附件2

食品中辛基酚等5種酚類物質(zhì)的測(cè)定

BJS

201913

范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚、雙酚A的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰兒配方食品、畜肉、禽蛋、水產(chǎn)品、罐頭食品、植物油中辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚、雙酚A的測(cè)定。

2原理

試樣中加入同位素內(nèi)標(biāo)后，經(jīng)乙腈提取，離心，取上清液經(jīng)固相萃取柱凈化，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。

3試劑和材料

除另行規(guī)定外，本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為GB/T

6682規(guī)定的一級(jí)水。

3.1

試劑

3.1.1

甲醇（CH3OH）：質(zhì)譜級(jí)。

3.1.2

乙腈（CH3CN）：質(zhì)譜級(jí)。

3.1.3

氨水（NH4OH）：色譜級(jí)。

3.2

試劑配制

0.05%

氨水溶液（V/V）：取氨水（3.1.3）0.5mL用水稀釋至1000

mL。

3.3

標(biāo)準(zhǔn)品

辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚、雙酚A標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和辛基酚-13C6、正辛基酚-D17、壬基酚-13C6、正壬基酚-D4、雙酚A

-D4同位素內(nèi)標(biāo)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見附錄A表A.1，純度≥98%。

3.4

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

3.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100

mg/L）：分別稱取辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚和雙酚A標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（3.3）10

mg（精確至0.000

g），用甲醇（3.1.1）溶解，并轉(zhuǎn)移至100

mL容量瓶中，定容至刻度，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為100

mg/L。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，貯存于-20

℃冰箱中，有效期12個(gè)月。

3.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1

mg/L）：分別準(zhǔn)確吸取辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚和雙酚A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100

mg/L)(3.4.1)

mL至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制成1

mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，置于4

℃冰箱中保存，有效期3個(gè)月。

3.4.3同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100

mg/L）：分別稱取辛基酚-13C6、正辛基酚-D17、壬基酚-13C6、正壬基酚-D4、雙酚A

-D4同位素內(nèi)標(biāo)（3.3）10

mg（精確至0.000

g），用甲醇（3.1.1）溶解，并轉(zhuǎn)移至100

mL容量瓶中，定容至刻度，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為100

mg/L。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，貯存于-20

℃冰箱中，有效期12個(gè)月。

3.4.4同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1

mg/L）：分別準(zhǔn)確吸取辛基酚-13C6、正辛基酚-D17、壬基酚-13C6、正壬基酚-D4、雙酚A

-D4同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100

mg/L)(3.4.3)各1

mL至100

mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制成1

mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，置于4

℃冰箱中保存，有效期3個(gè)月。

3.4.5

同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100

μg/L）：分別準(zhǔn)確吸取同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1

mg/L)(3.4.4)各1

mL至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制成100

μg

/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。臨用時(shí)配制。

3.4.6混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液

(1

mg/L)(3.4.2)適量，加入同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1

mg/L）(3.4.4)，使辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚和雙酚A濃度分別為0.5

μg/L、1

μg/L、5

μg/L、10

μg/L、20

μg/L和50

μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。臨用時(shí)配制。

3.5

材料

固相萃取小柱（官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱）：200

mg，6

mL。

儀器和設(shè)備

4.1高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧（ESI）離子源。

4.2天平：感量分別為0.001g和0.000

g。

4.3渦旋混合器。

4.4

離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥8000

r/min。

4.5

超聲波清洗器。

分析步驟

5.1

試樣制備

5.1.1

乳粉、米粉：試樣混合均勻，密封并標(biāo)明標(biāo)記，于-20℃冰箱冷藏保存。

5.1.2

禽蛋：取代表性試樣約200

g，去殼后用組織勻漿機(jī)攪拌均勻，裝入潔凈容器中，密封并標(biāo)明標(biāo)記，于-20

℃冰箱中冷藏保存。

5.1.3水產(chǎn)品、畜肉：取代表性試樣約200

g，用勻漿機(jī)勻漿均勻，裝入潔凈容器中，密封并標(biāo)明標(biāo)記，于-20

℃冰箱中冷藏保存。

5.1.4

植物油：試樣混合均勻，裝入潔凈容器中，密封并標(biāo)明標(biāo)記，于-20

℃冰箱中冷藏保存。

5.1.5

罐頭食品：取罐頭中固形物試樣約50

g,用勻漿機(jī)勻漿均勻，裝入潔凈容器中，密封并標(biāo)明標(biāo)記，于-20

℃冰箱中冷藏保存。

冷藏保存后的樣品解凍后需再次經(jīng)勻漿機(jī)均質(zhì)后使用。

5.2

提取

準(zhǔn)確稱取1

g（精確至0.001

g）樣品于15

mL具塞玻璃試管中，加入0.1mL同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100

μg/L）(3.4.5)

