第一篇：分子實驗學習總結——郁娟娟

DNAstar：序列拼接 MEGA：分析堿基組成 CLUSTAL：序列比對 PAUP：跑樹 DABE：飽和性分析

總思路：序列拼接-比對-

四、下載序列的方法

打開.Fasta格式的序列-File export-sequance alignment-保存 在NCBI上找到相應的序列方法：

Search Nucleotide

for 文章的genibank序列號-reports-復制序列到txt文件中，刪除沒用的東西，只留下序列和學名。保存成txt文件后，打開Editseq-將,txt序列復制到其中-save保存為seq格式

五、將拼接序列翻譯成蛋白質方法

打開拼接的序列-全選中-Goodies-translate DNA

2、如何計算堿基含量比值、答：MEGA-Nucleotide Composition

六、DAMBE序列飽和性分析

序列的飽和性分析在DAMBE程序中，以轉換、顛換數(shù)為縱軸，以TN93模型（Tamura and Nei, 1993）校正的距離為橫軸做散點圖。如果這些點隨序列間分歧增大呈線性分布就說明序列間替換沒有達到飽和，序列可以用于后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析。DAMBE還長用在單倍型的歸納、基因頻率和堿基組成分析、遺傳距離計算、序列排序、5.2.2堿基替換飽和效應的檢驗

當核苷酸序列分歧較小時，序列之間被觀察到的核苷酸差異數(shù)接近實際替換數(shù)。如果序列分歧較大，DNA序列的變異可能會受到飽和效應的影響，這時觀察到的堿基差異可能包含了部分進化雜音。一般說來，堿基轉換發(fā)生的頻率高于顛換，但是隨物種分歧程度的增加，轉換/顛換的比率接近或小于1，說明轉換可能已經(jīng)趨于飽和并可能成為進化雜音，所以轉換和顛換發(fā)生的頻率與序列間分歧度的關系就可以反映出堿基替換是否受飽和效應的影響。在著手構建分子系統(tǒng)樹前，為了排除這種進化雜音獲取正確的進化信息，必須對目的片段的堿基替換是否受到飽和效應的影響進行檢驗。

用 DAMBE（Xia，2000）分別對四個mtDNA片段的堿基替換模式進行檢測，以此估計所研究mtDNA片段的堿基替換是否受到飽和效應的影響。

打開DAMBE-FILE-Open standard sequence file-類型unknown-打開

proteincoding

and

nuc.seq-invMtdna-trains-table

versis

advance –go-graphics-trainsition tranversion –tn93-g0-graphstyle-curve only-保存.bmp

問題

1、如何計算密碼子的不同位上堿基變化，轉換顛換比值

2、如何進行序列的飽和性分析

序列的飽和性分析在DAMBE程序中，以轉換、顛換數(shù)為縱軸，以TN93模型（Tamura & Nei, 1993）校正的距離為橫軸做散點圖。如果這些點隨序列間分歧增大呈線性分布就說明序列間替換沒有達到飽和，序列可以用于后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析。

3、如何看用Editseq檢驗拼接后的序列是否能正確翻譯為蛋白質

4、如何計算遺傳距離（DAMBE）

一、DNAstar：序列拼接

在序列的拼接時，修改紅色和小寫字母的堿基 具體步驟：

1、2、ABI文件包括圖形和序列、SEQ文件只有序列沒有圖。DNAstar—seqman—File—NEW，把序列都放近去，有兩個正向，倆個反向的序列—Time ends—LOW—SEAN ALL-ASSEMBLE –出現(xiàn)contig 打開-雙擊contig_@_核對-contig-save consenus-single file-保存位置-sequce-add-選擇保存到的位置-點序列名字-add-雙擊-拼接完關閉。3、4、5、原始序列和拼接的序列各保存在一個文件夾內。EDIT-GOODIES-TRALS 翻譯成蛋白質?！?/p>

從ncbi上下載相關的序列和測得的序列保存在一個文件夾內，把前面的內容都刪除，保留種名。加〉符號-保存

二、序列的比對

6、先切齊序列：用Seqman-sequence-add-skip-把所有的序列加進去進行刪除，使序列整齊。-contig雙擊,將序列切齊，再復制到一個新建的文本文檔。

7、切齊后保存方式：contig-export sequences-multiple files=set location-file-保存切齊

8、當在切齊的序列中發(fā)現(xiàn)反向序列要改正：用editseq打開序列-select all –goodies-reserse complement-全選粘貼到文本文檔中，目的是比對。

三、構建NJ樹方法(MEGA)

1、將TXT格式保存為nexus和clustal格式（生成alndndnxs）CLUSTAR-進行比對-FILE-LOAD SEQUENCE-打開新建的文本文檔txt-加入進去后-aligment-do complete Alignment-File-Save sequence as –format-custal-ok-File-Save sequence as –format-NEXUS最后保存為nexus和clustal格式，NEXUS是PAUP格式-關閉clustal.2、點擊MEGA-File-open data-.aln文件-打開-ok-點擊向下的綠色圖標MEGA-File-open data-切齊序列,meg-ok-yes-inverttebrate-ok-ok-刪除最后沒用的東西-保存-切齊序列,meg-

