豆制品、火鍋、麻辣燙等食品中喹諾酮類化合物的測定

BJS

201909

范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豆腐、豆干、火鍋底料、麻辣燙底料及火鍋和麻辣燙的食材中諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于豆腐、豆干、火鍋底料、麻辣燙底料及火鍋和麻辣燙的食材中諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星的測定和確證。

原理

采用0.1

mol/L

EDTA-Mcllvaine

緩沖溶液提取樣品中的喹諾酮類化合物，經(jīng)離心和過濾后，上清液經(jīng)HLB固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測和確證，內(nèi)標(biāo)法定量。

試劑和材料

以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純，水為GB/T

6682規(guī)定的一級水。

3.1

乙腈（CH3CN）：色譜純。

3.2

甲醇（CH3OH）：色譜純。

3.3

甲酸（CHOOH）：色譜純。

3.4

甲醇（CH3OH）。

3.5

氨水（NH4OH）：濃度25%～28%。

3.6

乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2O8·2H2O）。

3.7

檸檬酸（C6H8O7·H2O）。

3.8

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）。

3.9

氫氧化鈉（NaOH）。

3.10

鹽酸（HCl）：含HCI

38%。

3.11

乙酸銨（CH3COONH4）：色譜純。

3.12

磷酸氫二鈉溶液（0.2

mol/L）：稱取71.63

g磷酸氫二鈉（3.8），用水溶解并定容至1000

mL。

3.13

檸檬酸溶液（0.1

mol/L）：稱取21.01

g檸檬酸（3.7），用水溶解并定容至1000

mL。

3.14

Mcllvaine緩沖溶液：將1000

mL

0.1

mol/L檸檬酸溶液（3.13）與625

mL

0.2

mol/L磷酸氫二鈉溶液（3.12）混合，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.0±0.1。

3.15

EDTA-Mcllvaine

緩沖溶液（0.1

mol/L）：稱取60.5g乙二胺四乙酸二鈉（3.6）至1625mL

Mcllvaine緩沖溶液（3.14）中，超聲使其溶解。

3.16

5%甲醇水溶液：取5

mL甲醇（3.4），用水稀釋至100

mL。

3.17

25%氨水甲醇溶液：取25

mL氨水（3.5），用甲醇（3.4）稀釋至100

mL。

3.18

標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量見附錄A表A.1，純度≥99%。

3.19

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品（3.18）約10

mg，置10

mL容量瓶中，加入0.2

mL甲酸（3.3），超聲使溶解，用乙腈（3.1）定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0

mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，轉(zhuǎn)移至溶劑瓶中于-18℃以下避光保存，有效期6個(gè)月。

3.20

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液（3.19）1

mL于100

mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為0.01

mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（環(huán)丙沙星、沙拉沙星濃度約0.015mg/mL），于4℃以下避光保存，有效期3個(gè)月。

3.21

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.20）1

mL至10

mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為1.0

μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（環(huán)丙沙星、沙拉沙星濃度約1.5

μg/mL），于4℃以下避光保存，臨用新配。

3.22

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：分別稱取氘代同位素標(biāo)準(zhǔn)品（3.18）約10

mg，至10

mL容量瓶中，加入0.2

mL甲酸（3.3），超聲溶解，用乙腈（3.1）稀釋至刻度，配制成濃度為1.0

mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃以下避光保存，有效期6個(gè)月。

3.23

混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：準(zhǔn)確吸取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液（3.22）0.01mL于10

mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為1.0

μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于4℃以下避光保存，臨用新配。

3.24

固相萃取小柱（500

mg，6

mL）：HLB柱或相當(dāng)者。使用前依次以6

mL甲醇、6mL水活化，保持柱體濕潤。

儀器和設(shè)備

4.1

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。

4.2

分析天平：感量0.001g和0.00001

g。

4.3

渦旋振蕩器

4.4超聲儀

4.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥8000

r/min

4.6

均質(zhì)器

4.7

氮?dú)鉂饪s儀

測定步驟

5.1

試樣制備與保存

豆制品、火鍋和麻辣燙的食材

從待檢樣品中取出樣品約500g，用組織搗碎機(jī)充分搗碎混勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于-18℃冷凍存放。

火鍋底料、麻辣燙底料

固體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，用組織搗碎機(jī)充分搗碎混勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于4℃冷藏存放。

半固體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，放入研缽中，迅速研磨均勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記于4℃冷藏存放。

液體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，攪拌均勻后裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于4℃冷藏存放。

