第一篇：實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌DNA的提取（寫寫幫推薦）

大腸桿菌總DNA的提取

實(shí)驗(yàn)原理：本實(shí)驗(yàn)利用溶菌酶和堿裂解液SDS使細(xì)胞壁破壞，利用氯仿抽提的方法去除蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液利用乙醇將DNA沉淀下來。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.掌握DNA提取的原理和方法；

2.掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法 實(shí)驗(yàn)材料：

1.實(shí)驗(yàn)菌株：大腸桿菌

2.試劑：TE溶液：Tris?HCl 10 mM，EDTA 1 mM，pH 8.0，20% SDS：

溶菌酶（50mg/ml）

5M NaCl

氯仿：異戊醇（24：1 v/v）

無水乙醇

0.8%瓊脂糖

TAE電泳緩沖液 儀器：離心機(jī)，電泳儀 實(shí)驗(yàn)步驟：

1)取1.5ml培養(yǎng)好的大腸桿菌培養(yǎng)液與離心管中，7,000 rpm離心5 min，棄上清； 2)加入500ul TE溶液洗滌菌體7,000 rpm離心5 min，棄上清；

3)用360ul TE溶液懸浮菌體，加入20ul 溶菌酶（50mg/ml），37°C保溫30min； 4)加入40ul 20 %SDS使其終濃度為2 %，60°C水浴30min。5)加入110ul 5 M 高氯酸鈉 使其終濃度為1 M，充分混勻；

6)加入等體積氯仿：異戊醇（24：1 v/v），充分混勻，4°C 12,000 rpm 離心15min，吸取上清于一新離心管中；

7)加入2倍體積的無水乙醇，混勻后12000rpm 離心10min； 8)棄上清，離心管在空氣中自然晾干； 9)加入30-40ul TE溶解DNA；

10)取3-5ul DNA溶液，瓊脂糖電泳檢測。

第二篇：實(shí)驗(yàn)四 植物DNA的提取[定稿]

實(shí)驗(yàn)四

植物DNA的提取

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握CTAB法從植物葉片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法從植物葉片中提取基因組DNA，并進(jìn)行純度分析。

二、實(shí)驗(yàn)原理

1、核酸提取的基本原理

核酸是生物有機(jī)體中的重要成分，在生物體中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩大類，在真核細(xì)胞中，前者主要存在于細(xì)胞核中，后者主要存在于細(xì)胞質(zhì)及核仁里。在制備核酸時(shí)，通過研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。

在濃氯化鈉溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很??；而在稀氯化鈉溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來。分離得到核蛋白后，需進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去，常采用的去除蛋白的方法有3種：①用含異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相和氯仿相中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積的無水乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來。如果用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀，得到的是游離的DNA。②用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性，與核酸分離，從而從材料中直接提取出DNA。③用苯酚處理，然后離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白變性后則停留在酚層內(nèi)。吸出上面水層，加兩倍體積的無水乙醇溶液，得到白色纖維狀DNA沉淀。反復(fù)使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液，就能將蛋白等雜質(zhì)較徹底地除去，得到較純的DNA制品。為了徹底除去DNA制品中混雜的RNA，可用RNA酶處理。生物材料中含有的脂肪物質(zhì)和大部分的多糖，在用鹽溶液分離核蛋白和用乙醇或異丙醇分級(jí)沉淀時(shí)即被除去。

在DNA提取、制備的過程中，核酸極不穩(wěn)定，許多因素可破壞其完整結(jié)構(gòu)：①化學(xué)因素，核酸的結(jié)構(gòu)在pH值4.0～11.0間較穩(wěn)定，pH值在此范圍外就會(huì)使核酸變性降解，故制備過程應(yīng)避免過酸過堿。②物理因素，DNA分子鏈很長，是雙螺旋結(jié)構(gòu)，既有一定的柔性，又有一定的剛性，故強(qiáng)機(jī)械作用如劇烈攪拌會(huì)令DNA分子斷裂，不利于收集，應(yīng)加以避免。③酶的作用，細(xì)胞中普遍存在的核酸酶在細(xì)胞壁或膜遭到破壞時(shí)被釋放出來，它會(huì)降解DNA分子。故須用酶的變性劑、抑制劑使之失活。操作過程最好在低溫(0℃左右)下進(jìn)行。常用的酶抑制劑有檸檬酸鹽、氟化物、砷酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作為蛋白變性劑，同時(shí)可使核酸酶被破壞而失活。

