第一篇：質(zhì)粒提取的原理、操作步驟、各溶液的作用

質(zhì)粒提取的原理、操作步驟、各溶液的作用

(2010-11-11 17:19:05)轉(zhuǎn)載標(biāo)簽： 質(zhì)粒

溶液

無水乙醇

大腸桿菌

雜談 ▼

分類： Biology

細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。

質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，下面主要介紹堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法。

堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和 SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。

純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價閉環(huán)兩個性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費(fèi)時。對于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀 等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用。

堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析。方法如下：

1、接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2ml LB培養(yǎng)基。

2、37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

3、取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。

4、加0.lml溶液I（1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0）充分混合。

5、加入0.2ml溶液 II（0.2 mM/L NaOH，1％ SDS），輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min.6、加入0.15m1預(yù)冷溶液III（5 mol/L KAc，pH4.8），輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min.7、以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管

8、加入等體積的異戊醇，混勻后靜置10min.9、再以10，000rpm離心20min，棄上清。

10、用70％乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。

11、待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE緩沖液中

試劑準(zhǔn)備

1.溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。

在10 lbf/in2高壓滅菌15min，貯存于4℃。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)對質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達(dá)10 mM的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實(shí)也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話告訴你，只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。

2.溶液II：是用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向 micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)?SDS也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂?；蚪M DNA的斷裂會帶來麻煩。

3.溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。

5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

溶液III加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的 SDS溶液中加入2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量 的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加 入5 N的NaCl，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量 要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。

1.為什么用無水乙醇沉淀DNA？

用無水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。

DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因?yàn)闊o水乙醇的價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15－30分鐘即可。

2.在用乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.1～0.25mol/L？

在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。

第二篇：質(zhì)粒大提--自制試劑配制和操作步驟總結(jié)

質(zhì)粒提取試劑配制和操作步驟

試劑配制(小量)

1.1M（M代表摩爾濃度即mol∕L）NaOH(400ml): 分子量為40，秤取16g NaOH, 溶于400ml DDW中。

2.2M Tris-HCl(500ml): 分子量為121.14, 秤取121.14g Tris,放入干凈的500ml燒杯中，加400 ml DDW，置于攪拌器上攪拌溶解，用HCl調(diào)節(jié)pH值為8.0（首先直接加12M的濃鹽酸約20ml，接近8.0時再用1M HCl 調(diào)節(jié)）, 定容至500ml，4℃保存。

3.10%SDS(200ml): 稱量20gSDS,放入干凈的燒杯中，加100 ml DDW，定容到200ml，室溫保存。（SDS具有較強(qiáng)的刺激性，稱量時一定帶好口罩，動作輕柔）。

4.Buffer P1(500ml): 用50ml離心管量取10ml 0.5M的EDTA，然后量取12.5ml 2M 的Tris-HCl，放入干凈的燒杯中，加入300ml DDW,置于攪拌器上攪拌溶解，用HCl調(diào)節(jié)pH值為8.0（大約加12M的濃鹽酸1ml），定容至500ml，4℃保存。

5.Buffer P2（100ml）: 20ml 1M NaOH和10ml 10%SDS放入200ml的玻璃瓶中，然后加入70ml DDW，混勻，室溫放置過夜，使其自溶，最后室溫保存。(注：不需要定容，嚴(yán)格按步驟操作)。

6.Buffer P3(500ml)： 秤取147.21g乙酸鉀，溶于300ml DDW中，置于攪拌器上攪拌溶解，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值為5.5，（約加80–100ml冰醋酸）, 定容至500ml，4℃保存。7.Buffer QBT（500ml）：分別稱取NaCl 21.915g, MoPS 5.23g, 放于干凈的500ml燒杯中，加入300ml DDW,置于攪拌器上攪拌溶解，用1M NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0（約加10–15ml NaOH）,然后加入75ml 異丙醇，定容至500ml，4℃保存。