5.2

樣品溶液制備

提取：稱取5.0

g均勻樣品（精確至0.001g），置50

mL離心管中，精密加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（3.23）0.1mL，加入20

mL

0.1

mol/L

EDTA-Mcllvaine

緩沖溶液（3.15），渦旋混勻1min，超聲提取15

min，8000

r/min離心5

min，上清液轉(zhuǎn)移至50

mL容量瓶中，殘?jiān)肊DTA-Mcllvaine

緩沖溶液（3.15）同法重復(fù)提取兩次，每次10

mL，合并上清液至同一容量瓶中，用EDTA-Mcllvaine

緩沖溶液（3.15）定容至刻度，混勻。用濾紙過濾（必要時(shí)10000

r/min離心5

min后過濾），續(xù)濾液待凈化。

凈化：精密吸取上述待凈化液25.0

mL，以約1

mL/min的流速全部通過固相小柱（3.24），用3

mL

5%甲醇水溶液（3.16）淋洗，抽干，先后以6

mL甲醇、3

mL氨水甲醇（3.17）洗脫，合并甲醇及氨水甲醇洗脫液，45

℃氮吹至近干，準(zhǔn)確加入2.0

mL流動相初始比例復(fù)溶液溶解殘?jiān)^0.22

μm濾膜，續(xù)濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

5.3

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

稱取5.0

g空白試樣（精確至0.001g），置50

mL離心管中，除不加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液外，其余同5.2操作處理后得到空白基質(zhì)，共制備6份。

分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（3.21）0

mL、0.010

mL、0.020

mL、0.050

mL、0.100

mL、0.200

mL及混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（3.23）0.025

mL于試管中，氮吹至近干，精密加入1.0

mL空白基質(zhì)復(fù)溶，過0.22

μm濾膜，制成濃度為0

ng/mL、10

ng/mL、20

ng/mL、50

ng/mL、100

ng/mL、200

ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（環(huán)丙沙星、沙拉沙星濃度為0

ng/mL、15

ng/mL、30

ng/mL、75

ng/mL、150

ng/mL、300

ng/mL，同位素內(nèi)標(biāo)濃度約25ng/mL）。

5.4

測定

5.4.1

液相色譜參考條件

1）

色譜柱：C18色譜柱，2.1

mm×50

mm×1.7

μm，或性能相當(dāng)者。

2）

柱溫：40℃。

3）

流速：0.25

mL/min。

4）

進(jìn)樣量：2

μL。

5）

流動相：A-5

mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），B-乙腈。梯度洗脫條件見表1。

表1

梯度洗脫條件

時(shí)間（min）

A(%)

B(%)

0

10.5

13.1

5.4.2

質(zhì)譜參考條件

1）

電離方式：電噴霧電離（ESI）；

2）

掃描方式：正離子掃描；

3）

檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；

4）

離子源參數(shù)參考條件：

離子源接口電壓，4000

V；離子源接口溫度，350

℃；脫溶劑溫度，250

℃；離子源加熱溫度，400

℃；霧化氣流速，2.9

L/min；干燥氣流速，10.0

L/min；加熱氣流速，10.0

L/min。

5）定性離子對、定量離子對參見表2。

表2

喹諾酮類藥物主要質(zhì)譜參數(shù)

序號

組分

母離子

子離子

Q1

預(yù)四極桿電壓

碰撞電壓

Q3

預(yù)四極桿電壓

（m/z）

（m/z）

（V）

(V)

（eV）

諾氟沙星

320.2

*302.0

231.1

氧氟沙星

362.2

*318.2

261.1

洛美沙星

352.0

*265.0

308.0

培氟沙星

334.0

290.1

*316.2

氟羅沙星

370.0

*326.0

269.0

沙拉沙星

386.2

342.0

299.1

*368.1

雙氟沙星

400.0

*356.0

299.0

司帕沙星

393.0

*349.0

292.0

環(huán)丙沙星

332.1

*314.1

287.8

231.0

達(dá)氟沙星

358.0

*340.1

283.2

82.1

恩諾沙星

360.0

*342.1

316.0

245.2

D8-環(huán)丙沙星

340.3

322.1

D5-恩諾沙星

365.1

321.1

D5-諾氟沙星

325.3

307.2

注：1.“*”表示定量離子；2.所列質(zhì)譜參考條件是在島津（LC/MS-8050）質(zhì)譜儀上完成的，此處所列試驗(yàn)用儀器型號僅供參考，不涉及商業(yè)目的，鼓勵(lì)方法使用者嘗試不同廠家或型號的儀器；3.對不同質(zhì)譜儀，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳；4.由于喹諾酮類化合物離子化受基質(zhì)干擾較為