3、點擊Mitochondrial-ok-

4、phylogency-construct phylogency-NJ樹-none改成bootstrap-k 2p-compute-保存（image-EMF）

5、使用Mega 2.0分析序列間的p-distance, 即兩兩序列間的核酸差異比例，分析序列變異情況 方法1：

Distance-compute pairwise-distance only改為std err-compute 方法2：

pattern-compute composition distance

三、構建MP樹方法

1、MrBays，目的是轉化為.nex文件步驟為：

用bioedit將.txt文件比對轉換成.nex文件格式

方法：打開BioEdit，將.txt文件打開-Accessory application-clustal multiple alignment-File-export-sequence Aligment-選paup/nex命令.nex-保存-把.nex begin 前面的都刪除。File-open-切齊序列.txt-accessory appliacation-clustal multiple aligment-file-expore-sequence aligment-選paup/nenu命名.nex-保存

2、在.nex中加命令模板

;end;begin paup;log file=coimp;set maxtrees=1000;set criterion=parsimony;hsearch addseq=random nreps=1000;showtrees;describetrees 1/plot=phylogram brlens=yes;savetrees file=coi(mp).tre root=yes brlens=yes;contree all/file=coi.tre;pscore all/CI=yes RI=yes RC=yes;bootstrap

nreps=1000 search=heuristic/addseq=random nreps=100;savetrees file=coi(mpb).tre root=yes;END;

2、打開paup-打開1.nex-open –開始跑樹

3、用treeview 打開.tree樹。

keepall=yes

MrBays建樹

1、用bioedit將.txt文件比對轉換成.nex文件格式

方法：打開BioEdit，將.txt文件打開-Accessory application-clustal multiple alignment-File-export-sequence Aligment-選paup/nex命令.nex-保存-把.nex begin 前面的都刪除。

File-open-切齊序列.txt-accessory appliacation-clustal multiple aligment-file-expore-sequence aligment-選paup/nenu命名.nex-保存2、3、用paup運行.nex文件

接著繼續(xù)用paup打開modeltest3.7 文件夾中的model paupblock命令-運行結束后，在modeltest 的modelfolder中生成一文件名為”model.scores”文件。

4、運行modeltest批處理文件，生成一文件名為”mt.txt”文件，則為最適合的模型文件

5、將最適模型文件中的參數(shù)(hLRTs)拷貝到.nex文件后，加入貝葉斯運行命令，并改正.ne格式等。刪除前后沒用的，改正外群名字等。只能用一個外群。

begin mrbayes;log start filename=coibayes.log;outgroup Cinara;Prset statefreqpr=dirichlet(0.3321,0.1058,0.1271,0.435);Lset nst=6 rates=gamma;mcmc ngen=1000000 printfreq=100 nchains=4 savebrlens=yes startingtree=random;end;

6、將加好命令的.nex文件拷貝到MrBayes文件夾所在路徑內，運行人頭的MrBayes , 輸入execute.文件名.net,回車。

7、8、輸入 sump burnin=1000回車 輸入 sumt burnin=1000回車

9、運算完畢后點擊close 彈出一對話框，輸入命令語句“ save tree file＝文件名.tre；”回車。

菜單欄Tree中的Show internal edge labels 即可顯示各結點的bootstrap值。

9、生成的.con，用treeview打開

注意：貝葉斯樹只能用一個外群。建設一個新文件夾，將.scores、mt.txt、txt、nex文件都放到一個文件夾內。

ML建樹

方法同MrBays相似。預測模型利用貝葉斯得到的模型。把ML命令模板拷貝到.nex，把log file改成自己的名(=coiML)，外群也改(Daktulosphaira_vitifoliae Cinara_edulis C_arizonica);-把最適模型lset base---likhood下面savetree file=coi savetrees file=coin(mb)Lset Base=(0.3365 0.0976 0.1280)Nst=6 Rmat=(26794342.0000 8028280.5000 10365153.0000 1.4084 255543472.0000)Rates=equal Pinvar=0.7355;–生成的.nex.con文件-treeview打開。

注意：外群要寫成Cinara_edulis形式，可以有多個外群。打開方式和mp樹一致。

戴傳銀筆記 PAUP NJ tree begin paup;outgroup outgroupname;setcriterion=distance;bootstrap search=nj nreps=1000 keepall;savetrees file=nj.tre;end;

PAUP MP TREE begin paup;outgroup outgroupname;setcriterion=parsimony;hsearch addseq=simple(random)bootstrap nreps=1000;describetrees 1/plot=phylogram brlens=yes;savetrees from=1 to=1000;end;

PAUP ML TREE begin paup;outgroup outgroupname;setcriterion=likelihood;gettrees file=xxx.tre;(xxx modeltest文件保存的樹的名稱)hsearch addseq=asis bootstrap nreps=1000;savetrees file=ml.tre;end;

MEGA3.1分析其核酸組成

1、打開MEGA，點擊“File”中的“Open Data”打開“COI.aln”文件，點擊綠色箭頭－“Convert to Mega format”快捷鍵，出一把COI.aln轉換成Mega格式的對話框，點擊OK，即轉換成COI的Mega file，保存。

2、用Mega 打開該文件。選Data Type。Protein－coding nucleotide sequence data？Yes。Select genetic Code。程序自行計算。

3、點擊TA圖標，出現(xiàn)Sequence Data Explorer C：Conserved sites 291/660,分母613是總位點數(shù) V：Variable sites 352/660 P: Parsimony-informative sites 26/660 N: Nonparsimony-informative sites 352-26＝326。

