附件6

動(dòng)物源性食品中喹諾酮類物質(zhì)的快速檢測

膠體金免疫層析法

(KJ201906)

范圍

本方法規(guī)定了動(dòng)物源性食品中喹諾酮類物質(zhì)的膠體金免疫層析快速檢測方法。

本方法適用于生乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳、豬肉、豬肝、豬腎中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、噁喹酸殘留的快速測定。

原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的喹諾酮類物質(zhì)與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制了抗體和檢測線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化，通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中喹諾酮類物質(zhì)進(jìn)行定性判定。

試劑和材料

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T

6682規(guī)定的二級水。

3.1

試劑

3.1.1

乙腈。

3.1.2

甲酸。

3.1.3

分散固相萃取劑I：分別稱取硫酸鎂18

g、醋酸鈉4.5

g放于研缽中研碎。

3.1.4

分散固相萃取劑II：分別稱取硫酸鎂27

g、N-丙基乙二胺（PSA）4.5

g放于研缽中研碎。

3.1.5

甲酸-乙腈溶液：98

mL乙腈中加入2

mL甲酸，混勻。

3.1.6

甲醇。

3.1.7

稀釋液：脫脂奶粉︰水（1︰10）。

3.2

參考物質(zhì)

喹諾酮類參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1，純度≥99%。

表1

喹諾酮類參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量

序號

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號

分子式

相對分子量

洛美沙星

Lomefloxacin

98079-51-7

C17H19F2N3O3

351.35

培氟沙星

Pefloxacin

70458-92-3

C17H20FN3O3

333.36

氧氟沙星

Ofloxacin

82419-36-1

C18H20FN3O4

361.37

諾氟沙星

Norfloxacin

70458-96-7

C16H18FN3O3

319.33

達(dá)氟沙星

Danofloxacin

112398-08-0

C19H20FN3O3

357.38

二氟沙星

Difloxacin

5522-39-4

C28H33N3F2

449.58

恩諾沙星

Enrofloxacin

93106-60-6

C19H22FN3O3

359.16

環(huán)丙沙星

Ciprofloxacin

85721-33-1

C17H18FN3O3

331.13

氟甲喹

Flumequine

42835-25-6

C14H12FNO3

261.25

噁喹酸

Oxolinic

Acid

14698-29-4

C13H11NO5

261.23

注：或等同可溯源物質(zhì)。

3.3

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

3.3.1喹諾酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1

mg/mL）：分別精密稱取喹諾酮類參考物質(zhì)（3.2）適量，置于50

mL燒杯中，加入適量甲醇（3.1.6）超聲溶解后，用甲醇轉(zhuǎn)入10

mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1

mg/mL的喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-20℃避光保存，有效期6個(gè)月。

3.3.2喹諾酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中間液（1

μg/mL）：分別吸取喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1

mg/mL）（3.3.1）100

μL于100

mL容量瓶中，用甲醇（3.1.6）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1

μg/mL的喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)中間液。

3.4

材料

3.4.1

金標(biāo)微孔（含膠體金標(biāo)記的特異性抗體）。

3.4.2

試劑條或檢測卡。

儀器和設(shè)備

4.1

移液器：100

μL、200

μL和1

mL。

4.2

渦旋混合器。

4.3

離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4000

r/min。

4.4

電子天平：感量為0.01

g。

4.5

孵育器：可調(diào)節(jié)時(shí)間、溫度，控溫精度±1℃。

4.6

讀數(shù)儀。

4.7

氮吹儀。

4.8

環(huán)境條件：溫度15℃～35℃，濕度≤80%（采用孵育器與讀數(shù)儀時(shí)可不要求環(huán)境溫度）。

分析步驟

5.1

試樣制備

液體乳直接用于測定，豬肉、豬肝、豬腎用組織搗碎機(jī)等攪碎后備用。

5.2

試樣的提取

5.2.1

生乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳

分別吸取同等體積的液體乳樣品與稀釋液混合后為待測液。

5.2.2

豬肉、豬肝、豬腎

準(zhǔn)確稱取2.5±0.01

g均質(zhì)后的組織樣品于15

mL離心管中，加入5

mL甲酸-乙腈溶液（3.1.5），渦旋混合1

min，振蕩5

min，4000

r/min離心5

min。將上清液2

mL轉(zhuǎn)入10

mL

離心管中，分別加入0.6

g分散固相萃取劑I(3.1.3)漩渦混合1

min、再加入0.6

g分散固相萃取劑II(3.1.4)后漩渦混合1

min，靜置分層后取1

mL于10

mL

離心管中，于氮吹儀60℃吹干后用1

mL樣品稀釋液溶解作為待測液。

5.3

測定步驟

5.3.1

檢測卡測定步驟

5.3.1.1將檢測卡平放入孵育器中。小心撕開檢測卡的薄膜至指示線處，避免提起檢測卡和海綿。

