí)應(yīng)以陽(yáng)性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)，凡在陽(yáng)性對(duì)照相應(yīng)部位有明顯條帶的為陽(yáng)性，其余均為陰性。以往對(duì)沙眼衣原體及解脲支原體的檢測(cè)主要靠培養(yǎng)法，費(fèi)時(shí)且昂貴，簡(jiǎn)便快速的PCR檢測(cè)對(duì)其有極高的使用價(jià)值。沙眼衣原體、解脲支原體樣本來(lái)源主要是尿道及宮頸分泌物拭子，由于分泌物中有許多污物含有PCR擴(kuò)增的抑制劑，因此每次采樣時(shí)盡量避免采集過(guò)多膿性分泌物，如果宮頸分泌物太多可以先用濕棉簽將表面的分泌物擦去，再用潔凈的濕棉簽輕壓旋轉(zhuǎn)采集宮頸脫落細(xì)胞送檢，其準(zhǔn)確性更高。PCR也可以用檢測(cè)單純皰疹病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒等。引物尖銳濕疣的病毒是人類(lèi)乳頭瘤（HPV）,可致生殖系統(tǒng)感染的乳頭瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究結(jié)果表明，在乳頭瘤病毒引起的良、惡性生殖器病變中，與血清型的關(guān)系并不密切，經(jīng)常有交叉或多型民時(shí)感染。為簡(jiǎn)化操作，對(duì)其基因?qū)Ρ确治鰧ふ夜餐蛄性O(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物可以同時(shí)檢出這幾種型別的病毒既簡(jiǎn)化操作又減少費(fèi)用是一種極理想的方法。

我國(guó)惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的發(fā)病率最高，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的60％以上。引起腫瘤的原因非常復(fù)雜包括外界環(huán)境因素及遺傳背景。外界因此可分為三大類(lèi)即化學(xué)、物理及生物因素。腫瘤與遺傳有關(guān)的證據(jù)越來(lái)越多，除已知的單基因遺傳腫瘤如視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤等以外，還在幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中觀察到原癌基因的重排，這些基因的變化常導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)控失調(diào)終形成腫瘤。癌基因是指在自然或?qū)嶒?yàn)條件下具有潛在誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因，它們是在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)的。目前已知的腫瘤基因有60多種，1969年Hubner根據(jù)Rous(1911)的實(shí)驗(yàn)，在小雞肉瘤濾液中發(fā)現(xiàn)一種能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后來(lái)又在其它哺乳動(dòng)物基因中發(fā)現(xiàn)與病毒癌基因同源序列，這種正常的細(xì)胞基因表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化有關(guān)。但若被某種因素激活就會(huì)轉(zhuǎn)化為有活力的癌基因，通常稱(chēng)之為原癌基因（Proto Oncogene）。為了與病毒癌基因區(qū)分，分別用V-Onc及C-Onc基因來(lái)代表。目前了解較多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常細(xì)胞中，并表達(dá)生物功能，只有在原癌基因被激活后才能誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可能的原癌基因活化機(jī)理有：①點(diǎn)突變，受到射線(xiàn)、化學(xué)因素、生物因素的誘導(dǎo)，這樣微小的變化，就會(huì)活化癌基因，活化的基因產(chǎn)物僅有極微的結(jié)構(gòu)差異，但在功能在卻有很大的區(qū)別。②獲得啟動(dòng)子，原癌基因從病毒基因中獲得啟動(dòng)子而活化。③基因易位，內(nèi)外界因素能導(dǎo)致染色體的某些基因易位、重排使原來(lái)無(wú)活性的原癌基因移至某些強(qiáng)的啟動(dòng)因子或增強(qiáng)子附近而被活化。④原癌基因的過(guò)量擴(kuò)增，原癌基因產(chǎn)物一般與生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體、跨膜信息蛋白有關(guān)或功能相近，過(guò)度表達(dá)時(shí)，會(huì)因調(diào)控失常而引起細(xì)胞癌變。另一類(lèi)與腫瘤相關(guān)的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因較復(fù)雜，作用機(jī)理不太清楚。癌基因檢測(cè)中常用的分子生物學(xué)技術(shù)有：雜交、DNA分子克隆、PCR擴(kuò)增及序列分析。PCR擴(kuò)增簡(jiǎn)便、快捷有較強(qiáng)的實(shí)用性，甚至可從病人體液樣本中檢測(cè)活化的癌基因而不需取活組織，對(duì)癌癥的早期診斷有極重要的意義。Ras基因是1964年首次從大鼠肉瘤的急性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分離出來(lái)取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱細(xì)胞細(xì)胞癌中檢出有轉(zhuǎn)化能力的ras基因與Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性稱(chēng)C-H-ras基因，后從肺細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)了與Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，從神經(jīng)母細(xì)胞中又發(fā)現(xiàn)了N-ras基因。Ras基因激活的最常見(jiàn)方式是點(diǎn)突變。人類(lèi)原發(fā)腫瘤時(shí)點(diǎn)突變主要發(fā)生在密碼子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行滅活，根據(jù)其點(diǎn)突變的情況可以基因診斷、療效觀察。用PCR擴(kuò)增樣本ras原癌基因，再使用雜交法、限制性?xún)?nèi)切酶消化或產(chǎn)物測(cè)序法檢測(cè)基因的突變情況即可用診斷。P53是抑制癌基因的代表，位于17號(hào)染色體短臂上，其產(chǎn)物為53KD分子量的蛋白從此而得名，可分為突變型和野生型，前者為癌基因，后者為抗癌基因。1979年Cane發(fā)現(xiàn)了P53蛋白Eliyahu發(fā)現(xiàn)了p53基因有抑癌作用。P53突變后其產(chǎn)物突變蛋白穩(wěn)定性增加，半衰期較野生型基因產(chǎn)物長(zhǎng)，在細(xì)胞內(nèi)堆積，可以用免疫組化法測(cè)出。PCR-RELP、PCR-SSCP則因方法簡(jiǎn)單、快速、特異性高，更具有實(shí)用價(jià)值。在SSCP分析中，單鏈DNA因堿基序列的變異，導(dǎo)致構(gòu)型改變，在進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，其泳動(dòng)速率發(fā)生改變，從布將變異的DNA與正常DNA區(qū)分開(kāi)，統(tǒng)計(jì)表明100-300bp分子大小的ssDNA突變檢出率可達(dá)97％，300-450bp標(biāo)出率可達(dá)69％，因此大于400bp的片段多態(tài)性應(yīng)采用其它方法檢測(cè)。