4、Mega-File-open

date-運

算

-sequence

Data Explorer-write data to file-title-寫名字.nex 注意：序列一定要正確，不能是反向的?。?！

5、打開paup-打開1.nex-open –開始跑樹

6、Bootstrap 值檢驗及樹的保存

輸入命令“bootstrap nreps＝1000 keepall＝y(tǒng)es search＝heuristic/addseq＝random nreps＝100；”點擊回車鍵，程序開始運算。運算完畢后點擊close 彈出一對話框，輸入命令語句“ save tree file＝文件名.tre；”回車。

菜單欄Tree中的Show internal edge labels 即可顯示各結點的bootstrap值。

7、用treeview 打開.tree樹。

阿征筆記 begin paup;set autoclose=yes notifybeep=yes;log file=log.txt;outgroup A00;set root=outgroup outroot=monophyl;set criterion=parsimony;hsearch chuckscore=1;savetrees format=nexus brlens=yes append=yes file=mp.tre root=yes;contree

all/file=mp(contree).tre

strict=no

addseq=random

nreps=500

nchuck=5 majrule=yes percent=50 le50=yes;bootstrap nreps=1000 conlevel=50 keepall=no search=heuristic/addseq=random nreps=100;savetrees

file=mp(bootstrap).tre

root=yes brlens=yes savebootp=both from=1 to=1000;end;征征 20:31:57 我每次都是先寫到contree那一步，然后在里面敲命令，后兩條分別

征征 20:32:13 begin paup;set autoclose=yes notifybeep=yes;log file=log.txt;outgroup A00;set root=outgroup outroot=monophyl;set criterion=parsimony;hsearch chuckscore=1;savetrees format=nexus brlens=yes append=yes file=mp.tre root=yes;contree

all/file=mp(contree).tre

strict=no

addseq=random

nreps=500

nchuck=5 majrule=yes percent=50 le50=yes;end;征征 20:32:25 然后bootstrap nreps=1000 conlevel=50 keepall=no search=heuristic/addseq=random nreps=100;征征 20:32:36 跑完后 savetrees file=mp(bootstrap).tre root=yes brlens=yes savebootp=both from=1 to=1000;征征 20:32:54 保存一個有bootstrap的樹 征征 20:33:35 再給你個阿榮給我的 征征 20:33:42

set autoclose=yes criterion=parsimony notifybeep=yes;log file=...;Hsearch addseq=random

nreps=100

start=stepwise savereps=yes randomize=addseq rstatus=yes hold=1 swap=tbr multrees=yes;savetrees format=nexus brlens=yes append=yes file=...;contree all/strict=no majrule=yes percent=50 le50=yes;bootstrap nreps=1000

conlevel=50

keepall=yes search=heuristic/addseq=random nreps=10;征征 20:34:16 對了，我的outroot=monophyl;你們分子不是monophyl

PAUP軟件使用簡要說明

1.數(shù)據(jù)輸入格式

將需要分析的一組DNA數(shù)據(jù)經(jīng)Clustal軟件比對分析后，將其比對結果的*.aln文件用Mega軟件打開并轉換為Mega格式（File-〉Convert To Mega Format），轉換結果會以*.meg文件存在與*.aln同一目錄下，再用DNAsp軟件將*.meg文件轉換為PAUP格式（File-〉Save/Export Date As，以NEXUS File Format保存）即可。

2.MP法分析

先啟動PAUP軟件，選擇相應數(shù)據(jù)文件，然后在命令行內依次鍵入

outgroup_外群名 回車

Bootstrap_nreps=1000_keepall 回車

Describetree 回車

Savetrees_from=1 to=1000 回車

3.NJ法分析

先啟動PAUP軟件，選擇相應數(shù)據(jù)文件，然后在命令行內依次鍵入

outgroup_外群名 回車

Set_criterion=distance 回車

Bootstrap_search=nj_nreps=1000_keepall 回車

contree 回車

Savetrees_from=1_to=1000 回車

4.ML法分析

先啟動PAUP軟件，選擇相應數(shù)據(jù)文件，然后在命令行內依次鍵入

outgroup_外群名 回車

Set_criterion=likelihood 回車

Bootstrap_nreps=100_keepall 回車

contree 回車

Savetrees_from=1_to=100 回車

注：外群名指的是分析數(shù)據(jù)中外群的代號；

下劃線“_”表示鍵入一個空格；

結果以*.tre格式存在分析數(shù)據(jù)的同一文件夾內，用Treeview軟件打開。

郁娟娟總結

一 Seqman 用來Assemble ,改錯后保存成Seq.Seqman 將所有的序列打開，將反方向的用Editseq轉換過來。

二 Editseq 打開所有的Seq序列——export as one----fas格式 三 Mega 打開fas格式文件——Alignment---alignment by clustle