2、CTAB法和SDS法的提取原理

（1）CTAB法是一種快速簡便的提取植物總DNA的方法.。CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽離子型去污劑，它不僅能使蛋白質(zhì)變性，而且還能與核酸形成特異的核酸-CTAB復(fù)合物，這種復(fù)合物溶于高鹽緩沖液（≥0.7M NaCl），降低鹽濃度，通過超速離心能選擇性地沉淀核酸，并與多糖等可溶性雜質(zhì)分開，CTAB-核酸復(fù)合物再用70-75%乙醇浸泡可脫掉CTAB。提取時(shí)先將新鮮的葉片在液氮中研磨，破碎其細(xì)胞，然后加入CTAB分離緩沖液，將DNA溶解出來，再經(jīng)氯仿－異戊醇抽提除去蛋白質(zhì)，最后通過異丙醇沉淀或低鹽離心得到DNA。

（2）SDS法也是提取植物DNA的常用方法。先將新鮮的葉片在液氮中研磨以機(jī)械力破本碎細(xì)胞壁，然后加入SDS使細(xì)胞膜破裂，并同時(shí)將蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)與核酸分開。加入KAc可使SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式，使沉淀更加完全。

3、DNA的濃度測定和純度分析

（1）定磷法：是對(duì)樣品中核酸（DNA和RNA）含量的準(zhǔn)確定量。將樣品中的核酸用強(qiáng)酸（硫酸或高氯酸）消化成無機(jī)磷，然后用定磷試劑對(duì)生成的無機(jī)磷酸進(jìn)行滴定。定磷試劑是酸性鉬酸銨溶液，鉬酸銨能與無機(jī)磷酸定量結(jié)合成磷鉬酸絡(luò)合物，該絡(luò)合物能被抗壞血酸等還原劑還原成蘭色的鉬藍(lán)，在660nm處有最大光吸收。

（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或單鏈DNA的A260=0.022~0.024。1個(gè)A260相當(dāng)于50ug/mL的DNA、40ug/mL的RNA。蛋白質(zhì)的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。純的DNA的A260/A280在1.8左右，純的RNA的A260/A280在2.0左右。

三、試劑和器材：

(1)1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸餾水，用濃HCl調(diào)至pH8.0以蒸餾水定容至1000ml(2)CTAB分離緩沖液： 2g CTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL巰基乙醇，加水定容到100mL。

(3)洗滌緩沖液（70%乙醇，10mmol/L乙酸銨）：70mL無水乙醇，0.077g乙酸銨，加水到100mL。(4)TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA(5)氯仿:異戊醇=24:1(6)液氮

(7)研缽，恒溫水?。?7～100℃），離心機(jī)，離心管。

四、操作方法：

(1)將10mlCTAB分離緩沖液加入50ml離心管中，置于65℃水浴中預(yù)熱。(2)稱取1.5g葉片，置于預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研碎。(3)取1g粉末直接加入預(yù)熱的CTAB分離緩沖液中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻。

(4)樣品于65℃保溫30分鐘，每5～10分鐘混勻一次。(5)加等體積（10ml）的氯仿－異戊醇，輕輕顛倒混勻。(6)室溫下4000r/min離心10分鐘。

(7)用膠頭滴管將上層水相吸入另一干凈的離心管中（注意不要吸動(dòng)懸浮的細(xì)胞碎片和中間白色的蛋白質(zhì)層），向離心管中加入2/3體積的異丙醇，輕輕混勻，使DNA析出。（有些情況下，這一步可以產(chǎn)生云霧狀的DNA析出，如果看不到云霧狀的DNA，樣品則可以在冰浴中放置數(shù)小時(shí)甚至過夜）。(8)用下述方法收集DNA：

如果呈云霧狀的DNA析出，則用玻璃棒在云霧狀的DNA中輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，纏起DNA，然后將玻璃棒轉(zhuǎn)移至20mL洗滌緩沖液中浸泡洗滌10分鐘（不要將DNA沉淀從玻璃棒上弄掉）。

如果看不到云霧狀的DNA，可將離心管在4000r/min離心5分鐘，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL洗滌緩沖液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，洗滌核酸沉淀10分鐘，然后離心，小心地倒掉上清液，讓DNA沉淀自然干燥20分鐘。(9)用玻璃棒纏出DNA，在室溫下使DNA自然干燥20分鐘。(10)

將自然干燥的DNA溶于1mLTE緩沖液中，—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(11)

取100uL稀釋20倍，測定A260，A280，A230，或作出吸收波譜200~400nm并計(jì)算濃度和得率。

(12)

取5~10uLDNA溶液做0.7%的瓊脂糖電泳，檢查DNA的大小和質(zhì)量，以λ-DNA/HindⅢ做分子量標(biāo)準(zhǔn)，另取5uL做限制性酶切。

注意；所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。

五、思考題

1、CTAB、EDTA、巰基乙醇的作用是什么？

2、吸取樣品、抽提、及電泳時(shí)應(yīng)注意什么？為什么？

第三篇：DNA提取問題集

DNA提取問題集

默認(rèn)分類 2009-12-31 18:59:50 閱讀155 評(píng)論0字號(hào)：大中小

提取植物DNA時(shí)遇到多糖成分的干擾，DNA質(zhì)量一直不高，如何消除多糖的影響？ 參考見解：一般來說，SDS法提取的DNA會(huì)還有較多的多糖，使DNA成膠凍狀。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比較高，可用以下方法試一試：