遺傳病是由于遺傳基礎(chǔ)異常而引起的疾病，人類(lèi)遺傳病約有3000多種，患者占總?cè)丝跀?shù)的10％。遺傳病大概可分為單基因、多基因及染色體遺傳病。常用診斷方法有家系譜分析、染色體檢查（特別是顯帶法）、生物化分析等。隨分子生物學(xué)發(fā)展，基因診斷愈來(lái)愈表現(xiàn)出其優(yōu)越性，PCR技術(shù)是基因診斷的主要技術(shù)之一，為快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)人類(lèi)遺傳病開(kāi)辟了一個(gè)新的途徑，預(yù)計(jì)與遺傳相關(guān)的疾病的檢測(cè)有80％將在3-5年內(nèi)被PCR法所取代。PCR在遺傳病診斷應(yīng)用中，可以利用引物直接擴(kuò)增變化的基因產(chǎn)物，也可以結(jié)合應(yīng)用限制內(nèi)切酶，分子雜交及電泳圖譜分析進(jìn)行診斷。應(yīng)用較為廣泛的有PCR法檢測(cè)中海貧血、苯丙酮尿癥、血友病、脆性X綜合癥及性別鑒定等。地中海貧血（Thalassmia）是世界上最常見(jiàn)的單基因遺傳病，不有同類(lèi)型，以a地中海貧血及在中海貧血最常見(jiàn)。a珠蛋白基因位于11號(hào)染色體短臂上，a珠蛋白基因突變致血紅蛋白的全成減少或缺失，表現(xiàn)溶血性貧血，肝脾腫大，在我國(guó)發(fā)病率為0.66％，貴州、四川等地高發(fā)可達(dá)2.2％。應(yīng)用PCR技術(shù)可以直接檢測(cè)突變的基因診斷此病。苯丙酮尿癥（Phenylketouria,PKU）是一種常染色體隱性遺傳病。病人肝臟苯丙氨酸羥化酶嚴(yán)重缺乏使苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酷氨酸血癥，出現(xiàn)腦組織損傷，智力障礙。此病患者出生時(shí)正常，出生后一經(jīng)確診立即停止母乳喂養(yǎng)，采用低苯丙氨酸飲食治療8-10年不致影響患者智力，但低苯丙氨酸飲食代價(jià)之昂貴是一般家庭所不能承受的，關(guān)鍵在于避免患兒出生。因此本病的早期診斷有極其重要的意義。PCR結(jié)合斑點(diǎn)雜交能有效診斷PKU。遺傳性疾病的基因變化很復(fù)雜，單基因固定位點(diǎn)變異布致病的情況很少，因此基因診斷過(guò)程中往往需要PCR技術(shù)與限制性?xún)?nèi)切酶、斑點(diǎn)雜交、聚丙烯酰胺膠電泳圖譜分析及擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析結(jié)合，作綜合判斷。