第二篇：分子實驗

分子生物學實驗設計方案

學院： 專業(yè)班級： 課程： 實驗名稱： 組員： 實驗日期：

一、實驗目的

1、學習與掌握利用ITS序列鑒定真菌的原理；

2、掌握用ITS序列鑒定真菌的方法有步驟。

二、實驗原理

1、菌物是真核生物的重要類別，傳統(tǒng)的菌物分類以子實體形態(tài)特征和生理生化指標為分類基礎，由于部分菌物的子實體不易獲得，形態(tài)特征不易掌握，少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定，是傳統(tǒng)的菌物鑒定工作困難或分類系統(tǒng)意見分歧。內轉錄間隔區(qū)ITS(internal transcribed space), 位于5.8S和18S之間（ITS1）以及5.8S和28SrDNA之間(ITS2)，ITS1和ITS2常被合稱為ITS，并且5.8SRNA基因也被包括在ITS之內。近年來，利用真核生物在rDNA的ITS區(qū)域既具保守性又在科、屬、種水平上均有特異性序列的特性，對ITS區(qū)進行PCR擴增、測序。隨著核糖體rDNA ITS序列分析技術在菌物研究中的應用，一些分類地位不明確、親緣關系不清楚的物種通過該技術得到了解決，一些重要的菌物遺傳信息得到闡明。

2、ITS（Internal Transcribed Spacer）：內轉錄間隔區(qū)。是真菌核糖體RNA（rRNA）基因非轉錄區(qū)的一部分。用于真菌鑒定的ITS序列通常包括ITS1、5.8 S 和ITS2。真菌ITS 區(qū)域長度一般在650 ～750 bp(堿基對)。

ITS（Internal Transcribed Spacer）鑒定是指對ITS序列進行DNA測序，通過將測序得到的ITS序列與已知真菌ITS序列比較，從而獲得未知真菌種屬信息的一種方法。

ITS鑒定的原理：rDNA 上的5.8、18 和28 SrRNA 基因有極大的保守性, 即存在著廣泛的異種同源性。而由于ITS 區(qū)不加入成熟核糖體, 所以ITS 片段在進化過程中承受的自然選擇壓力非常小,因此能容忍更多的變異。在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性, 即使是親緣關系非常接近的2 個種都能在ITS 序列上表現(xiàn)出差異, 顯示最近的進化特征。研究表明,ITS 片段的進化速率是18 S rDNA 的10 倍。這就是ITS 序列在微生物種類鑒定和群落分析的理論基礎。ITS1 和ITS2 是中度保守區(qū)域, 其保守性基本上表現(xiàn)為種內相對一致, 種間差異比較明顯。這種特點使ITS 適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關系分析。由于ITS 的序列分析能實質性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異, 此外ITS 序列片段較小、易于分析, 目前已被廣泛應用于真菌屬內不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中。ITS 的序列分析還有效地解決Lenti nul a、Suill us、Tuber、Cer at ocystis 和Oi diodendron等真菌應用形態(tài)學特征進行分類所引起的紛爭, 彌補了傳統(tǒng)分類上的一些不足。

ITS 鑒定的方法學：真菌rDNA ITS 序列分析用于真菌系統(tǒng)分類通常通過多聚酶鏈式反應(PCR)技術實現(xiàn)。rDNA 多復制的特性, 有利于低濃度或被更高度降解的DNA 樣品中ITS區(qū)域的擴增。這有利于研究尚無任何rDNA 序列資料的生物。根據(jù)這些基因上高度保守區(qū)段設計出通用引物, 借助PCR 技術擴增rDNA 的目的片段。PCR 技術在真菌分類、鑒定中與直接測序法相結合有很大的優(yōu)越性[ 14] : ①只需少量的DNA, 每次擴增只需約0.1 ～10 ng;②可對DNA 的2 條鏈測序, 從而減少錯誤;③可利用總DNA 的較粗制備品;④適合于自動測序儀進行測序。

三、實驗器材

1、真菌總基因組DNA的提取及其純度、濃度的檢測：

1)、儀器： 離心機 離心管 移液槍(200μL、1000μL)槍頭 研缽 恒溫水浴鍋 超凈工作臺 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 一次性手套 凝膠成像系統(tǒng) 紫外分光光度計 2)、材料：真菌 3)、試劑：

(1)、DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS(2)、3M NaAc(3)、TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA(4)、酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)(5)、氯仿:異戊醇(24:1)(6)、異丙醇(7)、無水乙醇(8)、75%乙醇

(9)、加入巰基乙醇(10)、RNaseA

2、ITS片段的PCR擴增及其產物電泳檢測：

1)、儀器：PCR熱循環(huán)儀 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 移液槍 一次性手套 2)、材料：真菌ITS片段 3)、試劑：

（1）、引物：ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’(5’端引物)ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’(3’端引物)（2）、ddH2O(2.5mM)（3）、10×MgCl2 緩沖液（4）、DNA模板（5）、脫氧核糖核酸聚合酶(Taq酶)（6）、50×TAE貯存液（7）、6×加樣緩沖液（8）、100bpDNA ladder。(9)、溴酚藍染料

3、ITS片段測序

1)、儀器：PCR熱循環(huán)儀 高壓電泳儀 測序用電泳槽 制膠設備 吸頭、與電泳玻璃相配的染色盤、小指管

2)、材料：ITS片段PCR擴增產物 3)、試劑：

藥品： 三羥甲基氨基甲烷（Tris）乙二胺四乙酸(EDTA)硼酸 尿素 丙烯酰胺 N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）過硫酸銨 冰乙酸 碳酸鈉（Na2CO3）甲醛 硫代硫酸鈉 硝酸銀（AgNO3）測序級Taq DNA 聚合酶 4種 d/ddNTP混合液 pGEM-3ZF(+)對照DNA 1μg/μL ITS4/ITS5正向引物 粘合硅烷 硅烷