1、在 DNA 未溶出之前，先用一些緩沖液洗去多糖。如可用緩沖液：100 mmol/LTris-HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗幾次。

2、使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍體積的無水乙醇，迅速混勻，多糖會(huì)先沉淀。

3、沉淀 DNA 時(shí)，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入 1/2 體積的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使終濃度為 10 mmol/L。或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）。

4、多糖和 DNA 的共沉淀物進(jìn)行再分離。如用 TE緩沖液反復(fù)清洗共沉淀 物，將清洗液合并再用醇沉淀 DNA，或?qū)⒊恋砦锶芙夂螅?jīng)瓊脂糖電泳，切下 DNA 部分再將膠回收，或者用多糖水解酶將多糖降解。還 有在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用而去除多糖。

上述方法還可組合使用，以達(dá)到最佳效果。然而這些方法均會(huì)在一定程度上減低 DNA 的提取量；如果材料較少或要求較高，則可考慮用柱層析方法，使用對(duì) DNA 具有 特異性吸附的樹脂來純化 DNA。曾有文獻(xiàn)提到選用 Wizard Purification Kit，PRC-5 柱，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G，或者 CsCl 梯度離心純化 DNA。血樣4度保存了2月，現(xiàn)在按照酚常規(guī)提取方法不能提取出DNA，有什么解決辦法？ 參考見解：按照常規(guī)的酚/氯仿法不可能提不出來，下面是參考方法：

1、首先洗出白細(xì)胞，最好有1毫升以上血液。

2、加入5ml DNA提取緩沖液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混勻。

3、加入25ul 蛋白酶K ,使終濃度達(dá)到100ug/ml, 混勻，50℃水浴過夜。

4、用等體積的（酚，氯仿，異戊醇，25：24：1）混合物抽提一次，5000r/min，10min離心收集水相。

5、取水層，加入3倍體積-20℃預(yù)冷無水乙醇5000r/min，10min，75%乙醇5000r/min洗DNA，充分干燥將DNA溶于適量水中。

CTAB法提取水稻基因組DNA，TE 溶解后瓊脂糖膠電泳檢測，點(diǎn)樣孔附近有一條明顯的主帶。用MBI 公司產(chǎn)的限制性內(nèi)切酶酶切過夜，鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)DNA已經(jīng)被完全切爛，只在溴酚藍(lán)前存在微弱smear狀產(chǎn)物。換用NEB 公司產(chǎn)的酶，更換EP管，滅菌水之后重復(fù)幾次，結(jié)果還是如此。拿其他人的DNA 做對(duì)照，酶切結(jié)果正常。用異丙醇將DNA 重新沉淀，換了TE溶解，檢測主帶仍舊清晰，可是用酶切之后DNA還是被切爛。為什么？

參考見解：

1、公司的酶不行。

2、如做酶切，DNA最好不用異丙醇（因其不易揮發(fā)）而用無水乙醇沉淀。

3、酶量大或作用時(shí)間太長了。

建議重提DNA，取少許用超純水溶解（非TE），按照說明書進(jìn)行酶切。要用新鮮樣品或液氮冷凍-70度保存的樣品。這樣通過降低內(nèi)切酶的活性減少DNA的降解；

要得到全血基因組DNA，可以先用分層液密度梯度離心將淋巴細(xì)胞分離嗎？這樣做，與沉淀全血細(xì)胞然后破壞紅細(xì)胞得到的結(jié)果有何差異？ 參考見解：

1、覺得還是先分離細(xì)胞好，因?yàn)镈NA和RNA大都是在細(xì)胞核內(nèi)，有紅細(xì)胞反而不太好。從血里面提RNA，用淋巴細(xì)胞分離液先分離有核細(xì)胞的，效果還是不錯(cuò)的。

2、現(xiàn)在提取全血的DNA,也就是提取淋巴細(xì)胞中的DNA，用密度梯度離心，只是富積淋巴細(xì)胞，能得到更多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的話，沒必要。

3、如果對(duì)基因組的要求不高，可以試試這個(gè)方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml Eppendorf管中，加無菌重蒸水500μl；10 000r/分鐘離心3分鐘，棄凈上清；加20μl 5mol/L KI，旋渦振蕩30秒;0.9%NaCl 100μl,150μl氯仿/異戊醇(24∶1)，振蕩30秒；10 000r/分鐘離心5分鐘，吸上清100μl于另一Eppendorf管中，加異丙醇60μl，輕輕混勻，10 000r/分鐘離心5分鐘，棄上清；加冷無水乙醇1000μl，10 000r/分鐘離心5分鐘；棄去無水乙醇，37℃烤干；50μl無菌重蒸水或TE，混勻溶解備用。