8.Buffer QC（500ml）：分別稱取NaCl 29.22g, MoPS 5.23g,放于干凈的500ml燒杯中，加入300ml DDW,置于攪拌器上攪拌溶解，用1M NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0（約加9ml NaOH,然后加入75ml 異丙醇，定容至500ml，4℃保存。9.Buffer QF（500ml）：稱取NaCl 36.525g, 量取2M Tris-HCl 12.5ml,放于干凈的500ml燒杯中，加入300ml DDW，置于攪拌器上攪拌溶解，用1M NaOH調(diào)節(jié)pH值為8.5（約加0.1ml NaOH），然后加入75ml異丙醇，定容至500ml，4℃保存。10.配制RNase:

(1)將RNase粉末溶于10mM的乙酸鉀（即Buffer P3），配制成濃度為10mg/ml的溶液。

(2)將配好的RNase溶液100℃加熱10min, 隨后冷卻至室溫。

(3)用1M 的Tris-HCl調(diào)節(jié)pH值至7.4，大約需要0.1體積的Tris-HCl。(4)分裝RNase溶液于1.5ml EP管中，-20℃保存。

試劑配制(大量)

1.1M NaOH(400ml): 分子量為40，秤取16g NaOH, 溶于400ml DDW中。2.2M Tris-HCl(500ml): 分子量為121.14, 秤取121.14g Tris,溶于400 ml DDW中，用HCl調(diào)節(jié)pH值為8.0, 定容至500ml。

3.Buffer P2（1000ml）: 稱取10g SDS, 放入1000ml的玻璃瓶中，然后加入750ml DDW，最后加入200 ml 1M的NaOH，混勻，室溫放置過夜，使其自溶。(注：不需要定容，嚴(yán)格按步驟操作。)4.Buffer P1(1000ml): 用50ml離心管量取20ml 0.5M的EDTA，然后量取25ml 2M 的Tris-HCl，加入700ml DDW, 用HCl調(diào)節(jié)pH值為8.0，定容至1000ml。

5.Buffer P3(1000ml)： 秤取294.42g乙酸鉀，溶于800ml DDW中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值為5.5，定容至1000ml。6.Buffer QBT（1000ml）：分別稱取NaCl 43.83g, MoPS 10.46g, 加入600ml DDW, 用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0，然后加入150ml 異丙醇，定容至1000ml。7.Buffer QC（1000ml）：分別稱取NaCl 58.44g, MoPS 10.46g, 加入600ml DDW, 用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0，然后加入150ml 異丙醇，定容至1000ml。8.Buffer QF（1000ml）：稱取NaCl 73.05g, 量取2M Tris-HCl 25ml, 加入800ml DDW，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為8.5，然后加入150ml 異丙醇，定容至1000ml。9.配制RNase:

(1)將RNase粉末溶于10mM的乙酸鉀（即Buffer P3），配制成濃度為10mg/ml的溶液。

(2)將配好的RNase溶液100℃加熱10min, 隨后冷卻至室溫。

(3)用1M 的Tris-HCl調(diào)節(jié)pH值至7.4，大約需要0.1體積的Tris-HCl。(4)分裝RNase溶液于1.5ml EP管中，-20℃保存。

操作步驟 準(zhǔn)備工作：

? 大提質(zhì)粒的前兩天用50ml離心管搖菌，在5-7ml加有氨芐抗生素AMP的LB液體培養(yǎng)基中挑菌，37℃下?lián)u菌12-16h。

? 大提質(zhì)粒前一天將50ml離心管搖好的菌液500ml大三角瓶中加入含有氨芐抗生素AMP的LB液體培養(yǎng)基200ml，37℃下?lián)u菌12-16h。

1.沉淀菌液：向離心機(jī)配套的50 ml離心管中，加入30 ml菌液，6000 g離心10min, 大約沉淀菌液200 ml。(注意：配平離心管，離心時要在離心管壁和蓋上都做好標(biāo)記，且離心時寫字的管壁側(cè)朝向外，以便容易找到沉淀物)。離好一管，取回棄去上液保留沉淀物，再反復(fù)離心直到所有200ml菌液全部離完），打開蓋倒置吸水紙上控干。2.溶解沉淀: 量取10 ml Buffer P1, 加入100μl RNase A, 混勻后，加入到離心沉淀的菌中，用振蕩器充分溶解菌液沉淀（可用15ml離心管量取，Buffer P1 加入沉淀離心管是管口不要接觸，以防互相污染）。