溶液：

（1）、5×TBE：

Tris 13.5g 硼酸 6.9g EDTA 0.9g 用雙蒸水定容至250mL（2）、6%變性聚丙烯酰胺凝膠貯液：

尿素

63.06g

丙烯酰胺

8.5g

N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺 0.45g 5×TBE 15mL 用雙蒸水定容至150mL（用普通濾紙過濾后使用）。

4、BLAST比對、鑒定屬、種：

儀器：電腦及攜帶BLAST程序（基本局部相似性比對搜索工具）

5、進化樹的繪制

儀器：電腦及攜帶MEGA軟件（分子進化遺傳分析）

四、實驗內容及步驟

(一)、實驗內容：

1、大量真菌的準備;

2、真菌總基因組DNA的提??；

3、真菌基因組DNA純度、濃度的檢測；

4、ITS片段的PCR擴增；

5、ITS片段的PCR擴增產物電泳檢測；

6、ITS片段測序；

7、BLAST比對、鑒定屬、種。

(二)、實驗步驟：

1、真菌總基因組DNA的提取及其純度、濃度的檢測：（1）、準備大量的真菌，然后去1g真菌，在液氮中迅速研磨成粉。

（2）、2%CTAB抽提緩沖液在65℃水浴中預熱；

(3)、在1.5mL離心管中加入65℃預熱的抽提液700μL。(4)、加入巰基乙醇50μL，上下震蕩，使蛋白質變性沉淀，65℃水浴40min，每隔10min振蕩混勻一次。

(5)、加入等體積（約750μL）的氯仿/異戊醇(24/1)混勻，除去蛋白質，4℃平衡離心，10000rpm，10min。(6)、取上清（約750μL）到1.5mL離心管中，加1/5體積（約150μL）65℃預熱的CTAB/NaCl混勻，加入600μL的氯仿/異戊醇(24/1)混勻，4℃平衡離心，10000rpm，10min。

(7)、取上清，加等體積（約750μL）的CTAB沉淀液，顛倒混勻。65℃水浴30min至沉淀可見。4℃平衡離心，10000 rpm，10min后小心去上清。

(8)、沉淀用TE（0.5mL）溶解，加入等體積（約0.5mL）的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提，4℃平衡離心，10000rpm，10min。

(9)、取上清加入2倍體積的無水乙醇（1mL），再加入1/10體積的NaAC（pH 5.2）約0.1mL。(10)、-20℃冰箱1h，4℃平衡離心，12000rpm，10min，棄上清，用70%酒精清洗2次，濾紙吸去多余水分，超凈臺吹干。

(11)、0.05mL TE溶解，加入5μLRNA酶液37℃放置30min；(12)、吸取適量樣品于紫外分光光度計上檢測濃度與純度；(13)、剩余的樣品置于-20℃保存待用。

2、ITS片段的PCR擴增及其產物電泳檢測

ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’

1)、PCR Amplification reaction system（PCR擴增反應體系）（50μl）ddH2O 38.5μl 10×buffer with MgCl2(MgCl2 緩沖液)5.0μl dNTPs(2.5mM)1.0μl Primer5’（5’端引物）2.0μl Primer3’（3’端引物）2.0μl DNA template（DNA模板）1.0μl Taq DNA polymerase(脫氧核糖核酸聚合酶)(5U/μl)0.5μl

2)、反應程序如下：

（1）94℃ for 5 minutes denaturalization（94℃預變性5min）（2）94℃ for 45 seconds denaturation（94℃變性45s）（3）52℃ for 45 seconds annealing(52℃退火45s)（4）72℃ for 1min30sec extension（72℃延伸90s）重復步驟(2)-(4)30次

（5）72℃ for 10 minutes final extension（72℃最后一次延伸 10min）大概500bp左右

3)、取5μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余-20℃保存：

(1)、瓊脂糖凝膠：將50×TAE貯存液用蒸餾水稀釋成1×TEA電泳緩沖液，待用，按1%稱取適量瓊脂糖置于250mL錐形瓶中，加入對應量1×TEA稀釋緩沖液，蓋上封口膜，以減少水分蒸發(fā)，放入微波爐里加熱沸騰，取出搖勻，使瓶壁上粘附的瓊脂糖全部溶解，反復3次，至瓊脂糖全部溶化，放置，待其稍冷卻。

(2)、膠板的制備：將制膠槽置于水平支持物上，選擇合適厚度和齒數(shù)的樣品梳，插上梳子。向冷卻至50-60℃的瓊脂糖凝膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液數(shù)滴，搖勻，小心地倒入制膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后，小心拔出梳子，將膠塊取出，至于已加入足量1×TEA電泳緩沖液的電泳槽內。

(4)、加樣：取5μl樣品與2μl 6×加樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加樣品槽中，在第一個孔或最后一個上樣孔內加入5μl的100bpDNA ladder。

(5)、電泳：接通電泳槽與電泳儀的電源，以5V/cm(約100V)電泳，當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。

(6)、成像：戴上一次性手套，在波長為254nm的紫外燈下觀察膠塊，DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶，用凝膠成像系統(tǒng)照相。

3、ITS片段測序

（一）測序反應：

1.對于每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當?shù)膁/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)石蠟油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.對于每組四個測序反應,在一個eppendorf管中混合以下試劑：