從經(jīng)福爾馬林處理后的組織標(biāo)本中提取DNA可以嗎？

參考見解：可以的，國外有好多相關(guān)試劑盒，qiagen, roche等公司都有的。

100ml的大量提取，蛋白酶Ｋ是必需的嗎？它的作用是什么？用溶菌酶代替可以嗎？每次在用酚氯仿異戊醇抽提后，上層里面都是絮狀的蛋白質(zhì)，離心幾次都沉淀不下來，請(qǐng)問是哪里出了問題？

參考見解：一般來說，蛋白酶的作用是將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時(shí)，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。而溶菌酶的作用是破壞微生物細(xì)胞壁，二者作用各異，不可替代。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中的蛋白問題，建議離心后先用竹簽挑出蛋白，小心吸取上層清液，再重復(fù)抽提幾次試試。

一般植物DNA提取的時(shí)候都不加蛋白酶K，這樣提出來的DNA鏈上的組蛋白等未被蛋白酶消化，不是很難除去嗎？那DNA是不是不純？可以用來酶切嗎？

參考見解：蛋白酶k的主要作用并不是消化組蛋白，而是消化細(xì)胞，在動(dòng)物細(xì)胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的，植物細(xì)胞的較易破碎，不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用：

1、消化組蛋白，釋放出DNA。

2、消化DNAse，提高DNA分子量。

建議還是加蛋白酶k為好，這樣提出來的 DNA分子量會(huì)高一點(diǎn)，且更純。提白粉孢子的總DNA，白粉孢子比較小，直接在研磨中加液氮研磨可以嗎？

參考見解：液氮研磨的方法應(yīng)該可行的，做動(dòng)物組織，植物組織多采用這種方法，植物纖維一樣可以用液氮研磨，要有耐心，邊加液氮邊研磨，研磨好后再抽提，應(yīng)該是可以的。在CTAB法提取DNA時(shí)，有一些品種沒有DNA析出，是什么原因？ 參考見解：

1、用預(yù)冷的異丙醇來沉淀試試，同時(shí)研磨的時(shí)候要研的非常非常的細(xì)。

2、沒有看到析出物并不代表沒有沉淀，可以繼續(xù)下一步試驗(yàn)，溶解的時(shí)候少加一點(diǎn)兒。

3、高離子強(qiáng)度下DNA與CTAB能形成共沉淀?？赡蹹NA就這樣留在沉淀里了。提取DNA配方

CTAB為十六烷基三甲基溴化銨，CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

Tris-HCl(pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境,防止核酸被破壞；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性；

NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境,使DNP充分溶解,存在于液相中；

Cβ-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除基因組DNA。

CTAB 4g

NaCl 16.364 g

1M Tris-HCl 20ml(PH8.0)

0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml滅菌

冷卻后0.2-1% 2-巰基乙醇（400ul）氯仿-異戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml異戊醇，搖勻即可。

提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，怎樣更好的抑制內(nèi)源核酸酶的活性？ 參考見解：在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí),可增加裂解液中螯合劑的含量,細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔。

用試劑盒對(duì)農(nóng)田土壤的的微生物群落DNA進(jìn)行提取，雖然總DNA提出來了，可是用細(xì)菌的通用引物進(jìn)行PCR的時(shí)候卻怎么也擴(kuò)不出來，請(qǐng)有沒有什么好的辦法可以解決這個(gè)問題？

參考見解：環(huán)境特別是土壤的樣品成分復(fù)雜，尤其是有腐殖酸具有和DNA類似的性質(zhì)，因此用一般的國內(nèi)試劑盒無法提純。應(yīng)當(dāng)選用自制的提取方法，在裂解液中加入要加入PVP。洗滌后硅膠膜上仍有雜色殘留？

參考見解：細(xì)胞裂解不充分，裂解液和樣品要快速充分混勻。洗滌產(chǎn)物中DNA量很少或沒有？ 參考見解：

1、樣品中細(xì)胞或者病毒濃度低。

2、裂解液和樣品混合不均勻造成細(xì)胞的裂解不充分。

3、蛋白酶K活性下降造成細(xì)胞裂解的不充分。

4、溫浴時(shí)間不夠造成的細(xì)胞裂解不充分或蛋白降解不完全，盡量把組織切成小塊，延長溫浴時(shí)間，使裂解物中沒有顆粒狀物殘留。

5、在上柱前，裂解物中沒有加乙醇，或用低濃度乙醇代替無水乙醇。

6、DNA沒有有效洗脫，提高洗脫效率，可將離心柱在加入洗脫液后在室溫靜止至少1min，再離心。

7、洗脫液pH不合適，低pH值會(huì)減少DNA產(chǎn)率，確保洗脫液pH在7.0－8.5之間。8洗脫體積太大，超過200ul洗脫體積所得的DNA濃度會(huì)降低，但DNA總量不會(huì)減少。