3.加入10 ml Buffer P2，液體呈現(xiàn)藍(lán)色，輕輕混勻，使其充分反應(yīng)，冰上放置2-3min即可。（此步主要是堿裂解細(xì)菌，使其中的蛋白質(zhì)和DNA變性，反應(yīng)時間不能太長，否則容易使大腸桿菌的基因組DNA斷裂成小片段，污染質(zhì)粒DNA）

4.加入10 ml 預(yù)冷的Buffer P3，輕輕顛倒混勻，直到藍(lán)色全部消失，出現(xiàn)白色蛋白沉淀，冰上放置20min。（此步發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，pH值降低，使變性的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)恢復(fù)，其中的SDS可以充分與蛋白質(zhì)結(jié)合，使其析出）

5.20 min后，6000 g 4℃離心25min。同時，向柱子中加入5ml Buffer QBT，使其全部流過柱子，平衡柱子。如果是重復(fù)使用的柱子，先使其中的HCl全部流盡，然后加滿DDW清洗2遍柱子，最后再加入Buffer QBT平衡柱子。

6.剪一小塊紗布，折疊4層，放于柱子上部。將離心后的液體緩慢倒入紗布中，最后擠壓紗布使其中的液體全部直接過濾到柱子中，使其充分流過柱子。（如果此步不只1個質(zhì)粒時，擠壓不同質(zhì)粒的紗布時，一定要換手套，避免污染質(zhì)粒）

7.清洗柱子: 液體全部流過柱子后，向柱子中直接加滿Buffer QC，使其全部流過柱子，清洗2遍，棄去廢液。

8.洗脫質(zhì)粒: 向柱子中加15ml Buffer QF，靠重力作用使其全部通過柱子，收集洗脫液。(注：要收集到一個新的管中)9.沉淀質(zhì)粒：向收集的液體中，加入0.7倍體積（即10.5 ml）異丙醇，輕輕混勻，6000 g 4℃離心25 min。（異丙醇可以充分沉淀質(zhì)粒，但同時會沉淀很多鹽分）

10.清洗質(zhì)粒：離心后，注意質(zhì)粒貼壁的方向，應(yīng)從其側(cè)面倒掉廢液。然后加入10 ml 70%的乙醇，輕輕晃動（不能用槍吹散，否則會損失很多質(zhì)粒）。

11.沉淀質(zhì)粒：6000 g 4℃離心10min，輕輕吸棄廢液，將質(zhì)粒開蓋晾置，使乙醇充分會發(fā)。（質(zhì)粒中的乙醇會影響后續(xù)反應(yīng)中的酶活性）

12.溶解質(zhì)粒：用300ulDDW或TE溶解步驟11中的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)移到新的1.5mlEP管中，做好標(biāo)記，檢測濃度。13.柱子回收:

(1)先用自來水沖洗柱子內(nèi)外；

(2)再用蒸餾水和DDW沖洗柱子內(nèi)外，最后加滿DDW，使其全部通過柱子，清洗2次。(3)向柱子中加滿1 M HCl，柱子底部蓋上蓋子，頂部用封口膜封上，室溫放置過夜。（HCl可充分降解DNA）

第三篇：瘦肉精檢測原理及操作步驟

瘦肉精檢測原理及操作步驟？

時間：2011-03-22 來源： 作者：

一、測定原理

“瘦肉精”克侖特羅競爭酶標(biāo)免疫檢測方法快速測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。酶聯(lián)板的微孔包被有針對兔抗克侖特羅特異性抗體的羊抗體（第二抗體）。加入兔抗克侖特羅特異性抗體（第一抗體）與第二抗體結(jié)合而被固定，洗滌后加入標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液與酶結(jié)合物（酶標(biāo)記抗原），標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中的游離抗原與酶標(biāo)抗原競爭兔抗克侖特羅特異性抗體上有限的結(jié)合位點(diǎn)。通過洗滌除去沒有與特異性抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原，加入酶基質(zhì)（過氧化脲）和發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）并孵育，結(jié)合到板上的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的底物。加酸終止反應(yīng)后，顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在單波長450 nm處測吸光度，吸收光強(qiáng)度與樣品中的克侖特羅濃度成反比。