5.3.1.2用移液器取待測液（5.2）300

μL，避免產(chǎn)生泡沫和氣泡。豎直緩慢的滴加至檢測卡兩側(cè)任意一側(cè)的凹槽中，將粘箔重新粘好。

5.3.1.3蓋上孵育器的蓋子，孵育器上的計(jì)時(shí)器自動(dòng)開始計(jì)時(shí)，紅燈閃爍，孵育3

min。

5.3.1.4

取出檢測卡，不要擠壓樣品槽，放于讀數(shù)儀中，讀數(shù)前保持樣品槽一端朝下直到在讀數(shù)儀上讀取結(jié)果，或從孵育器上取出后直接目視法進(jìn)行結(jié)果判定。

5.3.2試劑條與金標(biāo)微孔測定步驟

吸取300

μL待測液（5.2）于金標(biāo)微孔（3.4.1）中，抽吸5～10次使混合均勻，將試劑條（3.4.2）吸水海綿端垂直向下插入金標(biāo)微孔中，孵育5～8

min，從微孔中取出試劑條，進(jìn)行結(jié)果判定。

注：試劑條（或檢測卡）具體檢測步驟可參考相應(yīng)的說明書操作。

5.4

質(zhì)控試驗(yàn)

每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。

5.4.1

空白試驗(yàn)

稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

5.4.2

加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取空白試樣（精確至0.01

g）置于具塞離心管中，加入一定體積的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)中間液，使諾氟沙星終濃度為6

μg/kg，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

結(jié)果判定

6.1

讀數(shù)儀測定法

按讀數(shù)儀說明書要求操作直接讀取并進(jìn)行結(jié)果判定，6.2

目視法

通過對比控制線（C線）和檢測線（T線）的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。目視判定示意圖見圖1。

6.2.1

無效

控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試劑條/檢測卡無效。

6.2.2

陰性

檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或者檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當(dāng)，表明樣品中喹諾酮類低于方法檢測限，判定為陰性。

6.2.3

陽性

檢測線（T線）不顯色或檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺，表明樣品中喹諾酮類的含量高于方法檢測限，判定為陽性。

6.3

質(zhì)控試驗(yàn)要求

空白試驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陽性。

圖1

目視判定示意圖

結(jié)論

當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時(shí)，應(yīng)對結(jié)果進(jìn)行確證。

性能指標(biāo)

8.1

檢測限

生乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳、豬肉、豬肝、豬腎中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、噁喹酸為3

μg/kg。

8.2

靈敏度

靈敏度應(yīng)≥99%。

8.3

特異性

特異性應(yīng)≥95%。

8.4

假陰性率

假陰性率應(yīng)≤1%。

8.5

假陽性率

假陽性率應(yīng)≤5%。

注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見附錄A。

其他

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進(jìn)行考察，應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。

本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為GB/T

21312-2007

《動(dòng)物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》。附錄A

定性方法性能指標(biāo)計(jì)算方法

表A.1

性能指標(biāo)計(jì)算表

樣品情況a

檢測結(jié)果b

總數(shù)

陽性

陰性

陽性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數(shù)

N.1=N11+N12

N.2=N21+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異（х2）

c2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

靈敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特異性（p-，%）

p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-靈敏度

假陽性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特異性

相對準(zhǔn)確度，%c

（N11+N22）/（N1.+N2.）

注：

a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果；

b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。

N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C為方法的檢測結(jié)果相對準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價(jià)。

本方法負(fù)責(zé)起草單位：黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院。

驗(yàn)證單位：國家農(nóng)林副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、海南省藥品檢驗(yàn)所。

主要起草人：佟曉芳，楊光，趙平，陳薇薇，李春娟，姜金斗，王玉芝，陳堅(jiān)。