優(yōu)生學(xué)包括基礎(chǔ)優(yōu)生學(xué)、社會(huì)優(yōu)生學(xué)、臨床優(yōu)生學(xué)及環(huán)境優(yōu)生學(xué)。孕期檢查及產(chǎn)前診斷是臨床優(yōu)生學(xué)的最重要內(nèi)容之一。孕期檢查除一般項(xiàng)目外還能及時(shí)了解孕婦是患有某些對(duì)胎兒發(fā)育有嚴(yán)重影響的疾病如風(fēng)疹病毒感染、沙眼衣原體、解脲支原體、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、弓體感染等，及時(shí)發(fā)現(xiàn)及時(shí)治療并采取有效措施預(yù)防發(fā)展成為宮內(nèi)感染。PCR技術(shù)對(duì)這些病原體的檢測(cè)簡(jiǎn)便而確實(shí)，另外利用PCR技術(shù)可以對(duì)地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥、脆性X綜合癥等遺傳性疾病進(jìn)行宮內(nèi)診斷?？梢?jiàn)PCR在優(yōu)生優(yōu)育方面有很高的應(yīng)用價(jià)值。

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠(yuǎn)比血清學(xué)或等方法確實(shí)可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個(gè)內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫(kù)中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時(shí)或DAN嚴(yán)重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護(hù)措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對(duì)極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進(jìn)行分析。在人類(lèi)基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點(diǎn)特征的稱(chēng)為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。由于VNTR在等位基因中的多態(tài)性便構(gòu)成了遺傳標(biāo)記。使用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)合對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜分析即可進(jìn)行個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。由2-6核苷組成的重復(fù)串聯(lián)序列稱(chēng)為微衛(wèi)星。在人類(lèi)基因組中，微衛(wèi)星更加豐富。微衛(wèi)星的重復(fù)序列比VNTR短，擴(kuò)增分型簡(jiǎn)便，易于自動(dòng)化，在VNTR或微衛(wèi)星不僅重復(fù)片段的數(shù)量不同而且重復(fù)片段的核苷酸也具有多態(tài)性。在VNTR或微衛(wèi)星多態(tài)性分析時(shí)，如再結(jié)合堿基配對(duì)分析可以藜得更大量的信息，這一種更有希望的標(biāo)志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理論上其對(duì)嫌疑人的排除率為99.999％。PCR技術(shù)可以完成替代早期的Southern印跡法進(jìn)行多態(tài)性分析而且操作簡(jiǎn)便，敏感性及準(zhǔn)確性都有大幅度的提高。當(dāng)然PCR技術(shù)在法醫(yī)中的應(yīng)用仍在起步階段有許多技術(shù)問(wèn)題等待解決，如樣本中的抑制劑、檢村中DNA的損報(bào)告?zhèn)?、PCR擴(kuò)增污染等。想念隨著PCR技術(shù)的不斷完善它將在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有更加廣泛的應(yīng)用。

第五篇：關(guān)于PCR技術(shù)及其應(yīng)用實(shí)例和前景

PCR技術(shù)及其應(yīng)用實(shí)例和前景

檢驗(yàn)0905郭媛媛

PCR是我們研究 分子生物學(xué)的重要方法和工具，隨著醫(yī)學(xué)科技的不斷發(fā)展，這種技術(shù)越來(lái)越被人們看重，越來(lái)越多的應(yīng)用到我們的科技研究之中，作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作者，這種技術(shù)也是我們必須掌握的從這篇文章中讓我們了解一下它在實(shí)踐之中的前景。