二、試劑盒的組成

每個盒中（包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔）材料如下：

（1）1×96孔板（12排×8孔），包被有第二抗體（兔IgG抗體）；（2）6個標(biāo)準(zhǔn)液（300ul/瓶）為克侖特羅水溶液。濃度分別為0 ng/kg、100 ng/kg、300 ng/kg、900 ng/kg、2700 ng/kg、8100 ng/kg；（3）1個克侖特羅過氧物酶標(biāo)記物濃縮液12 ml（紅色帽）；（4）1個克侖特羅抗體濃縮液12 ml（黑色帽）；（5）1個酶基質(zhì)/發(fā)色劑11 ml（藍(lán)色帽）；（6）1個反應(yīng)停止液，1 mol/L硫酸14 ml（黃色帽）；（7）1個緩沖液25 ml，酶標(biāo)記物及抗體濃縮液稀釋用。

三、試驗(yàn)材料

1、設(shè)備

微孔板酶標(biāo)儀（450 nm）、均質(zhì)器、冷凍離心機(jī)、離心管（50 ml）、微量可調(diào)移液器（單道、八道）、RIDAC18柱、濾紙（0.45μm）。

2、試劑

甲醇（分析純、100%）、50 mmol/LHCL、10 mmol/LHCL、50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.0）、500 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.0）、1 mol/LNaOH。

四、儲存條件

試劑盒保存于2-8℃，不要冷凍。不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與干燥劑一起重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，避免直接暴露在光線下。

五、試劑變質(zhì)的跡象

發(fā)色劑有任何顏色表明已變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光值小于0.6時，表示試劑可能變質(zhì)。

六、樣品處理

1、尿樣

尿樣一般不用處理，取20清亮尿樣直接測定。如果尿樣混濁要過濾或離心至得到清亮尿樣。

2、肝臟、肉樣

粉碎的5g樣品與25ml50 mmol/L HCL混合，振蕩1.5 h，以達(dá)到均質(zhì)的目的。稱6g均質(zhì)物（相當(dāng)于1 g肝臟），加入離心管中。10-15℃條件下（非常重要）4000轉(zhuǎn)/min或更高的轉(zhuǎn)速離心15 min。轉(zhuǎn)移上清液到另一個離心管中，加300μl 1mol/L NaOH混合15 min。加入4 ml 500 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.0），簡單混合并在4℃保存至少1.5 h或過夜（非常重要）。10-15℃條件下（非常重要）4000轉(zhuǎn)/min或更高的轉(zhuǎn)速離心15 min。分離全部上清液（應(yīng)是清亮的，非常重要），使其升至室溫（20-24℃），然后用RIDAC18柱純化。

RIDAC18柱純化樣品必須在室溫條件下（20-24℃），并嚴(yán)格控制過柱時流速。用3 ml甲醇洗滌柱子，控制流速為1滴/s。用2ml洗滌液（50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH 3.0），洗滌柱子。肝臟、肉樣的全部上清液進(jìn)柱，控制流速為1滴/4s。用2 ml洗滌液（50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH 3.0），洗滌柱子，流速為1滴/s。用正壓除去殘留的流體并用空氣或氮?dú)獯? min，干燥柱子。用1 ml甲醇洗脫樣品，控制流速1滴/4s。在50-60℃并在弱空氣或氮?dú)饬飨峦耆舭l(fā)甲醇溶劑。用1 ml蒸餾水溶解干燥的殘留物，取20μl進(jìn)行分析。

3、飼料

取10ｇ飼料樣品，用10 mmol/LHCL溶解，連續(xù)震蕩10 min，用濾紙過濾，在濾液中加入120μl 1mol/L NaOH進(jìn)行中和，檢查pH，用NaOH控制PH值在6.5-7.5之間，取上清液20μl進(jìn)行分析。稀釋倍數(shù)為25（即含有0.04 g飼料樣品/ml）。