（1）樣品反應：

質粒模板DNA 2.1pmol 5×測序緩沖液 5ml 引物 4.5pmol 無菌ddH2O 至終體積 16ml

（2）對照反應

pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg)4.0ml

5×測序緩沖液 5ml

ITS4/ITS5正向引物(4.5pmol)3.6ml

無菌ddH2 O 至終體積 16 ml

3.在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。

4.從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。

5.在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。

6.把G、A、T、C 4個反應管放入預熱至95℃的熱循環(huán)儀，先經(jīng)過95℃ 2min，然后進入如下循環(huán)：

95℃ 30s 變性 42℃ 30s 退火 70℃ 1min 延伸 45-60個循環(huán)后，取出置于冰箱中

7.熱循環(huán)程序完成后，在每個小管內加入3μl DNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。

（二）、測序凝膠板的制備

1、玻璃板的處理：

（1）短玻璃板的處理

A.在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鮮的粘合溶液。

B.用經(jīng)浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過并已經(jīng)自然干燥的玻璃板, 整個板面都必須擦拭。

C.4-5分鐘后, 用95%乙醇單向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程, 每次均須換用干凈的紙, 除去多余的粘合溶液。

2、長版處理（換雙橡膠手套）

(1)、用浸透硅烷的吸水紙仔細擦邊玻璃板表面。

(2)、5-10min后，用浸透95%乙醇的干凈吸水紙輕輕擦去多余硅烷(硅烷不能過量，否則影響印染效果)。(3)、用0.4mm邊條裝配好，再用膠帶粘好，用夾子夾好以防滲漏。

(4)、將板呈40°角傾斜，按下面的比例直接混合溶液，然后用燒杯直接灌膠，或用50mL注射器注入，避免出現(xiàn)氣泡（氣泡出現(xiàn)，可敲擊玻璃板，使之排出）。

6%變性聚丙烯酰胺凝膠貯液90mL，四甲基乙二胺(TEMED)60μL，過硫酸胺90μL。灌滿后將鯊魚梳子背面插入液面5-6mm，將板放置20°角使之聚合。在室溫中約20min內聚合（注意底部不要邊條，直接用膠帶封，否則邊條不易取出）。

3、測區(qū)產物凝膠電泳（凝膠灌制后2-24h后均可獲得良好結果）

(1)、去掉凝膠兩邊和底部膠帶紙，拔下鯊魚齒梳并轉過來用尖齒插入凝膠約1mm。將凝膠板安裝到電泳儀上，在電極上、下槽都倒入1×TBE電泳緩沖液，用吸管吹洗掉梳齒形成加樣孔中殘留的尿素，并去掉氣泡。

接穩(wěn)定電源，40cm膠以1300V預電泳20-30min，是凝膠加熱到60℃左右。

(2)、將G、A、T、C 4個小管，各加入3μLDNA測序反應終止液，置于沸水中煮沸2min迅速插入冰中，上樣前，短暫離心混勻。(3)、關閉電源，上樣4μL。

(4)、上樣后，繼續(xù)電泳，直至二甲苯藍染料距離玻璃板底部2cm時，終止電泳。

4、DNA測序凝膠的銀染法處理

(1)、玻璃板的分離： 電泳結束后，小心揭開玻璃板，凝膠應牢牢黏附在短板上。

(2)、凝膠的固定： 將凝膠連同放入磁盤中，加入固定液，注意要沒過凝膠，放置20min直至溴酚藍和二甲苯藍的顏色消失。緩緩水平搖動。固定液可回收做定影液。(3)、洗膠： 用雙蒸水漂洗凝膠3次，每次2min。漂洗時輕輕搖動，每次前都將膠瀝干10-20s。(4)、凝膠的染色： 加入染色液緩緩搖動染色30min（25min后可在另一瓷盤中備好顯影液，同時要預冷到10℃）。

(5)、凝膠的漂洗： 由于這一步非常關鍵，所以操作一定要非?？?。將染色液倒入一個容器內，將瓷盤用雙蒸水涮一下，然后倒入3L雙蒸水，將凝膠浸入，然后將凝膠立即放入準備好的預冷顯影液中（從膠浸入雙蒸水到放入顯影液 不能超過5-10s，如超過則重復（4）（5）步）。

(6)、凝膠的顯影： 緩緩搖動，直到凝膠上顯條帶，一般為5-6min，時間不要過長，否則背景會過深（邊搖動，邊觀察，棕褐色條帶到一定強度后，馬上終止）。

(7)、終止顯影： 將等體積定影液直接加入顯影液，緩緩搖動2-3min（時間過長會使染色變淡）。

(8)、凝膠的漂洗： 用雙蒸水漂洗2次，每次2min。(9)、將凝膠放在空氣中干燥，識讀序列。

4、BLAST比對、鑒定屬、種

5、進化樹的繪制

第三篇：陳娟娟拜師總結

拜師學藝總結

雙井鎮(zhèn)中心小學陳娟娟

2014年秋，為拉動新教師的成長，我校組織開展拜師學藝活動。經(jīng)過一段時間的學習，我在教育教學過程中進步了很多，感慨很多，現(xiàn)總結如下：

一、對教師職業(yè)的認識

教師是教育過程中的主導力量。教師道德品質不僅是教師自身的行為規(guī)范，而且還是作用于學生的教育手段。其高尚與否，關系到到素質教育能否得以正確順利地實施。我深知作為人類靈魂的工程師，必須具有高尚的道德品質，對學生要有慈母般的愛心，且不斷更新、充實自己的知識，做到與時代同步，才能培養(yǎng)出符合社會發(fā)展需要的人才，挑好肩上這付教書育人的重擔。