摘要：PCR(ploymerse chain reaction)技術(shù)[1]，即聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，又稱(chēng)基因體外擴(kuò)增技術(shù)或和核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，利用兩種與相反鏈雜交并利用附著于目標(biāo)DNA兩端的寡核苷酸引物在高溫(95°C)使目標(biāo)DNA片斷的DNA雙鏈變性，分解為單鏈，在較低溫度(37-63°C)與引物退火，然后變溫到72°C左右。在耐高溫DNA聚合物酶的作用下引物被沿樣板DNA單鏈延伸合成互補(bǔ)鏈，然后有變性→退火→延伸反復(fù)進(jìn)行。引物大大過(guò)量，dNTP過(guò)量，酶在高溫中是較穩(wěn)定的，這樣經(jīng)過(guò)幾十個(gè)循環(huán)，目標(biāo)DNA片斷就按2的n次方遞增，用此法可以從mRNA中，cDNA庫(kù)中擴(kuò)出目標(biāo)基因?？傊?，生物體內(nèi)核酸的復(fù)制是半保留復(fù)制，PCR技術(shù)就是在體外對(duì)此進(jìn)行復(fù)制模擬。

關(guān)鍵詞：PCR技術(shù)；DNA；應(yīng)用；工程效益擴(kuò)大 1 引言

人類(lèi)利用微生物的實(shí)踐具有悠久的歷史，公元前，人類(lèi)就已經(jīng)利用天然的微生物（酶）生產(chǎn)奶酪和酒。進(jìn)入工業(yè)革命時(shí)代，人們開(kāi)始對(duì)天然微生物進(jìn)行篩選和誘變，生產(chǎn)某些簡(jiǎn)單的代謝產(chǎn)物，氨基酸，維生素和抗生素。

20世紀(jì)60年代至今，隨著人類(lèi)雖微生物認(rèn)識(shí)的加深，DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)，發(fā)酵技術(shù)的提高：更多的微生物可產(chǎn)生各種各樣的抗生素，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物學(xué)(Medical Microbiology)中；更多微生物被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生促生物質(zhì)，有利于人和動(dòng)植物的生長(zhǎng)，對(duì)農(nóng)業(yè)科學(xué)(Agriculture)有著極重要的支持；還有些微生物的代謝產(chǎn)物是重要的化工原料，加速了化工產(chǎn)業(yè)(Chemical Industry)的完善；再有些微生物被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)鑒定(Forenic)、醫(yī)學(xué)(Medical Science)、環(huán)境監(jiān)測(cè)(Environment Supervise)分子克隆(Member Clone)、序列分析(Alignment Analysis)、考古研究(Archaeology Search)等重要學(xué)科，具有廣泛的應(yīng)用前景，這就是我要介紹的PCR技術(shù)。2 PCR技術(shù)原理

下面我通過(guò)摘錄了一個(gè)實(shí)驗(yàn)[2]，來(lái)介紹一下PCR技術(shù)的過(guò)程及其原理(至于它詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程和方法詳見(jiàn)參考文獻(xiàn))。.在94°C高溫下雙鏈變性，分離出DNA單鏈的模板，然后降溫(55°C)，然添加的與DNA單鏈配對(duì)，緊接著溫度升高(72°C)，在DNA聚合酶的作用下，脫氧核苷三磷酸開(kāi)始滲入，并從引物的結(jié)合端開(kāi)始，按5ˊ-3ˊ方向延伸，合成出新生的DNA互補(bǔ)鏈，這一過(guò)程稱(chēng)為一循環(huán)，然后重復(fù)該循環(huán)，模板DNA被大量復(fù)制。

在此，我要特別強(qiáng)調(diào)幾點(diǎn)注意事項(xiàng)，這也是這個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)者提醒我們需要注意的地方：

(1)在配置PCR反映體系的過(guò)程中，Taq酶應(yīng)在加入dNTP混合物后加入，因?yàn)橛行┟傅?ˊ-5ˊ的外切酶反應(yīng)較強(qiáng)，反映體系如果不含dNTP，反應(yīng)體系中的引物可能被分解。

(2)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，可能是模板有與引物同源性高的其他位點(diǎn)，其次是復(fù)性溫度太低，適當(dāng)提高復(fù)性溫度就可以解決這些問(wèn)題。