七、測定步驟

第一步：所有試劑及樣品在開始檢測前必須回升至室溫（20-24℃），測定操作在20-24℃下進(jìn)行。

第二步：用盒中緩沖液以體積1﹕10的比例稀釋實(shí)際用量的克侖特羅抗體濃縮液（黑色蓋），稀釋前輕輕混均抗體，不要猛烈振蕩。

第三步：取出實(shí)驗(yàn)需要數(shù)量的微孔板條，足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用的數(shù)量，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個平行試驗(yàn)，記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。剩余的微孔板條放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，置于2-8℃冷藏。

第四步：每個微孔中底部加100μl稀釋后的抗體溶液，室溫（20-24℃）孵育微孔板15 min，避免光線照射。

第五步：孵育的同時進(jìn)行酶標(biāo)記物的稀釋，用盒中緩沖液以體積1﹕10的比例稀釋實(shí)際用量的克侖特羅酶標(biāo)記物濃縮液（紅色蓋），稀釋前輕輕混均抗體，不要猛烈振蕩，避光放置。

第六步：洗板，甩出孔中液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打，直到紙上無明顯水跡（拍打3次），以保證完全除去孔中的液體。用250μl蒸餾水充入孔中，再次甩掉微孔中液體，并在吸水紙上拍打，重復(fù)操作兩次。加洗滌水的移液器管尖必須置于微孔上方約0.5 cm處打出洗滌水，避免將板孔中的游離抗體帶入洗滌水中。洗板后立即進(jìn)行下一步操作，不要讓板孔干燥。

第七步：加入20μl標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔底部，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個平行實(shí)驗(yàn)。

第八步：加入100μl稀釋了的酶標(biāo)記物至微孔底部，輕輕震蕩微孔析并在桌面上作圓周運(yùn)動以混勻。移液器管尖不要接觸到孔中的混合物，避免交叉污染。

第九步：室溫孵育微孔板30 min，避免放置，盡可能每隔10 min輕輕振蕩1次，準(zhǔn)備好酶基質(zhì)/發(fā)色劑，并注意避光放置。

第十步：洗板，同第六步。在洗板過程中加洗滌水的移液器置于微孔板上方0.5 cm處打出洗滌水，避免將板孔中的游離酶標(biāo)記物帶入洗滌水中。

第十一步：不要讓板孔干燥，迅速加入100μl酶基質(zhì)/發(fā)色劑到每個孔中，步驟操作要迅速，避免頭尾反應(yīng)時間相差過長，輕輕振蕩板并在桌面上作圓周運(yùn)動以混勻。移液器管尖不要接觸微孔中的混合物，避免交叉污染。

第十二步：室溫暗處孵育微孔板15 min，暗處避光放置，同時準(zhǔn)備好反應(yīng)停止液。

第十三步：每孔加入100μl反應(yīng)停止液，混勻，60 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測量450 nm處波長吸光度值。

八、結(jié)果

所獲得的標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度值的平均值除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值再乘以100，并且以百分比的形式給出吸光度值。

吸光度值（％）＝ ×100

計算的標(biāo)準(zhǔn)值（吸光度值）繪成一個對應(yīng)克侖特羅濃度（mg/kg）的半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在200-2000 ng/kg范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成為線性。相對應(yīng)每一個樣品的濃度（ng/kg）可以從校正曲線上讀出

第四篇：索氏提取器的原理及其操作

索氏提取器

索氏提取器

索氏提取器又稱脂肪抽取器或脂肪抽出器

索氏提取器是由提取瓶、提取管、冷凝器三部分組成的（圖)，提取管兩側(cè)分別有虹吸管和連接管。各部分連接處要嚴(yán)密不能漏氣。提取時，將待測樣品包在脫脂濾紙包內(nèi)，放入提取管內(nèi)。提取瓶內(nèi)加入石油醚，加熱提取瓶，石油醚氣化，由連接管上升進(jìn)入冷凝器，凝成液體滴入提取管內(nèi)，浸提樣品中的脂類物質(zhì)。待提取管內(nèi)石油醚液面達(dá)到一定高度，溶有粗脂肪的石油醚經(jīng)虹吸管流入提取瓶。流入提取瓶內(nèi)的石油醚繼續(xù)被加熱氣化、上升、冷凝，滴入提取管內(nèi)，如此循環(huán)往復(fù)，直到抽提完全為止。