二、自己的幾點收獲

（一）、自己對于工作有了更深刻的認識

我總認為教師只要上好自己的課，把課本上的東西傳授給自己的學生就夠了，而缺乏對教師社會責任的認識。通過這段時間的學習，我的師傅陳杰老師對我淳淳教誨，進行了系統(tǒng)的教師社會責任的講解，使我知道了身為一名人民教師，我們不但要把課本上的知識交給學生，還要交給學生做人、做事的道理。通過教師的努力，學生不但要把知識學好，還要遵法守紀，勤勞禮貌，做一個合格的社會公民。

（二）、學到了新的知識

陳杰老師是我校經(jīng)驗豐厚的教師了，理論豐富，知識淵博。在與陳老師的學習中，有很多疑難問題在商討中得到了解決，使我不僅豐富了課本知識，更增加了許多課外知識，開闊了視野，自己的理論水平也得到了提高，同時也為自己的人生樹立了更高的目標，我相信這會對我終生受益的。

（三）、掌握了新的教學方法

在大學實習的過程中，我習慣沿用上學時老師的教學方法，過于陳舊，效果也不是太好，究其原因，是因為我對現(xiàn)在的學生，比如他們的心理和行為認識不夠，把握不準，造成了教學方法上的被動。通過陳老師的指導和我自己的努力，我進步了很多。同時，陳老師將他自己多年來研究的教學方法傳授給了我。通過對這些方法的運用，上課取得了很好的效果。

（四）、思想境界受到了感染

在與陳師相處的過程中，他心胸豁達，樂觀的思想境界深深感染了我。當我遇到了工作中的困難時，自己也能以一種坦然、把苦當樂的心態(tài)去克服它。

三、今后的努力方向。

（一）、加強師德修養(yǎng)，展現(xiàn)人格魅力

在教學過程中，我要利用業(yè)余時間積極學習國家教育方針，教育政策，遵守學校各項規(guī)定，甘做人梯，安于教師生涯，以“捧著一顆心來，不帶半棵草去”的高尚情懷，獻身教育，努力工作。

（二）、熱愛學生，以身作則

教師對學生要有一顆慈母般的愛心。教師對學生慈母般的愛心應來自對教育事業(yè)的無限忠誠，對教育事業(yè)的強烈事業(yè)心和高度責任感。教師的關愛能徹底化解學生的逆反心理和對抗情緒，最大限度地激發(fā)學生的學習主觀能動性。在日常教學中，教師如像母親一樣，無微不至地關心學生，幫助學生，對差生不嫌棄，不歧視，給他們多一點愛，就能極大地激發(fā)學生的積極性，使其在學習上有無窮的力量源泉。

（三）、努力學習提高自己的業(yè)務水平

教師要不斷更新充實自己的學識。博學多才對教師來說很重要。在教學過程中，學生什么問題都會提出來，而且往往“打破沙鍋問到底”。沒有廣博的知識，就不能很好地解學生之“惑”，傳為人之“道”。但知識絕不是處于靜止狀態(tài)，它在不斷地豐富和發(fā)展，每時每刻都在日新月異地發(fā)生著量和質的變化。因而，我們這些為師者讓自己的知識處于不斷更新的狀態(tài)，跟上時代發(fā)展趨勢，不斷更新教育觀念，改革教學內容和方法，顯得更為重要。否則，不去更新，不去充實，你那點知識就是一桶死水，終會走向腐化。

（四）、勤學好問，幫助他人

拜師學藝雖然結束了，但在我們的心中還不能結束。今后我們要繼續(xù)發(fā)揚拜師學藝形成的良好傳統(tǒng)，勤學好問，遇到業(yè)務上不懂的地方，仍要向師傅及有經(jīng)驗的老教師學習，同時，我們還要用我們學到的技能去幫助比我們年輕，更需要教學經(jīng)驗的新教師。

為了無愧于教師這一職業(yè)，也為了實現(xiàn)自己心中的理想信念，今后的工作中，我會更加努力，加強學習，提高素質，完善自己，書寫出燦爛美好的未來。

2014年9月22日

第四篇：推優(yōu)分子總結

zzzzzz

經(jīng)過近一段時間的自己學習和黨員的幫助，本人在思想上積極要求上進，在工作中向黨員同志看齊，對黨的認識逐漸深刻。現(xiàn)將本人對推優(yōu)總結及思想情況匯報如下：

思想方面：要提高學習馬克思主義理論的自覺性，認真學習馬克思列寧主義、鄧小平理論，要堅持理論聯(lián)系實際，學以致用，掌握做好本職工作的知識和本領。

學習方面：我認真學習每一學科的課程，按時完成課后作業(yè)，學習有規(guī)律有目標。工作方面：本人在系里擔任團總支組織部干事，學生會外聯(lián)部干事，治學自管會組織部，在班里擔任團組委等職務。認真負責的執(zhí)行各部門的工作，平時積極參加院或系里組織的各項活動，如：09年10月新生運動會擒敵拳表演，09年10月優(yōu)良學風班答辯會，2009年11月趣味運動會，2009年10月“挑戰(zhàn)杯”，2009年12月參加了初級黨課的學習并取得了結業(yè)證書，2010年2月參加無償鮮血活動，2010年4月學生手冊知識競答賽，2010年4月女生節(jié)活動等，當然在工作中我還有很多不足，因此我會更加努力完善自己保證工作保質保量的完成。