第四篇：dna粗提取和鑒定

dna粗提取和鑒定

實(shí)驗(yàn)用具

洋蔥或其他植物、洗潔精、食鹽、攪拌機(jī)或研缽(我們采用的是家用豆?jié){機(jī))、紗布、漏斗、燒杯、玻璃棒、量筒(10mL一支)、滴管、試管(20mL兩支)、天平，dna粗提取和鑒定。95%酒精、蒸餾水、0.015mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑。

實(shí)驗(yàn)材料的選取

凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是使用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大。

原理

①加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂

蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。

②加入洗滌劑和食鹽的作用

洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放;食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

③研磨不充分，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響

研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。

④此步驟獲得的濾液中可能含有的細(xì)胞成分?

可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液

動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋

.蔥的DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。

2.去除濾液中的雜質(zhì)

方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA;方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。

注意事項(xiàng)

①用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì);用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。

②方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開;方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。

DNA的析出與鑒定

將處理后的溶液過濾，加入與濾液體積相等、冷卻的酒精溶液，靜置2～3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取的DNA，鑒定材料《dna粗提取和鑒定》。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。

取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變藍(lán)。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.稱取30克已切碎的洋蔥，放入研缽中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L的氯化鈉溶液，充分研磨。

洋蔥含有揮發(fā)性刺激物，有效減少刺激，才能使實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。上課前，教師可先將洋蔥放入冰箱冷凍一會(huì)兒，使其涼透但又不能結(jié)冰;或?qū)⒀笫[切成幾大塊，放入清水泡一會(huì)兒，讓其揮發(fā)性刺激物溶于水，可以減輕刺激。然后將洋蔥切碎備用。研磨的目的主要是使洋蔥細(xì)胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化鈉溶液，沒必要將洋蔥研成粥糊狀，后者既浪費(fèi)時(shí)間又影響實(shí)驗(yàn)效果。研磨時(shí)，切忌使用攪拌器(榨汁機(jī))。使用攪拌器雖可以提高研磨效率，但攪拌器將洋蔥切成極細(xì)小的顆粒，無法通過過濾將洋蔥顆粒剔除。只能將酒精直接倒入濾液中，許多洋蔥小顆粒因?yàn)檩p會(huì)漂浮起來，DNA藏在其中，無法分辨。學(xué)生看不到白色纖維狀粘稠物的DNA。

2.研磨后，用漏斗和紗布將汁液過濾到小燒杯中，得到濾液。

3.向?yàn)V液中加入95%的酒精溶液20mL，沿?zé)诰従彽谷?，不要震?dòng)或攪拌。

此時(shí)，燒杯中的液體分為上、下兩層，下層較渾濁，上層澄清，很快上層溶液中就會(huì)有白色纖維狀粘稠物析出，用玻璃棒可將其輕輕卷起。這就是記錄生命遺傳信息的重要物質(zhì)——DNA。DNA析出的過程中，切忌震動(dòng)和攪拌(不震動(dòng)易于分層，我們就能很容易觀察到上清液中的絲狀物;攪拌會(huì)使非常柔軟的DNA斷裂成小段，不易取出)。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙簽，DNA提取物就纏繞在牙簽上了。

4.鑒定：取兩支試管，編為1、2號(hào)，各加入2mol/L的氯化鈉溶液2mL，向1號(hào)試管中加入一些白色纖維狀物，振蕩使其溶解，然后向兩支試管中各加入2mL二苯胺試劑，沸水浴加熱5分鐘。

注意事項(xiàng)

1.以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉防止血液凝固。

2.加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。

3.二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。

4.DNA的溶解度與NaCl溶液濃度的關(guān)系：

當(dāng)NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低;當(dāng)NaCl溶液濃度高于0.14mol/L時(shí)，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。

5.盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器。

雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會(huì)更少。因此，實(shí)驗(yàn)過程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過程的DNA的損失。

第五篇：實(shí)驗(yàn)四動(dòng)物血液中DNA的提取-教案

授課教師常祖明學(xué)生人數(shù) 55

課題血液基因組DNA的提取

授課類型新授課授課方法講授、演示 教學(xué)用具多媒體、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備

教學(xué)目的掌握雞血DNA提取的原理及方法

教學(xué)重點(diǎn)理解實(shí)驗(yàn)過程中每一步操作的目的及原理 教學(xué)難點(diǎn) 教學(xué)過程

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握雞血DNA提取的原理；

2.掌握雞血DNA提取的方法及操作過程。

二、實(shí)驗(yàn)原理

哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞已經(jīng)高度分化，因而當(dāng)中沒有細(xì)胞核，無法提取DNA。禽類的血細(xì)胞則可以。禽類代謝旺盛，血液中紅細(xì)胞更多，而且紅細(xì)胞中有完整的細(xì)胞核、大量的染色體。且材料易得、經(jīng)濟(jì)。用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個(gè)原因。一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對(duì)設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長。