和5

mL乙腈（3.1.2），渦旋混勻，超聲提取15

min，8000

r/min離心5

min，取上層乙腈相；殘留部分再用5

mL

乙腈重復(fù)提取一次，合并乙腈相，置冰箱-20℃冷凍2h，取出于8000

r/min離心5

min，取上清液待凈化。

5.3

凈化

取固相萃取柱（3.5），使用前用18

mL甲醇活化，6mL水平衡。將5.2項(xiàng)所得上清液加30

mL水稀釋,充分搖勻后以1

mL/min~2

mL/min的速度上樣，棄去濾液，用12

mL60

%甲醇水溶液（V/V）淋洗，棄去淋洗液，再用6

mL乙腈洗脫，洗脫液于50℃用氮?dú)獯抵两伞Ｓ?

mL甲醇溶解殘?jiān)?，待測(cè)。

5.4

空白試驗(yàn)

除不加樣品外，采用相同的分析步驟進(jìn)行操作。

5.5儀器參考條件

5.5.1色譜條件

a)

分析柱：

C18

柱（3

μm，50

mm

×

mm），或性能相當(dāng)者；捕集柱：

C18

柱（5

μm，50

mm

×

4.6

mm），或性能相當(dāng)者；捕集柱位于進(jìn)樣閥之前。

b）流動(dòng)相：A為0.05%氨水溶液（3.2），B為甲醇（3.1.1），洗脫梯度見表1。

c）流速：400

μL/min。

d)

柱溫：30℃。

e)

進(jìn)樣量：10

μL。

表1

梯度洗脫程序表

時(shí)間（min）

A(%)

B(%)

0

14.5

14.51

5.5.2

質(zhì)譜條件

a)

離子源：電噴霧離子源（ESI源）。

b)

檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）。

c)

碰撞氣為高純氮?dú)?，干燥氣、霧化氣、鞘氣等均為氮?dú)饣蚱渌线m氣體，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)相應(yīng)參數(shù)使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求，毛細(xì)管電壓、干燥氣溫度、鞘氣溫度、鞘氣流量、噴嘴電壓、碰撞能量、碎裂電壓等參數(shù)應(yīng)優(yōu)化至最佳靈敏度，監(jiān)測(cè)離子對(duì)和定量離子對(duì)等信息詳見附錄B。

5.6

定性測(cè)定

按照超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜條件測(cè)定試樣和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，記錄試樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物的色譜保留時(shí)間，當(dāng)試樣中檢出與某標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰保留時(shí)間一致的色譜峰（變化范圍在±2.5%之內(nèi)），并且試樣色譜圖中所選擇的監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)豐度比與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對(duì)豐度比（k）的偏差不超過表2規(guī)定的范圍，可以確定試樣中檢出相應(yīng)化合物。

表2

定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

相對(duì)離子豐度（%）

k＞50%

50%≥k＞20%

20%≥k＞10%

k≤10%

允許的最大偏差（%）

±

±

±

±

5.7定量測(cè)定

5.7.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（3.4.6）分別按儀器參考條件（5.5）進(jìn)行測(cè)定，得到目標(biāo)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中目標(biāo)化合物的濃度。

對(duì)照品色譜圖參見附錄C。

5.7.2試樣溶液的測(cè)定

將試樣溶液（5.3）按儀器參考條件（5.5）進(jìn)行測(cè)定，得到相應(yīng)的樣品溶液的色譜峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中組分的濃度，平行測(cè)定次數(shù)不少于兩次；樣品中各待測(cè)組分的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性響應(yīng)范圍內(nèi)，若超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，應(yīng)用甲醇（3.1.1）稀釋后進(jìn)行分析。

結(jié)果計(jì)算

結(jié)果按式（1）計(jì)算：

…………………………………………（1）

式中：

X—試樣中某種組分的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；

c—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣液中某種組分的濃度，單位為納克每毫升（μg/L）；

co——由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的過程空白樣品中某種組分的濃度，單位為微克每升（μg/L）