以上實(shí)驗(yàn)可清楚明了地向我們展示PCR技術(shù)的原理。3 PCR技術(shù)分類(lèi)

PCR技術(shù)自從1985年由Millus創(chuàng)立后，經(jīng)歷了20年的飛速發(fā)展，是傳統(tǒng)微生物學(xué)與現(xiàn)代基因?qū)W之間的完美結(jié)晶，已成為當(dāng)今世界上不可或缺的一項(xiàng)重要的微生物應(yīng)用技術(shù)，下面我將介紹幾種常用的PCR技術(shù)[3] 3.1反轉(zhuǎn)錄PCR 反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)即以RNA分子為模板的擴(kuò)增技術(shù)，主要用于克隆cDNA、檢測(cè)RNA病毒、合成cDNA探針機(jī)構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。3.2定量PCR 定量PCR(quantitative PCR)的基本原理是。假定其反應(yīng)產(chǎn)物的數(shù)量同反映混合物中起始模板的mRNA或DNA的量成正比，因此通過(guò)瓊脂糖電泳樣品條帶得比較，便可以確定兩種PCR產(chǎn)物之間的數(shù)量關(guān)系。另外定量PCR還有廣義和狹義之分[4]，在此就不詳細(xì)介紹了。3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用映光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)校正曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，還具有特異性更強(qiáng)、有效解決了PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。3.4重組PCR 重組PCR(recombinant PCR RP-PCR)是指用PCR法在DNA片段上進(jìn)行點(diǎn)突變，即擴(kuò)增產(chǎn)物中含有域模板序列不同的堿基。利用重組PCR可造成DNA片段的堿基插入或缺失，從而研究目的基因片段的功能。3.5反向PCR 反向PCR(inverse PCR IP-CR)是對(duì)一個(gè)已知的DNA片斷序列兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究的技術(shù)。3.6多重PCR 多重PCR(multiplex PCR)即在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，擴(kuò)增同一模板的幾個(gè)區(qū)域。多重PCR可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)或病原生物，有利于遺傳病和感染性疾病的診斷。3.7不對(duì)稱(chēng)PCR 不對(duì)稱(chēng)PCR(asymmetric PCR)即在擴(kuò)增體系中加入不同濃度的引物，而得到單鏈DNA產(chǎn)物。

另外還有幾種新型的、最近興起的PCR技術(shù)[5]，雖不十分成熟，但發(fā)展前景十分廣闊。它們包括： 3.8原位PCR 原位PCR是指對(duì)組織細(xì)胞中特異DNA或RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后再用原位PCR進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用原位雜交對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析的一種方法。目前有報(bào)道[6]用這種方法可檢測(cè)出組織細(xì)胞中的人乳頭瘤病毒、艾滋病毒、結(jié)核桿菌等。3.9巢式PCR 巢式PCR比常規(guī)PCR靈敏度大大提高，同時(shí)第二次擴(kuò)增又可鑒定第一次擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。所以這種方法用于臨床檢驗(yàn)，目前血清中丙型肝炎的監(jiān)測(cè)多用這種方法。

4.PCR技術(shù)應(yīng)用實(shí)例

PCR技術(shù)自從建立以來(lái)，由于其敏感、高效、操作簡(jiǎn)便，在分子生物學(xué)研究、臨床醫(yī)學(xué)和其他很多領(lǐng)域中得到4.1分子生物學(xué)理論研究[7] 如：制備cDNA文庫(kù)與篩選，要較多的組織。但如果用PCR技甚至幾個(gè)細(xì)胞就可以構(gòu)建cDNA高了工作效率。

再如：DNA測(cè)序、檢測(cè)突變堿基、基因重組與融合、用簡(jiǎn)并引物法擴(kuò)增未知序列，無(wú)不是PCR技術(shù)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用。4.2臨床醫(yī)學(xué)[8]

如：病原體診斷，利用PCR技術(shù)可以檢測(cè)標(biāo)本中的病毒、細(xì)菌、支原體，直至寄生蟲(chóng)等病原生物，標(biāo)本可以是組織、血液、細(xì)胞、分泌物、排泄物等。以后還發(fā)展了遺傳病基因的診斷、組織器官移植的配型選擇、腫瘤的診斷轉(zhuǎn)移和確定、法醫(yī)學(xué)和其他臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。4.3考古學(xué)[9]