三、實(shí)驗(yàn)儀器 1.水浴鍋：55℃

2.離心機(jī)：8000轉(zhuǎn)、12000轉(zhuǎn) 3.離心管：5ml（120個(gè)）

4.移液槍：10μl、680μl、700μl、800μl、900μl、1ml 5.容量瓶：100ml 6.取血針及管

四、實(shí)驗(yàn)材料及藥品

實(shí)驗(yàn)材料：普通家雞：需血液4.08ml（每管136(l）1.無水乙醇

作用：DNA沉淀劑、洗滌劑。

商品信息：瓶/500ml，分析純AR。

理化性質(zhì)：無色澄清液體。有灼燒味。易流動(dòng)。極易從空氣中吸收水分，能與水和氯仿、乙醚等多種有機(jī)溶劑以任意比例互溶。

儲(chǔ)存：儲(chǔ)存于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應(yīng)與氧化劑、酸類、堿金屬、胺類等分開存放，切忌混儲(chǔ)。采用防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。禁止使用易產(chǎn)生火花的機(jī)械設(shè)備和工具。

危害：易燃，具刺激性。蒸氣與空氣能形成爆炸性混合物，爆炸極限3.5%～18.0%（體積）。2.檸檬酸

作用：ACD抗凝血?jiǎng)┏煞种弧Ｔ诳鼓齽┲?，中和檸檬酸鈉的堿性。商品信息：分析純AR，白色塑料瓶/500g，理化性質(zhì)：無臭，有很強(qiáng)的酸味，白色粉末或顆粒，易溶于水和醇。在潮濕的空氣中微有潮解性。

儲(chǔ)存：在濕空氣中有輕微潮解，需陰涼密封干燥保存。

危害：檸檬酸濃溶液對(duì)黏膜有刺激作用。檸檬酸可燃。粉體與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、高熱或與氧化劑接觸，有引起燃燒爆炸的危險(xiǎn)。3.檸檬酸鈉

作用：ACD抗凝血?jiǎng)┏煞种?。能與血液中的鈣離子結(jié)合成螯合物，而使鈣離子失去凝血作用，從而阻止血液凝固。

商品信息：檸檬酸三鈉分析純500克/瓶。

理化性質(zhì)：有機(jī)化合物，外觀為白色到無色晶體。無臭, 有清涼咸辣味。常溫及空氣中穩(wěn)定, 在濕空氣中微有溶解性, 在熱空氣中產(chǎn)生風(fēng)化現(xiàn)象。加熱至150℃失去結(jié)晶水。易溶于水、可溶于甘油、難溶于醇類及其他有機(jī)溶劑，過熱分解，在潮濕的環(huán)境中微有潮解，在熱空氣中微有風(fēng)化，其溶液 pH 值約為8。儲(chǔ)存： 常溫密閉保存 危害：無毒 4.尿素

作用：禽血裂解液成分之一。尿素能非常有效地使蛋白質(zhì)變性，尤其能非常有效地破壞非共價(jià)鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)。

商品信息：化學(xué)試劑分析純 500克/瓶（塑料瓶裝）理化性質(zhì)：無色柱狀結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末，溶于水，乙醇和苯，難溶于乙醚，不溶于氯仿。儲(chǔ)存：密封避光保存。

危害：避免與皮膚和眼睛接觸。5.十二烷基硫酸鈉(SDS)作用：禽血裂解液成分之一。裂解核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體，用于從蛋白質(zhì)中分離核酸。商品信息：500g/分析純AR。

理化性質(zhì)：白色或淡黃色粉末。溶解性：溶于水，呈透明溶液，溶液呈中性。易溶于熱水，溶于水，溶于熱乙醇，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。儲(chǔ)存：密封陰涼干燥保存 防止受潮受熱 危害：對(duì)粘膜和上呼吸道有刺激作用，對(duì)眼和皮膚有刺激作用?？梢鸷粑到y(tǒng)過敏性反應(yīng)。該品可燃，具刺激性，具致敏性。遇明火、高熱可燃。受高熱分解放出有毒的氣體。6.1M Tris-HCl(PH8.0)緩沖液

作用：禽血裂解液成分之一。提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止DNA被破壞 商品信息：瓶/100ml，無色、澄清溶液

理化性質(zhì)：Tris中文品名為三羥甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一種白色結(jié)晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，對(duì)銅、鋁有腐蝕作用，有刺激性的化學(xué)物質(zhì)。