顯著，方法使用者可根據(jù)實(shí)際情況選擇表中所列離子對進(jìn)行定性定量測定。

5.4.3

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（5.3）按濃度由低到高依次進(jìn)樣檢測，內(nèi)標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5.5

定性

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，試樣中待測物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對應(yīng)的保留時(shí)間偏差應(yīng)在±2.5%之內(nèi)；且試樣譜圖中各組分定性離子的相對豐度與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液定性離子的相對豐度，其允許偏差不超過表3規(guī)定的范圍時(shí)，則可確定為樣品中存在此種待測物?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）典型圖譜見附錄B。

表3

定性確證時(shí)相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度，%

＞50%

＞20%～50%

＞10%～20%

≤10%

允許的相對偏差，%

±20%

±25%

±30%

±50%

5.6

定量

待測樣液中喹諾酮藥物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、氟羅沙星以氘代諾氟沙星為內(nèi)標(biāo)，洛美沙星、雙氟沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星以氘代環(huán)丙沙星為內(nèi)標(biāo)，司帕沙星、沙拉沙星、恩諾沙星以氘代恩諾沙星為內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)法定量。本方法中所列內(nèi)標(biāo)能基本滿足方法要求，如條件允許，可采用各化合物的對應(yīng)同位素化合物作為內(nèi)標(biāo)。

結(jié)果計(jì)算

試樣測定結(jié)果按公式（1）計(jì)算目標(biāo)物的含量：

………….(1)

式中：

X——試樣中被測組分的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；

m——試樣的稱樣量，單位為克（g）；

C——由工作曲線計(jì)算得到的試樣中被測組分的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；

V——定容體積，單位為毫升（mL）。

F——稀釋倍數(shù)

計(jì)算結(jié)果需扣除空白值（空白基質(zhì)），并保留三位有效數(shù)字。

檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

7.1

靈敏度

諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、雙氟沙星、司帕沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星檢出限均為5

μg/kg，環(huán)丙沙星檢出限為7.5

μg/kg，沙拉沙星檢出限為7.5

μg/kg。

諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、雙氟沙星、司帕沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星定量限均為15

μg/kg，環(huán)丙沙星定量限為22.5

μg/kg，沙拉沙星定量限為22.5

μg/kg。

7.2

準(zhǔn)確度

本方法在15.0～100.0

μg/kg的添加水平上的回收率范圍為65.0%～120.0%。

7.3

精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。

附錄A

標(biāo)準(zhǔn)品信息

表A.1

標(biāo)準(zhǔn)品中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量

序號

化合物名稱

英文名

CAS登錄號

分子式

相對分子質(zhì)量

諾氟沙星

Norfloxacin

70458-96-7

C16H18FN3O3

319.33

氧氟沙星

Ofloxacin

82419-36-1

C18H20FN3O4

361.37

洛美沙星

Lomefloxacin

98079-51-7

C17H19F2N3O3

351.35

培氟沙星

Pefloxacin

70458-92-3

C17H20FN3O3

333.36

氟羅沙星

Fleroxacin

79660-72-3

C17H18F3N3O3

369.34

鹽酸沙拉沙星

Sarafloxacin

Hydrochloride

91296-87-6

C20H18ClF2N3O3

421.81

鹽酸雙氟沙星

Difloxacin

Hydrochloride

91296-86-5

C21H20ClF2N3O3

435.85

司帕沙星

Sparfloxacin

110871-86-8

C19H22F2N4O3

392.40

環(huán)丙沙星

Ciprofloxacin

85721-33-1

C17H18FN3O3

331.34

甲磺酸達(dá)氟沙星

Danofloxacin

mesylate

119478-55-6

C20H24

FN3O6S

453.48

恩諾沙星

Enrofloxacin

93106-60-6

C19H22FN3O3

359.39

D8-環(huán)丙沙星

Ciprofloxacin-d8

/

C17H10D8FN3O3

339.39

D5-恩諾沙星

Enrofloxacin-d5

/

C19H17D5FN3O3

364.37

D5-諾氟沙星

Norfloxacin-d5

/

C16H13D5FN3O3

324.37

注：市售標(biāo)準(zhǔn)品中部分為其鹽酸鹽或甲磺酸鹽。

附錄B

14種喹諾酮類化合物多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）譜圖

14種喹諾酮類化合物火鍋底料基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(100

ng/mL，氘代內(nèi)標(biāo)為25

ng/mL)多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）譜圖

本方法負(fù)責(zé)起草單位：四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院

方法的參與驗(yàn)證單位：上海市食品藥品檢驗(yàn)所、遼寧省食品藥品檢驗(yàn)檢測院、深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院。

主要起草人：余曉琴，李道霞，黃麗娟，成長玉，李澍才，唐昌云