從固體物質(zhì)中萃取化合物的一種方法是，用溶劑將固體長期浸潤而將所需

要的物質(zhì)浸出來，即長期浸出法。此法花費(fèi)時間長．溶劑用量大、效率不高。

在實(shí)驗(yàn)室多采用脂肪提取器(索氏提取器)來提取、脂肪提取器(如圖所示)

就是利用溶劑回流及虹吸原理，使固體物質(zhì)連續(xù)不斷地被純?nèi)軇┹腿。裙?jié)約

溶利萃取效率又高。萃取前先將固體物質(zhì)研碎，以增加固液接觸的面積。然后

將固體物質(zhì)放在濾紙?zhí)?內(nèi)，置于提取器2中，提取器的下端勺盛有溶劑的圓

底燒瓶相連，上面接回流冷凝管。加熱園底燒瓶，使溶劑沸騰，蒸氣通過提取器 的支管3上升，被冷凝后滴入提取器中，溶劑和固體接觸進(jìn)行萃取，當(dāng)溶劑面超

過虹吸管4的最高處時，含有萃取物的溶劑虹吸回?zé)?，因而萃取出一部分?/p>

質(zhì)，如此重復(fù)，使固體物質(zhì)不斷為純的溶劑所蘋取、將萃取出的物質(zhì)富集在燒瓶中。

液—固萃取是利用溶劑對固體混合物中所需成分的溶解度大,對雜質(zhì)的溶解度小來達(dá)到

提取分離的目的.一種方法是把固體物質(zhì)放于溶劑中長期浸泡而達(dá)到萃取的目的,但是這種

方法時間長,消耗溶劑,萃取效率也不高.另一種是采用索氏提取器的方法,它是利用溶劑 的回流和虹吸原理,對固體混合物中所需成分進(jìn)行連續(xù)提取.當(dāng)提取筒中回流下的溶劑的液

面超過索氏提取器的虹吸管時,提取筒中的溶劑流回圓底燒瓶內(nèi),即發(fā)生虹吸.隨溫度升高，再次回流開始,每次虹吸前,固體物質(zhì)都能被純的熱溶劑所萃取,溶劑反復(fù)利用,縮短了提

取時間,所以萃取效率較高

索氏提取器應(yīng)用舉例：萃取法提取粗咖啡因

用濾紙制作圓柱狀濾紙筒,稱取10g茶葉,用研缽搗成茶葉末,裝入濾紙筒中,將開口

端折疊封住,放入提取筒中.將150 mL圓底燒瓶安裝于電熱套上,放入2粒沸石,量取95

%乙醇100mL,從提取筒中倒入燒瓶,安裝好索氏提取裝置,見圖4-21.1,打開電源,加熱

回流2小時.實(shí)驗(yàn)時能夠觀察到,隨著回流的進(jìn)行,當(dāng)提取筒中回流下的乙醇液的液面稍高于索氏

提取器的虹吸管頂端時,提取筒中的乙醇液發(fā)生虹吸并全部流回到燒瓶內(nèi).然后再次回流，虹吸,記錄虹吸次數(shù).虹吸5-6次后,當(dāng)提取筒中提取液顏色變得很淺時,說明被提取物已

大部分被提取,停止加熱,移去電熱套,冷卻提取液.拆除索氏提取器(若提取筒中仍有少量提取液,傾斜使其全部流到圓底燒瓶中),安裝

冷凝管進(jìn)行蒸餾，至剩余5mL左右時趁熱傾入盛有生石灰的蒸發(fā)皿中攪拌成糊狀后蒸

干成粉狀。然后用升華法獲得其晶體。

第五篇：DNA提取過程中各種試劑的作用及原理

DNA提取過程中各種試劑的作用及原理

1．溶液I—溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。2．溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。