儲(chǔ)存：室溫保存。

危害：毒性低，可致癌，不要直接接觸皮膚。7.乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）

作用：配制0.5M EDTA（PH8.0）溶液。螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制脫氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。商品信息：瓶/250g。理化性質(zhì)：無味無臭或微咸的白色或乳白色結(jié)晶或顆粒狀粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值約為5.3。可由EDTA與氫氧化鈉和碳酸鈣作用制得。

儲(chǔ)存：于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。應(yīng)與氧化劑分開存放，切忌混儲(chǔ)。配備相應(yīng)品種和數(shù)量的消防器材。儲(chǔ)區(qū)應(yīng)備有合適的材料收容泄漏物。

危害：對(duì)粘膜和上呼吸道有刺激作用。對(duì)眼睛、皮膚有刺激作用。本品可燃，具刺激性。8.蛋白酶K（共需300μl，每管10μl）作用：消化組蛋白，釋放出DNA；消化DNase，提高DNA產(chǎn)量 商品信息：（20mg/mL）1ml/支。

理化性質(zhì)：一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯氏白色念球菌中純化得到。儲(chǔ)存：保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，有效保證12月。危害：使用時(shí)注意不要接觸皮膚，以免損傷皮膚表面的蛋白質(zhì)。9.Tris飽和酚（共需60ml，每管2ml）作用：強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑。商品信息：瓶/250ml。理化性質(zhì)：為淺黃色透明液體，上層為Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羥基喹啉和0.1%的β-巰基乙醇。

儲(chǔ)存：4℃避光保存。

危害：Tris飽和酚有較強(qiáng)的腐蝕性，應(yīng)盡量避免皮膚直接接觸或吸入體內(nèi)。如發(fā)現(xiàn)變?yōu)辄S色或棕色，表明發(fā)生氧化，不能使用。10.氯仿（三氯甲烷）

作用：蛋白質(zhì)變性劑，加速有機(jī)相與液相分層，去除核酸溶液中的跡量酚。商品信息：瓶/500ml。

理化性質(zhì)：無色透明重質(zhì)液體，極易揮發(fā)，有特殊氣味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。儲(chǔ)存：保存在密封的棕色瓶中。

危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空氣逐漸被氧化生成劇毒的光氣。11.異戊醇

作用：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。商品信息：瓶/500ml。

理化性質(zhì)：無色液體，有不愉快的氣味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有機(jī)溶劑。

儲(chǔ)存：儲(chǔ)存于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應(yīng)與氧化劑、酸類等分開存放，切忌混儲(chǔ)。采用防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。禁止使用易產(chǎn)生火花的機(jī)械設(shè)備和工具。儲(chǔ)區(qū)應(yīng)備有泄漏應(yīng)急處理設(shè)備和合適的收容材料。

危害：吸入、口服或經(jīng)皮膚吸收有麻醉作用。其蒸氣或霧對(duì)眼睛、皮膚、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，長時(shí)間接觸有麻醉作用。易燃，其蒸氣與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、高熱能引起燃燒爆炸。12.無水葡萄糖

作用：ACD抗凝血?jiǎng)┏煞种?。商品信息?00g/瓶。

理化性質(zhì)：無色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末；無臭、味甜。水中易溶，在乙醇中微溶。儲(chǔ)存：無水葡萄糖易吸水結(jié)塊，因此應(yīng)密封保存。危害：無。

五、實(shí)驗(yàn)試劑 1.75%的乙醇

{75ml + 25ml水} → 100ml75%的乙醇

2.ACD抗凝劑 100ml（共需48ml，每管0.8ml）

{檸檬酸0.48g + 檸檬酸鈉1.32g + 葡萄糖1.47g} →加水至100ml，滅菌后備用。3.禽血裂解液 100ml（共需51ml，每管1.7ml）

{尿素12g + SDS 1g + 1M Tris-HCl(PH8.0)10ml + 0.5M EDTA(PH8.0)20ml} →加水定容至100ml，備用。

【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（約2g）調(diào)至PH8.0 →定容至100ml →分裝后高壓滅菌備用。注：需加入NaOH調(diào)至PH8.0才能完全溶解。4.氯仿-異戊醇（24:1）共需54ml，每管1.8ml {氯仿 96ml + 異戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存

5.酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）共需60ml，每管2ml {氯仿-異戊醇（24:1）40ml + Tris飽和酚40ml} = 80ml，4℃保存 6..TE緩沖液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} → →定容到50ml →高壓滅菌后冷卻4℃保存 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水 80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（約2g）調(diào)至PH8.0 →定容至100ml →分裝后高壓滅菌備用。注：需加入NaOH調(diào)至PH8.0才能完全溶解?！?0mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0緩沖液100μl + 水9.9ml} →定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液