由于PCR技術(shù)對(duì)基因組的完整性要求不高，因而對(duì)分子考古學(xué)極為有幫助，科判定生物種類(lèi)間的親緣關(guān)系、進(jìn)化途徑等。

如：1997年德國(guó)慕尼黑大學(xué)動(dòng)物研究所科學(xué)家宣稱(chēng)[10]，他們對(duì)歐洲原始人——?dú)W洲尼安德特人化石中的基因殘余物進(jìn)行分析，結(jié)果表示著名的歐洲原始人尼安德特人不是歐洲現(xiàn)代人的祖先，這一結(jié)果又得到了英國(guó)、俄羅斯和瑞典科學(xué)家的進(jìn)一步證實(shí)，為現(xiàn)代人的起源提供了新的論據(jù)。4.4 其他領(lǐng)域

PCR技術(shù)還在動(dòng)植物研究領(lǐng)域、組織和群體生物學(xué)等領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用[11]。5.前景與總結(jié)

結(jié)合對(duì)以上PCR技術(shù)的了解，我認(rèn)為PCR技術(shù)可以加快實(shí)現(xiàn)它的工程化，效

既費(fèi)錢(qián)費(fèi)時(shí)，又需術(shù)，只要很少組織文庫(kù)，并且大大提了廣泛應(yīng)用。益化，如：應(yīng)用在現(xiàn)代環(huán)境工程污水處理工程的微生物載體研究上[12]，PCR技術(shù)暫時(shí)只是致力于理論方面和研究方面，它并沒(méi)有像其他微生物技術(shù)那樣給人類(lèi)社會(huì)帶來(lái)大規(guī)模的經(jīng)濟(jì)效益，假如可以實(shí)現(xiàn)這一設(shè)想，那么不但PCR技術(shù)本身可以得到更加快速的發(fā)展，而且我們還可以促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

比如說(shuō)：在傳統(tǒng)的生物發(fā)酵技術(shù)上可以結(jié)合PCR技術(shù)，利用DNA在體外的復(fù)制和雜交，并實(shí)現(xiàn)表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)基因工程的超遠(yuǎn)緣雜交的物種突破難進(jìn)行的問(wèn)題；再比如：可以通過(guò)PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)核酸雜交技術(shù)，核酸雜交法比抗原捕獲特異、敏感，但半衰期短，放射性污染不易處理，顯影時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)外常用的生物素檢測(cè)標(biāo)本中致癌物質(zhì)[13]。

另外，還有很多微生物的PCR技術(shù)在工程上的應(yīng)用，這里就不一一列舉了。關(guān)鍵是怎樣擴(kuò)大在工程上的應(yīng)用，以擴(kuò)大經(jīng)濟(jì)效益。這是PCR技術(shù)的關(guān)鍵。

PCR技術(shù)運(yùn)用傳統(tǒng)生物技術(shù)結(jié)合近代基因工程原理，包含反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)、定量PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、重組PCR技術(shù)、反向PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)、不對(duì)稱(chēng)PCR技術(shù)等多種傳統(tǒng)PCR技術(shù)和原位PCR技術(shù)、巢式PCR技術(shù)等一系列新興PCR技術(shù)。最新的進(jìn)展如[14]：結(jié)核桿菌診斷PCR；病毒學(xué)PCR技術(shù)；HIV感染PCR；檢測(cè)人COX??；DMS/BMD基因；地中海貧血PCR；血友病A基因?

在工業(yè)在分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等眾多領(lǐng)域取得了巨大成就，不但只是局限于研究領(lǐng)域，而且還從實(shí)用角度證明了PCR技術(shù)是一項(xiàng)令人類(lèi)值得自傲的技術(shù)。自從1985年由Millus創(chuàng)立之后，又得到了近二十年的發(fā)展，所以PCR技術(shù)的發(fā)展前景是不可估量的。它絕對(duì)是現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)中一項(xiàng)值得發(fā)展的技術(shù)，在當(dāng)今社會(huì)乃至未來(lái)社會(huì)都會(huì)有它的立足之地，充分運(yùn)用它，人類(lèi)會(huì)在文明發(fā)展的進(jìn)程中，發(fā)出更耀眼的光芒。參考文獻(xiàn)：

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