V—試樣溶液定容體積，單位為毫升（mL）；

m—試樣稱取的質(zhì)量，單位為克（g）；

f—稀釋因子。

計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的20%。

8檢出限和定量限

當(dāng)稱樣量為1

g，定容體積為1

mL時(shí)，本方法中辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚和雙酚A的檢出限均為1.0μg/kg，定量限均為2.0μg/kg。

9其他

9.1實(shí)驗(yàn)中所用的器具均為玻璃材質(zhì)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的管線均為不銹鋼或聚四氟乙烯材質(zhì)。

9.2

嚴(yán)格控制試劑空白，空白值應(yīng)不得對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生明顯影響，否則扣除空白時(shí)會(huì)引起較大的誤差。

附錄A

辛基酚等5種酚類物質(zhì)相關(guān)信息

表A.1

辛基酚等5種酚類物質(zhì)英文名稱、中文名稱、分子式、CAS號(hào)、相對(duì)分子質(zhì)量

序號(hào)

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號(hào)

分子式

相對(duì)分子量

辛基酚

4-tert-Octyl

phenol

140-66-9

C14H22O

206.33

正辛基酚

4-n-Octyl

phenol

1806-26-4

C14H22O

206.33

壬基酚

Nonylphenol

25154-52-3

C15H24O

220.35

正壬基酚

4-n-Nonylphenol

104-40-5

C15H24O

220.35

雙酚A

Bisphenol

A

80-05-7

C15H16O2

228.29

辛基酚-13C6

4-tert-Octylphenol-13C6

1173020-24-0

C14H22O

212.28

正辛基酚-D17

4-n-Octyl

phenol-D17

1219794-55-4

CD3(CD2)7C6H4OH

223.43

壬基酚-13C6

3,6,3-Nonylphenol-13C6

1173020-38-6

C15H24O

226.40

正壬基酚-D4

4-n-Nonylphenol

-2,3,5,6-D4,OD

358730-95-7

C15H19D5O

225.38

雙酚A-D4

Bisphenol

A

-3,3’,5,5’-D4

347841-41-2

C15H12

D4O2

232.31

附錄B

超高效液相-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜參考條件

質(zhì)譜參考條件

a）電離方式：電噴霧負(fù)離子模式；

b）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；

c）離子源溫度(TEM):650℃;

d）霧化氣(Gas1):

55;

e）輔助氣(Gas2):

65；

f）氣簾氣(Gurtain

Gas):

20;

g）電噴霧電壓：-4500V；

h）干燥氣流速：11

L/min；

i）定性離子、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量見表B.1。

表B.1

化合物定性、定量離子和質(zhì)譜分析參數(shù)

化合物

Q1

Q3

DP/V

CE/V

辛基酚

205

133*

-80

205

117

-80

-80

正辛基酚

205

106*

-80

205

119

-80

-54

4-壬基酚

219

133*

-80

219

147

-80

4-正壬基酚

219

106*

-80

219

119

-80

雙酚A

227

212*

-80

227

133

-80

辛基酚-13C6

211

139*

-73

正辛基酚-D17

222

108*

-80

壬基酚-13C6

225.1

138.9*

-90

正壬基酚-D4

223

110*

-80

雙酚A-D4

231

216*

-80

*

定量離子。

附錄C

超高效液相-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

雙酚A

雙酚A-D4

B.2

B.1

壬基酚-13C6

4-壬基酚

B.4

B.3

4-正壬基酚

壬基酚-D4

B.6

B.5

對(duì)辛基酚-13C6

4-辛基酚

B.8

B.7

4-正辛基酚

辛基酚-D17

B.10

B.9

0.01

μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物MRM色譜圖

圖C.1

雙酚A；圖C.2

雙酚A-D4；圖C.壬基酚；圖C.4壬基酚-13C6；圖C.5正壬基酚；圖C.6

正壬基酚-D4；圖C.7辛基酚；圖C.8

辛基酚-13C6；圖C.9正辛基酚；圖C.10

正辛基酚-D17

本方法負(fù)責(zé)起草單位：中國食品藥品檢定研究院。

方法驗(yàn)證單位：北京市疾病預(yù)防控制中心、國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心、陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、中國肉類食品綜合研究中心、遼寧省食品檢驗(yàn)檢測(cè)院、湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院。

方法主要起草人：寧霄、金紹明、邵兵、黃傳峰、曹進(jìn)、丁宏、張爍。