六、實(shí)驗(yàn)步驟

1.采用翅靜脈采血，抽取血液5mL，溶于20mL 75%的乙醇中，振蕩混勻，配成家雞血樣25ml（酒精：血＝4：1）目的：乙醇可以抑制DNA水解酶的活性，防治DNA降解，并且75%有防止血液凝固的作用。75%乙醇效果比無水乙醇效果好，血樣不至于太干澀。酒精:血(4:1)混合的血樣保存時(shí)間長，可達(dá)4個(gè)月。

2.取血樣(酒精:血＝4:1)680(L至5mL離心管中，8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，棄上清； 目的：去除血樣中大部分的乙醇，保證后面蛋白酶K的活性。

3.加800(LACD搖勻，8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，棄上清；再加800(LACD搖勻，8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，棄上清；

目的：ACD抗凝劑可以螯合血液中的鈣離子，防治血細(xì)胞凝集成團(tuán)凝固，影響血細(xì)胞的破碎和對(duì)血細(xì)胞里DNA的提取。多次離心可以去除血樣中的乙醇，保證后面蛋白酶K的活性。4.加1700(L裂解液，10(L蛋白酶K（100(g），搖勻，55℃水浴保溫過夜； 目的：DNA裂解液的作用是破壞細(xì)胞膜、核膜,并使組織蛋白與DNA分離，抑制細(xì)胞中DNase的活性；而蛋白酶k的作用是將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來，蛋白酶k還可以消化DNAse，提高DNA產(chǎn)量。55℃水浴保溫過夜可以讓蛋白酶K充分發(fā)揮作用。

5.加2mL飽和酚，搖勻至無塊狀物，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘；

目的：飽和酚是強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，可以將蛋白質(zhì)及降解后的產(chǎn)物充分變性，變性后的蛋白質(zhì)溶解度減低，易沉淀。

6.吸取上層透明的DNA溶液至另一5mL離心管中，注意不要攪拌下層的酚－蛋白層；

目的：加入飽和酚后溶液分層，上層是透明的DNA溶液，再往下是變性的蛋白質(zhì)，飽和酚的比重最大在最下層。

7.加2mL酚-氯仿-異戊醇（25：24：1），搖勻至懸浮液，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘； 目的：加入酚-氯仿-異戊醇進(jìn)一步去除DNA溶液中的殘留蛋白質(zhì)。

8.吸取上層DNA液于另一5mL離心管中，加1.8mL氯仿-異戊醇溶液，搖勻，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘； 目的：由于酚與水有部分混溶，DNA水溶液中會(huì)混有部分酚，由于氯仿和酚互溶而不溶于水，用氯仿-異戊醇在抽提一次可以把酚帶走。

9.吸取上層DNA液900(L于另一5mL離心管中，加無水乙醇至滿，顛倒混合，試管中出現(xiàn)白色團(tuán)塊，即是DNA；

目的：DNA水溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇與DNA不相溶但與水相溶，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合收集。用無水乙醇的目的是乙醇中如果含有水，DNA會(huì)部分溶于水中，降低DNA沉淀的產(chǎn)量。

10.吸出試管中的無水乙醇，加75%的乙醇，混合，吸出75%的乙醇，重復(fù)2次；

目的：像前面步驟中加入的抗凝血?jiǎng)┲械臋幟仕徕c、葡萄糖，裂解液中的SDS、EDTA-2Na，在氯仿及醇中的溶解度低，經(jīng)乙醇沉淀后的DNA中會(huì)有以上雜質(zhì)存在。以上雜質(zhì)有個(gè)共同的特征就是都易溶于水，故用75%的乙醇洗滌，可以利用其中的15%的水溶解這些雜質(zhì)除去。11.將DNA自然晾干后溶入1000(L TE緩沖液，-20℃保存；

目的：乙醇已揮發(fā)除去，TE緩沖液一可以抑制Dnase活性，二維持一定堿性PH值，有助于DNA的溶解和穩(wěn)定。

七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1.在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作； 2.部分藥品有毒，操作中應(yīng)注意安全防護(hù)；

3.剛投入水浴時(shí)可以稍快速的晃動(dòng)，之后的晃動(dòng)一定要輕柔； 4.抽提時(shí)不要有太力振動(dòng)，操作也要仔細(xì)，盡量避免DNA斷裂；

5.吸出試管中的無水乙醇時(shí)用的槍頭一定要剪過的，這點(diǎn)很重要，過尖的槍頭會(huì)把DNA鏈弄斷。

八、思考題

1.本實(shí)驗(yàn)中幾次用到的不同濃度乙醇的作用是什么？

九、實(shí)驗(yàn)安排

全班55人，按照學(xué)號(hào)分組，每6人一組，共9組，最后一組7人。每組作3個(gè)離心管，共用一個(gè)研缽。

每3組（共18人9個(gè)離心管）共同進(jìn)行離心操作。