生活方面：在日常的生活中，樂于助人團結同學，待人友善，我與寢室各個男同學之間時常聯(lián)系。經(jīng)?；ハ鄠鬟_著班級及學校的信息。使得學校及老師下來的事情能更深入地滲入同學們的一言一行中，班級的各項工作也得到了進一步順利地開展。

我深知自己里黨組織還有很遠的距離，因此我會在學習生活和工作中更加努力認真，不斷學習有關黨的知識，使自己不斷向黨組織靠近，不斷完善自己成為同學的榜樣最終能夠完成自己對黨的追求。

第五篇：濱湖鎮(zhèn)郁郎小學2015年寒假學習總結

濱湖鎮(zhèn)郁郎小學2016年 寒假期間政治學習工作總結

為深入學習貫徹落實黨的十八大精神，進一步提高教職工的政治思想素質和業(yè)務素質，保障教育改革的順利進行和素質教育的全面推進，根據(jù)市教育局文件精神，我校對全體教師繼續(xù)進行寒假期間政治學習活動。我校制定了切實可行的學習計劃，工作安排清晰，學習內容豐富，一、明確目的，提高認識

讓教師們明確學習的目的，提高認識，是開展政治學習的基礎。政治學習是加強教師職業(yè)德建設，促進廣大教師進修提高和政治素養(yǎng)提高的良好時機，教師們都能認真正確地對待這次學習。

本次政治學習以 “崇德向善 愛崗敬業(yè)”師德專項教育活動，以加強師德師風建設為核心，以增強教師魅力重點，以提高教師的整體素質為目標，旨在通過學習，使教師能與時俱進，增強教書育人的責任感和事業(yè)心，用教師職業(yè)道德準則來規(guī)范自己的言行，做到依法執(zhí)教，愛崗敬業(yè)，為人師表，樂于奉獻，做一個忠誠黨的教育事業(yè)、為人民服務、讓人民滿意的教師。

二、加強領導，精心組織

為了切實有效地開展好政治學習活動，我校成立了以校長為組長，中層干部為成員的政治業(yè)務學習領導小組，以嚴肅認真的態(tài)度和高度負責的精神組織每一次的學習活動，確保學習質量。領導小組提前召開了有關學習的組織籌備會，對學習的各項工作作了統(tǒng)一的安排布置，要求講解人員預先作好充分準備，備講資料齊全，學習記錄詳實，先學習后討論，要求討論發(fā)言積極，人人過關。

三、內容充實，安排得當

我們安排的學習內容豐富，主要有：組織學習濱湖鎮(zhèn)寒假學習活動方案，和相關學習材料匯編。

四、嚴明紀律，嚴格要求

學習期間，教師嚴格遵守作息制度，并制定了教師學習考勤記錄，嚴格考勤，特殊情況請假必須向校長請假，批準后方可請假。

在學習過程中，大家積極參與，踴躍發(fā)言，精心做好記錄。每次學習后采取簡短的分組討論形式，對當天學習的內容進行內化，教師針對當天所學，結合實際，踴躍發(fā)言，各抒己見，最終達成共識。通過每次簡短的討論，使我們的教師更深刻地領會了所學內容的精髓。

開學后，我們要求每位教師根據(jù)自己在學習過程中的體會，結合自己的實際工作情況，對學習比較深刻的活動內容，撰寫了體會文章，每位教師的文章都結合自己的實際工作情況以及自己的切身體會，寫出了作為一個教師的真實想法，語言樸素、精練，反思深刻。

五、效果明顯，思想轉化

通過學習，我們教師的法制意識明顯增強，師德水平明顯提高，團結意識明顯加強，收到了良好的學習效果。

1、法制觀念明顯增強

通過對法規(guī)制度的學習，教師們更進一步地增強了遵守憲法、維護憲法的自覺性，在依法治園、依法從教、依法保護自己合法權益等方面轉變了觀念，增強了意識。教職工們紛紛表示，只有依法辦事、依規(guī)管理，我園的各項工作才能快速發(fā)展，教育不正之風才能及時糾正。

2、職業(yè)道德明顯強化

老師們進一步明白了自己育人的職責，應遵循的道德規(guī)范。通過學習和討論，使教職工們更加明確了遵守職業(yè)道德是加強行風建設的關鍵，是樹立良好校風的基礎，更是促進學校發(fā)展和進步的前提。

3、責任意識明顯好轉

在聯(lián)系本校和自己教育教學工作實際的討論中，絕大多數(shù)教師認真反思了一年來的經(jīng)驗和教訓，認識到加大教學管理、強化課改意識是推動教育事業(yè)發(fā)展的基礎性工程。在教學中必須盡快轉變教育觀念，以人為本，探索適合我校實際的、符合課改要求的，能整體提高教學水平的課堂教學模式。

總之，通過寒假政治學習，使我校22多名教師的思想政治素質、職業(yè)道德修養(yǎng)以及業(yè)務水平者得到了提高，對于我校今后的教育教學工作有著十分重要的指導意義！

濱湖鎮(zhèn)郁郎小學 2016.2.22

濱湖鎮(zhèn)郁郎小學2016年 寒假期間政治學習工作總結

2016.2.22