但當(dāng)pH＞12或pH＜3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。

SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：

（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。

（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。

但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中

（用RNase去除RNA時）受到干擾。

3.溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾桑瑴p少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。

4．為什么用無水乙醇沉淀DNA？

用無水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67％左右。

因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因?yàn)闊o水乙醇的價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95％乙醇昂貴）。

但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15－30分鐘即可。

5．在用乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.1～0.25mol/L？

在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。

6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理？

加進(jìn)去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。7．為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？

在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa＝7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2＋產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反應(yīng)時，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定。

氯仿的作用主要是使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開，異戊醇的作用是消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。

氯仿是強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，抑制RNA酶的活性，除去蛋白質(zhì)污染。

基因組DNA-CTAB法

CTAB法原理(植物DNA提取經(jīng)典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨),是一種陽離子去污劑,具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性.在高離子強(qiáng)度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物,只是不能沉淀核酸.通過有機(jī)溶劑抽提,去除蛋白,多糖,酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來.注:CTAB溶液在低于15℃ 時會形成沉淀析出,因此在將其加入冰冷的 植物材料之前必須預(yù)熱,且離心時溫度不要低于15℃.基因組DNA-CTAB法

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

Tris-HCl(pH8.0)提供一個緩沖環(huán)境,防止核酸被破壞;EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性;NaCl 提供一個高鹽環(huán)境,使DNP充分溶解,存在于液相中;CTAB溶解細(xì)胞膜,并結(jié)合核酸,使核酸便于分離;β-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除

基因組DNA-CTAB法

CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物,能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì),有效去除多酚,減少DNA中酚的污染;同時它也能和多糖結(jié)合,有效去除多糖.基因組DNA的提取核酸分離,純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時,應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)(酚/氯仿)抽提時應(yīng)充分混勻,但動作要輕柔離心分離兩相時,應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點(diǎn),在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取核酸分離,純化

蛋白質(zhì)的去除:酚/氯仿抽提使用變性劑變性(SDS,異硫氰酸胍等)高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離,純化

多糖的去除:高鹽法:用乙醇沉淀時,在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl,高鹽可溶解多糖.用多糖水解酶將多糖降解.在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積),氯苯可以與多糖的羥基作用,從而去除多糖.用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000(含1.2 M NaCl),冰浴20min.核酸分離,純化

多酚的去除:在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑:β-巰基乙醇,抗壞血酸,半胱氨酸,二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它們與酚類有較強(qiáng)的親和力,可防止酚類與DNA的結(jié)合

鹽離子的去除:70%的乙醇洗滌核酸吸附,沉淀和溶解使用合適的吸附材料吸附核酸,其它的雜質(zhì)均被洗掉,達(dá)到純化DNA的目的另一種方式加入1/10體積的NaAc(pH5.2,3M),用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后應(yīng)用70%的乙醇洗滌,以除去鹽離子等若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNasepH值為8.0,可防止DNA發(fā)生酸解。

基因組DNA提取常見問題

DNA中含有蛋白,多糖,多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前,有酒精殘留,酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子有RNA的存留原因?qū)Σ咧匦录兓疍NA,過吸附柱去除蛋白,多糖,多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA,讓酒精充分揮發(fā)增加70%乙醇洗滌的次數(shù)(2-3次)加入RNase降解RNA 問題一:DNA樣品不純,抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng).DNA提取常見問題材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈,DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融。盡量取新鮮材料,低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后,應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時,可增加裂解液中螯合劑的含量,細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制,耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中,避免反復(fù)凍融 問題二:DNA降解.DNA提取常見問題實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗滌時DNA丟失。盡量選用新鮮(幼嫩)的材料動植物要勻漿研磨充分;G+菌,酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁.高溫裂解時,時間適當(dāng)延長(對于動物細(xì)胞,細(xì)菌可增加PK的用量).增加吸附的時間,或低溫沉淀小心操作 問題三:DNA提取量少.